FR2694765A1 - Hybrid nucleic acid sequence, non-human transgenic mammals having such a sequence and their applications as well as method for producing said mammals. - Google Patents
Hybrid nucleic acid sequence, non-human transgenic mammals having such a sequence and their applications as well as method for producing said mammals. Download PDFInfo
- Publication number
- FR2694765A1 FR2694765A1 FR9209946A FR9209946A FR2694765A1 FR 2694765 A1 FR2694765 A1 FR 2694765A1 FR 9209946 A FR9209946 A FR 9209946A FR 9209946 A FR9209946 A FR 9209946A FR 2694765 A1 FR2694765 A1 FR 2694765A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- human
- fragment
- hybrid
- sequence according
- transgenic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 51
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title claims abstract description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 39
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 39
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 claims description 30
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 22
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 17
- 210000002837 heart atrium Anatomy 0.000 claims description 17
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 claims description 15
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 claims description 11
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 10
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 claims description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- 239000003416 antiarrhythmic agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 5
- 101500027325 Homo sapiens Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 claims description 4
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 3
- 230000003288 anthiarrhythmic effect Effects 0.000 claims description 3
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 claims description 2
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 claims description 2
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 claims description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 2
- 230000001536 pro-arrhythmogenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000009758 senescence Effects 0.000 claims description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 102000002723 Atrial Natriuretic Factor Human genes 0.000 claims 1
- 230000004346 regulation of heart rate Effects 0.000 claims 1
- 108010014494 beta-1 Adrenergic Receptors Proteins 0.000 abstract description 7
- 102000016967 beta-1 Adrenergic Receptors Human genes 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 12
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 11
- WGSPBWSPJOBKNT-UHFFFAOYSA-N iodocyanopindolol Chemical compound CC(C)NCC(O)COC1=CC=CC2=C1C(I)=C(C#N)N2 WGSPBWSPJOBKNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 5
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 4
- 108060003345 Adrenergic Receptor Proteins 0.000 description 4
- 102000017910 Adrenergic receptor Human genes 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 4
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 4
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 4
- JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N (+-)-Isoprenaline Chemical compound CC(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150013030 FAN1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229940039009 isoproterenol Drugs 0.000 description 3
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- VFIDUCMKNJIJTO-BBRMVZONSA-N ICI 118551 Chemical compound CC(C)N[C@@H](C)[C@@H](O)COC1=CC=C(C)C2=C1CCC2 VFIDUCMKNJIJTO-BBRMVZONSA-N 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 208000007177 Left Ventricular Hypertrophy Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 150000003943 catecholamines Chemical class 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- WRRSFOZOETZUPG-FFHNEAJVSA-N (4r,4ar,7s,7ar,12bs)-9-methoxy-3-methyl-2,4,4a,7,7a,13-hexahydro-1h-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-7-ol;hydrate Chemical compound O.C([C@H]1[C@H](N(CC[C@@]112)C)C3)=C[C@H](O)[C@@H]1OC1=C2C3=CC=C1OC WRRSFOZOETZUPG-FFHNEAJVSA-N 0.000 description 1
- -1 (Frielle T. et al. Proteins 0.000 description 1
- AQHHHDLHHXJYJD-CQSZACIVSA-N (R)-(+)-propranolol Chemical compound C1=CC=C2C(OC[C@H](O)CNC(C)C)=CC=CC2=C1 AQHHHDLHHXJYJD-CQSZACIVSA-N 0.000 description 1
- VFPOVCXWKBYDNF-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-5-[2-[[2-hydroxy-3-[4-[1-methyl-4-(trifluoromethyl)imidazol-2-yl]phenoxy]propyl]amino]ethoxy]benzamide;methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O.CN1C=C(C(F)(F)F)N=C1C(C=C1)=CC=C1OCC(O)CNCCOC1=CC=C(O)C(C(N)=O)=C1 VFPOVCXWKBYDNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000117 Abnormal behaviour Diseases 0.000 description 1
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 1
- 206010003130 Arrhythmia supraventricular Diseases 0.000 description 1
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 description 1
- 108090000312 Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000003922 Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 206010007572 Cardiac hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000006029 Cardiomegaly Diseases 0.000 description 1
- 206010052895 Coronary artery insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100027284 Fanconi-associated nuclease 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 101000914689 Homo sapiens Fanconi-associated nuclease 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- 102000004016 L-Type Calcium Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000420 L-Type Calcium Channels Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001800 adrenalinergic effect Effects 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003126 arrythmogenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037849 arterial hypertension Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002057 chronotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000010247 heart contraction Effects 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000297 inotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005246 left atrium Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001452 natriuretic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000001242 postsynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000005245 right atrium Anatomy 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0375—Animal model for cardiovascular diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
La présente invention est relative à une séquence d'acide nucléique hybride comportant une séquence codant pour un récepteur membranaire humain impliqué dans la régulation du rythme cardiaque sinusal et notamment, le récepteur ssl-adrénergique, à des mammifères transgéniques non-humains possèdant une telle séquence, ainsi qutà une méthode de production desdits mammifères transgéniques non-humains (rongeurs, notamment) exprimant ledit récepteur humain. The present invention relates to a hybrid nucleic acid sequence comprising a sequence encoding a human membrane receptor involved in the regulation of the sinus heart rate and in particular the ss1-adrenergic receptor, to non-human transgenic mammals having such a sequence as well as a method for producing said non-human transgenic mammals (including rodents) expressing said human receptor.
La présente invention est également relative aux cellules et aux tissus de mammifères transgéJniques non-humains, dans lesquels l'expression dudit récepteur humain est contrôlée, ainsi qu'à un modèle d'étude des troubles du rythme et de la contractilité cardiaque et à une méthode d'évaluation de médicaments utiles dans les troubles du rythme. The present invention also relates to non-human transgenic mammalian cells and tissues, in which the expression of said human receptor is controlled, as well as to a model for studying disorders of rhythm and cardiac contractility and to a method of evaluating drugs useful in rhythm disorders.
Les récepteurs membranaires et notamment les récepteurs -adrénergiques du myocarde humain jouent un râle important dans les effets inotropes et chronotropes des hormones circulantes. La présence de noradrénaline au niveau des récepteurs ss-adrénergiques (ss-RA) postsynaptiques entraîne une modification du rythme et de la force des contractions cardiaques, modulée par le système transmembranaire ss-RA-adénylate cyclase, qui est sous le contrôle des protéines G. Membrane receptors and especially human adrenergic receptors play an important role in the inotropic and chronotropic effects of circulating hormones. The presence of norepinephrine at the postsynaptic ss-adrenergic receptors (ss-RA) causes a change in the rhythm and strength of the cardiac contractions, modulated by the transmembrane system ss-RA-adenylate cyclase, which is under the control of the G proteins. .
En augmentant le taux intracellulaire d'AMP cyclique, les protéines G de stimulation traduisent les résultats du stimulus agoniste en une réponse physiologique, telle que l'activation d'une kinase et la phosphorylation subséquente des canaux ioniques. By increasing the intracellular level of cyclic AMP, stimulating G proteins translate the results of the agonist stimulus into a physiological response, such as kinase activation and subsequent phosphorylation of the ion channels.
Le courant Ca2 f sensible au voltage joue un rôle central dans la régulation de l'excitabilité cardiaque et de la contractilité. The voltage-sensitive Ca2 + current plays a central role in the regulation of cardiac excitability and contractility.
La stimulation des récepteurs ss-adrénergiques myocardiques (ventriculaires et auriculaires) augmente la contractilité cardiaque et modifie le rythme cardiaque. Stimulation of myocardial (ventricular and atrial) ss-adrenergic receptors increases cardiac contractility and changes the heart rate.
