FR2689904A1 - Testing effect of stimulation, e.g. by UV radiation or chemical on tanning - using human epidermis reconstituted by cell culture - Google Patents
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Abstract
Description
ETAT DE LA TECHNIQUE:
A) LES EPIDEPNES RECONSTITUEES IN VITRO
Afin de pouvoir reproduire in vitro toutes les caractéristiques et étapes de la différenciation épidermique terminale, les conditions de culture doivent se rapprocher le plus possible de l'environnement naturel de l'épiderme.STATE OF THE ART:
A) EPIDEPNES RECONSTITUTED IN VITRO
In order to be able to reproduce in vitro all the characteristics and stages of terminal epidermal differentiation, the culture conditions must be as close as possible to the natural environment of the epidermis.
Par conséquent, après confluence, les cultures doivent être exposées à l'air et le milieu nutritif doit traverser le substrat pour parvenir par le bas aux cellules prolifératives de la première couche. Plusieurs systèmes de culture comprennent l'utilisation de substrats dermiques ou pseudodermiques, tandis que d'autres se contentent de substrat constitués par des filtres chimiquement inertes, recouverts ou non d'une matrice extracellulaire pouvant favoriser l'attachement cellulaire.Therefore, after confluence, the cultures must be exposed to air and the nutrient medium must pass through the substrate to reach the proliferative cells of the first layer from below. Several culture systems include the use of dermal or pseudodermal substrates, while others are satisfied with substrate constituted by chemically inert filters, covered or not with an extracellular matrix which can promote cell attachment.
Dans ces systèmes, on obtient la formation d'un vrai stratum corneum, c'est à dire une différenciation épidermique apparemment complète avec présence de toutes les couches cellulaires successives caractéristiques, et l'expression des marqueurs biochimiques essentiels. In these systems, the formation of a true stratum corneum is obtained, that is to say an apparently complete epidermal differentiation with the presence of all the successive characteristic cellular layers, and the expression of essential biochemical markers.
Le système de culture sur derme désépidermisé présente l'avantage de garder une membrane basale intacte comme surface d'attachement des kératinocytes tout en éliminant les interférences dues aux fibroblastes du derme, puisque ces derniers sont "tués" par congélations successives (Régnier et coll., 1981,1989; Pruniéras et coll., 1983a,b). The culture system on de-epidermalized dermis has the advantage of keeping an intact basement membrane as attachment surface for keratinocytes while eliminating interference due to fibroblasts of the dermis, since the latter are "killed" by successive freezing (Régnier et al. , 1981, 1989; Pruniéras et al., 1983a, b).
Le système de Bell: L'équivalent de derme est préparé en incluant des fibroblastes vivants dans une matrice de collagène qui est modifiée et contractée par ces cellules résidentes. Des kératinocytes sont cultivés à la surface de ces substrats qui sont alors exposés à l'air au moyen de grilles en acier inoxydable (Bell et coll., 1983). Ces peaux reconstruites, en présence de 10% de sérum dans le milieu, expriment tous les principaux marqueurs de la différenciation épidermique, mais leur localisation précise dans les différentes couches cellulaires ne correspond pas tout à fait à celle observée dans l'épiderme in vivo (Asselineau et coll., 1985). De plus, certains antigènes des cellules basales ne sont pas polarisés comme in vivo (Asselineau et coll., 1986).Récemment le système a été perfectionné en ajustant la concentration en acide rétinoique à 10 9 M, grâce à l'utilisation d'un sérum délipidisé: l'expression des différents marqueurs ressemble alors fortement à la situation normale in vivo (Asselineau et coll., 1989). The Bell system: The dermis equivalent is prepared by including living fibroblasts in a collagen matrix which is modified and contracted by these resident cells. Keratinocytes are cultured on the surface of these substrates which are then exposed to the air by means of stainless steel grids (Bell et al., 1983). These reconstructed skins, in the presence of 10% serum in the medium, express all the main markers of epidermal differentiation, but their precise location in the different cell layers does not quite correspond to that observed in the epidermis in vivo ( Asselineau et al., 1985). In addition, certain antigens of the basal cells are not polarized as in vivo (Asselineau et al., 1986). Recently the system has been improved by adjusting the concentration of retinoic acid to 10 9 M, through the use of a delipidized serum: the expression of the different markers then strongly resembles the normal situation in vivo (Asselineau et al., 1989).
