FR2675805A1 - Antigens specific for rheumatoid arthritis, their constituent proteins, their preparation and their diagnostic application - Google Patents
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Abstract
Description
La présente Invention a pour objet-des anti
ozènes extraits d'épithélium malpighien de mammifère et reconnus spécifiquement par les autoanticorps présents -hez les patients atteints de polyarthrite rhumatoide :?R).The present invention relates to anti
ozenes extracted from squamous epithelium from mammals and recognized specifically by the autoantibodies present - in patients suffering from rheumatoid arthritis:? R).
L'invention est plus précisément relative dune ' uns part à un antigène extrait d'épiderme humain et vautre part à un antigène extrait d'épithéliums oeso phagiens de rat, ainsi qu'aux protéines antigéniques les constituant. The invention relates more precisely to one part of an antigen extracted from human epidermis and to one part to an antigen extracted from rat oesophageal epithelia, as well as to the antigenic proteins constituting them.
L'invention concerne également les anticorps reconnaissant ces antigènes, ainsi que les compositions antigéniques pour le diagnostic de la présence dautoanticorps et les compositions i=tunogènes pour la laréparation de vaccin, comprenant lesdits antigènes ou protéines. The invention also relates to the antibodies recognizing these antigens, as well as the antigenic compositions for diagnosing the presence of autoantibodies and the i = tunogenic compositions for the repair of vaccine, comprising said antigens or proteins.
L'invention concerne aussi un procédé de diagnostic de la polyarthrite rhumatoide mettant en oeuvre lesdits antigènes ou protéines. The invention also relates to a method for diagnosing rheumatoid arthritis using said antigens or proteins.
La polyarthrite rhumatoide (PR) est le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires chroniques. Elle atteint environ 2 % de la population des pays développés. Rheumatoid arthritis (RA) is the most common chronic inflammatory rheumatism. It reaches around 2% of the population of developed countries.
La PR est évolutive, invalidante et pose des problèmes de diagnostic difficiles dans ses formes de dé Dut, alors même quelle appelle des traitements spéci tiques. En dehors des signes cliniques et radiologiques, le rhumatologue ne dispose actuellement que de tests biologiques peu spécifiques pour son diagnostic. Les plus utilisés d'entre eux sont les tests de Waaler-Rose, qui détectent le facteur rhumatoide dans 7 PR sur 10. Cependant, la spécificité de ces tests est très mauvaise puisque ces facteurs sont détectés dans la plupart des autres pathologies autoimmunes et même chez des individus sains. RA is progressive, debilitating and poses difficult diagnostic problems in its forms of Dut Dut, even though it calls for specific treatments. Apart from clinical and radiological signs, the rheumatologist currently only has biological tests which are not very specific for his diagnosis. The most used of them are the Waaler-Rose tests, which detect the rheumatoid factor in 7 PR out of 10. However, the specificity of these tests is very poor since these factors are detected in most other autoimmune pathologies and even in healthy individuals.
La présence d'autoanticorps dirigés contre les composants cellulaires est la caractéristique générale des maladies autoimmunes telles que la polyarthrite rhu matoise (PR), le lupus érythémateux disséminé (LED), la sclérodermie (SCL), la polymyosite ou ia maladie du tissu connectif (MTCD). Parmi les nombreux types d'autoanticorps identifiés dans ces maladies, ceux spéci fi-ement présents chez les malades atteints de PR et réagissant avec un antigène épithélial oesophagien ont été décrits pour la première fois par B.J.J. Young et al. The presence of autoantibodies directed against cellular components is the general characteristic of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis (RA), systemic lupus erythematosus (SLE), scleroderma (SCL), polymyositis or connective tissue disease ( MTCD). Among the many types of autoantibodies identified in these diseases, those specifically present in RA patients and reacting with an esophageal epithelial antigen have been described for the first time by B.J.J. Young et al.
dans Br.Med.J. 2:97-99, 1979. Ces autoanticorps ont été improprement dénommés anticorps antikératines.in Br.Med.J. 2: 97-99, 1979. These autoantibodies have been incorrectly called anti-keratin antibodies.
Ces autoanticorps spécifiques de la PR ont été jusqu'à présent détectés et titrés par immunofluorescence indirecte sur cryocoupes transversales d'oesophage de rat. -.Serre et al. dans Rev.Rhum. 53(11):604-614 (1986) ont montré que l'antigène défini par ces autoanticorps est malpighien et cornifié et présent uniquement dans le
Stratum corneum ; ils ont aussi montré que l'antigène reconnu par les sérums de patients atteints de PR est également présent dans l'épiderme humain (G.Serre et al.These RA-specific autoantibodies have so far been detected and titrated by indirect immunofluorescence on transverse cryoputs of rat esophagus. -.Serre et al. in Rev.Rhum. 53 (11): 604-614 (1986) have shown that the antigen defined by these autoantibodies is squamous and cornified and present only in the
Stratum corneum; they also showed that the antigen recognized by the sera of RA patients is also present in the human epidermis (G. Ser et al.
Revue du Rhumatisme, 1986, 53(11), 607-614). Revue du Rhumatisme, 1986, 53 (11), 607-614).
Les travaux effectués par la Demanderesse dans le domaine de la différenciation épidermique et malpighienne et ltétude d'anticorps monoclonaux pour la définition de nouveaux antigènes de différenciation mais aussi d'autoanticorps humains contre ces mêmes antigènes, lui ont permis de montrer que les anticorps anti-Stratum corneum d'oesophage de rat sont dauchentiques autoanticorps, qui ne reconnaissent pas les kératines humaines ou murines, mais d'autres antigènes exprimés dans ces tissus. The work carried out by the Applicant in the field of epidermal and squamous differentiation and the study of monoclonal antibodies for the definition of new differentiation antigens but also of human autoantibodies against these same antigens, enabled it to show that the anti- Rat esophageal stratum corneum are dauchentic autoantibodies, which do not recognize human or murine keratins, but other antigens expressed in these tissues.
Des travaux plus poussés ont permis à la
Demanderesse d'extraire, de purifier et de caractériser biochimiquement ces antigènes ainsi que les protéines les constituant, spécifiquement reconnues par les autoanticorps sériques présents chez les malades atteints de PR. Further work has enabled the
Applicant to extract, purify and biochemically characterize these antigens as well as the proteins constituting them, specifically recognized by the serum autoantibodies present in RA patients.
L'Invention concerne en conséquence un antigène de différenciation terminale présent dans les épithéliums malpighiens de mammifères, spécifiquement reconnu par les autoanticorps présents chez un patient atteint de polyarthrite rhumatoide, caractérisé en ce qu'il présente les propriétés suivantes - il est de nature protéique, - un traitement par une nucléase ne modifie pas son
immunoréactivité, - un traitement par l'éthanol ne modifie pas son
immunoréactivité, - un traitement par l'acide trichloroacétique ne modifie
pas son immunoréactivité, - il est hydrosoluble.The invention therefore relates to a terminal differentiation antigen present in the squamous epithelia of mammals, specifically recognized by the autoantibodies present in a patient suffering from rheumatoid arthritis, characterized in that it has the following properties - it is of a protein nature, - nuclease treatment does not change its
immunoreactivity, - treatment with ethanol does not change its
immunoreactivity, - treatment with trichloroacetic acid does not modify
not its immunoreactivity, - it is water-soluble.
Parmi les épithéliums malpighiens de mammifère, on peut citer les épithéliums qui tapissent la cavité buccale, tels que les muqueuses jugales, gingivales, linguales ou palatines ; ainsi que les muqueuses génitales, anales et aérodigestives supérieures. Among the squamous mammalian epithelia, mention may be made of the epithelia that line the oral cavity, such as the jugal, gingival, lingual or palatal mucous membranes; as well as the upper genital, anal and aerodigestive mucosa.
Les travaux ayant mené à la présente Invention ont plus particulièrement concerné l'épithélium oesophagien de rat et l'épiderme humain. The work which led to the present invention more particularly concerned the rat esophageal epithelium and the human epidermis.
Un premier antigène spécifiquement reconnu par les autoanticorps présents chez les malades atteints de
PR a été extrait de l'épiderme humain.A first antigen specifically recognized by the autoantibodies present in patients with
PR was extracted from the human epidermis.
Cet antigène présente les propriétés suivantes - après électrophorèse en conditions natives, il se dissocie en plusieurs protéines antigéniques dont le poids moléculaire correspondant est compris entre environ 80 et 400 kD, les protéines les plus immunoréactives ayant un poids moléculaire apparent compris entre 80 et 120 kD, - après isoélectrofocalisation, il se dissocie en plusieurs protéines antigéniquesdont les pHi varient de 5,8 à 7,4. This antigen has the following properties - after electrophoresis under native conditions, it dissociates into several antigenic proteins whose corresponding molecular weight is between approximately 80 and 400 kD, the most immunoreactive proteins having an apparent molecular weight between 80 and 120 kD , - after isoelectrofocusing, it dissociates into several antigenic proteins whose pHi vary from 5.8 to 7.4.
Cet antigène est caractérisé par les propriétés suivantes - après électrophorèse bidimensionnelle du type
isoélectrofocalisation, suivie d'une migration en gel
de polyacrylamide-SDS, il apparaît comme une
protéine antigénique de poids moléculaire apparent
moyen d'environ 40 kD dont les pHi varient de 5,8 à
7,4.This antigen is characterized by the following properties - after two-dimensional electrophoresis of the type
isoelectric focusing, followed by gel migration
polyacrylamide-SDS, it appears as a
antigenic protein of apparent molecular weight
average of around 40 kD whose pHi range from 5.8 to
7.4.
Cet antigène est encore caractérisé par la propriété suivante - il présente des propriétés immunologiques en commun
avec la filaggrine humaine ou un fragment de protéolyse
du précurseur de la filaggrine.This antigen is further characterized by the following property - it has immunological properties in common
with human filaggrin or a proteolysis fragment
of the precursor of filaggrin.
En outre, cet antigène extrait d'épiaerme .-.amain présente des propriétés immunologiques en commun avec la filaggrine humaine ou un fragment de protéolyse précurseur de la filaggrine. In addition, this antigen extracted from epiaerm .-. Amain has immunological properties in common with human filaggrin or a fragment of proteolysis precursor of filaggrin.
La Demanderesse a également extrait épithéliums oesophagiens de rat un second antigène spé citiquement reconnu par les autoanticorps présents chez les patients atteints de PR. The Applicant has also extracted rat esophageal epithelia a second antigen specifically recognized by the autoantibodies present in RA patients.
Cet antigène présente les propriétés suivantes - après électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS, il
se sépare en les trois protéines antigéniques suivantes une première protéine de poids moléculaire moyen
d'environ 210 kD, * une deuxième protéine de poids moléculaire moyen
compris entre environ 90 et 130 kD, * une troisième protéine de poids moléculaire moyen
compris entre environ 67 et 90 kD, - après électrophorèse en gel de polyacrylamide en
condition native, il se sépare en les trois protéines
antigéniques suivantes * une première protéine dont le poids moléculaire moyen
apparent correspondant est d'environ 440 kD, * une deuxième protéine dont le poids moléculaire moyen
apparent correspondant est d'environ 220 kD, * une troisième protéine dont le poids moléculaire moyen
apparent correspondant est d'environ 120 kD.This antigen has the following properties - after polyacrylamide-SDS gel electrophoresis, it
separates into the following three antigenic proteins a first protein of average molecular weight
about 210 kD, * a second protein of average molecular weight
between approximately 90 and 130 kD, * a third protein of average molecular weight
between approximately 67 and 90 kD, - after polyacrylamide gel electrophoresis in
native condition it separates into the three proteins
following antigens * a first protein with an average molecular weight
corresponding apparent is approximately 440 kD, * a second protein with an average molecular weight
apparent corresponding is approximately 220 kD, * a third protein whose average molecular weight
apparent corresponding is about 120 kD.
Cet antigène est encore caractérisé par les propriétés suivantes - après électrophorèse bidimensionnelle du type
isoélectrofocalisation, suivie d'une migration en gel
de polyacrylamide-SDS, il se dissocie en les trois pro
téines antigéniques suivantes une première protéine de poids moléculaire moyen d'en
viron 210 kD dont les pHi varient d'environ 5,85 à 6,85, * une deuxième protéine de poids moléculaire compris en
tre environ 90 et 130 kD dont les pHi varient d'environ
5,85 à 7,35, * une troisième protéine dont le poids moléculaire dimi
nue d'environ 120 à 67 kD pendant que son pHi varie
d'environ 5 à 7,5.This antigen is further characterized by the following properties - after two-dimensional electrophoresis of the type
isoelectric focusing, followed by gel migration
of polyacrylamide-SDS, it dissociates into the three pro
antigenic tines following a first protein of average molecular weight of
approximately 210 kD, the pHi of which vary from approximately 5.85 to 6.85, * a second protein of molecular weight included in
be around 90 and 130 kD whose pHi vary from around
5.85 to 7.35, * a third protein whose molecular weight is reduced
naked from around 120 to 67 kD while its pHi varies
from about 5 to 7.5.
- après chromatographie de gel-filtration et interaction
hydrophobe puis électrophorèse sur gel de
polyacrylamide-SDS, cet antigène se sépare en les deux
fractions protéiques antigéniques suivantes * une première fraction très hydrophobe contenant la pro
téine de poids moléculaire moyen d'environ 210 kD et la
protéine de poids moléculaire moyen compris entre envi
ron 90 et 130 kD, * une deuxième fraction moins hydrophobe que la première
contenant la protéine de poids moléculaire moyen com
pris entre environ 120 et 67 kD.- after gel-filtration chromatography and interaction
hydrophobic then gel electrophoresis
polyacrylamide-SDS, this antigen separates into the two
following antigenic protein fractions * a very hydrophobic first fraction containing the pro
tine of average molecular weight of about 210 kD and the
average molecular weight protein between about
ron 90 and 130 kD, * a second fraction less hydrophobic than the first
containing medium molecular weight protein com
taken between around 120 and 67 kD.
Les protéines constitutives de ces antigènes ont été purifiées et testées avec les autoanticorps présents chez les patients atteints de PR. il apparaît que ces protéines présentent des propriétés immunologiques au moins équivalentes à celles des antigènes dont elles sont issues. The proteins that make up these antigens have been purified and tested with the autoantibodies present in RA patients. it appears that these proteins have immunological properties at least equivalent to those of the antigens from which they are derived.
L'Invention concerne en conséquence également les trois protéines mises en évidence après électrophorèse bidimensionnelle du type électrofocalisation, suivie d'une migration en gel de polyacrylamide-SDS, de l'antigène extrait de l'épithélium oesophagien de rat. The invention therefore also relates to the three proteins demonstrated after two-dimensional electrophoresis of the electrofocusing type, followed by migration in polyacrylamide-SDS gel, of the antigen extracted from the rat esophageal epithelium.
Ces trois protéines ont également été mises en évidence dans les fractions protéiques obtenues après chromatographie séquentielle de gel-filtration et interaction hydrophobe de l'antigène extrait d'épithélium oesophagien de rat, puis électrophorèse en conditions dénaturantes. These three proteins have also been demonstrated in the protein fractions obtained after sequential gel-filtration chromatography and hydrophobic interaction of the antigen extracted from rat esophageal epithelium, then electrophoresis under denaturing conditions.
La première de ces trois protéines présente un poids moléculaire moyen d'environ 210 kD et des pHi variant d'environ 5,85 à 7,35 ; la deuxième présente un poids moléculaire moyen compris entre 90 et 130 kD et des pHi variant d'environ 5,85 à 7,35 ; la troisième présente un poids moléculaire moyen compris entre 67 et 120 kD et des pHi variant d'environ 5,8 à 7,4. The first of these three proteins has an average molecular weight of approximately 210 kD and pHi ranging from approximately 5.85 to 7.35; the second has an average molecular weight between 90 and 130 kD and pHi varying from about 5.85 to 7.35; the third has an average molecular weight between 67 and 120 kD and pHi varying from approximately 5.8 to 7.4.
L'Invention concerne aussi la protéine mise en évidence après électrophorèse bidimensionnelle du type électrofocalisation suivie d'une migration en gel de polyacrylamide-SDS, de l'antigène extrait d'épiderme humain. Cette protéine a un poids moléculaire d'environ 40 kD et des pHi variant d'environ 5,8 à 7,4. The invention also relates to the protein demonstrated after two-dimensional electrophoresis of the electrofocusing type followed by migration in polyacrylamide-SDS gel, of the antigen extracted from human epidermis. This protein has a molecular weight of about 40 kD and pHi ranging from about 5.8 to 7.4.
Les antigènes et les protéines précédemment décrits sont particulièrement utiles pour la préparation de compositions antigéniques pour le diagnostic de la présence d'autoanticorps dans un échantillon biologique d'un patient atteint de polyarthrite rhumatoide. The antigens and proteins previously described are particularly useful for the preparation of antigenic compositions for the diagnosis of the presence of autoantibodies in a biological sample from a patient suffering from rheumatoid arthritis.