Deux sous-types distincts de récepteurs adrénergiques ss (ss1-RA et 52-RA) sont impliqués dans la réponse biologique aux catécholamines et sont impliqués dans l'insuffisance chronique cardiaque (ICC), chez 1 'Homme. Two distinct subtypes of adrenergic receptors ss (ss1-RA and 52-RA) are involved in the biological response to catecholamines and are implicated in chronic cardiac insufficiency (CHF) in humans.
L'ICC, qui est l'une des maladies graves les plus fréquemment rencontrées dans les sociétés occidentales, a comme étiologie majeure, l'hypertension artérielle et/ou l'insuffisance coronarienne ; il s'agit d'une maladie mortelle (survie à 5 ans), soit par défaillance mécanique, soit du fait des troubles du rythme. CCI, which is one of the most common serious illnesses encountered in Western societies, has as a major etiology, arterial hypertension and / or coronary insufficiency; it is a fatal disease (survival at 5 years), either by mechanical failure or due to rhythm disorders.
Elle fait généralement suite à une hypertrophie ventriculaire gauche (HVG), compensée. Le traitement actuel, lorsqu'il ne peut être étiologique, ce qui est rare, est palliatif et combine inotropes positifs, vasodilatateurs et anti-arythmiques. Il est maintenant bien admis que les troubles du rythme, en particulier, sont une des conséquences de l'hypertrophie cardiaque elle-même, et que, pîiis précisément, ils sont dûs au réarrangement des protéines membranaires et de la matrice extra-cellulaire, qui caractérise le cardiocyte hypertrophié. Ces troubles sont indépendants de l'étiologie et sont distincts des arythmies d'origine ischémique. L'arythmogénicité du coeur hypertrophié apparaît comme l'un des problèmes majeurs de la cardiologie contemporaine.It usually follows a compensated left ventricular hypertrophy (LVH). The current treatment, when it can not be etiologic, which is rare, is palliative and combines positive inotropes, vasodilators and anti-arrhythmics. It is now well recognized that rhythm disorders, in particular, are one of the consequences of cardiac hypertrophy itself, and that, precisely, they are due to the rearrangement of the membrane proteins and the extracellular matrix, which characterizes the hypertrophied cardiocyte. These disorders are independent of etiology and are distinct from arrhythmias of ischemic origin. The arrhythmogenicity of the hypertrophied heart appears as one of the major problems of contemporary cardiology.
La complexité des relations entre les différents mécanismes arythmogènes et l'absence de modèle animal rendent les améliorations du diagnostic et de la thérapie difficiles ; en effet les animaux transgéniques décrits dans la littérature, concernant le domaine cardiovasculaire, ne sont pas adaptés à l'étude du rythme et de la contractilité cardiaque et à l'établissement d'une relation fonction physiologique/modification de l'expres- sion génique de différents paramètres, notamment in vivo [L.J. FIELD, (Science, 1988, 239, 1029-1032)]. The complexity of the relationships between the different arrhythmogenic mechanisms and the absence of an animal model make improvements in diagnosis and therapy difficult; in fact, the transgenic animals described in the literature, concerning the cardiovascular field, are not adapted to the study of cardiac rhythm and contractility and to the establishment of a physiological function / gene expression relationship. different parameters, especially in vivo [LJ FIELD, (Science, 1988, 239, 1029-1032)].
Afin de résoudre ce problème, les Inventeurs ont cherché à mettre au point un modèle d'étude des troubles du rythme et de la contractilité cardiaque ainsi qu'un modèle de physiologie à l'envers", bien adapté à l'étude du rythme et de la contractilité cardiaque et à l'établissement d'une relation fonction physiologiquemodification de llexpression génique de différents paramètres impliqués. In order to solve this problem, the inventors have sought to develop a model for studying arrhythmias and cardiac contractility as well as an upside-down physiology model, which is well adapted to the study of rhythm and of cardiac contractility and the establishment of a physiological function relationship modifying the gene expression of various parameters involved.
La présente invention a pour objet une séquence d'acide nucléique hybride, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment d'un gène codant pour un récepteur membranaire humain, impliqué dans la régulation du rythme cardiaque sinusal et un promoteur hétérologue spécifique des oreillettes. The subject of the present invention is a hybrid nucleic acid sequence, characterized in that it comprises at least one fragment of a gene coding for a human membrane receptor, involved in the regulation of the sinus cardiac rhythm and a heterologous promoter specific for Headsets.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite séquence d'acide nucléique hybride, elle comprend un fragment du gène codant pour un récepteur ss-adrénergique humain, de préférence le récepteur l-adrénergique humain et un promoteur hétérologue spécifique des oreillettes, apte à contrôler l'expression dudit récepteur ss-adréner- gique humain, en particulier dans le tissu auriculaire d'animaux transgéniques non-humains. According to an advantageous embodiment of said hybrid nucleic acid sequence, it comprises a fragment of the gene coding for a human ss-adrenergic receptor, preferably the human 1-adrenergic receptor and a heterologous specific atrial promoter, capable of controlling the expression of said human β-adrenergic receptor, particularly in the atrial tissue of non-human transgenic animals.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence hybride comprend au moins la séquence codant pour ledit récepteur Dl-adrénergique humain et au moins le promoteur humain du facteur atrial natriurétique (FAN) ou un fragment de celui-ci. According to an advantageous arrangement of this embodiment, said hybrid sequence comprises at least the sequence coding for said human D1-adrenergic receptor and at least the human atrial natriuretic factor (FAN) promoter or a fragment thereof.
Selon une modalité avantageuse de cette disposition, ladite séquence comprend les régions régulatrices et un fragment du promoteur humain du facteur atrial na triurétique (FAN), d'environ 0,56 kb, apte à contrôler l'expression dudit récepteur humain, dans un tissu auriculaire non-humain. According to an advantageous embodiment of this arrangement, said sequence comprises the regulatory regions and a fragment of the human atrial triuretic atrial factor (FAN) promoter, of approximately 0.56 kb, capable of controlling the expression of said human receptor in a tissue. non-human auricular.
Un tel fragment de 0,56 kb, est notamment un fragment BamHI-XbaI. Such a fragment of 0.56 kb is in particular a BamHI-XbaI fragment.
Conformément à cette modalité, ladite séquence hybride comprend le fragment de 0,6 kb du promoteur hu main du facteur atrial natriurétique et un fragment correspondant à la région codante et à la région 3' non-codante du gène ssl-RA, laquelle séquence hybride présente une longueur totale d'environ 4 kb. According to this modality, said hybrid sequence comprises the 0.6 kb fragment of the human hand promoter of atrial natriuretic factor and a fragment corresponding to the coding region and to the 3 'non-coding region of the ss1-RA gene, which hybrid sequence has a total length of about 4 kb.
Le fragment correspondant à la région codante et à la région 3' non-codante du gène ssl-RA est avantageusement un fragment BstEII-HindIII. The fragment corresponding to the coding region and to the 3 'non-coding region of the ss1-RA gene is advantageously a BstEII-HindIII fragment.
Conformément à cette modalité, ladite séquence comprend, en outre, un fragment de jonction XbaI-BstEII d'environ 45pb entre le fragment correspondant au promoteur humain du facteur atrial natriurétique et le fragment correspondant à la région codante et à la région 3' non-codante du gène pl-RA. According to this modality, said sequence further comprises an XbaI-BstEII junction fragment of approximately 45 bp between the fragment corresponding to the human promoter of the natriuretic atrial factor and the fragment corresponding to the coding region and the 3 'non-region. coding of the pl-RA gene.
Au sens de la présente invention, ladite séquence hybride englobe également ses séquences complémentaires. For the purposes of the present invention, said hybrid sequence also encompasses its complementary sequences.