Le même substrat de derme-équivalent a servi pour l'obtention, à partir de follicules de cheveux humains exposé à l'interface air-liquide, d'un épiderme in vitro présentant tous les aspects de la différenciation épidermique (Lenoir et coll., 1988). Ce travail est en accord avec l'observation courante que les racines des poils qui subsistent dans une plaie après un traumatisme sont capables de régénérer un épiderme interfolliculaire normalement différencié. D'autres chercheurs cultivent des kératinocytes sur ces mêmes lattices de Bell, mais en culture d'organe, c'est à dire en y incorporant une biopsie de peau humaine (Coulomb et coll.,1986; 1989). The same dermis-equivalent substrate was used to obtain, from human hair follicles exposed to the air-liquid interface, an epidermis in vitro having all the aspects of epidermal differentiation (Lenoir et al., 1988). This work is in agreement with the current observation that the hair roots which remain in a wound after a trauma are capable of regenerating a normally differentiated interfollicular epidermis. Other researchers cultivate keratinocytes on these same Bell lattices, but in organ culture, that is to say by incorporating a biopsy of human skin (Coulomb et al., 1986; 1989).
D'autres systèmes consistent à inoculer des cellules épidermiques sur des films ou gels de collagène, des filtres en nylon ou de nitrocellulose couverts ou non de collagène ou d'équivalent de membrane basale déposé par des cellules endothéliales de boeuf, puis d'exposer ces cultures à l'air pour 14 à 21, ou même 65 jours (Fusenig et coll.,1983;
Bernstam et coll.,l990; Vaughan et coll.,1986; Lillie et coll.,1980,1988). Other systems consist in inoculating epidermal cells on collagen films or gels, nylon or nitrocellulose filters covered or not with collagen or equivalent of basement membrane deposited by beef endothelial cells, then exposing these air cultures for 14 to 21, or even 65 days (Fusenig et al., 1983;
Bernstam et al., 1990; Vaughan et al., 1986; Lillie et al., 1980, 1988).
Un des points communs de tous ces systèmes de culture épidermique tridimensionnelle est l'exposition à l'air, qui semble essentielle pour la formation d'une couche cornée in vitro; mais surtout toutes ces cultures ont été réalisées en présence de sérum dans le milieu de culture, estimée nécessaire pour arriver à la différenciation terminale complète.Or, pour estimer ou mesurer l'influence de facteurs ou produits cosmétiques ou pharmaceutiques (tels que les retinoïdes, ou des extraits organiques de toutes origines) sur le métabolisme et la différenciation épidermiques en culture, il faut pouvoir utiliser des concentrations parfois infimes (10 12 M, par exemple) de ces facteurs, et donc disposer d'un environnement (milieu et support) de culture chimiquement défini, où les interférences dues aux molécules présent dans le sérum sont impossible. One of the common points of all these three-dimensional epidermal culture systems is exposure to air, which seems essential for the formation of a stratum corneum in vitro; but above all all these cultures were carried out in the presence of serum in the culture medium, considered necessary to arrive at complete terminal differentiation. However, to estimate or measure the influence of cosmetic or pharmaceutical factors or products (such as retinoids, or organic extracts of all origins) on epidermal metabolism and differentiation in culture, it must be possible to use sometimes minute concentrations (10 12 M, for example) of these factors, and therefore have an environment (medium and support) chemically defined culture, where interference from molecules in the serum is impossible.
Une différenciation épidermique terminale complète de kératinocytes humains cultivés en milieu chimiquement défini sur des substrats constitués par des filtres inertes à l'interface air-liquide est décrite dans la demande de brevet français n" 2665175 du 27.07.1990 (Rosdy et Clauss, 1990):
Un épithélium totalement différencié ayant les caractéristiques de l'épiderme a été obtenu in vitro en cultivant des kératinocytes humains normaux (KHN) dans un milieu chimiquement défini sur des substrats de filtres inertes à l'interface air-liquide.Des coupes verticales doublement colorées et des études d'immunofluorescence indirecte ont montré la stratification et l'expression correctes de marqueurs protéiques de la différenciation; l'analyse par microscopie électronique montre la présence de desmosomes, de granules de kératohyaline, de corps lamellaires extrudant leur contenu lipidique et la formation d'un stratum corneum de dix couches. De plus, tous les lipides typiques de l'épiderme humain stratifié étaient présents dans ces cultures, notamment les céramides, qui sont probablement responsables de la relative imperméabilité du stratum corneum. A complete terminal epidermal differentiation of human keratinocytes cultured in a chemically defined medium on substrates constituted by inert filters at the air-liquid interface is described in French patent application No. 2665175 of July 27, 1990 (Rosdy and Clauss, 1990) :
A fully differentiated epithelium having the characteristics of the epidermis was obtained in vitro by culturing normal human keratinocytes (KHN) in a chemically defined medium on inert filter substrates at the air-liquid interface. indirect immunofluorescence studies have shown correct stratification and expression of protein markers of differentiation; analysis by electron microscopy shows the presence of desmosomes, keratohyaline granules, lamellar bodies extruding their lipid content and the formation of a ten-layer stratum corneum. In addition, all the lipids typical of the stratified human epidermis were present in these cultures, in particular ceramides, which are probably responsible for the relative impermeability of the stratum corneum.