Ces compositions permettent la formation d'un complexe antigène-anticorps entre les protéines ou antigènes de l'invention et les autoanticorps présents dans un échantillon biologique, tel que du sérum, d'un sujet atteint de PR ; ces compositions et les antigènes qu'elles contiennent sont donc particulièrement intéressants pour le diagnostic in vitro de la PR. These compositions allow the formation of an antigen-antibody complex between the proteins or antigens of the invention and the autoantibodies present in a biological sample, such as serum, from a subject suffering from RA; these compositions and the antigens which they contain are therefore particularly advantageous for the in vitro diagnosis of RA.
Un test par immunotransfert pour la détection des autoanticorps anti-Stratum corneum de classe G, spécifique de la polyarthrite rhumatoide a été mis au point. An immunoblot test for the detection of anti-Stratum corneum class G autoantibodies, specific for rheumatoid arthritis, has been developed.
Ces autoanticorps étaient antérieurement détectés par IIF sur cryocoupe d'oesophage de rat. These autoantibodies were previously detected by IIF on a rat esophagus cryocut.
Un protocole d'immunotransfert, réalisé à partir d'un extrait antigénique épithélial oesophagien murin, a été optimisé pour obtenir une meilleure définition des bandes immunoréactives et une meilleure sensibilité, puis trois configurations, différentes, soit par la méthode de séparation des protéines antigéniques (électrophorèse en conditions natives ou dénaturantes), soit par la dilution des sérums analysés, ont été validées sur le plan diagnostic avec une large série de sérums représentatifs de la pathologie rhumatologique. An immunoblotting protocol, carried out using a murine esophageal epithelial antigenic extract, was optimized to obtain a better definition of the immunoreactive bands and better sensitivity, then three different configurations, either by the method of separation of antigenic proteins ( electrophoresis in native or denaturing conditions), either by diluting the sera analyzed, were validated on the diagnostic level with a large series of sera representative of rheumatological pathology.
Il est apparu que dans ces trois conditions, la sensibilité diagnostique du test oscillait autour de 50% pour une spécificité voisine de 95%, lorsque seule la présence ou l'absence d'immunoréactivité était prise en compte. It appeared that in these three conditions, the diagnostic sensitivity of the test hovered around 50% for a specificity close to 95%, when only the presence or absence of immunoreactivity was taken into account.
Par contre, la protéine antigénique de 120 kD de l'antigène séparé en conditions natives, reconnue beaucoup plus spécifiquement par les sérums de patients atteints de PR, a permis la détection des sérums avec une sensibilité de 68% pour une spécificité de 99%, performance très supérieure à celle de 1'IIF qui présente une sensibilité de 43% pour une spécificité de 99%. On the other hand, the 120 kD antigenic protein of the antigen separated under native conditions, recognized much more specifically by the sera of patients suffering from RA, made it possible to detect the sera with a sensitivity of 68% for a specificity of 99%, performance far superior to that of IIF which has a sensitivity of 43% for a specificity of 99%.
L'approche parallèle conduite avec l'antigène extrait d'épiderme humain a permis de montrer que la protéine de 40 kD, seule forme immunoréactive dans ce tissu, permettait d'obtenir des performances diagnostiques équivalentes à celles de la protéine antigénique murine de 120 kD. The parallel approach conducted with the antigen extracted from human epidermis made it possible to show that the 40 kD protein, the only immunoreactive form in this tissue, made it possible to obtain diagnostic performances equivalent to those of the murine antigenic protein of 120 kD. .
L'invention a également trait à des anticorps formés contre les antigènes et protéines de l'invention, anticorps qui peuvent être polyclonaux ou monoclonaux et produits alors par tout hybridome préparé selon les méthodes classiques de fusion cellulaire entre des cellules spléniques activées in vitro par l'antigène ou provenant d'un animal immunisé contre l'une des protéines ou glycoprotéines antigéniques de l'invention et des cellules d'une lignée de cellules myélomateuses. The invention also relates to antibodies formed against the antigens and proteins of the invention, antibodies which can be polyclonal or monoclonal and then produced by any hybridoma prepared according to conventional methods of cell fusion between spleen cells activated in vitro by antigen or from an animal immunized against one of the antigenic proteins or glycoproteins of the invention and cells of a myeloma cell line.
L'invention est aussi relative à un procédé de purification des autoanticorps spécifiquement présents chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoide, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes - la mise en contact d'un fluide biologique d'un patient
atteint de polyarthrite rhumatoide avec au moins un
antigène ou au moins une protéine, tels que définis
nans ce qui précède, dans des conditions permettant la
formation de complexes immunologiques avec lesdits
anticorps, - l'isolement desdits complexes du milieu réactionnel, - la séparation des autoanticorps des complexes immuno
logiques.The invention also relates to a method for purifying the autoantibodies specifically present in patients suffering from rheumatoid arthritis, characterized in that it comprises at least the following steps - bringing a patient's biological fluid into contact
rheumatoid arthritis with at least one
antigen or at least one protein, as defined
in the foregoing, under conditions allowing the
formation of immunological complexes with said
antibodies, - the isolation of said complexes from the reaction medium, - the separation of autoantibodies from immuno complexes
logical.
L'invention concerne enfin un procédé de diagnostic in vitro de la polyarthrite r;aumatolde dans un fluide biologique, comprenant au moins les étapes suivantes - la mise en contact de ce fluide biologique avec au
moins un antigène ou une protéine selon l'invention,
éventuellement marqué, ou un conjugué de cet antigène
ou protéine avec une molécule porteuse, dans des condi
tions permettant la formation d'un complexe immunolo
gique avec les autoanticorps éventuellement présents - la détection dans le fluide biologique de la présence
du complexe immunologique, par des méthode physiques
ou chimiques.The invention finally relates to a method of in vitro diagnosis of polyarthritis r; aumatolde in a biological fluid, comprising at least the following steps - bringing this biological fluid into contact with at
minus an antigen or a protein according to the invention,
optionally labeled, or a conjugate of this antigen
or protein with a carrier molecule, under conditions
tions allowing the formation of an immunol complex
gic with the autoantibodies possibly present - the detection in the biological fluid of the presence
of the immunological complex, by physical methods
or chemical.
Le procédé de diagnostic précédent peut être mis en oeuvre grâce à un nécessaire ou kit comprenant - au moins un antigène ou une protéine selon l'invention,
éventuellement marqué, ou un conjugué de cet antigène
avec une molécule porteuse - des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à
la réaction immunologique avec les autoanticorps éven
tuellement présents dans un échantillon biologique - un ou plusieurs réactifs pour la détection du complexe
immunologique formé - le cas échéant, un échantillon de référence, tel qu'un
sérum négatif. The above diagnostic method can be implemented using a kit or kit comprising - at least one antigen or a protein according to the invention,
optionally labeled, or a conjugate of this antigen
with a carrier molecule - reagents for the constitution of an environment favorable to
the immunological reaction with the autoantibodies even
commonly present in a biological sample - one or more reagents for the detection of the complex
immunological trained - if applicable, a reference sample, such as
negative serum.
D'autres caractéristiques et avantages de 1'Invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et qui sont illustrés par les figures en annexe étant entendu que ces exemples ne sauraient être interprétés comme tendant à réduire la portée des Revendications. Other characteristics and advantages of the invention will appear on reading the examples which follow and which are illustrated by the appended figures, it being understood that these examples should not be interpreted as tending to reduce the scope of the Claims.
EXEMPLE 1 - CARACTERISATION DE L'ANTIGENE EXTRAIT
D'EPITHELIUMS OESOPHAGIENS DE RAT
I - MATERIEL ET METHODE
A - EXTRACTIONS DES PROTEINES EPITHRLMÈS
1) Préparation de l'épithélium oesophagien par clivaae chorioétithélial
L'oesophage de rat est composé de trois tuniques principales qui sont, de 'extérieur vers l'intérieur : une couche conjonctive (l'adventice), une couche musculaire (la musculeuse), une couche composée d'un chorion recouvert par un épithélium malpighien cor nifie. EXAMPLE 1 - CHARACTERIZATION OF THE EXTRACT ANTIGEN
RAT ESOPHAGIC EPITHELIUMS
I - MATERIAL AND METHOD
A - EPITHRLMES PROTEIN EXTRACTIONS
1) Preparation of the esophageal epithelium by chorioetithelial clivaae
The rat esophagus is composed of three main coats which are, from outside to inside: a connective layer (the adventitia), a muscular layer (the muscularis), a layer composed of a chorion covered by an epithelium Malpighian cor nifies.
Après élimination, par dissection, de l'adventice et de la musculeuse, l'épithélium est séparé mécaniquement du chorion (clivage chorio-épithélial) après un choc athermique en milieu liquide (KH2/K2H-PO4 8,5 mM; NaCl 150 mM; EDTA 5 mM; PMSF 0,4 mM; pH 7,2). Les épithéliums clivés sont conservés hydratés par un volume minimal de PBS (KH2-/K2H-P04 8,5 mM; NaCl 150 mM; pH 7,2) avant de subir un contrôle histologique permettant de vé- rifier l'absence de chorion contaminant
After elimination, by dissection, of the adventitia and the muscularis, the epithelium is separated mechanically from the chorion (chorioepithelial cleavage) after an athermic shock in liquid medium (KH2 / K2H-PO4 8.5 mM; NaCl 150 mM ; EDTA 5 mM; PMSF 0.4 mM; pH 7.2). The cleaved epithelia are kept hydrated with a minimum volume of PBS (KH2- / K2H-P04 8.5 mM; 150 mM NaCl; pH 7.2) before undergoing a histological control making it possible to verify the absence of contaminating chorion
2) Extraction des protéines épithéliales
a) Tampons et séouences d'extraction
L'antigène de l'invention étant exclusivement épithélial, c'est à partir du seul épithélium qu'ont été réalisées les extractions.2) Extraction of epithelial proteins
a) Extraction buffers and sequences
The antigen of the invention being exclusively epithelial, it is from the single epithelium that the extractions were carried out.
A partir d'épithéliums clivés, l'extraction des protéines épithéliales est réalisée successivement par broyage au potter puis agitation à 4 Celsius en milieu tamponné. Après centrifugation, le surnageant est récupéré et le culot est soumis aux étapes d'extraction afin d'améliorer les rendements. From cleaved epithelia, the extraction of the epithelial proteins is carried out successively by grinding with a potter then stirring at 4 Celsius in buffered medium. After centrifugation, the supernatant is recovered and the pellet is subjected to the extraction steps in order to improve the yields.
Des protocoles classiques (W.W. Franke et al.,
J. Mol. Biol., 153:933-959, 1981 - Sun and Green,
J. Biol. Chem. 253(6):2053-2060, 1978) adaptés à l'extraction séquentielle des protéines à partir de tissus épithéliaux et notamment de l'épiderme, ont été tout d'abord utilisés. Puis des extractions en une seule étape ont ensuite été testées. Différents milieux d'extraction correspondant à des tampons Tris-HCl additionnés ou non de sels (KCl, NaCl), de détergents (Triton, NP40), d'agents dénaturants (urée, SDS) et d'agents réducteurs (bêta-mercaptoéthanol) ont ainsi été testés.Classic protocols (WW Franke et al.,
J. Mol. Biol., 153: 933-959, 1981 - Sun and Green,
J. Biol. Chem. 253 (6): 2053-2060, 1978) adapted to the sequential extraction of proteins from epithelial tissues and in particular from the epidermis, were first used. Then one-step extractions were then tested. Different extraction media corresponding to Tris-HCl buffers with or without added salts (KCl, NaCl), detergents (Triton, NP40), denaturing agents (urea, SDS) and reducing agents (beta-mercaptoethanol) have thus been tested.
Au cours des extractions fractionnées, l'antigène a été retrouvé exclusivement dans la fraction correspondant soit à un tampon Tris de faible force ionique, soit à un tampon TBS-EDTA-Triton. Ceci a permis de confirmer que l'antigène n'est pas une cytokératine, de montrer qu'il est extractible en absence d'urée et d'agents réducteurs et qu'il est hydrosoluble. During fractional extractions, the antigen was found exclusively in the fraction corresponding either to a Tris buffer of low ionic strength, or to a TBS-EDTA-Triton buffer. This made it possible to confirm that the antigen is not a cytokeratin, to show that it is extractable in the absence of urea and reducing agents and that it is water-soluble.
Cependant, en comparant les diverses techniques d'extraction, l'intensité de l'immunoréactivité est apparue légèrement supérieure en présence de NP40. However, when comparing the various extraction techniques, the intensity of immunoreactivity appeared to be slightly higher in the presence of NP40.
Un milieu d'extraction constitué de TBS + inhibiteurs + NP40 0,5 * apparaît donc comme le plus efficace. An extraction medium consisting of TBS + inhibitors + NP40 0.5 * therefore appears to be the most effective.
La grande hydrosolubilité de l'antigène a été confirmée, lorsque le PBS destiné à empêcher la dessiccation des épithéliums lors des clivages chorio-épithéliaux et donc inhibant ceux-ci sous un très faible volume, a été analysé. Il est apparu que ce tampon PBS était riche en protéines et contenait des traces détectables d'antigènes. L'antigène n'était que partiellement extrait en PBS puisqu'on le retrouvait en quantité importante après broyage des oesophages en tampon TBS-NPQO. Cette étape de broyage n'a donc pas été supprimée. The high water solubility of the antigen was confirmed when the PBS intended to prevent desiccation of the epithelia during chorioepithelial cleavages and therefore inhibiting them in a very small volume, was analyzed. It was found that this PBS buffer was rich in protein and contained detectable traces of antigens. The antigen was only partially extracted in PBS since it was found in significant quantity after grinding of the esophaguses in TBS-NPQO buffer. This grinding step has therefore not been eliminated.
Lors de la purification de l'antigène, l'intense absorption de NP40 à 280 nm interférant avec celle des protéines, notamment en chromatographie de gelfiltration, a conduit à comparer les immunoréactivités d'extractions réalisées avec et sans NP40. Les culots restants ont été dans les deux cas réextraits en tampon additionné de NP40. Très peu d'antigène a été détectable dans ces culots, qui ont été extraits au départ avec ou sans détergent.En outre, les profils en gel PAGE-SDS ont été identiques et la quantité de protéines extraites a été très voisine (5,62 mg/ml sans NP40 contre 5,76 mg/ml avec NP40). Ce dernier tampon (TBS + inhibiteur sans toP40) est donc celui qui doit être adopté pour I'extraction de l'antigène en préalable à tous les travaux de purification et de caractérisation. During the purification of the antigen, the intense absorption of NP40 at 280 nm interfering with that of proteins, in particular in gelfiltration chromatography, led to comparing the immunoreactivity of extractions carried out with and without NP40. The remaining pellets were in both cases re-extracted in a buffer supplemented with NP40. Very little antigen was detectable in these pellets, which were extracted initially with or without detergent. In addition, the profiles in PAGE-SDS gel were identical and the quantity of proteins extracted was very similar (5.62 mg / ml without NP40 versus 5.76 mg / ml with NP40). This last buffer (TBS + inhibitor without toP40) is therefore the one which must be adopted for the extraction of the antigen before all the purification and characterization works.
b) Ostlmlsatlon des conditions thvsiaues
d'extraction
Afin d'optimiser la procédure d'extraction, certains paramètres physiques ont été explorés de manière systématique. Il s'agit de la température, de la durée, du type de broyage, du type d'agitation et de l'action d' inhibiteurs enzymatiques.b) Ostlmlsatlon of thvsiaues conditions
extraction
In order to optimize the extraction procedure, certain physical parameters have been systematically explored. These are temperature, time, type of grinding, type of agitation and the action of enzyme inhibitors.
- Broyage :
Il a été effectué soit au potter électrique à haute vitesse, soit de façon plus douce, au potter manuel. L'efficacité de l'extraction a été dans les deux cas à peu près équivalente. Le potter électrique est cependant préféré car il permet le broyage d'un plus grand nombre d'oesophages.- Grinding :
It was carried out either with an electric potter at high speed, or more gently with a manual potter. The extraction efficiency in both cases was roughly equivalent. The electric potter is however preferred because it allows the grinding of a greater number of esophagus.
- Sonification
L'optimisation de l'extraction par des sonifications de durée variable, après potterisation a été testée. Elle s'est avérée très faible et la sonification n'est donc pas nécessaire. - Sonification
Optimization of the extraction by sonifications of variable duration, after potterization was tested. It turned out to be very weak and sonification is therefore not necessary.
- Agitation :
Agitation douce et agitation rapide ont été comparées. Une agitation rapide en présence d'un détergent entraînant la formation de mousse et provoquant une suroxygénation du milieu est en effet susceptible d'altérer l'antigène. En fait, la qualité de l'extraction a été identique dans les deux cas. Une agitation douce a cependant été retenue pour préserver au maximum 1 antigène. - Agitation:
Soft agitation and rapid agitation were compared. Rapid agitation in the presence of a detergent leading to the formation of foam and causing over-oxygenation of the medium is indeed likely to alter the antigen. In fact, the quality of the extraction was identical in both cases. Gentle agitation was however used to preserve a maximum of 1 antigen.