La présente invention a également pour objet des cardiocytes auriculaires de mammifère non-humain, caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence d'acide nucléique hybride telle que définie ci-dessus, incluant la séquence codant pour un récepteur membranaire humain impliqué dans la régulation du rythme cardiaque sinusal, lesquels cardiocytes non-humains expriment ledit récepteur membranaire humain. The present invention also relates to non-human mammal atrial cardiocytes, characterized in that they comprise a hybrid nucleic acid sequence as defined above, including the coding sequence for a human membrane receptor involved in the regulation sinus heart rate, which non-human cardiocytes express said human membrane receptor.
La présente invention a également pour objet des fragments de tissu auriculaire de mammifère non-humain, caractérisés en ce qu'ils comprennent une séquence d'acide nucléique hybride telle que définie ci-dessus, incluant la séquence codant pour un récepteur membranaire humain impliqué dans la régulation du rythme cardiaque sinusal, lesquels fragments de tissu auriculaire non-humain expriment ledit récepteur membranaire humain. The subject of the present invention is also non-human mammalian atrial tissue fragments, characterized in that they comprise a hybrid nucleic acid sequence as defined above, including the sequence encoding a human membrane receptor involved in sinus heart rate regulation, which non-human atrial tissue fragments express said human membrane receptor.
La présente invention a également pour objet des mammifères transgéniques non-humains, notamment des rongeurs, caractérisés en ce qu'ils possèdent, dans leurs cellules germinales et somatiques, une séquence hybride telle que définie ci-dessus (transgène), c'est-à-dire incluant un promoteur hétérologue spécifique des oreillettes et un fragment d'un gène codant pour un récepteur membranaire impliqué dans la régulation du rythme cardiaque sinusal humain et en ce qu'ils expriment ledit récepteur membranaire humain dans leurs oreillettes. The subject of the present invention is also non-human transgenic mammals, in particular rodents, characterized in that they possess, in their germinal and somatic cells, a hybrid sequence as defined above (transgene), that is, that is, including an atrial-specific heterologous promoter and a fragment of a gene encoding a membrane receptor involved in the regulation of human sinus rhythm and expressing said human membrane receptor in their atria.
Conformément à l'invention, de tels animaux transgéniques sont susceptibles d'être obtenus par une méthode de production de mammifères non-humains transgéniques qui comprend l'introduction d'au-moins une copie de la séquence nucléique hybride telle que définie cidessus, dans les cellules d'un embryon de mammifère nonhumain à un stade précoce, de préférence dans l'un des pronuclel de l'oeuf fertilisé (obtention d'un transgène). According to the invention, such transgenic animals are capable of being obtained by a method for producing non-human transgenic mammals which comprises introducing at least one copy of the hybrid nucleic sequence as defined above, into cells of a nonhuman mammalian embryo at an early stage, preferably in one of the pronuclel of the fertilized egg (obtaining a transgene).
La présente invention a également pour objet un modèle d'étude des troubles du rythme et de la contractilité, ainsi que des arythmies cardiaques physiologiques de la sénescence, caractérisé en ce qu'il est constitué par des cardiocytes, des fragments de tissu auriculaire ou des animaux non-humains transgéniques, conformes à l'invention. The present invention also relates to a model for studying disorders of rhythm and contractility, as well as physiological cardiac arrhythmias of senescence, characterized in that it consists of cardiocytes, atrial tissue fragments or non-human transgenic animals, according to the invention.
La présente invention a, en outre, pour objet une méthode d'évaluation des effets antiarythmiques ou proarythmiques de substances chimiques et notamment de médicaments anti-arythmiques, caractérisée en ce qu'elle comprend
(1) la mise en contact de cardiocytes, de fragments tissulaires auriculaires de mammifères non-humains ou d'animaux transgéniques non-humains, porteurs de séquences d'acides nucléiques (transgènes) telles que définies ci-dessus et exprimant un récepteur membranaire humain impliqué dans la régulation du rythme cardiaque sinusal, conformément à la présente invention, avec un produit à tester et
(2) l'évaluation des modifications du rythme cardiaque et/ou de la contractilité, liée à exaction de ladite substance.The present invention furthermore relates to a method for evaluating the antiarrhythmic or proarrhythmic effects of chemical substances, and in particular antiarrhythmic drugs, characterized in that it comprises
(1) contacting cardiocytes, atrial tissue fragments of non-human mammals or non-human transgenic animals carrying nucleic acid sequences (transgenes) as defined above and expressing a human membrane receptor involved in regulating the sinus rhythm, in accordance with the present invention, with a product to be tested and
(2) evaluation of changes in heart rate and / or contractility, related to exaction of said substance.
La présente invention a, de plus pour objet une méthode de production d'animaux transgéniques non-humains, exprimant au moins un récepteur membranaire humain impliqué dans la régulation du rythme cardiaque, caractérisée en ce qu'elle comprend
(1) l'introduction d'au moins une copie de la séquence hybride ou transgène tels que définis ci-dessus, dans les cellules d'un embryon de mammifère non-humain à un stade précoce, de préférence dans l'un des pronuclel de l'oeuf fertilisé, et
(2) la détection d'au moins une copie dudit transgène chez les animaux transgéniques obtenus, par hy hybridation avec une séquence complémentaire dudit transgène.The present invention further relates to a method for producing non-human transgenic animals, expressing at least one human membrane receptor involved in the regulation of the cardiac rhythm, characterized in that it comprises
(1) the introduction of at least one copy of the hybrid or transgene sequence as defined above, into the cells of a non-human mammalian embryo at an early stage, preferably in one of the pronuclel fertilized egg, and
(2) detecting at least one copy of said transgene in the transgenic animals obtained by hybridization with a sequence complementary to said transgene.
En variante, ladite détection est réalisée après amplification à l'aide d'amorces choisies de telle sorte qu'elles permettent uniquement l'amplification des transgènes avec l'amorce sens dans la région du promoteur du FAN (5' AGGCAGAGAGGGGCTGTGACAAGCCC 3') et l'amorce anti-sens (5' CATCAGCAGACCCATGCCCGCTGTCC 3'), dans la région codant pour le récepteur Bl-adrénergique. Alternatively, said detection is carried out after amplification using primers chosen so that they only allow the amplification of the transgenes with the forward primer in the region of the FAN promoter (5 'AGGCAGAGAGGGGCTGTGACAAGCCC 3') and the antisense primer (5 'CATCAGCAGACCCATGCCCGCTGTCC 3'), in the region encoding the β1-adrenergic receptor.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention. In addition to the foregoing, the invention also comprises other arrangements, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the method that is the subject of the present invention.
De manière inattendue, les séquences hybrides conformes à l'invention, comprenant un promoteur d'un gène exprimé spécifiquement dans les oreillettes, notamment le promoteur humain FAN et au moins un fragment d'un gène codant pour un récepteur membranaire humain, impliqué dans la régulation du rythme cardiaque sinusal permet de cibler l'expression du récepteur humain transgénique obtenu, entraînant notamment, en ce qui concerne les récepteurs ssl-adrénergiques humains, une surexpression d'un facteur de l'ordre de 5-10 des récepteurs ssl-adr- énergiques humains totaux dans les oreillettes de souris transgéniques ; les récepteurs humains ainsi exprimés sont, en outre, fonctionnels et rendent de tels animaux transgéniques, particulièrement intéressants, comme modèles d'étude du rythme et de la contractilité cardiaques et à l'établissement d'une relation fonction physiologique/modification de l'expression génique de différents paramètres impliqués dans l'ICC. Unexpectedly, the hybrid sequences according to the invention, comprising a promoter of a gene specifically expressed in the atria, in particular the human FAN promoter and at least one fragment of a gene coding for a human membrane receptor, involved in the regulation of the sinus heart rate makes it possible to target the expression of the transgenic human receptor obtained, resulting in particular, with regard to the human ss1-adrenergic receptors, an overexpression of a factor of the order of 5-10 of the ssl-adr receptors energetic total humans in the atria of transgenic mice; the human receptors thus expressed are, in addition, functional and render such transgenic animals, which are particularly interesting, as models for studying cardiac rhythm and contractility and for establishing a physiological function / expression modification relationship. of different parameters involved in the ICC.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. It should be understood, however, that these examples are given solely by way of illustration of the object of the invention, of which they in no way constitute a limitation.