B) LA PRESENCE DE MELANOCYTES FONCTIONNELS DANS LES
éPIDERMES RECONSTITUES
Lorsqu'on isole des cellules épidermiques à partir d'un échantillon de peau, on recueille une suspension constituée en grande majorité de kératinocytes, mais aussi d'un petit nombre de mélanocytes. Le rapport entre les deux types cellulaires que l'on obtient varie beaucoup selon les différents échantillons de peau.B) THE PRESENCE OF FUNCTIONAL MELANOCYTES IN THE
RECONSTRUCTED EPIDERMICS
When epidermal cells are isolated from a skin sample, a suspension consisting mainly of keratinocytes, but also of a small number of melanocytes, is collected. The ratio between the two cell types that one obtains varies a lot according to the different skin samples.
Ainsi, dans les cultures de kératinocytes sur couche nourritrice de fibroblastes irradiés et en présence de 10% de sérum (système développé par Howard Green à Boston;
Rheinwald et Green,1975) on peut détecter des mélanocytes fonctionnels, c'est à dire qui sont capables de transférer des mélanosomes aux kératinocytes (DeLuca et coll., 1988).Thus, in cultures of keratinocytes on a nourishing layer of irradiated fibroblasts and in the presence of 10% of serum (system developed by Howard Green in Boston;
Rheinwald and Green, 1975) functional melanocytes can be detected, ie which are capable of transferring melanosomes to keratinocytes (DeLuca et al., 1988).
Ces cultures forment des feuillets de 3 à 4 couches cellulaires où le nombre de mélanocytes présents est aléatoire, donc n'est pas contrôlé. C'est le cas également pour le système de culture d'organe entier, bien qu'il permette la constitution d'équivalents épidermiques plus complets, toujours en présence de 10% de sérum dans le milieu de culture (Topol et coll., 1986). Sur de telles cultures d'organe, c'est à dire des excroissances à partir d'une biopsie de peau entière, la stimulation de la mélanogénèse a été décrite (Bertaux et coll., 1988). La prolifération des mélanocytes y est stimulée par les rayons
UV-B, W-A, ainsi qu'en présence de psoralènes, mais la densité de mélanocytes ne peut être contrôlée, donc la mélanogénèse ne peut être normalisée dans ce système. These cultures form sheets of 3 to 4 cell layers where the number of melanocytes present is random, therefore is not controlled. This is also the case for the whole organ culture system, although it allows the constitution of more complete epidermal equivalents, always in the presence of 10% serum in the culture medium (Topol et al., 1986 ). On such organ cultures, ie growths from a whole skin biopsy, stimulation of melanogenesis has been described (Bertaux et al., 1988). The proliferation of melanocytes is stimulated by the rays
UV-B, WA, as well as in the presence of psoralens, but the density of melanocytes cannot be controlled, therefore melanogenesis cannot be normalized in this system.
Un autre système de coculture (Scott et Haake, 1991;
Haake et Scott, 1991) permet en revanche d'étudier les conséquences de différents rapports mélanocyte/kératinocyte à l'ensemencement. Mais ce système nécessite également 10% de sérum dans le milieu de culture, ainsi qu'un derme artificiel contenant des fibroblastes de nouveau-né. En plus, les cellules utilisées ne sont pas adultes, mais proviennent de tissus de donneurs nouveau-nés, constituant des épidermes en culture qui diffèrent notablement de l'épiderme adulte.Another coculture system (Scott and Haake, 1991;
Haake and Scott, 1991), on the other hand, makes it possible to study the consequences of different melanocyte / keratinocyte relationships during seeding. However, this system also requires 10% serum in the culture medium, as well as an artificial dermis containing fibroblasts from newborns. In addition, the cells used are not adults, but come from tissues of newborn donors, constituting epidermis in culture which differ significantly from the adult epidermis.