- Terrtoérature
Température ambiante et température de 4-Celsius ont été comparées. De meilleurs résultats ont t obtenus avec des extractions conduites à 4-Celsius. - Territory
Ambient temperature and 4-Celsius temperature were compared. Better results have been obtained with extractions conducted at 4-Celsius.
- Durée :
Des extractions sous agitation de 15 minutes, 2 heures et 17 heures ont été comparées. Bien que 1' augmentation du temps d'extraction augmente faiblement la quantité d'antigène extrait, une durée de 15 minutes a été retenue pour la minimisation du risque d'altération de l'antigène.- Duration:
15 minute, 2 hour and 17 hour stirred extractions were compared. Although increasing the extraction time slightly increases the amount of antigen extracted, a period of 15 minutes has been used to minimize the risk of alteration of the antigen.
- Inhibit.eurs
L'effet protecteur pour antigène des inhibiteurs suivants a été testé - Inhibiteur de la prolifération bactérienne
Azide de sodium, - Inhibiteur d'enzymes lytiques
protéases (aprotinine, PMSF), phosphatases (NaF, PCMB),
glycosidases (déoxymannojirimycine, déoxyJirimycine). - Inhibitors
The protective effect for antigen of the following inhibitors has been tested - Inhibitor of bacterial proliferation
Sodium azide, - Inhibitor of lytic enzymes
proteases (aprotinin, PMSF), phosphatases (NaF, PCMB),
glycosidases (deoxymannojirimycin, deoxyJirimycin).
Des extractions sans inhibiteurs ont été réalisées notamment lorsque l'extrait était destiné à la caractérisation biochimique de l'antigène par action de différentes enzymes ; aucune modification de l'antigène nta été constatée en l'absence d'inhibiteur. Extractions without inhibitors were carried out in particular when the extract was intended for the biochemical characterization of the antigen by the action of different enzymes; no modification of the antigen was noted in the absence of an inhibitor.
- Protocole d'extraction optimisé
L'étude des paramètres précédents a permis de déterminer le protocole d'extraction optimisé ci-après - Substrat : épithélium d'oesophage ae rat obtenu par
clivage chorio-épithélialX - Tampon : Tris HC1 40 mM
NaCl 150 mM
EDTA 10 mM
pH 7,4 - Inhibiteurs :Azide de sodium 0,1 8
PMSF 1 mM
Aprotinine 2 mg/ml - Rapport substrat/tampon
500 tjl de tampon par épithélium oesophagien - Conditions
Broyage : potter électrique 15 minutes
Température de broyage : 4-Celsius
Agitation après broyage : 15 minutes à 4-Celsius - Concentration protéique totale de l'extrait
5 à 8 mg/ml - Conservation de l'extrait brut
-20 ou -40'C
- PréDaratlon à partir de muqueuse
oesoshaaienne totale
Dans un but de simplification de la procédure d'extraction, l'extraction de l'antigène à partir de muqueuse oesophagienne totale a été étudiée. I1 s'agit alors d'une dissection de la muqueuse mais sans- clivage chorio-épithélial. La contamination protéique ainsi induite a été étudiée.- Optimized extraction protocol
The study of the previous parameters made it possible to determine the optimized extraction protocol below - Substrate: epithelium of esophagus ae rat obtained by
chorioepithelial cleavage X - Buffer: Tris HC1 40 mM
150 mM NaCl
EDTA 10 mM
pH 7.4 - Inhibitors: Sodium azide 0.1 8
PMSF 1 mM
Aprotinin 2 mg / ml - Substrate / buffer ratio
500 tjl of buffer per esophageal epithelium - Conditions
Grinding: electric potter 15 minutes
Grinding temperature: 4-Celsius
Agitation after grinding: 15 minutes at 4-Celsius - Total protein concentration of the extract
5 to 8 mg / ml - Storage of the raw extract
-20 or -40'C
- PreDaratlon from mucosa
total esoshaaian
In order to simplify the extraction procedure, the extraction of the antigen from the total esophageal mucosa has been studied. It is then a dissection of the mucosa but without chorioepithelial cleavage. The protein contamination thus induced was studied.
Des extractions parallèles, soit à partir de muqueuses, soit à partir d'épithéliums clivés. Parallel extractions, either from mucous membranes, or from cleaved epithelia.
L' analyse en PAGE-SDS des protéines extraites (fraction "PBS" et extraction par broyage selon la méthode de Sun and Green) montre que la présence du chorion n'entraîne pas de contamination protéique dans la zone de masse molaire de l'antigène. Après immunotransfert de la fraction épithélio-choriale extraite par broyage, l'antigène est parfaitement détectable. The SDS-PAGE analysis of the proteins extracted ("PBS" fraction and extraction by grinding according to the Sun and Green method) shows that the presence of the chorion does not lead to protein contamination in the molar mass zone of the antigen . After immunoblotting of the epitheliochorial fraction extracted by grinding, the antigen is perfectly detectable.
c) Concentration de l'extrait brut
L'antigène étant faiblement représenté dans l'extrait brut (environ moins de 1 % des protéines totales), une étape de concentration des extraits s'avère nécessaire, surtout lorsque ceux-ci doivent être analysés par électrophorèse sur système FPLC (dépôts de l'ordre du microlitre).c) Concentration of the crude extract
As the antigen is poorly represented in the crude extract (approximately less than 1% of total proteins), a step of concentrating the extracts is necessary, especially when these have to be analyzed by electrophoresis on an FPLC system (deposits of l 'microliter order).
Parmi les diverses techniques de concentration testées, celle consistant à concentrer les extraits par précipitation au TCA 10 % a été retenue. Cette technique facile à mettre en oeuvre ne produit aucune altération de l'antigène puisque la réponse immunologique est parfaitement conservée en immunotransfert. Among the various concentration techniques tested, that of concentrating the extracts by precipitation with 10% TCA was chosen. This easy-to-use technique produces no alteration of the antigen since the immunological response is perfectly preserved in immunoblotting.
De la même façon, des précipitations par l'méthanol ou le sulfate d'ammonium ainsi que la lyophilisation contrôlée n'induisent aucune altération sensible de l'antigène et sont donc parfaitement utilisables. Similarly, precipitation with methanol or ammonium sulphate as well as controlled lyophilization do not induce any significant alteration of the antigen and are therefore perfectly usable.
B - ELECTROPHORESES
Pour tous les milieux d'extraction étudiés ciaprès, les protéines solubles sont séparées par électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS (PAGE-SDS) puis électro-transférées sur nitrocellulose.B - ELECTROPHORESES
For all the extraction media studied below, the soluble proteins are separated by electrophoresis in polyacrylamide-SDS gel (PAGE-SDS) and then electro-transferred to nitrocellulose.
1) Séparation tar isoélectrofocallsatlon (IEF)
horizontale . Gel : 9 X 15 cm, 4% acrylamide contenant des ampholines
formant un gradient de pH de 3,5 à 9,5.1) Isoelectrofocallsatlon tar separation (IEF)
horizontal. Gel: 9 X 15 cm, 4% acrylamide containing ampholines
forming a pH gradient from 3.5 to 9.5.
Echantillon déposé : extrait brut préparé selon le pro
tocole précédent, concentré par purification à l'acide
trifluoroacétique (TCA) à 10% et repris dans l'eau. Sample deposited: raw extract prepared according to the pro
previous toole, concentrated by acid purification
trifluoroacetic (TCA) at 10% and taken up in water.
2) Electrothorèses monodimensionnelles - Electrophorèse verticale classique selon la méthode
décrite par Laemmli (Nature, 227 : 680-685, 1970) . Gel : 10 X 10 cm, 7% acrylamide . Tampon de migration : Tris 25 mM, glycine 192 mM,
Sodium Dodécyl Sulfate (SDS),1%, pH 8,3. 2) Monodimensional electrothoreses - Classic vertical electrophoresis according to the method
described by Laemmli (Nature, 227: 680-685, 1970). Gel: 10 X 10 cm, 7% acrylamide. Migration buffer: Tris 25 mM, glycine 192 mM,
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 1%, pH 8.3.
échantillon déposé : extrait brut lyophylisé et repris
en Tris-HCl 10 mM pH 7.~4, SDS 2%, 2-Mercaptoéthanol
(2ME) 1%, bleu de bromophénol 0,1%, glycérol 10%.sample deposited: crude lyophilized extract and taken up
in 10 mM Tris-HCl pH 7. ~ 4, SDS 2%, 2-Mercaptoethanol
(2ME) 1%, bromophenol blue 0.1%, glycerol 10%.
- Electrophorèse horizontale miniaturisée" en conditions
dénaturantes.- Miniaturized horizontal electrophoresis "under conditions
denaturing.
Gel : 4 X 4 cm, 7,5% acrylamide
Tampon 200 mM, Tricine 200 mM, SDS 0,55%, pH 8,1.Gel: 4 X 4 cm, 7.5% acrylamide
200 mM buffer, 200 mM Tricin, 0.55% SDS, pH 8.1.
Echantillon déposé : extrait brut concentré par préci
pitation au TCA 10% et repris en Tris-HCl 10 mM,
pH 7,4, SDS 2%, 2-ME 1%, Bleu de bromophénol 0,1%. Sample deposited: crude extract concentrated by preci
pitation with 10% TCA and taken up in 10 mM Tris-HCl,
pH 7.4, SDS 2%, 2-ME 1%, Bromophenol blue 0.1%.
Electrophorèse horizontale "miniaturisée" en conditions
natives."Miniaturized" horizontal electrophoresis under conditions
natives.
Gel : 4 X 4 cm, gradient de 8 à 25% en acrylamide Tampon de migration : Tris 250 mM, L-Alanine 880 mM,
pH 8,8.Gel: 4 X 4 cm, gradient from 8 to 25% in acrylamide Migration buffer: Tris 250 mM, L-Alanine 880 mM,
pH 8.8.
Echantillon déposé : extrait brut concentré par préci
pitation au TCA 10% et repris soit dans l'eau, soit en
tampon Tris-HCl 200 mM à différents pH.Sample deposited: crude extract concentrated by preci
pitation with TCA 10% and taken up either in water or in
200 mM Tris-HCl buffer at different pH.
3 Electroohorèses bidimensionnelles IEF/PAGE-SDS première dimension : IEF horizontale. 3 IEF / PAGE-SDS two-dimensional electroohoreses first dimension: horizontal IEF.
Gel : 4 X 4 cm, 4% acrylamide, gradient de pH 3,5 à 9,5 Echantillon déposé : extrait brut concentré par préci
pitation à l'éthanol (4 volumes) et repris dans l'eau. Gel: 4 X 4 cm, 4% acrylamide, pH gradient 3.5 to 9.5 Sample deposited: crude extract concentrated by preci
pitation with ethanol (4 volumes) and taken up in water.
deuxième dimension : électrophorèse dénaturante comme
décrite précédemment.second dimension: denaturing electrophoresis as
previously described.
. Echantillon déposé : piste gel IEF incubé en Tris
112 mM, acide acétique 112 mM, SDS 2,5%, 2-ME 1%.. Sample deposited: IEF gel track incubated in Tris
112 mM, acetic acid 112 mM, SDS 2.5%, 2-ME 1%.
C - IMMMNODETECTION
L'immunodétection de l'antigène est réalisée à l'aide de sérums humains provenant de patients atteints de PR dans lesquels les autoanticorps anti-Stratum corneum d'oesophage de rat avait été préalablement titrés par immunofluorescence indirecte semiguantitative et affectés d'une valeur-titre de 0 à 8 : paramètre GIFOR (G-Immunofluorescence-Oesophage de Rat) La valeur-seuil, GIFOR = 2, qui correspond à une spécificité diagnostique pour la PR supérieure à 99 % permet de classer les sérums de malades en deux groupes : GIFOR+ et GIFOR- (C.Vincent et al., Ann. Rheum. Dis. 48:712-722, 1989).C - IMMMNODETECTION
Immunodetection of the antigen is carried out using human sera from RA patients in which the rat esophageal anti-Stratum corneum autoantibodies were previously titrated by semiguantitative indirect immunofluorescence and assigned a value- titer from 0 to 8: GIFOR parameter (Rat G-Immunofluorescence-Esophagus) The threshold value, GIFOR = 2, which corresponds to a diagnostic specificity for RA greater than 99%, allows the patient's sera to be classified into two groups: GIFOR + and GIFOR- (C. Vincent et al., Ann. Rheum. Dis. 48: 712-722, 1989).
Dans les sérums choisis, on a également pris en compte le paramètre immunologique suivant : le titre des autoanticorps anticytokératines épidermiques de classe G déterminé en ELISA (GELISA) (G.Serre et al,
J. Invest. Dermatol. 88:21-27, 1987). Ces autoanticorps réagissent en immunotransfert avec les cytokératines humaines contaminantes éventuellement présentes dans l'extrait et dues à la desquamation naturelle des manipulateurs. Les sérums utilisés ont été choisis pour consti cuver également deux groupes, GELISA+ et GELISA-, en fonction du titre élevé (DO > 0,6) ou faible (DO < 0,2) de ces autoanticorps naturels.Au total, les quatre sous-groupes de sérums de PR suivants ont été utilisés
- GIFOR+/GELISAs
- GIFOR+/GELISA
- GIFOR-/GELISA+
- GIFOR-/GELISA
Enfin, des sérums témoins provenant d'individus normaux ou de patients atteints d'infections rhumatologiques non rhumatoides ainsi que des anticorps monoclonaux murins spécifiques des cytokératines humaines ont été inclus dans les tests (G.Serre et al., Colloque
INSERM, Vol. 171:524, 1988).In the selected sera, the following immunological parameter was also taken into account: the titer of epidermal class G anticytokeratin autoantibodies determined in ELISA (GELISA) (G.Serre et al,
J. Invest. Dermatol. 88: 21-27, 1987). These autoantibodies react in immunotransfer with contaminating human cytokeratins possibly present in the extract and due to the natural scaling of the manipulators. The sera used were chosen to also form two groups, GELISA + and GELISA-, depending on the high (OD> 0.6) or low (OD <0.2) titer of these natural autoantibodies. - the following groups of PR sera were used
- GIFOR + / GELISAs
- GIFOR + / GELISA
- GIFOR- / GELISA +
- GIFOR- / GELISA
Finally, control sera from normal individuals or from patients suffering from rheumatoid rheumatic infections as well as murine monoclonal antibodies specific for human cytokeratins were included in the tests (G.Serre et al., Colloquium
INSERM, Vol. 171: 524, 1988).
Dans ces conditions expérimentales, l'antigène extrait d'épithéliums oesophagiens de rat est repérable en immunotransfert par une immunoréactivité spécifique des sérums de PR GIFOR+ correspondant à une large bande située entre 90 et 120 Kd. Les autoanticorps naturels antikératines se traduisent par la présence de bandes immunoréactives situées autour de 65-67 Kd, présentes dans les seuls sérums GELISA+, plus ou moins intenses en fonction de leur titre et totalement indépendantes de la valeur de GIFOR
D - CHROMATOGRAPHIE
Les molécules antigéniques ont été séparées dans différentes fractions après chromatographie séquentielle gel-filtration/interaction hydrophobe. Puis ces fractions ont été analysées par PAGE-SDS et PAGE en conditions natives.Under these experimental conditions, the antigen extracted from rat esophageal epithelia is detectable in immunoblotting by a specific immunoreactivity of PR GIFOR + sera corresponding to a broad band located between 90 and 120 Kd. Natural anti-keratin autoantibodies result in the presence of immunoreactive bands located around 65-67 Kd, present in GELISA + sera alone, more or less intense depending on their titer and completely independent of the value of GIFOR
D - CHROMATOGRAPHY
The antigenic molecules were separated into different fractions after sequential gel-filtration chromatography / hydrophobic interaction. Then these fractions were analyzed by PAGE-SDS and PAGE under native conditions.
E - DIGESTION ENZYMATIQUR
1) Protéínase K
Deux extraits d'épithélium d'oesophage de rat en tampon TBS/NP40 sont précipités au TCA 10% et les protéines reprises dans un tampon Tris-HCl 50 mM PH 7,5 CaC1î 10 mM. Un des extraits est additionné de protéinase
K (préincubée pendant 1 heure à 37'C pour éliminer d'autres hydrolases éventuellement présentes dans la préparation commerciale) à la concentration finale de 50 Rg/ml. Les deux échantillons sont ensuite incubés pendant 1 heure à 37'C puis analysés comparativement en immunotransfert après migration en PAGE en conditions natives ou en PAGE-SDS.E - ENZYMATIQUR DIGESTION
1) Proteinase K
Two extracts of rat esophageal epithelium in TBS / NP40 buffer are precipitated with 10% TCA and the proteins taken up in a 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5 10 mM CaCl 2. One of the extracts is supplemented with proteinase
K (preincubated for 1 hour at 37 ° C. to eliminate other hydrolases possibly present in the commercial preparation) at the final concentration of 50 Rg / ml. The two samples are then incubated for 1 hour at 37 ° C. and then analyzed comparatively in immunoblot after migration to PAGE under native conditions or to SDS-PAGE.