EXEMPLE 1 : Construction du gène chimérique.EXAMPLE 1 Construction of the Chimeric Gene
Un fragment BamHI-BstEII, correspondant à la partie 5' du gène du récepteur ssl-adrénergique humain,(Frielle T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84, 7920-7924) cloné dans un plasmide pUC18 au niveau des sites BamHI-HindIII, est échangé avec un fragment BamHI
XbaI du promoteur FAN humain, de 0,56 kb ; les deux parties sont liées à l'aide d'un fragment oligonucléotidique qui reconstitue le site XbaI, le codon d'initiation et la région codante 5' du gène du récepteur ssl-adrénergique (CTAGATGGGCGCGGGGGTGCTCGTCCT GGGCGCCTCCGAGCCCG). Le gène hybride obtenu, est sous-cloné dans le plasmide pUC18 le fragment d'ADN hybride de 4 kb BamHI-HindIII est isolé et purifié par électroélution, pour réaliser les microinjections.A BamHI-BstEII fragment, corresponding to the 5 'portion of the human ss1-adrenergic receptor gene, (Frielle T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84, 7920-7924) cloned into a plasmid pUC18 at the BamHI-HindIII sites, is exchanged with a BamHI fragment
XbaI of the human FAN promoter, 0.56 kb; both portions are linked using an oligonucleotide fragment which reconstitutes the XbaI site, the initiation codon and the 5 'coding region of the ss1-adrenergic receptor gene (CTAGATGGGCGCGGGGGTGCTCGTCCT GGGCGCCTCCGAGCCCG). The hybrid gene obtained is subcloned in plasmid pUC18. The BamHI-HindIII hybrid 4 kb DNA fragment is isolated and purified by electroelution, to carry out the microinjections.
On peut également utilisé tout autre fragment du promoteur du FAN ou le promoteur entier (+ de 3 kb), pour réaliser le gène chimèrique, conforme à l'invention. Any other fragment of the FAN promoter or the entire promoter (more than 3 kb) may also be used to produce the chimeric gene according to the invention.
EXEMPLE 2 : Production de souris transgéniques.EXAMPLE 2 Production of transgenic mice
Elle est réalisée par microinjection de 1'ADN tel que préparé à l'exemple 1, dans des pronuclei d'oeufs fertilisés de souris femelles (génération F1) superovulées (C57Bt/6 X DBA) et la réimplantation chez des souris femelles pseudogestantes (B 6X CBA), est réalisée comme décrit dans HOGAN B.L.M. et al. (Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY). It is carried out by microinjection of the DNA as prepared in Example 1, in pronuclei of fertilized eggs of superovulated female F1 (generation F1) mice (C57Bt / 6 X DBA) and reimplantation in female pseudogenic mice (B 6X CBA) is performed as described in HOGAN BLM et al. (Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY).
Les animaux fondateurs transgéniques sont détectés par la méthode de Southern (hybridation avec une séquence complémentaire du transgène), après extraction de I'ADN à partir de biopsies de queues, digestion avec des enzymes de restriction appropriées. The transgenic founding animals are detected by the Southern method (hybridization with a sequence complementary to the transgene), after extraction of the DNA from tail biopsies, digestion with appropriate restriction enzymes.
Des lignées transgéniques sont produites par croisement entre des souris transgéniques issues d'un même fondateur, puis les animaux transgéniques porteurs du transgène sont détectés, après amplification par PCR de 1'ADN extrait, comme précisé ci-dessus. Transgenic lines are produced by crossing between transgenic mice from the same founder, then the transgenic animals carrying the transgene are detected, after amplification by PCR of the extracted DNA, as specified above.
Les amorces sont sélectionnées de telle sorte qu'elles permettent uniquement l'amplification des transgènes conformes à l'invention : amorce sens dans la région du promoteur du FAN (5' AGGCAGAGAGGGGCTGTGAC
AAGCCC 3') et amorce anti-sens (5' CATCAGCAGACCCATGCCCGC
TGTCC 3'), dans la région codant pour le récepteur 1- adrénergique.The primers are selected such that they only allow amplification of the transgenes according to the invention: sense primer in the region of the FAN promoter (5 'AGGCAGAGAGGGGCTGTGAC
AAGCCC 3 ') and antisense primer (5' CATCAGCAGACCCATGCCCGC
TGTCC 3 '), in the region encoding the 1-adrenergic receptor.
Les conditions de la PCR sont les suivantes
dénaturation : 1 min 30 à 93 C
hybridation : 2 min à 55 C
élongation : 2 min à 72 C pendant 30 cycles avec 2,5 U de Taq polymérase dans un tampon standard additionné de formamide 5 % et de DMSO 10 W. The conditions of the PCR are as follows
denaturation: 1 min 30 to 93 C
hybridization: 2 min at 55 ° C
elongation: 2 min at 72 ° C for 30 cycles with 2.5 U Taq polymerase in standard buffer supplemented with 5% formamide and 10 W DMSO.
- Résultats
a) Le gène de fusion (transgène FAN-B1) contient les régions régulatrices et le promoteur du gène du FAN humain (0,56 kb), lié à la région codante et à la région 3' non-codante du gène du récepteur l-adréner- gique (figure la : transgène FAN1). - Results
a) The fusion gene (FAN-B1 transgene) contains the regulatory regions and the promoter of the human FAN gene (0.56 kb), bound to the coding region and to the 3 'non-coding region of the receptor gene. adrenergic (Figure la: transgene FAN1).
Quatre fondateurs transgéniques, porteurs du transgène FAN-ss1 ont été détectés. Deux de tes fondateurs (ne15 et n 42), présentant des copies multiples dudit trans gène sont révélés par la méthode de Southern ; les deux autres fondateurs (ne17 et n'19), porteurs d'une simple-copie du transgène FAN-l sont détectés, après criblage PCR (figure lb). Four transgenic founders carrying the FAN-ss1 transgene were detected. Two of your founders (ne15 and n42), having multiple copies of said trans gene are revealed by the Southern method; the other two founders (ne17 and n19) carrying a single copy of the FAN-1 transgene are detected after PCR screening (FIG. 1b).
Cette figure lb représente le résultat de l'amplification par PCR de l'ADN des 4 lignées (15, 17,19 et 42), la détermination du nombre de copies de transgènes dans la descendance de chaque lignée et le contrôle de 11 expression de 1'ARNm dans le myocarde par RT-PCR lARN total (0,5 Wg) des lignées 15, 19 et 42 est traité à l'ADNase, incubé avec la transcriptase inverse et amplifié en présence d'-amorces spécifiques (du transgène ou de l'a-actine). This figure 1b represents the result of the PCR amplification of the DNA of the 4 lines (15, 17, 19 and 42), the determination of the number of copies of transgenes in the progeny of each line and the control of expression of MRNA in the myocardium by RT-PCR total RNA (0.5 Wg) of lines 15, 19 and 42 is treated with DNAase, incubated with reverse transcriptase and amplified in the presence of specific primers (transgene or of a-actin).