La stimulation de la mélanogénèse en culture n'a été décrite que sur des cultures immergées de mélanocytes pures, c'est à dire en absence de kératinocytes, ce qui est très loin de la situation épidermique in vivo (Libow et coll., 1988). En effet, les kératinocytes semblent contrôler par des mécanismes paracrines la prolifération et la différenciation (mélanogénèse) des mélanocytes humains (Yaar et coll., 1991), donc leur présence active est indispensable à la reconstitution normalisée de la mélanogénèse. The stimulation of melanogenesis in culture has only been described on submerged cultures of pure melanocytes, that is to say in the absence of keratinocytes, which is very far from the epidermal situation in vivo (Libow et al., 1988) . Indeed, keratinocytes seem to control by paracrine mechanisms the proliferation and differentiation (melanogenesis) of human melanocytes (Yaar et al., 1991), therefore their active presence is essential for the normalized reconstitution of melanogenesis.
C) TESTS DE BRONZAGE
L'efficacité des produits de protection ou de stimulation solaires est testée couramment in vivo: les modèles animaux (cobaye, rat, souris) présentent l'avantage de pouvoir normaliser les séries de sujets, mais la peau des animaux est plus vulnérable à cause de la plus grande finesse de leur couche cornée et de l'absence de pigments mélaniques.C) TANNING TESTS
The effectiveness of sun protection or stimulation products is commonly tested in vivo: animal models (guinea pig, rat, mouse) have the advantage of being able to normalize the series of subjects, but the skin of animals is more vulnerable because of the greater fineness of their horny layer and the absence of melanin pigments.
Les essais chez l'homme restent les plus probants. La diversité de réactivité de la peau humaine aux rayons ultraviolets implique un grand échantillonage de sujets, ce qui revient très cher. Human trials remain the most convincing. The diversity of reactivity of human skin to ultraviolet rays implies a large sampling of subjects, which is very expensive.
L'appréciation clinique des résultats (sur l'animal ou chez l'homme) se fait couramment à l'oeil nu par 2 observateurs indépendants qui ne connaissent pas les conditions d'application et d'irradiations. Cette observation visuelle semble rester le moyen le plus sûr et le plus sensible, mais des techniques de mesure instrumentale de la couleur de la peau ont récemment été publiées (Chardon et coll. 1991). The clinical assessment of the results (on animals or in humans) is commonly done with the naked eye by 2 independent observers who do not know the conditions of application and irradiation. This visual observation seems to remain the safest and most sensitive means, but techniques for the instrumental measurement of skin color have recently been published (Chardon et al. 1991).
L'INVENTION:
Test de bronzage épidermique humain in vitro.THE INVENTION:
In vitro human epidermal tanning test.
L'invention décrite ici consiste en un test de bronzage utilisant des épidermes humains adultes reconstitués par culture cellulaire en milieu défini. Le bronzage des épidermes reconstruits par culture en milieu chimiquement défini à l'interface air-liquide est évalué par la mesure quantitative de la production et sécrétion de grains de mélanine (mélanosomes) par les melanocytes présents dans ces cultures, et de leur transfert et distribution dans les kératinocytes environnants. The invention described here consists of a tanning test using adult human epidermis reconstituted by cell culture in a defined medium. The tan of epidermis reconstructed by culture in a chemically defined medium at the air-liquid interface is evaluated by the quantitative measurement of the production and secretion of melanin grains (melanosomes) by the melanocytes present in these cultures, and of their transfer and distribution. in the surrounding keratinocytes.
La grande reproductibilité de l'aspect et des qualités biochimiques des épidermes reconstitués décrits, qui est due à l'emploi exclusif de milieux définis, permet de comparer les effets d'une stimulation (rayons UV, activateur chimique, etc...) avec une grande précision sur un nombre important d'échantillons produits en parallèle. Par cette uniformité des épidermes obtenus on peut en effet surmonter le problême des variations importantes du bronzage in vivo selon les endroits du corps, et donc normaliser le bronzage in vitro. De plus, on peut obtenir un très grand nombre d'équivalents d'épiderme qui ont tous le même comportement, c'est à dire la même intensité de bronzage, après irradiation aux rayons UV par exemple.Ceci permet de tester en parallèle un grand nombre de produits (ou de concentrations de produits) à usage cosmétique ou pharmaceutique censés interférer (freiner, inhiber ou stimuler) avec le bronzage de la peau humaine. The high reproducibility of the appearance and the biochemical qualities of the reconstructed epidermis described, which is due to the exclusive use of defined media, makes it possible to compare the effects of stimulation (UV rays, chemical activator, etc.) with great precision on a large number of samples produced in parallel. By this uniformity of the epidermis obtained, it is indeed possible to overcome the problem of significant variations in tanning in vivo according to the locations of the body, and therefore to normalize tanning in vitro. In addition, a very large number of skin equivalents can be obtained which all have the same behavior, i.e. the same tanning intensity, after irradiation with UV rays for example. This makes it possible to test in parallel a large number of products (or concentrations of products) for cosmetic or pharmaceutical use intended to interfere (curb, inhibit or stimulate) with the tanning of human skin.