2) Nucléase
Deux extraits d'épithélium d'oesophage de rat en tampon TBS/NP40 sont précipités au TCA 10%. L'un d'eux est hydrolysé par 2 U/ L de nucléase de microcoque (hydrolyse de l'ADN et de 1'ARN) en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, CaC12 5 mM. Le deuxième échantillon, non traité, sert de témoin. Les deux préparations sont incubées pendant 1 heure à 37-C puis analysées comparativement en immunotransfert après migration en PAGE en conditions natives ou en PAGE-SDS
F - DEGLYCOSYLATION
1) OxYdatlon~àà l'acide rerlodloue
Le protocole de WOODWARD et COLL. (J. IMM.2) Nuclease
Two extracts of rat esophageal epithelium in TBS / NP40 buffer are precipitated with 10% TCA. One of them is hydrolyzed with 2 U / L of micrococcal nuclease (hydrolysis of DNA and RNA) in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM CaCl 2. The second sample, untreated, serves as a control. The two preparations are incubated for 1 hour at 37 ° C. and then analyzed comparatively in immunoblot after migration to PAGE under native conditions or to PAGE-SDS
F - DEGLYCOSYLATION
1) OxYdatlon ~ with rerlodloue acid
WOODWARD and COLL protocol. (J. IMM.
METH. 78:143-153, 1985) a été utilisé ; ce protocole permet l'oxydation periodique d'un échantillon préalablement transféré sur une membrane de nitrocellulose, 1 l'oxydation periodique pouvant être suivie d'une immunodétection. METH. 78: 143-153, 1985) was used; this protocol allows periodic oxidation of a sample previously transferred to a nitrocellulose membrane, 1 periodic oxidation can be followed by immunodetection.
Un extrait d'épithélium d'oesophage de rat est transféré après migration en PAGE-SDS, La membrane de nitrocellulose est découpée en plusieurs pistes qui sont soumises à une oxydation periodique (incubation en tampon acétate de sodium 50 mM pH 4,4, periodate de sodium 20 mM, pendant 1 heure à l'obscurité et à température ambiante) suivie d'une réduction au borohydrure de sodium (NaBH4 50 mM en PBS pH 7,4 pendant 30 mn à température ambiante). Des échantillons témoins ne subissant aucun traitement chimique ou subissant uniquement la réduction ont été inclus. L'ensemble des échantillons est ensuite immunodétecté. An extract of rat esophageal epithelium is transferred after migration in SDS-PAGE. The nitrocellulose membrane is cut into several tracks which are subjected to periodic oxidation (incubation in 50 mM sodium acetate buffer pH 4.4, periodate 20 mM sodium, for 1 hour in the dark and at room temperature) followed by reduction with sodium borohydride (50 mM NaBH4 in PBS pH 7.4 for 30 min at room temperature). Control samples undergoing no chemical treatment or undergoing only reduction were included. All of the samples are then immunodetected.
2) Traitement tar l'acide
trifluoromethanesulfoniaue (TFMS)
L'utilisation du TFMS, selon la méthode de
EDGE et COLL. (ANAL. BIOCHEM. 118:131-137, 1981), permet une déglycosylation quasi-totale des glycoprotéines tout en conservant leur axe peptidique. Cette méthode a été appliquée à une glycoprotéine témoin, la fétuine bovine et à des extraits d'épithélium d'oesophage de rat contenant l'antigène. Des extraits sont dialysés contre de l'eau puis lyophilisés; Leur traitement est réalisé par addition d'un mélange (66/33-V/V) de TFMS et d'amisol (agent protecteur de l'axe peptidique) et incubation sous agitation après saturation en azote de l'atmosphère des tubes.Le protocole de référence a été optimisé en faisant varier différents paramètres - proportion de mélange TFMS/Anisol par rapport à la
masse de protéines traitée : 33 à 266 Rl de mélange par
mg de protéine totale de l'extrait oesophagien.2) Acid tar treatment
trifluoromethanesulfoniaue (TFMS)
The use of TFMS, according to the method of
EDGE and COLL. (ANAL. BIOCHEM. 118: 131-137, 1981), allows almost total deglycosylation of the glycoproteins while retaining their peptide axis. This method was applied to a control glycoprotein, bovine fetuin and to extracts of rat esophageal epithelium containing the antigen. Extracts are dialyzed against water and then lyophilized; Their treatment is carried out by adding a mixture (66/33-V / V) of TFMS and amisol (agent protecting the peptide axis) and incubation with shaking after nitrogen saturation of the atmosphere of the tubes. reference protocol was optimized by varying different parameters - proportion of TFMS / Anisol mixture compared to the
mass of proteins treated: 33 to 266 Rl of mixture per
mg of total protein from the esophageal extract.
- température : O'C, 4-C ou température ambiante.- temperature: O'C, 4-C or room temperature.
- Durée de l'incubation : 1, 3 ou 24 heures.- Duration of incubation: 1, 3 or 24 hours.
Dans tous les cas, après incubation, l'arrêt de la réaction est effectué par addition de 2 volumes d'éther glacial et de 3 volumes d'un mélange py'idine/eau (50/50-V/V). Le précipité de trifluorométhanesulfonate de pyridinium, soluble dans la phase éthérée, a été éliminé avec elle. Après une nouvelle extraction par l'éther glacial, la phase aqueuse a été dialysée contre de l'eau. In all cases, after incubation, the reaction is stopped by adding 2 volumes of glacial ether and 3 volumes of a pyidine / water mixture (50/50-V / V). The precipitate of pyridinium trifluoromethanesulfonate, soluble in the ethereal phase, was removed with it. After a further extraction with glacial ether, the aqueous phase was dialyzed against water.
Les échantillons ont ensuite été lyophylisés, séparés par
PAGE, transférés, puis immunodétectés.The samples were then lyophilized, separated by
PAGE, transferred, then immunodetected.
3) Traltement ar la tettide N-alvcosldase F (PNGase F)
La PNGase, également commercialisée sous le nom de Glycopeptidase F ou de N-Glycanase, hydrolyse la liaison amide existant entre le résidu asparaginyl d'une glycoprotéine et le N, N' diacétyl-chitobiose de la structure commune à tous les oligosaccharides N-liés.3) Traltement ar tettide N-alvcosldase F (PNGase F)
PNGase, also marketed under the name of Glycopeptidase F or N-Glycanase, hydrolyzes the amide bond existing between the asparaginyl residue of a glycoprotein and the N, N 'diacetyl-chitobiose of the structure common to all N-linked oligosaccharides .
La fétuine contient trois chaînes oligosaccharidiques N-liées dont l'élimination par la PNGase F entraîne une diminution de masse molaire facilement visualisable en PAGE-SDS (S. HIRANI et al., ANAL. BIOCHEM. Fetuin contains three N-linked oligosaccharide chains, the elimination of which by PNGase F results in a reduction in molar mass that can easily be viewed in SDS-PAGE (S. HIRANI et al., ANAL. BIOCHEM.
162:485-492, 1987).162: 485-492, 1987).
La fétuine bovine (2 mg/ml) et un extrait lyophilisé d'épithélium oesophagien de rat (8 mg/ml de protéine) sont dénaturés pendant 5 mn à 90'C avec du SDS à 28 et du 2ME 0,05 M. Puis les protéines sont placées dans un milieu réactionnel de composition suivante - Nonidet P40 (NP40) 1,25% (protection de l'enzyme vis-à
vis de l'action dénaturante du SDS), - phosphate de potassium 166 mM pH 8 (conservation du pH
optimale de l'enzyme), - 1,10-orthophénentroLine 10 mM (inhibiteur de protéase)
solubilisés dans du méthanol à la concentration finale
de 10%, - PNGase F 0,3 U/Al. Bovine fetuin (2 mg / ml) and a lyophilized extract of rat esophageal epithelium (8 mg / ml of protein) are denatured for 5 min at 90 ° C. with SDS at 28 and 2ME 0.05 M. Then the proteins are placed in a reaction medium of the following composition - Nonidet P40 (NP40) 1.25% (protection of the enzyme against
vis the denaturing action of SDS), - potassium phosphate 166 mM pH 8 (conservation of pH
optimal enzyme), - 1,10-orthophenentroLine 10 mM (protease inhibitor)
solubilized in methanol at the final concentration
10%, - PNGase F 0.3 U / Al.
Dans ce milieu réactionnel, les concentrations finales respectives du SDS et du 2ME sont de 0,166 % et 16 mM. L'incubation est de 24 heures à 37'C. In this reaction medium, the respective final concentrations of SDS and 2ME are 0.166% and 16 mM. The incubation is 24 hours at 37 ° C.
Des témoins "fétuines" ec " extraits antigéniques" incubés sans enzymes sont inclus dans le proto zone. Après hydrolyse et concentration par précipitation au TCA, les échantillons sont séparés par PAGE, transfé
es et immunodétectés."Fetuin" and "antigenic extracts" controls incubated without enzymes are included in the proto zone. After hydrolysis and concentration by precipitation with TCA, the samples are separated by PAGE, transferred
es and immunodetected.
G - REACTIVITE AVEC DIFFERENTES LECTINES
Les Inventeurs ont cherché à confirmer la na =Üre glycoprotéique de l'antigène en détectant spécifiquement certains sucres par des lectines couplées à la peroxydase. Deux lectines végétales : les lectines de germes de blé (WGA) et la concanavaline A (ConA) ont été choisies pour leur spécificité différente tI.J. GOLSTEIN ez R.D. PORETZ, The Lectins : properties, function and application in biology and medicine) - la WGA reconnaît des résidus de ssD-N acétylglycosamine
avec les affinités croissantes suivantes
(1) GlcNAc < < GlcNAcpl - 4GlcNAc < GlcNAcBl-4 GlcNAc51-4GlcNAc et se fixe également avec une moindre affinité sur les résidus d'acide sialique.G - REACTIVITY WITH DIFFERENT LECTINS
The inventors sought to confirm the glycoprotein nature of the antigen by specifically detecting certain sugars by lectins coupled to peroxidase. Two plant lectins: wheat germ lectins (WGA) and concanavalin A (ConA) were chosen for their different specificity tI.J. GOLSTEIN ez RD PORETZ, The Lectins: properties, function and application in biology and medicine) - the WGA recognizes residues of ssD-N acetylglycosamine
with the following growing affinities
(1) GlcNAc <<GlcNAcpl - 4GlcNAc <GlcNAcBl-4 GlcNAc51-4GlcNAc and also binds with less affinity to sialic acid residues.
- La Con A s'associe aux sucres suivant classés par affi
nité croissante
(2) aGlcNAc < aGlc < oMan < Manal-2Man < Manal-ZManal-2Man les protéines de deux extraits antigéniques, bruts ou pu rifiés, sont transférées sur nitrocellulose après migration en PAGE monodimensionnelle ou IEF/PAGE-SDS. Les bandes de nitrocellulose ont été incubées avec la Con A et la WGA couplées à la peroxydase aux concentrations minimales respectives de 20 et 15 \Lg/rtLi (J.C.S. CLEGG,
ANAL. BIOCHEM 127:389-394, 1982 et W.F. GLASS et al.,
ANAL. BIOCHEM. 115:219-224, 1981). L'incubation est réalisée dans un tampon Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 200 mM, CaC12 lmM, MnC12 1 mM et Tween 0,18 pendant 1 heure à 37'C et 1 nuit à 4 C. Celle-ci est précédée et suivie d'étapes de lavages dans le même tampon. Différents agents de saturation supplémentaires comme la gélatine ou la sérum-albumine bovine oxydée par un traitement à l'acide periodique ne permettent pas d'ampSifier la réponse obtenue lors de l'utilisation du seul Tween.- Con A associates with the following sugars classified by affi
growing nity
(2) aGlcNAc <aGlc <oMan <Manal-2Man <Manal-ZManal-2Man the proteins of two antigenic extracts, crude or pu rified, are transferred to nitrocellulose after migration in one-dimensional PAGE or IEF / PAGE-SDS. The nitrocellulose bands were incubated with Con A and WGA coupled with peroxidase at the minimum concentrations of 20 and 15 μg / rtLi respectively (JCS CLEGG,
ANAL. BIOCHEM 127: 389-394, 1982 and WF GLASS et al.,
ANAL. BIOCHEM. 115: 219-224, 1981). The incubation is carried out in a 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4, 200 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MnC 12 and 0.18 Tween for 1 hour at 37 ° C. and 1 night at 4 ° C. is preceded and followed by washing steps in the same buffer. Various additional saturation agents such as gelatin or bovine serum albumin oxidized by a treatment with periodic acid do not allow to amplify the response obtained when using the Tween alone.
Après le dernier lavage, l'association lectine-antigène est révélée par mise en évidence de l'activité peroxydasique par H202 et 4-chloro-1-naphtol comme lors des immunodétections.After the last wash, the lectin-antigen association is revealed by demonstrating the peroxidase activity with H2O2 and 4-chloro-1-naphthol as during immunodetections.
II - CARACTERISATION PYSICOCHIMIQOE DE~'ANTLGENPI
La caractérisation physico-chimique de l'antigène a été effectuée à partir d'extraits bruts d'épithélium d'oesophage de rat, puis à partir de fractions antigéniques purifiées Dans les deux cas, après séparation électrophorétique, les protéines ont été transférées puis immunodétectées par des sérums de patients atteints de PR.II - PYSICOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF ~ 'ANTLGENPI
The physicochemical characterization of the antigen was carried out using crude extracts of rat esophagus epithelium, then from purified antigenic fractions In both cases, after electrophoretic separation, the proteins were transferred and then immunodetected by sera from RA patients.
A - MASSE MOLAIRE
L'analyse en immunotransfert d'un extrait d'épithélium d'oesophage de rat séparé par PAGE-SDS et immunodétecté avec des sérums de PR GIFOR + et GIFOR montre que l'antigène se présente sous la forme d'une zone immunoréactive large et étalée correspondant à une protéine de masse molaire moyenne comprise entre 90 et 130 kD, d'une bande immunoréactive étroite correspondant à une protéine de masse molaire moyenne d'environ 210 kD et d'une zone immunoréactive correspondant à une protéine de masse molaire moyenne comprise entre 67 et 90 kD.A - MOLAR MASS
Immunoblot analysis of an extract of rat esophageal epithelium separated by PAGE-SDS and immunodetected with PR GIFOR + and GIFOR sera shows that the antigen is in the form of a large immunoreactive zone and spread corresponding to a protein of average molar mass between 90 and 130 kD, a narrow immunoreactive band corresponding to a protein of average molar mass of approximately 210 kD and an immunoreactive zone corresponding to a protein of average molar mass between 67 and 90 kD.
B - POINTS ISOELECTRIQUES
L'extrait brut est concentré cinq fois par précipitation TCA 10%, repris dans veau, séparé par IEF (pHi 3,5 à 9,5), transféré puis immunodétecté avec des sérums de patients atteints de PR GIFOR + et GIFOR -. Les molécules antigéniques présentent une aistribution très hétérogène, les protéines de l'extrait brut reconnues spécifiquement par la plupart des sérums GIFOR + se répartissent en un faisceau de bandes fines dont les points isoélectriques varient de 5,2 à 7,5. B - ISOELECTRIC POINTS
The crude extract is concentrated five times by TCA 10% precipitation, taken up in calf, separated by IEF (pHi 3.5 to 9.5), transferred then immunodetected with sera from patients with GIFOR + and GIFOR - PR. The antigenic molecules have a very heterogeneous distribution, the proteins of the crude extract recognized specifically by most GIFOR + sera are distributed in a bundle of fine bands whose isoelectric points vary from 5.2 to 7.5.
C - CARACTERTSTIQUE DE MIGRATION EN CONDITIONS
NATIVES
La figure 1 représente 1'immunotransfert d'un extrait d'épithéliums d'oesophage de rat repris en milieu acide et séparé par PAGE en conditions natives. L'extrait brut concentré dix fois par précipitation au TCA, est repris dans l'eau (pH inférieur à 4), séparé par PAGE en conditions natives (8-25%), transféré puis immunodétecté avec des sérums de PR GIFOR + (pistes 74, 52, 5, 11) dilué au 1/100 ; la piste Tg représente un témoin négatif.Dans ces conditions de reprise à pH acide l'immunotransfert effectué avec quatre sérums de patients atteints de PR fait apparaître trois zones immunoréactives correspondant à des protéines de poids moléculaire moyen apparent d'environ 440 kD, 220 kD et 120 kD, lesquelles sont reconnues avec une affinité variable selon les sérums.C - CHARACTERTS OF MIGRATION IN CONDITIONS
NATIVES
FIG. 1 represents the immunoblot of an extract of rat esophageal epithelia taken up in an acid medium and separated by PAGE under native conditions. The crude extract concentrated ten times by precipitation with TCA, is taken up in water (pH less than 4), separated by PAGE under native conditions (8-25%), transferred then immunodetected with PR GIFOR + sera (tracks 74, 52, 5, 11) diluted 1/100; track Tg represents a negative control. In these conditions of recovery at acidic pH, the immunoblotting carried out with four sera from RA patients reveals three immunoreactive zones corresponding to proteins of apparent average molecular weight of approximately 440 kD, 220 kD and 120 kD, which are recognized with a variable affinity according to the sera.