Le fondateur n"17 ne transmet pas le transgène à sa descendance ; en conséquence des animaux transgéniques homozygotes sont dérivés à partir des trois autres lignées transgéniques fondatrices. Le nombre de copies de transgènes FAN-1 varie de 2 à 20. Les sites d'intégration des transgènes sont différents pour les trois lignées fondatrices (profils de restriction différents, par la méthode de Southern). Après six mois, les souris transgéniques homozygotes ne présentent pas un phénotype de mort prématurée ou de n'importe quel autre comportement anormal. Founder No. 17 does not transmit the transgene to its offspring, therefore, homozygous transgenic animals are derived from the other three founder transgenic lines The copy number of FAN-1 transgenes varies from 2 to 20. The sites of Integration of transgenes are different for the three founder lines (different restriction patterns, by the Southern method). After six months, homozygous transgenic mice do not exhibit a phenotype of premature death or any other abnormal behavior.
b) Analvse de 1'ARN : spécificité tissulaire
Pour analyser l'expression du transgène et la spécificité tissulaire du promoteur FAN, 1'ARN total est préparé selon la méthode de LIVELLI et al. (J. Biol.b) ANALYSIS OF RNA: Tissue specificity
To analyze transgene expression and tissue specificity of the FAN promoter, total RNA is prepared according to the method of LIVELLI et al. (J. Biol.
Chem., 1982, 257, 6782), à partir de plusieurs tissus (coeur, foie, cerveau, rein et poumon) de souris transgéniques hétérozygotes et homozygotes âgées de 4 mois et de souris témoins. Les échantillons d'ARN (0,5 Ag) sont soumis à une PCR inverse, utilisant des amorces oligodT, pour générer de l'ADNc en présence de transcriptase inverse (VERES G. et al., Science, 1987, 237, 415-417). Chem., 1982, 257, 6782), from several tissues (heart, liver, brain, kidney and lung) of 4-month-old heterozygous and homozygous transgenic mice and control mice. RNA samples (0.5 Ag) are subjected to reverse PCR, using oligodT primers, to generate cDNA in the presence of reverse transcriptase (VERES G. et al., Science, 1987, 237, 415- 417).
Les amorces utilisées au cours de la PCR sont choisies de manière à amplifier seulement l'ARNm transgénique mais sont différentes de celles utilisées pour le criblage transgénique : brin sens (5' GGGACAGACGTAGGCCAA
GAGAGGG 3') et brin anti-sens (5' GCACAGCACGTCCACTGA
GGTCCA 3').The primers used during PCR are chosen to amplify only transgenic mRNA but are different from those used for transgene screening: sense strand (5 'GGGACAGACGTAGGCCAA
GAGAGGG 3 ') and antisense strand (5' GCACAGCACGTCCACTGA
GGTCCA 3 ').
Les conditions de la PCR sont celles décrites précédemment, dans un tampon comprenant Tris-HCl pH 8,4 10 mM, MgC12 2,5 mM, Tween 20 0,025 %, NP40 0,25 %, formamide 5 % et DMSO 10 %. The conditions of the PCR are those described above, in a buffer comprising 10 mM Tris-HCl pH 8.4, 2.5 mM MgCl2, 0.025% Tween 20, 0.25% NP40, 5% formamide and 10% DMSO.
Pour analyser la surexpression auriculaire spécifique du transgène, 1'ARN est préparé à partir d'oreillettes, selon CIVELLI et al., cité, et la détection est réalisée par PCR inverse comme précisé ci-dessus. To analyze the specific atrial overexpression of the transgene, the RNA is prepared from atria, according to CIVELLI et al., Cited, and the detection is carried out by reverse PCR as specified above.
Les taux d'expression des transgènes sont déterminés pour les trois lignées et la figure lb illustre le fait que le taux d'expression n'est pas corrélé avec le nombre de copies. The expression levels of the transgenes are determined for the three lines and FIG. 1b illustrates the fact that the level of expression is not correlated with the number of copies.
La lignée 15, qui a le plus grand nombre de copies transgéniques, ne donne pas un signal supérieur à la lignée 19, qui présente une seule copie du transgène. Line 15, which has the highest number of transgenic copies, does not give a signal superior to line 19, which has a single copy of the transgene.
Ce phénomène est souvent observé chez les animaux transgéniques et est supposé être le résultat d'une modulation, induite par les régions adjacentes au site d'intégration. This phenomenon is often observed in transgenic animals and is thought to be the result of modulation induced by regions adjacent to the site of integration.
La lignée transgénique 42 est celle qui présente le meilleur taux d'expression d'ARNm dans le myocarde. The transgenic line 42 is the one that has the best mRNA expression level in the myocardium.
La présence d'ARNm transgénique a été recherchée dans différents tissus, pour vérifier la spécificité cardiaque du promoteur FAN (figure 2) ; le transgène n'est détecté que dans le myocarde des souris transgéniques. La figure 2 confirme cette spécificité. The presence of transgenic mRNA was investigated in different tissues, to verify the cardiac specificity of the FAN promoter (FIG. 2); the transgene is only detected in the myocardium of transgenic mice. Figure 2 confirms this specificity.
On sait que le FAN est exprimé à des taux relativement bas dans le rein et dans certaines parties du cerveau (VESELY D.L. et al., Peptides, 1992, 13/1, 165-170). Cependant, même à 20 Ag d'ARN, le transgène FAN-l n'est pas détecté dans le rein de souris transgéniques bien que la limite de détection soit inférieure à 0,1 Wg d'ARN dans le coeur. FAN is known to be expressed at relatively low levels in the kidney and in certain parts of the brain (VESELY D.L. et al., Peptides, 1992, 13/1, 165-170). However, even at 20 Ag of RNA, the FAN-1 transgene is not detected in the kidney of transgenic mice although the detection limit is less than 0.1 Wg of RNA in the heart.
Ceci suggère que le taux d'expression chez l'animal transgénique est au moins 50 fois supérieur dans le coeur que dans le rein. Ce rapport est en accord avec l'expression de FAN endogène dans les tissus non-cardiaques (inférieur à 1 t) (VESELY et al., cité). This suggests that the expression level in the transgenic animal is at least 50 times higher in the heart than in the kidney. This ratio is consistent with the expression of endogenous FAN in non-cardiac tissues (less than 1 t) (VESELY et al., Cited).
Le taux d'expression du transgène est également estimé séparément sur les préparations d'ARN d'oreillette et de ventricule (figure 3). The expression level of the transgene is also estimated separately on atrial and ventricular RNA preparations (FIG. 3).
Le transgène se révèle être spécifiquement exprimé dans les oreillettes. The transgene proves to be specifically expressed in the atria.
Cette figure 3 illustre la spécificité de l'expression auriculaire du transgène. L'ARN total des oreillettes et des ventricules a été soumis, séparément à une RT-PCR, avec des amorces spécifiques au transgène :
A : oreillettes ; V : ventricules ; T : coeur total. La quantité relative d'ARN, dans chaque échantillon, est comparée, en utilisant un témoin interne RT-PCR, lla-ac- tine.This figure 3 illustrates the specificity of the atrial expression of the transgene. Total atrial and ventricular RNA was subjected, separately to RT-PCR, with transgene-specific primers:
A: atria; V: ventricles; T: total heart. The relative amount of RNA in each sample is compared using an internal RT-PCR control, lla-acin.
c) Détermination de la surexoression des récenteurs :
La quantification relative est réalisée par
PCR inverse (RT-PCR), utilisant des amorces ssl-AR correspondant à des zones conservées d'espèces, de manière à amplifier 1'ADNc ssl-AR total (humain et murin) (amorce sens 5' TCGTGTGCACCGTGTGGGCC 3' et amorce anti-sens 5'
AGGAAACGGCGCTCGCAGCTGTCG 3').c) Determination of the over-exposure of the recenters:
Relative quantification is performed by
Reverse PCR (RT-PCR), using ss1-AR primers corresponding to conserved areas of species, to amplify the total ss1-AR cDNA (human and murine) (sense primer 5 'TCGTGTGCACCGTGTGGGCC 3' and anti primer -sens 5 '
AGGAAACGGCGCTCGCAGCTGTCG 3 ').