L'intensité de la pigmentation des épidermes reconstitués en culture et donc la production et la distribution de mélanine après stimulation par des rayons W (ou d'autres stimulants physiques ou chimiques) est quantifiée et calibrée par des témoins négatifs et positifs appropriés pour chaque série d'épidermes reconstitués produits. Ainsi standardisés, ces équivalents d'épiderme humain sont utilisés pour des tests comparatifs reproductibles de produits favorisant, freinant ou inhibant le bronzage de la peau. Ces produit à tester peuvent être appliqués directement sur la couche cornée des épidermes reconstitués et/ou ajoutés au milieu de culture qui nourrit les cellules à travers le support qui sert de substrat aux cultures.Dans le premier cas, le test simule l'application topique sur la peau, dans le second cas le test simule les effets systémiques, c'est à dire après ingestion du produit. The intensity of the pigmentation of the epidermis reconstituted in culture and therefore the production and distribution of melanin after stimulation by W rays (or other physical or chemical stimulants) is quantified and calibrated by negative and positive controls appropriate for each series. of reconstructed epidermis produced. Thus standardized, these equivalents of human epidermis are used for reproducible comparative tests of products promoting, slowing down or inhibiting tanning of the skin. These test products can be applied directly to the stratum corneum of the reconstituted epidermis and / or added to the culture medium which nourishes the cells through the support which serves as a substrate for the cultures. In the first case, the test simulates the topical application on the skin, in the second case the test simulates the systemic effects, ie after ingestion of the product.
Les eventuels effets cytotoxiques d'un produit à tester sur les cellules épidermiques peuvent être détectés parallèlement. The possible cytotoxic effects of a product to be tested on epidermal cells can be detected in parallel.
MéTHODES D'OBTENTION
Les équivalents d'épiderme sont obtenus par ensemencement sur des substrats inertes ou collagèneux d'un nombre donné de kératinocytes humains adultes normaux et d'un nombre donné de mélanocytes humains adultes normaux.METHODS OF OBTAINING
The skin equivalents are obtained by seeding on inert or collagenous substrates a given number of normal adult human keratinocytes and a given number of normal adult human melanocytes.
Ces deux types cellulaires doivent être isolés auparavant à partir d'échantillons de peau humaine saine, et leur nombre amplifié par culture en immersion classique dans un milieu de culture chimiquement défini qui permet leur prolifération rapide, sur un ou plusieurs passages. Ensuite ces stocks de cellules (kératinocytes et mélanocytes) sont congelés et des échantillons sont décongelés selon les besoins, oubien ils sont utilisés directement pour la fabrication des épidermes reconstitués. Après trypsination, les concentrations cellulaires de chacune des suspensions (kératinocytes et mélanocytes) sont ajustées pour permettre l'ensemencement du mélange dans un petit volume de milieu défini en respectant le rapport voulu de mélanocytes sur kératinocytes. Plus le nombre de cellules totales est petit, plus le rapport mélanocytes sur kératinocytes doit tendre vers 1.Quand la 5 2 densité de l'ensemencement dépasse 5X105 cellules par cm ce rapport doit être inférieur ou égal à 1/2. Ceci est dû au fait que, contrairement aux kératinocytes, les mélanocytes ne se divisent que rarement dans les cultures d'épidermes reconstitués (comme dans l'épiderme in vivo), donc leur densité d'ensemencement doit être déterminée avec précision.These two cell types must be isolated beforehand from samples of healthy human skin, and their number amplified by culture in conventional immersion in a chemically defined culture medium which allows their rapid proliferation, on one or more passages. Then these stocks of cells (keratinocytes and melanocytes) are frozen and samples are thawed as required, or else they are used directly for the manufacture of reconstituted epidermis. After trypsination, the cell concentrations of each of the suspensions (keratinocytes and melanocytes) are adjusted to allow the seeding of the mixture in a small volume of defined medium while respecting the desired ratio of melanocytes to keratinocytes. The smaller the number of total cells, the more the melanocyte to keratinocyte ratio should tend towards 1. When the 5 2 density of the seeding exceeds 5 × 105 cells per cm this ratio must be less than or equal to 1/2. This is due to the fact that, unlike keratinocytes, melanocytes only rarely divide in reconstituted epidermis cultures (as in the epidermis in vivo), therefore their seeding density must be determined with precision.