D - ELECTROPHORESE BIDINENSIONNELLE IHP'/PAGE-SDS
Cette technique qui combine IEF dans la premi ère dimension et PAGE-SDS dans la deuxième permet de déterminer simultanément les points isoélectriques et les masses molaires des diverses molécules antigéniques, de confirmer leur grande hétérogénéité de charge et de montrer leur grande hétérogénéité de masse.D - TWO-DIMENSIONAL ELECTROPHORESIS IHP '/ PAGE-SDS
This technique which combines IEF in the first dimension and PAGE-SDS in the second makes it possible to simultaneously determine the isoelectric points and the molar masses of the various antigenic molecules, to confirm their great heterogeneity of charge and to show their great heterogeneity of mass.
La figure 2 représente l'immunotransfert d'un extrait d'épithéliums d'oesophage de rat séparé par électrophorèse bidimensionnelle (lEF/PAGE-SDS). L'extrait brut concentré 20 fois par précipitation à l'éthanol puis repris dans l'eau, est séparé par IEF (pHi 5 à 8) puis par PAGE-SDS (7,5*), transféré puis immunodétecté avec deux sérums de patients atteints de PR GIFOR +, dilués au 1/100. La zone immunoréactive de 90 à 130 kD présente des pHi variant de 5,85 à 7,35, ceux de la bande de 210 kD varient de 5,85 à 6,85. Une troisième population immunoréactive, en forme de "virgule" a migré de 120 à 67 kD tandis que ces pHi se répartissent de manière continue entre 5 et 7,5.Les molécules antigéniques de masse molaire inférieures à 90 kD, clairement détectées après électrophorèse bidimensionnelle n'apparaissent en élec t rohorès e monodimensionnelle qu'avec des sérums de titre élevé, sous la forme d'une extension de 1timmunoréactivité vers les zones de faible poids molécu iaire. La plus grande quantité d'antigène déposée en IEF/PAGE-SDS, permettant une meilleure sensibilité d'immunodétection, explique cette apparente discordance. FIG. 2 represents the immunoblot of an extract of rat esophageal epithelia separated by two-dimensional electrophoresis (EF / PAGE-SDS). The crude extract concentrated 20 times by precipitation with ethanol then taken up in water, is separated by IEF (pHi 5 to 8) then by SDS-PAGE (7.5 *), transferred then immunodetected with two patient sera with PR GIFOR +, diluted 1/100. The immunoreactive zone of 90 to 130 kD has pH i varying from 5.85 to 7.35, those of the 210 kD band vary from 5.85 to 6.85. A third immunoreactive population, in the form of a "comma", migrated from 120 to 67 kD while these pHi are distributed continuously between 5 and 7.5. The antigenic molecules with a molar mass of less than 90 kD, clearly detected after two-dimensional electrophoresis only appear in one-dimensional electrohores with high titer sera, in the form of an extension of immunoreactivity towards areas of low molecular weight. The greater quantity of antigen deposited in IEF / PAGE-SDS, allowing better immunodetection sensitivity, explains this apparent discrepancy.
E - CARACTERISTIQUES DE SEPARATION C}IROMATOGRAPHIQW3
La figure 3 représente la séparation en chro matographie d'interaction hydrophobe d'une solution antigénique prépurifiée par gel-filtration (profil d'élution suivi par mesure de la DO à 280 nit). Des fractions immunoréactives purifiées par chromatographie de gelfiltration (Superose 12) à partir d'un extrait brut sont séparés sur Phényl-Superose (Tampon d'équilibre phosphate 50 mM, NH2S04 1,7 M, pH 7 ; Tampon d'élution phosphate 50 mM, pH 7 ; volume injecté : 30 mm ; Débit 0,5 ml/mn ; DO 280 nm pleine échelle : 0,05 ; Collecte 1 ml/tube).E - CHARACTERISTICS OF SEPARATION C} IROMATOGRAPHIQW3
FIG. 3 represents the separation in hydrophobic interaction chromatography of a prepurified antigen solution by gel-filtration (elution profile followed by measurement of the OD at 280 nit). Immunoreactive fractions purified by gelfiltration chromatography (Superose 12) from a crude extract are separated on Phenyl-Superose (50 mM phosphate equilibrium buffer, 1.7 M NH 2 SO 4, pH 7; 50 mM phosphate elution buffer , pH 7; volume injected: 30 mm; Flow rate 0.5 ml / min; DO 280 nm full scale: 0.05; Collection 1 ml / tube).
Les profils- d'élution et l'étude par immunotransfert des différentes fractions antigéniques se sont avérés très reproductibles au cours de multiples purif i- cations. La répartition des molécules antigéniques dans les différentes fractions a donc pu être modelisée. The elution profiles and the immunoblot study of the different antigenic fractions proved to be very reproducible during multiple purifications. The distribution of antigenic molecules in the different fractions could therefore be modeled.
La figure 4 représente la modélisation des profils d'immunoréactivité des fractions antigéniques purifiées par chromatographie séquentielle gelfiltration/interaction hydrophobe, obtenue après PAGE-SDS (1) ou PAGE en conditions natives (2) , Les différences d'intensité des bandes ou zones immunoréactives reflètent, pour une même bande ou zone, la richesse relative en protéines antigéniques de chaque fraction. FIG. 4 represents the modeling of the immunoreactivity profiles of the purified antigenic fractions by sequential gelfiltration / hydrophobic interaction chromatography, obtained after PAGE-SDS (1) or PAGE under native conditions (2), The differences in intensity of the bands or immunoreactive zones reflect, for the same band or zone, the relative richness in antigenic proteins of each fraction.
En électrophorèse dénaturante, la- bande à 210 kD (fractions F, G et H), la large bande mal limitée de 90 à 130 kD (D, E, F, G et H) et une bande de 67 à 90 kD (C, D et E) ont été visualisées. In denaturing electrophoresis, the band at 210 kD (fractions F, G and H), the broad band ill-defined from 90 to 130 kD (D, E, F, G and H) and a band from 67 to 90 kD (C , D and E) have been visualized.
En électrophorèse native, la bande fine à 440 kD (F, G et H), la bande à 232 kD (C, D, E, F, G et H) et la large bande au niveau de 120 kD (B, C, D et E) ont été retrouvées. In native electrophoresis, the fine band at 440 kD (F, G and H), the band at 232 kD (C, D, E, F, G and H) and the wide band at 120 kD (B, C, D and E) have been found.
La comparaison des molécules antigéniques analysées en PAGE-SDS dans les différentes fractions purifiées et des molécules identifiées après électrophorèse bidimensionnelle (IEF/PAGE-SDS) dans un extrait brut, comme indiqué à la figure 7, renseigne sur l'ampleur d'hydrophobicité respective
- La bande à 210 kD dont les pHi varient de 5,85 à 6,85, est retrouvée dans les fractions obtenues en fin d'élution (F, G et H), elle est donc très hydrophobe.The comparison of the antigenic molecules analyzed in PAGE-SDS in the various purified fractions and of the molecules identified after two-dimensional electrophoresis (IEF / PAGE-SDS) in a crude extract, as indicated in FIG. 7, provides information on the extent of respective hydrophobicity.
- The 210 kD band, the pHi of which varies from 5.85 to 6.85, is found in the fractions obtained at the end of elution (F, G and H), it is therefore very hydrophobic.
- La zone diffuse de 90 à 130 k, dont les pHi se situent de 5,85 à 7,35, présente le même profil d'élution que la bande à 210 kD (fraction E, F, G et H) et donc la même hydrophobicité. - The diffuse zone from 90 to 130 k, whose pHi are between 5.85 and 7.35, has the same elution profile as the band at 210 kD (fraction E, F, G and H) and therefore the same hydrophobicity.
- Par contre, la population en forme de virgule qui présente des pHi plus étalés de 5 à 7,5, est retrouvée majoritairement en début d'élution (fractions B,
C, D et E) et présente donc un caractère moins hydrophobe que les deux molécules précédentes.- On the other hand, the population in the form of a comma which has pHi more spread out from 5 to 7.5, is found mainly at the start of elution (fractions B,
C, D and E) and therefore has a less hydrophobic character than the two previous molecules.
III - CARACTERISATION BIOCHIMIOUE DE L'ANTIGèNE
A - LES MOLECCLES ANTIGENIQUES SONT DE NATURE
PROTEIQUE
La figure 5 représente 1 'analyse en immunotransfert des protéines d'un extrait antigénique digéré (B) ou non (A) par la protéinase K, séparé par PAGE en conditions natives (8-25z), transférés puis immunodétectés avec trois sérums de patients atteints de PR
GIFOR + (pistes I à 3) et un sérum de patient atteint de
PR GIFOR - (piste 4) ; la piste Tg représente des témoins négatifs.III - BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF THE ANTIGEN
A - ANTIGENIC MOLECCLES ARE NATURAL
PROTEIN
FIG. 5 represents the immunoblot analysis of the proteins of a digested antigenic extract (B) or not (A) by proteinase K, separated by PAGE under native conditions (8-25z), transferred then immunodetected with three patient sera with RA
GIFOR + (tracks I to 3) and a patient serum
PR GIFOR - (track 4); track Tg represents negative controls.
Les colorations au Rouge Ponceau des bandes de nitrocellulose correspondant aux échantillons traités montrent la digestion totale des protéines de l'extrait. The red culvert stains of the nitrocellulose bands corresponding to the treated samples show the total digestion of the proteins of the extract.
L'immunodétection après PAGE en conditions non natives montre que l'iinmunoréactivité spécifique des sérums
GIFOR + disparaît Lorsque l'échantillon est préalablement digéré par la protéinase K. L'iinmunodétection après transfert des échantillons séparés en PAGE-SDS a confirmé ce résultat.Immunodetection after PAGE in non-native conditions shows that the specific immunoreactivity of sera
GIFOR + disappears When the sample is previously digested with proteinase K. Immunodetection after transfer of the separated samples to PAGE-SDS confirmed this result.
La nature protéique des molécules porteuses de l'antigéniclté étant affirmée, les Inventeurs ont déterminé s'il s'agissait d'homo- ou d'hétéroprotéines, quelles associations et/ou substitutions de l'antigène étaient susceptibles de rendre compte de la diversité de poids isoélectrique et de masse molaire apparente et quelle était la nature biochimique du ou des épitopes reconnus. The protein nature of the molecules carrying the antigenicity being affirmed, the inventors determined whether they were homo- or heteroproteins, which associations and / or substitutions of the antigen were capable of accounting for the diversity. isoelectric weight and apparent molar mass and what was the biochemical nature of the recognized epitope (s).
B - LES PROTEINES ANTIGENIQUES NE SONT PAS
ASSOCIEES A DES ACIDES NUrtwIQZES
L'association éventuelle de l'antigène avec des acides nucléiques a été étudiée. Un extrait d'épithéliums d'oesophage de rat a été traité ou non par la nucléase de microcoque puis analysé par électrophorèse en gel d'agarose 1%, suivie d'une coloration au bromure d'éthidium.B - ANTIGENIC PROTEINS ARE NOT
ASSOCIATED WITH NUrtwIQZES ACIDS
The possible association of the antigen with nucleic acids has been studied. An extract of rat esophageal epithelia was treated or not with micrococcal nuclease and then analyzed by electrophoresis in 1% agarose gel, followed by staining with ethidium bromide.
Après séparation des échantillons par électrophorèse en gel d'agarose 1%, l'absence d'acides nucléiques dans l'échantillon traité prouve l'efficacité de la digestion enzymatique. After separation of the samples by electrophoresis in 1% agarose gel, the absence of nucleic acids in the treated sample proves the efficiency of the enzymatic digestion.
La figure 6 représente l'analyse par immunotransfert après PAGE en conditions natives (8-25%) d'un extrait d'épithélium d'oesophage de rat traité (b) ou non (a) par la nucléase de microcoque. L'analyse a été réalisée avec trois sérums de patients atteints de PR GIFOR + (pistes 1 à 3) et un sérum de PR GIFOR - (piste 4) ; la piste Tg représente des témoins négatifs. FIG. 6 represents the analysis by immunotransfer after PAGE under native conditions (8-25%) of an extract of epithelium of rat esophagus treated (b) or not (a) with micrococcal nuclease. The analysis was carried out with three sera from patients with PR GIFOR + (lanes 1 to 3) and one serum from PR GIFOR - (lane 4); track Tg represents negative controls.
L'immunodétection après PAGE en conditions natives montre l'insensibilité des protéines antigéniques au traitement par les nucléases tant du point de vue de leur immunoréactivité avec les sérums de patients de PR que de celui de leur masse molaire apparente, prouvant qu'elles ne sont pas associées à des acides nucléiques. Immunodetection after PAGE under native conditions shows the insensitivity of the antigenic proteins to nuclease treatment both from the point of view of their immunoreactivity with sera from RA patients and from that of their apparent molar mass, proving that they are not not associated with nucleic acids.
C - LES PROTEINES ANTIGENIQUES SONT-RT.'T.KS DES
GLYCOPROTEINES ?
Les glycoprotéines présentent souvent une forte hétérogénéité de points isoélectriques et un taux inconstant de fixation du SDS qui rend médiocre leur résolution en PAGE-SDS. Les protéines antigéniques présentant également ces caractéristiques, les Inventeurs ont cherché leur éventuelle substitution par des résidus glucidiques. Dans ce but, des techniques visant soit à altérer les molécules de sucres éventuellement portées par l'axe peptidique, soit à débarrasser la partie protéique de ses résidus glycaniques, ont été utilisées.C - ANTIGENIC PROTEINS ARE RT.'T.KS DES
GLYCOPROTEINS?
The glycoproteins often exhibit a high heterogeneity of isoelectric points and an inconstant rate of SDS binding which makes their resolution in PAGE-SDS poor. Antigenic proteins also having these characteristics, the inventors sought their possible substitution with carbohydrate residues. To this end, techniques aimed either at altering the sugar molecules possibly carried by the peptide axis, or at ridding the protein part of its glycan residues, were used.
1) Destruction d'éventuels étitotes
alucidioues car 1 'acide teriodiatie
La figure 7 représente l'immunodétection d'un extrait d'épithéliums d'oesophage de rat qui, après séparation par PAGE-SDS (7,5%) et transfert a été - incubé pendant lh30 en tampon TBS (témoins
"incubation" : piste a), - incubé pendant 1h en tampon acétate de sodium, puis ré
duit pendant 30 mn au borohydrure de sodium (témoins
"réduction" : piste b), - oxydé par l'acide periodique en tampon acétate de so-
dium pendant 1h puis réduit pendant 30 mn au boro
hydrure de sodium ("essai" : piste c),
trois sérums de PR GIFOR + (pistes 1 à 3), deux sérums
de PR GIFOR - (pistes 4 et 5) et deux sérums de
contrôle (pistes 6 et 7) ont été utilisés ; la piste Tg
représente des témoins négatifs.1) Destruction of possible etitotes
alucidioues because 1 acid teriodiatie
FIG. 7 shows the immunodetection of an extract of rat esophageal epithelia which, after separation by PAGE-SDS (7.5%) and transfer, was - incubated for 1 h 30 min in TBS buffer (controls
"incubation": track a), - incubated for 1 hour in sodium acetate buffer, then re
duit for 30 min with sodium borohydride (controls
"reduction": lane b), - oxidized by periodic acid in acetate buffer of so-
dium for 1 hour then reduced for 30 minutes with boro
sodium hydride ("test": track c),
three PR GIFOR + sera (tracks 1 to 3), two sera
from PR GIFOR - (tracks 4 and 5) and two sera from
control (tracks 6 and 7) were used; the Tg track
represents negative controls.
Le traitement par l'acide periodique n'a en rien modifié les protéines spécifiquement reconnues par les sérums de patients atteints de PR. Trois interprétations de ce résultat sont possibles - les protéines antigéniques sont des glycoprotéines mais
les sucres sensibles à une oxydation periodique
qu'elles portent ne sont pas impliqués dans le ou les
épitopes majoritairement reconnus par les autoanticorps
spécifiques de la polyarthrite rhumatoide.Treatment with periodic acid did not change the proteins specifically recognized by the sera of RA patients. Three interpretations of this result are possible - the antigenic proteins are glycoproteins but
sugars sensitive to periodic oxidation
that they wear are not involved in the
epitopes mainly recognized by autoantibodies
specific for rheumatoid arthritis.