Une discrimination plus poussée des séquences amplifiées humaines et murines est réalisée par séquen çage direct après la PCR (CALDERONE A. et al., Circulation Res., 1991, 69/2, 333-343). Further discrimination of human and murine amplified sequences is achieved by direct sequencing after PCR (CALDERONE A. et al., Circulation Res., 1991, 69/2, 333-343).
Le taux relatif d'expression de l'ARNm de 51-
AR chez les souris transgéniques, compare à celui de sou ris témoins non-transgéniques, est estimé par amplification PCR inverse des régions B1 et a-actine (figure 4).The relative level of expression of 51-mRNA
AR in the transgenic mice, compared to that of non-transgenic control sugars, is estimated by inverse PCR amplification of the B1 and α-actin regions (Figure 4).
Le profil PCR montre que l'expression de
I'~n~RNm m de 51-AR est plus important dans les oreillettes transgéniques que dans les oreillettes normales et correspond à un produit d'origine humaine comme le confirme le séquençage direct après la PCR.The PCR profile shows that the expression of
The 51-AR mRNA is larger in transgenic atria than in normal atria and is a product of human origin as confirmed by direct sequencing after PCR.
Dans la figure 4, la colonne 1 correspond à une séquence d'a-actine amplifiée à partir d'ARN d'oreillettes transgéniques ; la colonne 2 correspond à la séquence amplifiée d'a-actine à partir d'ARN d'oreillette non transgénique ; la colonne 3 correspond à la séquence de 1-AR amplifiée à partir d'ARN d'oreillettes transgéniques et la colonne 4 correspond à la séquence de ssl-AR amplifiée à partir d'ARN d'oreillettes témoins non transgéniques. Les poids moléculaires des fragments sont respectivement de 236 pb (actine) et de 264 pb (il). In Figure 4, column 1 corresponds to an amplified α-actin sequence from transgenic atrium RNA; column 2 corresponds to the amplified α-actin sequence from non-transgenic atrium RNA; column 3 corresponds to the sequence of 1-AR amplified from transgenic atrium RNA and column 4 corresponds to the amplified ss1-AR sequence from nontransgenic control atrium RNA. The molecular weights of the fragments are 236 bp (actin) and 264 bp (il), respectively.
d) Analvse Drotéicue
- Quantification des récepteurs transgéniques dans des tests de liaison sur des préparations membranaires
La détection de la surexpression de protéine 51-AR humaine est réalisée à l'aide d'un test de liaison sur des homogénats auriculaires et ventriculaires, avec un ligand spécifique radiomarqué Ç125I]-cyanopindolol (ICYP), à une concentration proche du KD B1 (50 pM).d) Analvse Drotéicue
- Quantification of transgenic receptors in binding assays on membrane preparations
The detection of the overexpression of human 51-AR protein is carried out using a binding test on atrial and ventricular homogenates, with a radiolabelled specific ligand γ125I] -cyanopindolol (ICYP), at a concentration close to KD B1. (50 μM).
Le radioligand est incubé pendant 90 min à température ambiante avec des préparations membranaires et -les échantillons sont filtrés à travers des filtres
Whatman GF/F, lavés trois fois avec un tampon froid (Tris-HCl 12,5 mM pH 7,5). Ensuite, les filtres sont comptés dans un compteur 7.The radioligand is incubated for 90 min at room temperature with membrane preparations and the samples are filtered through filters.
Whatman GF / F, washed three times with cold buffer (12.5 mM Tris-HCl pH 7.5). Then the filters are counted in a counter 7.
Dans le test de liaison, sur des membranes auriculaires, l'une des expériences correspond à un mélange oreillette droite et oreillette gauche de trois souris. In the binding test, on atrial membranes, one of the experiments corresponds to a mixture of right atrium and left atrium of three mice.
Les valeurs correspondent aux moyennes des trois expé riences réalisées en double.The values correspond to the averages of the three experiments performed in duplicate.
La liaison non-spécifique est déterminée avec du (+) propranolol 1 WM et la spécificité de la liaison au récepteur Bl-adrénergique est déterminée en utilisant des ligands sélectifs 1 (CGP 20712A) ou ss2 (ICI 118551) respectivement à 500 et 20 nM, une concentration qui entraîne un blocage total des sites ssl ou 52. Nonspecific binding is determined with (+) propranolol 1 WM and the specificity of B1-adrenergic receptor binding is determined using selective ligands 1 (CGP 20712A) or ss2 (ICI 118551) at 500 and 20 nM respectively. , a concentration which results in a total blocking of the sites ssl or 52.
Au niveau de 1'ARN, on a montré (voir c)) que le transgène FAN-B1 est surexprimé, en comparaison du récepteur 1 murin. At the level of RNA, it has been shown (see c) that the FAN-B1 transgene is overexpressed, in comparison with the murine receptor 1.
Ce résultat indique que le promoteur est fonctionnel mais ne prouve pas que les étapes post-transcriptionnelles et post-traductionnelles sont réalisées correctement. This result indicates that the promoter is functional but does not prove that the post-transcriptional and post-translational steps are performed correctly.
La détection de récepteurs fonctionnels est étudiée à l'aise du test de liaison tel que défini cidessus, qui permet la détermination du nombre de récepteurs et du pourcentage de récepteurs dans un état de forte affinité, couplés à la Gs (DE LEAN A. et al., J. The detection of functional receptors is studied at ease with the binding assay as defined above, which allows the determination of the number of receptors and the percentage of receptors in a high affinity state, coupled with Gs (DE LEAN A. et al. al., J.
Biol., Chem., 1980, 255, 7108-7117).Biol., Chem., 1980, 255, 7108-7117).
La protéine humaine codée par ce trans gène FAN-B1 est détectée. The human protein encoded by this FAN-B1 trans gene is detected.
Le test de liaison de 1'ICYP tel que défini ci-dessus sur des préparations membranaires permet la détermination du nombre de récepteurs ssl-adrénergiques (120 + 30 fmol/mg de protéine), qui correspond à l'augmentation de l'ordre de 5-10 fois celle des récepteurs pl-adrénerglques dans les cardiocytes auriculaires des souris transgéniques, par rapport à des souris témoins.(figure 5). The ICYP binding assay as defined above on membrane preparations allows the determination of the number of ss1-adrenergic receptors (120 + 30 fmol / mg protein), which corresponds to the increase in the order of 5-10 times that of the adrenergic receptors in the atrial cardiocytes of the transgenic mice, compared with control mice (FIG. 5).
Cette figure 5 illustre la liaison spécifique de l'ICYP sur des préparations membranaires de cellules auriculaires et ventriculaires. Comme spécifié ci-dessus, 1'ICYP est utilisé à une concentration proche du KD. This Figure 5 illustrates the specific binding of ICYP on membrane preparations of atrial and ventricular cells. As specified above, ICYP is used at a concentration close to KD.
Aucune augmentation du nombre des récepteurs BT;-adrénergiques n'est trouvée dans les ventricul, ceci confirmant à nouveau l'expression auriculaire spécifique du transgène. No increase in the number of BT-adrenergic receptors is found in the ventricul, again confirming the transgene-specific atrial expression.
Ces résultats ont été obtenus lorsqu'on utilise des préparations membranaires selon CALDERONE et al., cité, mais ne sont pas aussi tranchés, lorsque d'autres procédures sont utilisées. These results were obtained when using membrane preparations according to CALDERONE et al., Cited, but are not as sliced when other procedures are used.
e) Essais de liaison sur des couses de coeur intact :
Pour visualiser le taux élevé de récepteurs l-adrénergiques dans les oreillettes de- souris transgéniques par rapport aux souris normales, des expériences de liaison sont réalisées sur des coupes de coeur. Les coeurs sont congelés à -80'C, coupés avec un cryotome (épaisseur : 20 Wm) et fixés sur une coupe de microscope avec de la gélatine à -20'C et stockés à -80'C jusqu'à leur utilisation.e) Connection tests on intact heart cuffs:
To visualize the high level of l-adrenergic receptors in transgenic mouse atria compared to normal mice, binding experiments are performed on heart-slides. The hearts are frozen at -80 ° C, cut with a cryotome (thickness: 20 Wm) and fixed on a microscope section with gelatin at -20 ° C and stored at -80 ° C until use.