Alternativement, les mélanocytes peuvent être ensemencés avant les kératinocytes. Alternatively, the melanocytes can be seeded before the keratinocytes.
Des mélanocytes provenant d'un autre échantillon de peau (d'un autre donneur) que les kératinocytes peuvent être coensemencés avec ces derniers. Après avoir atteint la confluence, les cultures sont exposées à l'interface air/milieu de culture en hissant les substrats de culture sur des supports inertes permettant le flux du milieu jusqu'à la face inférieure de ces substrats. Après au minimum 2 jours de culture sur un milieu chimiquement défini, les cultures sont irradiées aux rayons UV à l'aide d'un irradiateur de laboratoire: Des irradiations répétées de UV-A et/ou UV-B sont effectuées en présence des produits à tester ainsi que de témoins négatifs et positifs. Le témoin négatif peut être une crême cosmétique classique qui n'interagit pas avec la stimulation du bronzage par les rayons UV, tandis que le témoin positif peut être par exemple une crême cosmétique de protection filtrant les rayons UV oubien, au contraire renforçant les effets des rayons UV (par exemple: contenant des psoralènes). Melanocytes from another skin sample (from a different donor) than keratinocytes can be co-seeded with the latter. After reaching confluence, the cultures are exposed to the air / culture medium interface by hoisting the culture substrates on inert supports allowing the flow of the medium to the underside of these substrates. After at least 2 days of culture on a chemically defined medium, the cultures are irradiated with UV rays using a laboratory irradiator: Repeated irradiations of UV-A and / or UV-B are carried out in the presence of the products to be tested as well as negative and positive controls. The negative control can be a conventional cosmetic cream which does not interact with the stimulation of tanning by UV rays, while the positive control can for example be a cosmetic protective cream which filters UV rays or well, on the contrary reinforcing the effects of UV rays (for example: containing psoralens).
Les effets des stimulations (exemple: rayons UV) sur les épidermes reconstitués dans ces différentes conditions expérimentales sont ensuite caractérisés et/ou quantifiés selon plusieurs méthodes: -mesure du nombre de grains de mélanine dans un certain
nombre de coupes verticales colorées des cultures par
analyse d'images assistée par ordinateur.The effects of the stimulations (example: UV rays) on the skin reconstructed under these different experimental conditions are then characterized and / or quantified according to several methods: -measurement of the number of melanin grains in a certain
number of colored vertical sections of crops by
computer-assisted image analysis.
-mesure du contenu en mélanine des homogénats de cultures
par des techniques biochimiques. -measurement of the melanin content of homogenates of cultures
by biochemical techniques.
-mesure de l'activité de la tyrosinase épidermique contenue
dans les cultures par techniques biochimiques.-measurement of the activity of the epidermal tyrosinase contained
in cultures by biochemical techniques.
-mesure du nombre de mélanocytes présents et de leur
localisation dans les cultures par coloration à la DOPA,
par des techniques d'immunofluorescence indirecte ou de
microscopie électronique.-measurement of the number of melanocytes present and their
localization in cultures by staining with DOPA,
by indirect immunofluorescence techniques or
electron microscopy.
-mesure instrumentale de la couleur par colorimétrie
qui tient compte de l'équilibre variable entre les
différents pigments et leur états physico-chimiques.- instrumental color measurement by colorimetry
which takes into account the variable balance between
different pigments and their physico-chemical states.
-toute autre technique permettant d'évaluer précisément
l'intensité de bronzage obtenu.- any other technique allowing precise evaluation
the intensity of tanning obtained.
Les intensités et les durées de stimulation nécessaires pour induire une synthèse accrue détectable de grains de mélanine et leur transfert dans les kératinocytes environnants varient en fonction de la race et de l'âge du donneur de cellules initial: La calibration du test est donc nécessaire chaque fois que les cellules d'un autre donneur sont utilisées. Pour réduire ces variations dûes aux donneurs de peau, on peut établir des stocks de cellules (kératinocytes et mélanocytes séparément) où les cellules de plusieurs donneurs sont mélangées. Ceci apporte aussi l'avantage de disposer de stocks cellulaires plus importants, donc de pouvoir effectuer un plus grand nombre de cultures à partir d'un même stock. Mais chacune des séries de cultures d'épidermes reconstitués doit néanmoins être caractérisée et contrôlée par l'utilisation de témoins négatifs et positifs. The intensities and durations of stimulation necessary to induce an increased detectable synthesis of melanin grains and their transfer into the surrounding keratinocytes vary according to the race and age of the initial cell donor: The calibration of the test is therefore necessary each once another donor's cells are used. To reduce these variations due to skin donors, it is possible to establish cell stocks (keratinocytes and melanocytes separately) where the cells of several donors are mixed. This also brings the advantage of having larger cell stocks, therefore being able to carry out a greater number of cultures from the same stock. However, each series of reconstituted epidermis cultures must nevertheless be characterized and controlled by the use of negative and positive controls.