- les protéines antigéniques sont des glycoprotéines mais
les sucres qu'elles portent de par leur nature et/ou
leur type d'enchaînement sont insensibles à une oxyda
tion periodique (1'acide periodique clive la liaison
entre deux carbones vicinaux portant initialement soit
chacun une fonction alcool, soit 1un une fonction
alcool et l'autre une fonction acide ou cétone ou amide
primaire ou secondaire).- the antigenic proteins are glycoproteins but
the sugars which they carry by their nature and / or
their type of chain are insensitive to an oxida
periodic (periodic acid cleaves the bond
between two vicinal carbons initially bearing either
each an alcohol function, or 1 a function
alcohol and the other an acid or ketone or amide function
primary or secondary).
- les protéines antigéniques ne sont pas des glyco
protéines.- antigenic proteins are not glyco
proteins.
Afin de trancher entre ces trois possibilités, les Inventeurs ont utilisé une méthode ae déglycosylation totale puis cherché des modifications de la masse ou de
I'immunoréactivité des protéines antigéniques.In order to decide between these three possibilities, the inventors used a method of total deglycosylation and then sought modifications of the mass or
The immunoreactivity of antigenic proteins.
2) Déalocosvlatlon
Deux types principaux de lien permettent l'association d'un oligosaccharide à un axe peptidique la liaison O-glycosidique qui permet l'association a'un oligosaccharide à un résidu Serine ou Thréonine (et rarement hydroxylysine) par l'intermédiaire d'une galactosamine N-acétylée et la liaison N-glycosidique qui rattache un oligosaccharide à un résidu asparagine par l'intermédiaire d'une glucosamine N-acétylée.2) Déalocosvlatlon
Two main types of link allow the association of an oligosaccharide with a peptide axis the O-glycoside link which allows the association of an oligosaccharide with a Serine or Threonine (and rarely hydroxylysine) residue via a galactosamine. N-acetylated and the N-glycosidic bond which attaches an oligosaccharide to an asparagine residue via an N-acetylated glucosamine.
Pour déglycosyler les glycoprotéines, deux types de traitement peuvent être appliqués - des traitements aspécifiques permettant d'éliminer tous
les types de radicaux glucidiques, qu'ils soient liés à
la protéine par une liaison N- ou une liaison
O-glycosidique. C'est le cas par exemple du traitement
chimique par l'acide trifluorométhanesulfonique (TFMS); - des traitements spécifiques de l'un ou llautre de ces
types de liaison. C'est le cas de la ss-élimination par
la soude pour les liaisons O-glycosiaique et un certain
nombre d'hydrolyse enzymatique plus ou moins spécifique
de la nature chimique du sucre N-lié pour les liaisons
N-glycosidiques.To deglycosylate the glycoproteins, two types of treatment can be applied - specific treatments allowing to eliminate all
types of carbohydrate radicals, whether related to
the protein by an N- bond or a bond
O-glycosidic. This is the case, for example, with treatment
chemical with trifluoromethanesulfonic acid (TFMS); - specific treatments for one or the other of these
types of binding. This is the case of ss-elimination by
soda for O-glycosia bonds and some
more or less specific number of enzymatic hydrolysis
of the chemical nature of N-linked sugar for bonds
N-glycosides.
a) Traltement assécifioue tar le TFMS
L'analyse par immunotransfert après PAGE-SDS (7,5%) d'un extrait antigénique traité par le TFMS et d'un extrait incubé dans l'eau montre que les protéines antigéniques présentent une légère diminution de masse molaire apparente par rapport à l'échantillon témoin.a) Tralement assécifioue tar TFMS
Analysis by immunoblot after SDS-PAGE (7.5%) of an antigenic extract treated with TFMS and of an extract incubated in water shows that the antigenic proteins show a slight decrease in apparent molar mass compared to the control sample.
Bien que faible cette différence d'environ 10 à 20 kD est observée pour toutes les conditions de traitement et retrouvée dans deux expériences distinctes. L'analyse en immunotransfert après IEF des protéines d'un extrait d'épithéliums d'oesophage de rat traité par le TFMS montre que l'immunoréactivité spécifique des sérums de patients atteints de -PR sur les échantillons témoins s'étale dans une zone de pHi d'environ 5,2 à 7,3. Après traitement des TFMS, les protéines immunodétectées par les sérums de patients atteints de PR ont présenté des pHi plus basiques compris entre 6 et 8.Although small, this difference of approximately 10 to 20 kD is observed for all the treatment conditions and found in two separate experiments. Immunoblot analysis after IEF of the proteins of an extract of rat esophageal epithelia treated with TFMS shows that the specific immunoreactivity of the sera of patients with -PR on the control samples spreads over an area of pHi from about 5.2 to 7.3. After treatment for TFMS, the proteins immunodetected by the sera of patients with RA presented more basic pHi between 6 and 8.
Ce changement de pHi et de masse molaire apparente des protéines antigéniques est en faveur d'une substitution glycanique des molécules. Cependant la persistance d'une mauvaise définition en PAGE-SDS et d'une large gamme de pHi en IEF suggère que les protéines anti génioues pourraient être substituées aussi par d'autres radicaux non glucidiques et/ou que les effets observés pourraient être dus au clivage d'une liaison peptidique particulièrement fragile. This change in pHi and apparent molar mass of the antigenic proteins is in favor of a glycan substitution of the molecules. However, the persistence of a poor definition in PAGE-SDS and a wide range of pHi in IEF suggests that anti geniou proteins could also be substituted by other non-carbohydrate radicals and / or that the observed effects could be due to cleavage of a particularly fragile peptide bond.
Toutefois, la conservation de l'immuno-réactivité après traitement par le TFMS est un argument fort en faveur de la nature non glucidique du ou des épitopes reconnus par les autoanticorps spécifiques de la PR. However, the conservation of the immunoreactivity after treatment with TFMS is a strong argument in favor of the non-carbohydrate nature of the epitope (s) recognized by the specific autoantibodies of RA.
b) Traitement spécifique tar la PNGase F
Afin de confirmer les résultats obtenus avec le TFMS, les Inventeurs ont entrepris des expériences de déglycosylation par l'enzyme PNGase F qui élimine spécifiquement les sucres N-liés.b) Specific treatment for PNGase F
In order to confirm the results obtained with TFMS, the inventors undertook deglycosylation experiments with the PNGase F enzyme which specifically eliminates N-linked sugars.
La déglycosylation par la PGNase F a été effectuée sur un extrait antigénique brut après dialyse contre de l'eau et lyophilisation. L'analyse de cet extrait par immunodétection en PAGE-SDS et transfert ne fait apparaître aucune différence entre l'antigène témoin et l'antigène traité par la PNGase F. Deux interprétations de ce résultat sont possibles - l'antigène n'est pas substitué par des
N-oligosaccharides, - les oligosaccharides branchés à des résidus asparagine
de la protéine ont une structure chimique originale qui
les empêche d'être clivés par la PNGase F.Deglycosylation with PGNase F was carried out on a crude antigenic extract after dialysis against water and lyophilization. Analysis of this extract by immunodetection in PAGE-SDS and transfer does not show any difference between the control antigen and the antigen treated with PNGase F. Two interpretations of this result are possible - the antigen is not substituted by
N-oligosaccharides, - oligosaccharides connected to asparagine residues
of protein have an original chemical structure which
prevents them from being cleaved by PNGase F.
Cependant, une seule analyse monodimensionnelle ne permet pas d'affirmer clairement l'insensibilité à la PNGase F des protéines antigéniques puisque cellesci se superposent partiellement, comme le montre l'analyse en électrophorèse bidimensionnelle. However, a single one-dimensional analysis does not make it possible to clearly state the insensitivity to PNGase F of the antigenic proteins since these are partially superimposed, as shown by the analysis in two-dimensional electrophoresis.
3) Détection des sucres tar des lectines
La réactivité éventuelle de l'antigène avec la lectine de germe de blé (W.G.A.) ou la concanavaline (conA) a été testée par "affinodétection" sur nitrocellulose antigénique et comparée aux profils d'immunodétection spécifiques des sérums de PR.3) Detection of lectins tar sugars
The possible reactivity of the antigen with wheat germ lectin (WGA) or concanavalin (conA) was tested by "affinodetection" on antigenic nitrocellulose and compared with the specific immunodetection profiles of RA sera.
Les protéines de 1extrait antigénique brut, reconnues après PAGE-SDS ou PAGE en conditions natives, par un sérum de patients atteints de PR, ont été différentes des protéines reconnues par les lectines. Cependant, des zones communes de réactivité, en particulier au niveau de la protéine de 210 kD en PAGE-SDS, suggère que la WGA et la ConA reconnaissent une partie de l'antigène. The proteins of the crude antigen extract, recognized after PAGE-SDS or PAGE under native conditions, by a serum of RA patients, were different from the proteins recognized by lectins. However, common zones of reactivity, in particular at the level of the 210 kD protein in SDS-PAGE, suggests that the WGA and the ConA recognize part of the antigen.
Des fractions antigéniques purifiées par chromatographie de filtration sur gel ont été analysées dans les mêmes conditions. Cette expérience a confirmé que des glycoprotéines de même poids moléculaire que certaines protéines antigéniques étaient reconnues par la ConA et que le profil de réactivité de la WGA semblait se rapprocher de celui d'un sérum de patients atteints de PR.Antigenic fractions purified by gel filtration chromatography were analyzed under the same conditions. This experiment confirmed that glycoproteins of the same molecular weight as certain antigenic proteins were recognized by ConA and that the reactivity profile of WGA seemed to approximate that of a serum of RA patients.
La preuve dune affinité des lectines vis-àvis des protéines antigéniques a été obtenue après tEF/PAGE-SDS de l'extrait antigénique brut. Evidence for an affinity of the lectins for the antigenic proteins was obtained after tEF / PAGE-SDS of the crude antigenic extract.
La figure 8 représente la détection des protéines d'un extrait antigénique brut, après électrophorèse bidimensionnelle (IEF pHi 5 à 8/PAGE-SDS 7,5%) et transfert sur nitrocellulose, avec - en (2) : un sérum de patients atteints de PR GIFOR +, - en (4) : la ConA, - en (5) : la WGA, afin d'amplifier la réactivité, trois dépôts d'extraits antigéniques ont été effectués sur le gel d'IEF. Une fraction de l'antigène (bande à 200 kD et zone immunoréactive entre 90 et 130 kD) déposée côté anode y a précipité, produisant une réactivité artéfactuelle dans la zone des pHi acides. FIG. 8 represents the detection of the proteins of a crude antigenic extract, after two-dimensional electrophoresis (IEF pHi 5 to 8 / PAGE-SDS 7.5%) and transfer to nitrocellulose, with - in (2): a serum of patients with of PR GIFOR +, - in (4): ConA, - in (5): WGA, in order to amplify the reactivity, three deposits of antigenic extracts were made on the gel of IEF. A fraction of the antigen (band at 200 kD and immunoreactive zone between 90 and 130 kD) deposited on the anode side precipitated there, producing an artefactual reactivity in the zone of acid pHi.
Cette étude a permis de montrer que les molécules reconnues par la ConA étaient différentes de l'antigène, mais que la WGA s'associait spécifiquement aux protéines antigéniques de 90-130 kD et 210 kD. Les protéines immunoréactives en forme de "virgule" s'étalant de 120 kD à 67 kD avec des pHi de 5 à 7,5 ne présentent, par contre, aucune réactivité vis-à-vis de la WGA. This study made it possible to show that the molecules recognized by ConA were different from the antigen, but that the WGA associated specifically with the antigenic proteins of 90-130 kD and 210 kD. The immunoreactive proteins in the form of a "comma" ranging from 120 kD to 67 kD with pHi of 5 to 7.5 do not, on the other hand, show any reactivity towards WGA.
EXEMPLE 2 - CARACTERISATION DE L 'ANTIGENH EXTIT DE
L'EPIDERME HUMAIN SPECIFIQUE DE LA
POLYARTHRITE RHDDATO IDE
I - MATERIEL ET METHODE
A - PATIENTS ET SERUMS
La présente étude a été réalisée à partir de 64 sérums de patients atteints de diverses maladies rhu matologiques parfaitement caractérisées sur les plans clinique et biologique. Parmi ces 64 sérums, 45 proviennent de patients atteints d'une polyarthrite rhumatoïde défile selon les critères de lAmerican Rhumatism Asso- ciation. 32 sérums provenant de sujets sains, hommes et femmes, ont été utilisés à titre de contrôle.EXAMPLE 2 - CHARACTERIZATION OF THE ANTIGENH EXTIT OF
THE SPECIFIC HUMAN EPIDERMIS OF THE
POLYARTHRITIS RHDDATO IDE
I - MATERIAL AND METHOD
A - PATIENTS AND SERUMS
The present study was carried out on 64 sera from patients suffering from various rheumatic diseases perfectly characterized clinically and biologically. Among these 64 sera, 45 come from patients suffering from rheumatoid arthritis scrolling according to the criteria of the American Rheumatism Association. 32 sera from healthy subjects, men and women, were used as a control.
L'immunodétection a été réalisée à l'aide de deux anticorps monoclonaux, l'un spécifique des cytokératintes humaines dénommé F 12-19 (réf. iblio. ou ou rét
Biosoft-Clonatec), l'autre spécifique de la filaggrine humaine dénommé AKH-1 (réf. Blblio. ou réf. Biomédical
Technologies Inc.).The immunodetection was carried out using two monoclonal antibodies, one specific for human cytokeratints called F 12-19 (ref. Iblio. Or or ret
Biosoft-Clonatec), the other specific for human filaggrin called AKH-1 (ref. Blblio. Or ref. Biomedical
Technologies Inc.).
B - EXTRACTION EXTRACTION DES PROTEINES EPIDERMIQUES
Des fragments de peau recueillis après chirurgie plastique mammaire et abdominale ou après circoncision ont été conservés à -80'C. L'épiaerme a été séparé mécaniquement du derme, selon la méthode décrite par Kassis et Sondergaard (Arch. Dermatol. Res. 273 301-306, 1982), par un traitement thermique à 57'C en tampon PBS (KH2-/K2H-PO4 8,5 mM ; NaCI 150 mM) contenant de i'EDTA 5 mM et du Phénylméthylsulfonylfluoride (PMSF) 0,5 mM puis broyé mécaniquement en tampon Tris-HCl 40 mM pH 7,* ; NaCl 150 mM ; EDTA 10 mM ; NP40 0,5 mM, ci-après dénommé tampon A.B - EXTRACTION EXTRACTION OF EPIDERMAL PROTEINS
Skin fragments collected after breast and abdominal plastic surgery or after circumcision were stored at -80 ° C. The epiaerm was mechanically separated from the dermis, according to the method described by Kassis and Sondergaard (Arch. Dermatol. Res. 273 301-306, 1982), by heat treatment at 57 ° C. in PBS buffer (KH2- / K2H- 8.5 mM PO4; 150 mM NaCl) containing 5 mM EDTA and 0.5 mM Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) then mechanically milled in 40 mM Tris-HCl buffer pH 7, *; 150 mM NaCl; 10 mM EDTA; NP40 0.5 mM, hereinafter called buffer A.
Après centrifugation à 12 000 g pendant 15 minutes, le surnageant a été séparé du culot contenant les cytokératines épidermiques. After centrifugation at 12,000 xg for 15 minutes, the supernatant was separated from the pellet containing the epidermal cytokeratins.
En outre, d'autres extractions ont été réalisées selon le même protocole mais dans un tampon Tris-HOl 20 mM pH 7,4 ; PMSF 0,5 mM, ci-après dénommé tampon B. In addition, other extractions were carried out according to the same protocol but in a 20 mM Tris-HO1 buffer, pH 7.4; 0.5 mM PMSF, hereinafter referred to as buffer B.
Les différentes fractions ont été conservées à -20'C. The different fractions were kept at -20 ° C.
C - ELECTROPHORESES
Les protéines des diverses fractions ont été analysées par focalisation isoélectrique à l'équilibre ou avant ltéquilibre, ou par électrophorèse en gel d'acrylamide (PAGE) en présence de sodium dodécyl sulfate (conditions dénaturantes ; PAGE-SDS) ou en absence de sodium dodécyl sulfate (conditions natives ; PAGE-native).C - ELECTROPHORESES
The proteins of the various fractions were analyzed by isoelectric focusing at equilibrium or before equilibrium, or by acrylamide gel electrophoresis (PAGE) in the presence of sodium dodecyl sulfate (denaturing conditions; PAGE-SDS) or in the absence of sodium dodecyl sulfate (native conditions; PAGE-native).
Des électrophorèses bidimensionnelles ont également été réalisées.Two-dimensional electrophoresis was also carried out.
Les protéines ont parfois été précipitées par 4 volumes d'éthanol ou par l'acide trichloroacétique (TCA) 15% final, afin d'en augmenter la concentration. The proteins were sometimes precipitated by 4 volumes of ethanol or by 15% trichloroacetic acid (TCA) final, in order to increase the concentration.