Les essais de liaison sont réalisés avec de 1'ICYP 80 pM pendant 90 min à température ambiante dans un tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, MgC12 0,5 mM et acide ascorbique 0,05 %. Binding assays were performed with 80 μM ICYP for 90 min at room temperature in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.6, 0.5 mM MgCl 2 and 0.05% ascorbic acid.
Les liaisons non-spécifiques sont déterminées comme précisé ci-dessus. Non-specific bonds are determined as specified above.
Après incubation, les coupes de coeur sont lavées trois fois pendant 15 min à 37'C avec un tampon Tris 40 mM, pH 7,6. After incubation, the heart sections are washed three times for 15 minutes at 37 ° C. with a 40 mM Tris buffer, pH 7.6.
L'ICYP lié est visualisé après autoradiographie pendant 9 jours avec un Hyperfilms Amersham. The bound ICYP is visualized after autoradiography for 9 days with Amersham Hyperfilms.
L'analyse quantitative est réalisée par densitométrie à l'aide d'un programme d'analyse statistique et les valeurs obtenues correspondent aux moyennes obtenues à partir de 10 coupes différentes. The quantitative analysis is carried out by densitometry using a statistical analysis program and the values obtained correspond to the averages obtained from 10 different sections.
La surexpression auriculaire du récepteur transgénique est confirmée par cette méthode (figure 6) et montre une augmentation d'un facteur 3,5 du nombre de récepteurs Bl-adrénergiques dans les oreillettes transgéniques, alors qu'il n'y a pas d'augmentation significa tive dans les ventricules (figure 6B). The atrial overexpression of the transgenic receptor is confirmed by this method (Figure 6) and shows a 3.5 fold increase in the number of B1-adrenergic receptors in the transgenic atria, whereas there is no increase significant in the ventricles (Figure 6B).
La figure 6 illustre le taux d'expression élevé du transgène dans le myocarde de souris, visualisé par la liaison spécifique de 1'ICYP sur des sections de coeur ; figure 6A : T représente des coupes de coeurs de souris transgéniques et N représente des coupes de coeurs de souris normales ; la liaison de 1'ICYP total est représenté en T1 et N1 et les liaisons non spécifiques sont représentées en T2 et N2 ; figure 6B : quantification par ordinateur, après lecture des films. Figure 6 illustrates the high level of transgene expression in mouse myocardium visualized by the specific binding of ICYP to core sections; Fig. 6A: T represents sections of hearts of transgenic mice and N represents sections of normal mouse hearts; total ICYP binding is represented at T1 and N1 and nonspecific binding is shown at T2 and N2; FIG. 6B: quantification by computer, after reading the films.
f) Etude de la fonctionnalité des récenteurs ssl-adréneraiaues transaéniaues
Pour vérifier si les récepteurs 131-adréner- giques sont effectivement fonctionnels, des tests de compétition de liaison de 1'ICYP sont réalisés avec l'isoprotérénol, agoniste sélectif vis-à-vis des récepteurs B. f) Study of the functionality of trans-adrenal adrenal transceivers
To verify whether the 131-adrenoceptors are indeed functional, ICYP binding competition assays are performed with isoproterenol, a selective B-receptor agonist.
Les courbes d'inhibition compétitive de l'ICYP sont réalisées, en utilisant des concentrations en iso protérénol comprises entre 10-10 M et 10 4 M, en présence de 20 nM d'ICI 118551, une concentration qui entraîne un blocage total des sites 2 et peuvent s'interpréter par l'existence de deux classes de récepteurs (récepteurs à forte affinité et récepteurs à faible affinité). Les conditions de liaison sont celles décrites ci-dessus, en présence d'un tampon de liaison complémenté avec de l'acide ascorbique 1 mM. The competitive inhibition curves of the ICYP are carried out, using isoproterenol concentrations of between 10 -10 M and 10 -4 M, in the presence of 20 nM of ICI 118551, a concentration which results in complete blocking of the sites. 2 and can be interpreted by the existence of two classes of receptors (high affinity receptors and low affinity receptors). The binding conditions are those described above, in the presence of a binding buffer supplemented with 1 mM ascorbic acid.
Les courbes de compétition obtenues sont illustrées à la figure 7. The competition curves obtained are shown in Figure 7.
L'analyse informatique desdites courbes révèle deux types de sites Bl-adrénergiques pour l'isoprotérénol : sites à forte affinité, avec un KH de 5nM et sites à faible affinité, avec un KL de 400 nM (voir tableau I, ci-après). Computer analysis of these curves reveals two types of B1-adrenergic sites for isoproterenol: high affinity sites, with 5nM KH and low affinity sites, with a KL of 400 nM (see Table I, below). .
Lorsque les résultats sont exprimés en pourcentage de l'inhibition de la liaison, les sites à forte affinité correspondent à 30 % des sites totaux pour les récepteurs transgéniques contre 50 % pour les récepteurs normaux. When the results are expressed as a percentage of the inhibition of binding, the high affinity sites correspond to 30% of the total sites for the transgenic receptors against 50% for the normal receptors.
Lorsque les résultats sont exprimés en fmol/mg de protéine, les sites à forte affinité sont augmentés d'un facteur 3 pour les récepteurs transgéniques par rapport aux récepteurs normaux. When the results are expressed in fmol / mg of protein, sites with high affinity are increased by a factor of 3 for transgenic receptors compared to normal receptors.
TABLEAU I
<tb> <SEP> Sites <SEP> 5-RA <SEP> Sites <SEP> de <SEP> haute <SEP> affinité <SEP> (KH)
<tb> <SEP> totaux
<tb> <SEP> fmol/mg <SEP> W <SEP> <SEP> fmol/mg
<tb> Animaux
<tb> transgéniques
<tb> oreillettes <SEP> 120 <SEP> + <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> + <SEP> 5 <SEP> 35 <SEP> + <SEP> 5
<tb> - <SEP> ventricules <SEP> 6,8
<tb> Animaux <SEP> non
<tb> transgéniques
<tb> - <SEP> oreillettes <SEP> 18 <SEP> + <SEP> 6 <SEP> 50 <SEP> + <SEP> 10 <SEP> 12 <SEP> + <SEP> 3
<tb> ventricules <SEP> 6
<tb>
Ces résultats indiquent que les récepteurs transgéniques peuvent se coupler aux protéines G mais que le taux de récepteurs couplés à la protéine G peut dépendre de la quantité de protéines G libres capable de réagir avec les récepteurs stimulés par l'agoniste.<tb><SEP> Sites <SEP> 5-RA <SEP><SEP> Sites of <SEP> High <SEP> Affinity <SEP> (KH)
<tb><SEP> totals
<tb><SEP> fmol / mg <SEP> W <SEP><SEP> fmol / mg
<tb> Animals
<tb> transgenic
<tb> atria <SEP> 120 <SEP> + <SEP> 30 <SEP> 30 <SEP> + <SEP> 5 <SEP> 35 <SEP> + <SEP> 5
<tb> - <SEP> ventricles <SEP> 6.8
<tb> Animals <SEP> no
<tb> transgenic
<tb> - <SEP> atria <SEP> 18 <SEP> + <SEP> 6 <SEP> 50 <SEP> + <SEP> 10 <SEP> 12 <SEP> + <SEP> 3
<tb> ventricles <SEP> 6
<Tb>
These results indicate that the transgenic receptors can couple to the G proteins but that the level of G protein-coupled receptors may depend on the amount of free G proteins capable of reacting with the agonist-stimulated receptors.