EXEMPLE
Des échantillons de peau adulte saine sont fournis par un service chirurgical après une opération de réduction mammaire. L'épiderme est séparé du derme avec 0.25% de trypsine dans une solution saline oubien d'abord par l'action de la dispase ou de la collagènase. Après comptage, la suspension cellulaire est diluée dans un milieu de culture défini favorisant l'attachement et la croissance soit des mélanocytes (Pittelkow et Shipley, 1989), soit des kératinocytes (Boyce et Ham, 1983). La prolifération des mélanocytes est stimulée dans un milieu défini par la présence de facteurs de croissance tels que le basic-FGF (fibroblast growth factor), l'insuline, et le TPA (l2-O-tetradecanoyl phorbol 13-acetate) qui par ailleurs inhibe la prolifération des kératinocytes présents en induisant leur différenciation terminale irréversible.La croissance des kératinocytes est stimulée par l'insuline, 1'EGF (epidermal growth factor) et l'hydrocortisone. Ce dernier type de milieu permet cependant la survie des mélanocytes: ceci permet d'isoler les mélanocytes après quelques jours de culture mixte à l'aide d'une trypsination différentielle: les mélanocytes se détachent en effet beaucoup plus rapidement que les kératinocytes. Le milieu défini utilisé est soit le MCDB 153 (Boyce et Ham,1983), soit un milieu préparé à partir de DMEM (Dulbecco's modified
Eagle's Medium) et de milieu de Ham F-12. Avant le dernier passage, les mélanocytes sont sevrés de TPA pendant plusieurs jours.Après un certain nombre de passages et avant d'atteindre la confluence, les cellules sont trypsinées, comptées, et ensemencées dans un rapport 5 1/2 2 mélanocytes/kératinocytes 1/2 à une densité de 105 par cm sur des filtres en polycarbonate. Les milieux sont changés tous les deux-trois jours. Après avoir atteint la confluence, les cultures sont hissées à l'interface air-liquide sur des grilles en inox ou des pastilles en fibre de verre. Le milieu de culture n'arrive alors plus que par le bas à travers le filtre jusqu'à la couche basale des cultures.Après 14 jours de culture ainsi émergée, certains épidermes reconstruits sont fixées dans une solution de formol, puis inclus dans des blocs paraffine, d'autres sont congelés dans l'azote liquide et stockés à -80 C, d'autres sont inclus dans des blocs de résine pour la microscopie électronique, d'autres encore sont homogénéisés et traités pour la mesure biochimique des activités tyrosinase et de la mélanine. Sur des coupes paraffines la coloration Fontana
Mas son permet de distinguer les différentes couches cellulaires formées et de visualiser et de compter (par analyse d'image assistée par ordinateur) les grains de mélanine présents. Dans les cultures non stimulées, les mélanocytes contenant des grains de mélanine se situent surtout dans la première couche cellulaire, comme in vivo, alors que les kératinocytes n'en contiennent pas.La stimulation par irradiation aux UV-B (à partir du jour 10, 4 fois 100mCoules/jour) induit une distribution beaucoup plus homogène des grains de mélanine, puisque pratiquement toutes les cellules des deux trois premières couches en contiennent. L'analyse d'image sur plusieurs coupes parallèles montre une augmentation de la quantité de mélanine présente de l'ordre de 45 fois le niveau contrôle.EXAMPLE
Samples of healthy adult skin are provided by a surgical department after a breast reduction operation. The epidermis is separated from the dermis with 0.25% of trypsin in a saline solution, first by the action of dispase or collagenase. After counting, the cell suspension is diluted in a defined culture medium promoting attachment and growth either of melanocytes (Pittelkow and Shipley, 1989) or of keratinocytes (Boyce and Ham, 1983). The proliferation of melanocytes is stimulated in an environment defined by the presence of growth factors such as basic-FGF (fibroblast growth factor), insulin, and TPA (12-O-tetradecanoyl phorbol 13-acetate) which, moreover, inhibits the proliferation of keratinocytes present by inducing their irreversible terminal differentiation. The growth of keratinocytes is stimulated by insulin, EGF (epidermal growth factor) and hydrocortisone. This latter type of medium, however, allows the melanocytes to survive: this makes it possible to isolate the melanocytes after a few days of mixed culture using differential trypsination: the melanocytes detach themselves much faster than keratinocytes. The defined medium used is either MCDB 153 (Boyce and Ham, 1983), or a medium prepared from DMEM (Dulbecco's modified