D - INODETECTION
Les protéines ont été transférées sur membrane de nitrocellulose selon la technique décrite par TOWBIN et al. (PNAS 76 : 4350-4354, 1979). Les sérums ont été utilisés dilués du 1/10 au 1/100 après incubation des bandelettes de nitrocellulose en PBS, Tween-20 0,05%.D - INODETECTION
The proteins were transferred onto a nitrocellulose membrane according to the technique described by TOWBIN et al. (PNAS 76: 4350-4354, 1979). The sera were used diluted 1/10 to 1/100 after incubation of the nitrocellulose strips in PBS, Tween-20 0.05%.
L'incubation en présence des sérums a été poursuivie pendant 1 heure à 37'C puis 12 heures à 4 C. Incubation in the presence of the sera was continued for 1 hour at 37 ° C. and then 12 hours at 4 ° C.
Les anticorps monoclonaux AKH-1 dilué au 1/100 ou F12-19 dilué au 1/500 ont été incubés pendant 2 heures à 37 C. Après lavages, les bandelettes de nitrocellulose ont été révélées par des anticorps secondaires, anti-IgG humaines ou murines marquées à la peroxydas e. The monoclonal antibodies AKH-1 diluted 1/100 or F12-19 diluted 1/500 were incubated for 2 hours at 37 C. After washing, the nitrocellulose strips were revealed by secondary antibodies, anti-human IgG or murines marked with peroxydas e.
E - TRAITEMENTS ENZYMATIQUES
L'extrait épidermique concentré (80 Rg/l) a été traité par la protéinase K (1 mg/ml, 30 minutes, 37 C en présence de SDS 1%) ou par la nucléase microccocale (100 U/ml, 30 minutes, 37 C dans un tampon Tris-CaC12 5mM, Tris-HOl 30 mM pH8). E - ENZYMATIC TREATMENTS
The concentrated epidermal extract (80 Rg / l) was treated with proteinase K (1 mg / ml, 30 minutes, 37 C in the presence of 1% SDS) or with microccocal nuclease (100 U / ml, 30 minutes, 37 C in a 5 mM Tris-CaC12 buffer, 30 mM Tris-HO1 pH8).
F - IMMUNOPRECIPITATION -
L'extrait épidermique préadsorbé sur Protéine
A-Sepharose a été incubé à 37'C pendant 2h en présence de l'anticorps AKH-1 ou F12-19 et de NaCl, 1 M final.F - IMMUNOPRECIPITATION -
Preadsorbed epidermal extract on Protein
A-Sepharose was incubated at 37 ° C for 2 h in the presence of the antibody AKH-1 or F12-19 and NaCl, 1 M final.
Les complexes anticorps-antigène formés ont été ensuite recueillis par la protéine A-Sepharose puis analysés par immunotransfert après PAGE-SDS. The antibody-antigen complexes formed were then collected by the protein A-Sepharose and then analyzed by immunoblotting after PAGE-SDS.
G - PURIFICATION DES CYTOKERATINES
Les cytokératines uréosolubles ont été purifiées à partir d'épiderme mammaire selon la méthode dé crite par SUN et GREEN (J. Biol. Chem. 252 : 2053-2060, 1978).G - PURIFICATION OF CYTOKERATINS
The water-soluble cytokeratins were purified from mammary epidermis according to the method described by SUN and GREEN (J. Biol. Chem. 252: 2053-2060, 1978).
H - PURIFICATION DE LA FILAGGRINE HUMAINE
La filaggrine a été extraite à partir de peau mammaire selon la technique décrite par LIMLEY et DALE (BBA 774 : 28-35, 1983) avec les modifications sui vantes : extrait épidermique en urée 6M, préparé en absence d'agent réducteur, a été purifié sur chromatographie FPLC avec une résine échangeuse d'anions. Les protéines cationiques non retenues ont été précipitées par 4 volumes d'acétone, redissoutes dans un petit volume de tampon contenant 1,5% de SDS et 2,5% de 2-mercaptoéthanol et déposées au sommet d'un gel préparatif SDS de 10 cm de hauteur. Ce gel a ensuite été transféré sur une membrane du type Immobilan-PVDF commercialisée par la Société
MILLIPORE.La zone correspondant à la filaggrine a été repérée par immunodétection avec l'anticorps AKE-1 et découpée ; la filaggrine a alors été éluée par 0,3 ml/cm2 de tampon d'élution (Tris-HCl 50 mM pH 8,8 SDS 2%
Triton X-100 1t) et concentrée par précipitation.H - PURIFICATION OF HUMAN FILAGGRIN
Filaggrin was extracted from breast skin according to the technique described by LIMLEY and DALE (BBA 774: 28-35, 1983) with the following modifications: epidermal extract in 6M urea, prepared in the absence of reducing agent, was purified on FPLC chromatography with an anion exchange resin. The cationic proteins not retained were precipitated with 4 volumes of acetone, redissolved in a small volume of buffer containing 1.5% of SDS and 2.5% of 2-mercaptoethanol and deposited on top of an SDS preparative gel of 10 cm in height. This gel was then transferred to a Immobilan-PVDF type membrane marketed by the Company
MILLIPORE. The area corresponding to filaggrin was identified by immunodetection with the antibody AKE-1 and cut out; the filaggrin was then eluted with 0.3 ml / cm2 of elution buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.8 2% SDS
Triton X-100 1t) and concentrated by precipitation.
I - PURIFICATION DE L'ANTIGENE
20 cm2 d'épiderme mammaire ont été broyés au potter électrique dans le tampon A. L'homogénat a été centrifugé pendant 15 minutes à 10 000 g et le surnageant précipité par le TCA (15% final). Le précipité a été resolubilisé dans un petit volume de Tris-HCl 30 mM pH8, CaC12 5mM ; la fraction soluble a été clarifiée par centrifugation, additionnée de SDS 1,5 et 2ME 2,5* et déposée au sommet d'un gel préparatif SDS de 10 cm de hauteur. L'antigène a alors été purifié comme décrit cidessus pour la filaggrine, la zone correspondant à l'antigène étant référée par immunodétection avec un sérum de polyarthrite rhumatoide.I - PURIFICATION OF THE ANTIGEN
20 cm2 of mammary epidermis were ground in an electric potter in buffer A. The homogenate was centrifuged for 15 minutes at 10,000 g and the supernatant precipitated by TCA (15% final). The precipitate was resolubilized in a small volume of 30 mM Tris-HCl pH8, 5 mM CaCl 2; the soluble fraction was clarified by centrifugation, added with SDS 1.5 and 2ME 2.5 * and deposited on top of an SDS preparative gel 10 cm in height. The antigen was then purified as described above for filaggrin, the zone corresponding to the antigen being referred by immunodetection with a serum of rheumatoid arthritis.
II - RESULTATS
A - CARACTERISATION PHYSICO-CHIMIQUE ET
BIOCHIMIQUE DE L 'ANTIGENE
Afin de caractériser l'antigène reconnu par les sérums de polyarthrite rhumatoide, un extrait épidermique mammaire a été préparé par homogénéisation d'épiderme mammaire dans le tampon A, en présence d'un détergent non ionique (NP40). Cet extrait soluble a été analysé par immunodétection après PAGE et transfert des protéines sur nitrocellulose.II - RESULTS
A - PHYSICO-CHEMICAL CHARACTERIZATION AND
BIOCHEMICAL ANTIGEN
In order to characterize the antigen recognized by the rheumatoid arthritis sera, a mammary epidermal extract was prepared by homogenization of the mammary epidermis in buffer A, in the presence of a nonionic detergent (NP40). This soluble extract was analyzed by immunodetection after PAGE and transfer of the proteins to nitrocellulose.
La figure 9 représente l'analyse en immunotransfert de l'extrait NP40 précédent avec des sérums de polyarthrite rhumatoide et des sérums de contrôle. FIG. 9 represents the immunoblot analysis of the preceding NP40 extract with rheumatoid arthritis sera and control sera.
L'extrait NP40 (8 mg/ml) a été précipité par TCA, repris en tampon Tris-CaC12 en le concentrant 7 fois puis analysé par immunotransfert après PAGE-SDS (gradient 8-25%).The NP40 extract (8 mg / ml) was precipitated by TCA, taken up in Tris-CaC12 buffer by concentrating it 7 times then analyzed by immunoblotting after PAGE-SDS (gradient 8-25%).
Les sérums ont été dilués au 1/10 en PBS-Tween 20 0,05%.The sera were diluted 1/10 in 0.05% PBS-Tween 20.
les sérums 1 et 3 proviennent de patients atteints de myolane malui, le sérum 2 provient d'un patient atteint de la maladie de SHARP, le sérum 4 provient d'un patient atteint d'arthrose, le sérum 5 provient d'un patient atteint de polymyosite, le sérum 6 provient d'un patient atteint de la maladie de BIAGET, les sérums 7 à 21 proviennent de patients atteints de polyarthrite rhumatoide et les sérums 22 à 38 proviennent de sujets normaux ; t0 est un témoin incubé seulement avec l'anticorps anti-IgG humaine marquée.sera 1 and 3 are from patients with myolan malui, serum 2 is from a patient with SHARP disease, serum 4 is from a patient with osteoarthritis, serum 5 is from a patient polymyositis, serum 6 is from a patient with BIAGET disease, sera 7 to 21 are from patients with rheumatoid arthritis and sera 22 to 38 are from normal subjects; t0 is a control incubated only with the labeled anti-human IgG antibody.
La plupart des sérums de patients atteints de polyarthrite rhumatoide (80%) ont reconnu une protéine présentant en gel SDS (conditions dénaturantes)-un poids moléculaire d'environ 40 kD. Sa migration n'a pas été mo difiée par l'omission de l'agent réducteur (2ME) dans le tampon d'échantillon, ce qui indique que cette molécule ne contient probablement pas de pont disulfure. Au concraire, 89% des sérums de patients atteints d'une ma laaie rhumatologique autre que la polyarthrite rhumatoide et aucun des sérums de contrôle n'ont reconnu cet antigène. Une protéine de 68 kD a été détectée non spécifiquement par une large portion de sérums appartenant à tous les groupes testés et donc vraisemblablement par des autoanticorps naturels. Most of the sera from patients with rheumatoid arthritis (80%) have recognized a protein having an SDS gel (denaturing conditions) - a molecular weight of approximately 40 kD. Its migration was not modified by the omission of the reducing agent (2ME) in the sample buffer, which indicates that this molecule probably does not contain a disulfide bridge. Conversely, 89% of the sera from patients suffering from rheumatoid arthritis other than rheumatoid arthritis and none of the control sera recognized this antigen. A 68 kD protein was detected non-specifically by a large portion of sera belonging to all the groups tested and therefore probably by natural autoantibodies.
La figure 10 représente l'analyse en immunotransfert de l'extrait antigénique NP40 précédent, traité ou non par une nucléase (1) ou une protéase (2). En (1), l'extrait NP40 d'épiderme mammaire a été précipité par le
TCA, repris en tampon Tris-CaC12 puis traité avec (+) ou sans (-) nucléase microccocale (100 U/ml) pendant 30 minutes à 37'C. En (2), l'extrait NP40 d'épiderme humain identique au précédent a été précipité par le TCA puis repris dans SDS 1% et traité sans (-) ou avec (+) 10 mg/ml de protéinase K pendant 30 minutes à 37'C. Dans tous les cas, les protéines ont été séparées en PAGE-SDS (8-25%), transférées puis immunodétectées avec des sérums de contrôle (a) et des sérums de patients atteints de polyarthrite rhumatoide (b) dilués au 1,'100. La disparition de la région immunoréactive après un traitement de l'extrait par la protéinase K confirme la nature pro téioue de la molécule porteuse du ou des épitopes reconnus car les autoanticorps, alors que cette région n'a pas été modifiée après une digestion des acides nucléiques par la nucléase de Micrococcus, les molécules reconnues spécifiquement par les sérums de patients atteints de PR après transfert et immunodétection des protéines épidermiques analysées par PAGE en conditions natives, sont hétérogènes. FIG. 10 represents the immunoblot analysis of the preceding NP40 antigenic extract, whether or not treated with a nuclease (1) or a protease (2). In (1), the NP40 extract of breast epidermis was precipitated by the
TCA, taken up in Tris-CaC12 buffer then treated with (+) or without (-) microccocal nuclease (100 U / ml) for 30 minutes at 37 ° C. In (2), the NP40 extract of human epidermis identical to the previous one was precipitated by TCA then taken up in SDS 1% and treated without (-) or with (+) 10 mg / ml of proteinase K for 30 minutes at 37'C. In all cases, the proteins were separated into SDS-PAGE (8-25%), transferred then immunodetected with control sera (a) and sera from patients suffering from rheumatoid arthritis (b) diluted to 1, 100 . The disappearance of the immunoreactive region after treatment of the extract by proteinase K confirms the protective nature of the molecule carrying the epitope (s) recognized as autoantibodies, whereas this region has not been modified after digestion of the acids. nucleic acid by Micrococcus nuclease, the molecules specifically recognized by the sera of RA patients after transfer and immunodetection of the epidermal proteins analyzed by PAGE under native conditions, are heterogeneous.
La figure 11 représente l'analyse de l'antigène par cette électrophor..èse en conditions natives cette analyse a consisté à précipiter l'extrait NP40 d'épiderme humain par l'éthanol, puis à effectuer une immunodétection après PAGE en conditions natives (8-25%) et transfert sur nitrocellulose avec des sérums de patients atteints de PR (sérums 1 à 4 et 8 à 8) et de sérums témoins (sérums 5 à 7), dilués au 1/100. FIG. 11 represents the analysis of the antigen by this electrophoresis under native conditions this analysis consisted in precipitating the NP40 extract of human epidermis with ethanol, then in carrying out an immunodetection after PAGE under native conditions ( 8-25%) and transfer to nitrocellulose with sera from RA patients (sera 1 to 4 and 8 to 8) and control sera (sera 5 to 7), diluted to 1/100.
La figure 12 représente l'analyse de l'antigène par isoélectrofocalisation (IEF). Les protéines de l'extrait NP40 d'épiderme mammaire ont été précipitées par l'éthanol, séparées par IEF (pHi 3 à 9), transférées sur nitrocellulose avec des sérums de patients atteints de polyarthrite rhumatoide (sérums S à 12) et des sérums témoins (sérums 1 à 4) dilués au 1/100, puis immunodétectées. L'antigène présente aussi une distribution très hétérogène de pHi, ceux-ci variant de 5,8 à 7,4. FIG. 12 represents the analysis of the antigen by isoelectric focusing (IEF). The proteins of the NP40 extract of breast epidermis were precipitated by ethanol, separated by IEF (pHi 3 to 9), transferred to nitrocellulose with sera from patients suffering from rheumatoid arthritis (sera S to 12) and sera controls (sera 1 to 4) diluted 1/100, then immunodetected. The antigen also has a very heterogeneous distribution of pHi, these varying from 5.8 to 7.4.
Cette hétérogénéité de pHi a été vérifiée en électrophorèse 2D (IEF/PAGE-SDS). La protéine reconnue spécifiquement par les sérums de patient atteints de PR, après transfert d'un tel geL 2D montre une image caractéristique en forme de virgule, le poids moléculaire apparent diminuant au fur et à mesure que le pHi devient plus basique.This heterogeneity of pHi was verified by 2D electrophoresis (IEF / PAGE-SDS). The protein recognized specifically by the sera of patients suffering from RA, after transfer of such a 2D geL shows a characteristic image in the form of a comma, the apparent molecular weight decreasing as the pHi becomes more basic.
La figure 13 représente l'analyse de l'antigène en gel bidimensionnel IEF/PAGE-SDS ; les protéines de l'extrait NP40 d'épiderme mammaire ont été précipitées par l'éthanol, séparées par IEF (pHi 5 à 8) suivi de
PAGE-SDS (12,5%), transférées sur nitrocellulose et immunodétectées par un sérum de patient atteint de polyarthrite rhumatoide (PR) et un sérum de contrôle.FIG. 13 represents the analysis of the antigen in two-dimensional gel IEF / PAGE-SDS; the proteins of the NP40 extract of breast epidermis were precipitated with ethanol, separated by IEF (pHi 5 to 8) followed by
SDS-PAGE (12.5%), transferred to nitrocellulose and immunodetected by a serum from a patient suffering from rheumatoid arthritis (RA) and a control serum.
L'hétérogénéité marquée de l'antigène, aussi bien en masse qu'en pHi, indique probablement la présence d'isoformes modifiées ; elle suggère qu'il pourrait être glycosylé et/ou phosphorylé. Cependant un traitement par la N-peptide N-glycosidase-F n'a modifié ni sa -migration ni son immunoréactivité après PAGE-SDS. The marked heterogeneity of the antigen, both in mass and in pHi, probably indicates the presence of modified isoforms; it suggests that it could be glycosylated and / or phosphorylated. However, treatment with N-peptide N-glycosidase-F did not modify its migration or its immunoreactivity after PAGE-SDS.