Les récepteurs sont, en outre, fonctionnels. The receivers are, furthermore, functional.
Leur surexpression entraîne une sensibilité accrue du tissu auriculaire aux catécholamines et représente un avantage supplémentaire dans l'utilisation d'animaux porteurs de tels récepteurs, comme modèles de l'arythmie cardiaque.Their overexpression leads to increased sensitivity of the atrial tissue to catecholamines and represents an additional advantage in the use of animals carrying such receptors as models of cardiac arrhythmia.
En effet, la liaison d'un agoniste aux récepteurs '31-adrénergiques, dans les cardiocytes, accroît le taux intracellulaire en AMPc, activant la protéine kinase dépendant de l'AMPc et phosphorylant un peptide associé aux canaux calciques de type L. Indeed, binding of an agonist to adrenergic receptors in cardiocytes increases the intracellular level of cAMP, activating cAMP-dependent protein kinase and phosphorylating a peptide associated with L-type calcium channels.
L'activation des canaux calciques augmente le courant des ions Ca2+ qui initialisent et propagent les potentiels d'action. Activation of calcium channels increases the current of Ca2 + ions that initiate and propagate action potentials.
La stimulation des récepteurs ssl-adrénergiques auriculaires accélère la conduction nodale atrioventriculaire. Ss1-adrenergic atrial receptor stimulation accelerates atrioventricular nodal conduction.
Dans la mesure où la fonction nodale atrioventriculaire joue un rôle crucial dans un certain nombre d'arythmies, comme précisé ci-dessus, ces souris transgéniques surexprimant les récepteurs '31-adrénergiques présentent un intérêt particulier notamment pour l'étude des évènements moléculaires en cascade associés à l'arythmie auriculaire et plus particulièrement pour le criblage et la sélection de médicaments anti-arythmiques in vivo. Since atrioventricular nodal function plays a crucial role in a number of arrhythmias, as mentioned above, these transgenic mice overexpressing the? -Adrenergic receptors are of particular interest in particular for the study of cascade molecular events. associated with atrial arrhythmia and more particularly for the screening and selection of antiarrhythmic drugs in vivo.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. As is apparent from the above, the invention is not limited to those of its modes of implementation, implementation and application which have just been described more explicitly; it encompasses all the variants that may come to the mind of the technician in the field, without departing from the scope or scope of the present invention.
Claims (4)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9209946A FR2694765A1 (en) | 1992-08-12 | 1992-08-12 | Hybrid nucleic acid sequence, non-human transgenic mammals having such a sequence and their applications as well as method for producing said mammals. |
| PCT/FR1993/000797 WO1994004668A1 (en) | 1992-08-12 | 1993-08-06 | Regulation of the sinusal rhythm by a human membrane receptor sequence |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9209946A FR2694765A1 (en) | 1992-08-12 | 1992-08-12 | Hybrid nucleic acid sequence, non-human transgenic mammals having such a sequence and their applications as well as method for producing said mammals. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2694765A1 true FR2694765A1 (en) | 1994-02-18 |
Family
ID=9432803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9209946A Pending FR2694765A1 (en) | 1992-08-12 | 1992-08-12 | Hybrid nucleic acid sequence, non-human transgenic mammals having such a sequence and their applications as well as method for producing said mammals. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2694765A1 (en) |
| WO (1) | WO1994004668A1 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1007560A1 (en) * | 1997-02-14 | 2000-06-14 | Törnell, Jan | Method for screening and transgenic model |
| US6218597B1 (en) * | 1997-04-03 | 2001-04-17 | University Technology Corporation | Transgenic model and treatment for heart disease |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0351921A2 (en) * | 1988-07-22 | 1990-01-24 | Merck & Co. Inc. | Modified beta adrenergic receptor |
| EP0453119A1 (en) * | 1990-04-03 | 1991-10-23 | Merck & Co. Inc. | Modified beta adrenergic receptor |
| WO1992012246A1 (en) * | 1991-01-14 | 1992-07-23 | Centre National De La Recherche Scientifique-Cnrs | Nucleotidic sequences coding for the murine adrenergic beta 3 receiver and applications thereof |
-
1992
- 1992-08-12 FR FR9209946A patent/FR2694765A1/en active Pending
-
1993
- 1993-08-06 WO PCT/FR1993/000797 patent/WO1994004668A1/en active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0351921A2 (en) * | 1988-07-22 | 1990-01-24 | Merck & Co. Inc. | Modified beta adrenergic receptor |
| EP0453119A1 (en) * | 1990-04-03 | 1991-10-23 | Merck & Co. Inc. | Modified beta adrenergic receptor |
| WO1992012246A1 (en) * | 1991-01-14 | 1992-07-23 | Centre National De La Recherche Scientifique-Cnrs | Nucleotidic sequences coding for the murine adrenergic beta 3 receiver and applications thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1994004668A1 (en) | 1994-03-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wikström et al. | Abnormal heart rate and body temperature in mice lacking thyroid hormone receptor α1 | |
| Kuang et al. | Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. | |
| Lin et al. | Genetic exploration of the role of acid-sensing ion channels | |
| Kittleson et al. | The genetic basis of hypertrophic cardiomyopathy in cats and humans | |
| Dalloz et al. | Manipulating the contractile apparatus: genetically defined animal models of cardiovascular disease | |
| Kim et al. | Genetic models for non insulin dependent diabetes mellitus in rodents | |
| FR2694765A1 (en) | Hybrid nucleic acid sequence, non-human transgenic mammals having such a sequence and their applications as well as method for producing said mammals. | |
| US6753456B2 (en) | Point mutant mice with hypersensitive alpha 4 nicotinic receptors: dopaminergic pathology and increased anxiety | |
| Kaneda et al. | A novel β-myosin heavy chain gene mutation, p. Met531Arg, identified in isolated left ventricular non-compaction in humans, results in left ventricular hypertrophy that progresses to dilation in a mouse model | |
| JP7061312B2 (en) | Multiple system atrophy model animal | |
| J. Babu et al. | Transgenic mouse models for cardiac dysfunction by a specific gene manipulation | |
| EP1315417B1 (en) | Mutant non-human mammal for expressing the alpha6 acetylcholine nicotinic receptor subunit and use for screening substances capable of interacting with said receptor | |
| JP2000510001A (en) | Transgenic animal having a disrupted NPY Y1 receptor gene | |
| Alvarez | Genetic basis for circadian rhythms in mammals | |
| JP2003199460A (en) | Transgenic mouse of parkinson's disease model | |
| FR2761576A1 (en) | NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMAL IN WHICH EXPRESSION OF THE GENE CODING FOR INSULIN IS SUPPRESSED | |
| WO2004092371A1 (en) | Mouse with deficiency of glutamate trasnporter glast function | |
| JP6323876B2 (en) | Knock-in mouse | |
| KR100635865B1 (en) | /-105 Transgenic dementia mice expressing the mutagenic APP/C-105 gene | |
| Krieger | Fuctional analysis of Hoxa5: Analysis of structural, behavioral, and molecular effects of Hoxa5 overexpression in transgenic line Hoxa5SV2 | |
| WO1996034094A1 (en) | Non-human transgenic animal with modified d2 receptor expression | |
| Lu | Physiological studies of mice lacking alpha-calcitonin gene-related peptide | |
| JING | FUNCTIONAL ROLE OF RNA EDITING OF CAV1. 3 IQ DOMAIN | |
| FR2845245A1 (en) | Transgenic animal model of Parkinson's disease, useful in screening for agents effective against neurodegenerative diseases, contains a parkin gene with a deletion in exon 3 | |
| Jerez | Fine-mapping of quantitative trait loci with large effects on growth and fatness on mouse chromosome 2 |