Eagle's Medium) and middle of Ham F-12. Before the last passage, the melanocytes are weaned from TPA for several days. After a certain number of passages and before reaching confluence, the cells are trypsinized, counted, and seeded in a 5 1/2 2 melanocyte / keratinocyte 1 ratio. / 2 at a density of 105 per cm on polycarbonate filters. The media are changed every two to three days. After reaching the confluence, the cultures are hoisted at the air-liquid interface on stainless steel grids or fiberglass pellets. The culture medium then only reaches the bottom through the filter to the basal layer of cultures. After 14 days of culture thus emerged, some reconstructed epidermis are fixed in a formalin solution, then included in blocks paraffin, others are frozen in liquid nitrogen and stored at -80 C, others are included in resin blocks for electron microscopy, still others are homogenized and treated for the biochemical measurement of tyrosinase activities and melanin. Fontana coloring on paraffin cups
Mas son makes it possible to distinguish the different cellular layers formed and to visualize and count (by computer-assisted image analysis) the melanin grains present. In unstimulated cultures, melanocytes containing melanin grains are mainly located in the first cell layer, as in vivo, while keratinocytes do not contain them.Stimulation by UV-B irradiation (from day 10 , 4 times 100mCoules / day) induces a much more homogeneous distribution of the melanin grains, since practically all the cells of the first two or three layers contain it. Image analysis on several parallel sections shows an increase in the amount of melanin present in the order of 45 times the control level.
L'application topique préalable d'une goutte de 20~1 de crême solaire à filtre UV total avant chaque irradiation empêche à 89% (+/- 5%) cette mélanogénèse induite par les
UV-B. L'irradiation aux UV-A (4 fois 2.5 Joules/jour) en présence et absence de psoralène (10 6M de 8-MOP)dans le milieu de culture produit une plus faible réaction de bronzage: 5 fois plus de grains de mélanine, mais en plus le nombre de mélanocytes chargés de mélanine triple dans la couche cellulaire basale. Les cultures congelées en parallèle ont permis de marquer spécifiquement et de compter à l'aide d'anticorps antimélanosome (Tomita et coll.,l991) par immunofluorescence indirecte, les mélanocytes présents selon les conditions expérimentales. Les homogénats en milieu tamponné ont permis la quantification biochimique de la mélanine totale présente dans chacune des cultures: la même augmentation d'un facteur 45 (+/-6) a été mesurée après irradiation aux W-B. L'activité tyrosinase (Halaban et coll., 1991) est augmentée d'un facteur trois après la première irradiation aux UV-B et reste à ce niveau même après 4 irradiations.Prior topical application of a drop of 20 ~ 1 sunscreen with total UV filter before each irradiation prevents 89% (+/- 5%) of this melanogenesis induced by
UV-B. The UV-A irradiation (4 times 2.5 Joules / day) in the presence and absence of psoralen (10 6M of 8-MOP) in the culture medium produces a weaker tanning reaction: 5 times more melanin grains, but in addition the number of melanocytes loaded with triple melanin in the basal cell layer. The cultures frozen in parallel made it possible to specifically mark and count with the aid of antimelanosome antibodies (Tomita et al., L991) by indirect immunofluorescence, the melanocytes present according to the experimental conditions. The homogenates in buffered medium allowed the biochemical quantification of the total melanin present in each of the cultures: the same increase by a factor of 45 (+/- 6) was measured after irradiation with WB. The tyrosinase activity (Halaban et al., 1991) is increased by a factor of three after the first UV-B irradiation and remains at this level even after 4 irradiations.
Ces résultats sont bien entendu relatifs aux cellules utilisées (donneur féminin de 36 ans, type caucasien) et ne sont décrits ici qu'à titre d'exemple. Des variations et différences dues aux systèmes de culture cellulaire utilisés et aux sources de cellules sont évidentes pour l'homme de l'art. These results are of course relative to the cells used (36-year-old female donor, Caucasian type) and are only described here by way of example. Variations and differences due to the cell culture systems used and the cell sources are obvious to those skilled in the art.
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