3 - HROSOLUILITE DE L 'ANTIGENE
5 cm2 d'épiderme mammaire ont été broyés mécaniquement dans le tampon A ou dans le tampon B. Les homogénats ont ensuite été centrifugés 10 minutes à 10 000 g et une quantité égale des protéines solubles des deux surnageants a été précipitée par l'éthanol puis séparée par PAGE en conditions natives (8-25e), transférée sur nitrocellulose puis immunodétectée des sérums de patients atteints de PR et des sérums de contrôle. Cette étude indilue que l'antigène est extrait non seulement en présence d'un détergent (tampon A) mais également en son absence (tampon B). En outre, l'antigène est toujours retrouvé majoritairement dans les fractions solubles et présents dans les culots en très faible quantité.Ces résultats indiquent que 1antigène humain, comme celui d'oesophage de rat est une molécule très hydrosoluble.3 - HROSOLUILITY OF THE ANTIGEN
5 cm 2 of mammary epidermis were mechanically ground in buffer A or in buffer B. The homogenates were then centrifuged for 10 minutes at 10,000 g and an equal quantity of the soluble proteins of the two supernatants was precipitated with ethanol and then separated by PAGE under native conditions (8-25), transferred to nitrocellulose then immunodetected from sera from RA patients and from control sera. This study indiluates that the antigen is extracted not only in the presence of a detergent (buffer A) but also in its absence (buffer B). In addition, the antigen is always found mainly in soluble fractions and present in the pellets in very small quantities. These results indicate that the human antigen, like that of rat esophagus is a highly water-soluble molecule.
C - EXPRESSION DE L'ANTIGANG DANS DIFFERENTS
TERRITOIRES ANATOMIQUES EPIDERMIQUES
L'analyse par immunotransfert des protéines d'un extrait NP40 d'épiderme abdominal et d'épiderme préputial indique que l'antigène associé à la PR est présent dans l'épiderme humain indépendamment du sexe et du territoire anatomique (sein, abdomen ou prépuce), ainsi que de l'âge (enfants et adultes). L'antigène étant histologiquement localisé dans le Stratum corneum, il est légitime de penser que son abondance dépendra de
L'épaisseur de celui-ci qui varie suivant le territoire anatomique.C - EXPRESSION OF ANTIGANG IN DIFFERENT
EPIDERMAL ANATOMICAL TERRITORIES
Immunoblot analysis of proteins from an NP40 extract of abdominal epidermis and preputial epidermis indicates that the antigen associated with RA is present in the human epidermis regardless of sex and anatomical territory (breast, abdomen or foreskin ), as well as age (children and adults). The antigen being histologically located in the Stratum corneum, it is legitimate to think that its abundance will depend on
The thickness of it which varies according to the anatomical territory.
D - IDENTIFICATION DE L'ANTIGèNE
L'antigène reconnu par les sérums de malades atteints de PR n'est pas une cytokératine épidermique humaine.D - IDENTIFICATION OF THE ANTIGEN
The antigen recognized by the sera of patients suffering from RA is not a human epidermal cytokeratin.
La figure 14 représente - en (a) : un extrait NP40 d'épiderme mammaire immuno
détecté, après PAGE-SDS (8-25*) et transfert sur nitro
cellulose, avec un sérum de patient atteint de PR, pré
incubé dune part avec le tampon d'extraction (1), avec
l'extrait lui-même (2) et avec une fraction insoluble
enrichie en cytokératine épidermique (3).FIG. 14 represents - in (a): an NP40 extract of immuno-mammary epidermis
detected, after PAGE-SDS (8-25 *) and transfer to nitro
cellulose, with RA patient serum, pre
incubated on the one hand with the extraction buffer (1), with
the extract itself (2) and with an insoluble fraction
enriched with epidermal cytokeratin (3).
- en (b) : les cytokératines uréosolubles immuno
détectées, après PAGE-SDS (8-25%) et transfert, avec
l'anticorps monoclonal anti-cytokératine F12-19 pré
incubé soit avec le tampon d'extraction (1), soit avec
l'extrait épidermique (2), soit avec une fraction enri
chie en cytokératine (3), soit avec les cytokératines
uréosolubles (4).- in (b): the immunosoureasible cytokeratins
detected, after PAGE-SDS (8-25%) and transfer, with
monoclonal anti-cytokeratin antibody F12-19 pre
incubated either with the extraction buffer (1) or with
epidermal extract (2), either with an enri fraction
shit in cytokeratin (3), either with cytokeratins
water soluble (4).
- en (c) : les protéines de l'extrait d'épiderme (5), une
fraction enrichie en cytokératine z) et les cyto
kératines uréosolubles pures (7) séparées par PAGE-SDS
(8-25%), transférées et immunodétectées avec lAcM
anti-cytokératines F12-19.- in (c): the proteins of the epidermis extract (5), a
fraction enriched in cytokeratin z) and cyto
pure water-soluble keratins (7) separated by PAGE-SDS
(8-25%), transferred and immunodetected with mAb
anti-cytokeratin F12-19.
L'immunoréactivité des sérums de patients atteints de PR na pas été inhibée par une préincubation de ceux-ci sur des cytokératines épidermiques (enrichie ou purifiée) alors quelle a disparu en présence d'extrait hydrosoluble de peau. De même, l'anticorps monocLonal F12-19 na reconnu en immunotransfert, aucune protéine de l'extrait antigénique
La forme caractéristique en virgule de l'antigène en gel 2D et son poids moléculaire apparent en gel
SDS sont voisins de ceux de la filaggrine, protéine qui apparaît dans le Stratum granulosum au cours de la différenciation épidermique (SARRET et ai., Path. Biol.The immunoreactivity of sera from RA patients was not inhibited by preincubation of these on epidermal cytokeratins (enriched or purified), which then disappeared in the presence of water-soluble skin extract. Similarly, the monoclonal antibody F12-19 has not recognized in immunoblot, no protein of the antigenic extract
The characteristic comma form of the 2D gel antigen and its apparent gel molecular weight
SDS are similar to those of filaggrin, a protein which appears in the Stratum granulosum during epidermal differentiation (SARRET et al., Path. Biol.
37:297-303, 1989). Les Inventeurs ont donc cherché à déterminer si la filaggrine et l'antigène de l'invention étaient identiques et si les sérums de malades atteints de PR contenaient des autoanticorps anti-f ilaggrine. 37: 297-303, 1989). The inventors therefore sought to determine whether the filaggrin and the antigen of the invention were identical and whether the sera of patients suffering from RA contained anti-ilaggrin autoantibodies.
La figure 15 représente analyse d'un immunotransfert des protéines d'un extrait d'épiderme mammaire séparées en (A) par PAGE-SDS (12,5%), en (B) par PAGE en conditions natives et en (C) par IEF (pHi 3 à- 9), puis transférées sur nitrocellulqse et immunodétectées par des sérums de patients atteints de PR (sérums 1, 3, 6, 7 et 8), l'anticorps monoclonal anti-filaggrine AKH-1 (2), un anticorps monoclonal de contrôle (4) et un sérum de contrôle (5). Ces protéines ont été séparées en triplica (D) par NEpHGE suivi de PAGE-SDS (8-25%) puis transférées sur nitrocellulose et colorées au Rouge Ponceau (a) ou immunodétectées par l'anticorps monoclonal AKH-1 (b), et par un sérum de patient atteint de PR (c). L'antigène est reconnaissable à sa forme caractéristique en virgule. FIG. 15 represents analysis of an immunoblot of the proteins of an extract of mammary epidermis separated in (A) by PAGE-SDS (12.5%), in (B) by PAGE in native conditions and in (C) by IEF (pHi 3 to 9), then transferred to nitrocellulse and immunodetected by sera from RA patients (sera 1, 3, 6, 7 and 8), the anti-filaggrin AKH-1 monoclonal antibody (2), a control monoclonal antibody (4) and a control serum (5). These proteins were separated into triplica (D) by NEpHGE followed by PAGE-SDS (8-25%) then transferred to nitrocellulose and stained with Ponceau Red (a) or immunodetected by the monoclonal antibody AKH-1 (b), and with a serum from a patient with RA (c). The antigen is recognizable by its characteristic comma shape.
L'anticorps monoclonal antifilaggrine humaine
AKH-1 reconnaît spécifiquement en immunotransfert une protéine épidermique humaine soluble en présence de NP40, présentant les mêmes caractéristiques de migration en conditions d'électrophorèse dénaturante ou native que l'antigène de la PR. Après IEF et gel 2D, l'antigène et la protéine reconnus en immunotransfert par AKH-1 présentent une image identique.The human antifilaggrin monoclonal antibody
AKH-1 specifically recognizes in immunotransfer a human epidermal protein soluble in the presence of NP40, having the same migration characteristics under denaturing or native electrophoresis conditions as the RA antigen. After IEF and 2D gel, the antigen and protein recognized in immunoblotting by AKH-1 present an identical image.
Les Inventeurs ont alors cherché à déterminer si l'anticorps monoclonal AKH-1 pouvait immunoprécipiter l'antigène à partir de l'extrait épidermique en NP40. The inventors then sought to determine whether the monoclonal antibody AKH-1 could immunoprecipitate the antigen from the epidermal extract in NP40.
La figure 16 présente l'analyse comparative des protéines d'un extrait épidermique NP40, préabsorbées sur protéine A-Sepharose, séparées par PAGE-SDS (12,5%) - avant immunoprécipitation avec l'anticorps monoclonal
AKH-1 (totale), - après immunoprécipitation avec l'anticorps monoclonal
AKH-1 (IP KAH-l), - immunoprécipitation avec l'anticorps monoclonal de
contrôle G36 (IP G36),
puis, après transfert sur nitrocellulose, immuno
détectée avec AKH-1, G36, un sérum de patient atteint
de PR, un sérum de contrôle (CO) ou avec les seuls
anticorps secondaires anti-IG de souris (Tg S) et
anti-IG humaines (Tg h); les surnageants des fractions
immunoprécipitées avec G36 (Surn G36) et AKH-1
(Surn AKH-1) ont été analysées de la même façon après
précipitation avec le TCA.FIG. 16 presents the comparative analysis of the proteins of an NP40 epidermal extract, preabsorbed on protein A-Sepharose, separated by PAGE-SDS (12.5%) - before immunoprecipitation with the monoclonal antibody
AKH-1 (total), - after immunoprecipitation with the monoclonal antibody
AKH-1 (IP KAH-1), - immunoprecipitation with the monoclonal antibody of
G36 control (IP G36),
then, after transfer to nitrocellulose, immuno
detected with AKH-1, G36, a patient serum
of PR, a control serum (CO) or with the only
secondary anti-mouse IG antibodies (Tg S) and
anti-human GI (Tg h); the supernatants of the fractions
immunoprecipitated with G36 (Surn G36) and AKH-1
(Surn AKH-1) were analyzed in the same way after
precipitation with TCA.
Ces résultats montrent que AKE-1 a effectivement immunoprécipité une protéine épidermique de même poids moléculaire que l'antigène de la PR, cette molécule étant d'ailleurs reconnue spécifiquement en immunotransfert par les sérums de patients atteints de PR. These results show that AKE-1 has effectively immunoprecipitated an epidermal protein of the same molecular weight as the RA antigen, this molecule being moreover specifically recognized in immunoblotting by the sera of patients suffering from RA.
Cette immunoprécipitation a été réalisée en présence de
NaCl 1 M, ce qui rend peu probable une co-immunoprécipitation due à une association entre les deux protéines (filaggrine et antigène). Afin de vérifier que les protéines de l'extrait reconnu par AKH-1 et par les sérums de patients atteints de PR étaient les mêmes, les surnageants d'une immunoprécipitation par 1'anticorps monoclonal anti-filaggrine ont été subséquemment analysés par immunotransfert avec un sérum de patients atteints de PR.This immunoprecipitation was performed in the presence of
1 M NaCl, which makes co-immunoprecipitation unlikely due to an association between the two proteins (filaggrin and antigen). In order to verify that the proteins of the extract recognized by AKH-1 and by the sera of RA patients were the same, the supernatants of an immunoprecipitation by the anti-filaggrin monoclonal antibody were subsequently analyzed by immunoblotting with a serum from RA patients.
La figure 16 montre que l'extrait a été épuisé (partiellement ou totalement) en antigène et en filaggrine par l'anticorps monoclonal antifilaggrine. A l'inverse, les sérums de patients atteints de PR n'ont pas immunoprécipité l'antigène. Ce résultat négatif peut être dû à une faible affinité des autoanticorps pour l'antigène, à une trop faible quantité d'autoanticorps dans le sérum ou à une non reconnaissance par ceux-ci de l'antigène sous sa forme native. Cette dernière hypothèse est peu probable puisque l'antigène est immunodétectable sur nitrocellulose après électrophorèse en gel natif.FIG. 16 shows that the extract has been exhausted (partially or completely) in antigen and in filaggrin by the monoclonal antibody antifilaggrin. Conversely, sera from RA patients did not immunoprecipitate the antigen. This negative result may be due to a low affinity of the autoantibodies for the antigen, to a too small amount of autoantibodies in the serum or to a non-recognition by them of the antigen in its native form. The latter hypothesis is unlikely since the antigen is immunodetectable on nitrocellulose after native gel electrophoresis.
Afin de confirmer que la filaggrine et l'antigène de la PR ont au moins en commun l'épitoge détecté par 1anticorps monoclonal AKH-1, 1antigène a été purifié par élution à partir d'une membrane de transfert. In order to confirm that the filaggrin and the RA antigen at least have in common the epitog detected by the monoclonal antibody AKH-1, the antigen was purified by elution from a transfer membrane.
La figure 17 représente l'analyse par PAGE-SDS et immunotransfert des protéines des diverses fractions au cours de la purification. Les protéines totales d'un extrait d'épiderme humain (1), les protéines solubles après pré cipitation de l'extrait par le TCA (2) et celies de la fraction antigénique purifiée finale (3) ont été séparées par PAGE-SDS (12,5%), transférées sur nitrocellulose et colorées à l'amldo-plaque (Amido) ou immunodétectées avec un sérum de patients atteints de PR (PR), un sérum de contrôle (cl), un anticorps monoclonal anti-filaggrine (AKH-1) et un anticorps monoclonal de contrôle (G36).FIG. 17 represents the analysis by PAGE-SDS and immunotransfer of the proteins of the various fractions during the purification. The total proteins of a human epidermis extract (1), the soluble proteins after precipitation of the extract by TCA (2) and those of the final purified antigenic fraction (3) were separated by PAGE-SDS ( 12.5%), transferred to nitrocellulose and stained with amldo-plate (Amido) or immunodetected with a serum from RA patients (PR), a control serum (cl), a monoclonal anti-filaggrin antibody (AKH -1) and a monoclonal control antibody (G36).
Les protéines majeures, solubles après précipitation au TCA apparaissent sous la forme d'un doublet de poids moléculaire (PM) apparent d'environ 40 kD. Ce doublet est la principale bande immunoréactive reconnue par un sérum de patients atteints de PR. Cette protéine a alors été purifiée à partir d'un gel PAGE-SDS préparatif par transfert puis élution. L'antigène de la PR a été spécifiquement immunodétecté après PAGE-SDS, par l'anticorps monoclonal antifilaggrine AKH-1. The major proteins, soluble after precipitation with TCA, appear in the form of an apparent molecular weight (PM) doublet of approximately 40 kD. This doublet is the main immunoreactive band recognized by a serum from RA patients. This protein was then purified from a preparative PAGE-SDS gel by transfer then elution. The RA antigen was specifically immunodetected after PAGE-SDS by the monoclonal antibody antifilaggrin AKH-1.
De façon à vérifier que les sérums de patients atteints de PR reconnaissaient également la filaggrine humaine et donc que celle-ci était étroitement apparentée à l'antigène, les Inventeurs ont purifié la filaggrine selon la méthode décrite par LINNEY et DALE (BBA 744:28-35, 1983). La figure 18 représente l'analyse de la filaggrine humaine purifiée, analysée par PAGE-SDS (12,5%) transférée sur- nitrocellulose et immunodétectée avec des sérums de patients atteints de PR (sérums 1 à 4), un sérum de contrôle (sérum 5), un AcM de contrôle (6) et 1'AcM AKH-1 (7) ou colorée par le Rouge Ponceau (8). La figure 18 montre que les sérums de patients atteints de PR reconnaissent spécifiquement la filaggrine humaine. In order to verify that the sera of patients with RA also recognized human filaggrin and therefore that it was closely related to the antigen, the inventors purified filaggrin according to the method described by LINNEY and DALE (BBA 744: 28 -35, 1983). FIG. 18 represents the analysis of purified human filaggrin, analyzed by PAGE-SDS (12.5%) transferred onto nitrocellulose and immunodetected with sera from patients with RA (sera 1 to 4), a control serum ( serum 5), a control mAb (6) and the AKH-1 mAb (7) or stained with Rouge Ponceau (8). Figure 18 shows that sera from RA patients specifically recognize human filaggrin.
Claims (18)
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