FR2674632A1 - Process and device for the rapid detection of undesirable microorganisms in a product of the agrifood or medicoveterinary sector - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention a pour objet un procédé et un dispositif de détection rapide de la présence (ou de l'absence) de micro-organismes indésirables, dans un échantillon de taille et/ou de volume important, à l'état liquide, semi-liquide, gélifié, pâteux ou solide. The subject of the present invention is a method and a device for rapidly detecting the presence (or absence) of undesirable microorganisms, in a sample of large size and / or volume, in the semi-liquid state. liquid, gelled, pasty or solid.
On entend, au sens de la présente invention, par échantillon de taille importante, un échantillon d'une quantité de l'ordre de plusieurs grammes ; un échantillon conforme à l'invention peut notamment être un produit du domaine agro-alimentaire ou médico-vétérinaire (fluide biologique, par exemple). For the purposes of the present invention, the term “large sample” means a sample of an amount of the order of several grams; a sample in accordance with the invention may in particular be a product from the agri-food or medico-veterinary field (biological fluid, for example).
La détection qualitative et quantitative rapide de la présence de micro-organismes, tels que bactéries, levures, moisissures, parasites et virus, même présents en quantité extrêmement faible, dans des produits alimentaires, des produits d'hygiène ou des fluides, s'avère obligatoire dans le cadre de normes de qualité telles que celle définie dans l'Arrêté du 21 décembre 1979, norme relative aux critères microbiologiques auxquels doivent satisfaire certaines denrées (par exemple absence de Salmonella dans 25 g d'échantillon ou de Staphylocoque dans 1 g d'échantillon). The rapid qualitative and quantitative detection of the presence of microorganisms, such as bacteria, yeasts, molds, parasites and viruses, even present in extremely small quantities, in food products, hygiene products or fluids, proves to be mandatory within the framework of quality standards such as that defined in the Decree of December 21, 1979, standard relating to the microbiological criteria with which certain foodstuffs must meet (for example absence of Salmonella in 25 g of sample or Staphylococcus in 1 g of 'sample).
Pour détecter la présence d'un microorganisme, dans un produit donné, il existe à l'heure actuelle, un certain nombre de méthodes. To detect the presence of a microorganism in a given product, there are currently a number of methods.
On peut citer tout d'abord, la mise en culture de l'échantillon de produit à tester ; cette méthode permet une multiplication sélective des micro-organismes, dont la présence (ou l'absence) est ensuite contrôlée par exemple par coloration sélective et examen microscopique ou par toute autre méthode appropriée, et notamment l'utilisation d'une sonde dite immunitaire ou d'une sonde nucléique, la détection d'un métabolite spécifique, etc.... Cette méthode a l'avantage de permettre la détection de la contamination initiale de l'échantillon par un seul micro-organisme, grâce au pouvoir multiplicateur de la culture. First of all, mention may be made of the cultivation of the sample of product to be tested; this method allows a selective multiplication of microorganisms, whose presence (or absence) is then controlled for example by selective staining and microscopic examination or by any other suitable method, and in particular the use of a so-called immune probe or of a nucleic probe, the detection of a specific metabolite, etc. This method has the advantage of allowing the detection of the initial contamination of the sample by a single microorganism, thanks to the multiplying power of the culture.
Cependant, cette méthode a pour principaux inconvénients d'être longue à mettre en oeuvre, les microorganismes éventuellement présents, se développant dans un délai de 2 à 30 jours ; de plus, cette méthode ne permet qu'une évaluation approximative du nombre de microorganismes présents au départ et est donc peu quantitative. However, the main drawbacks of this method are that it takes a long time to implement, the microorganisms which may be present, developing within 2 to 30 days; moreover, this method allows only an approximate evaluation of the number of microorganisms present at the start and is therefore not very quantitative.
On peut également citer l'immunodiagnostic, qui utilise les propriétés que possèdent des anticorps choisis, de se fixer très spécifiquement sur un antigène spécifique du germe à détecter. Mention may also be made of immunodiagnosis, which uses the properties possessed by selected antibodies, to bind very specifically to an antigen specific for the germ to be detected.
Il est ainsi possible, par exemple, après filtration d'un échantillon de lait sur une membrane, de fixer sur les germes éventuellement retenus par ladite membrane, des anticorps marqués à l'aide d'un marqueur approprié (marqueur luminescent ou fluorescent, par exemple). Un examen de la membrane mi : microscopique, à l'oeil nu ou par des techniques de reconnaissance d'image, permet alors de distinguer la présence (ou de constater l'absence) du germe recherché. It is thus possible, for example, after filtration of a milk sample on a membrane, to fix on the germs possibly retained by said membrane, antibodies labeled with the aid of an appropriate marker (luminescent or fluorescent marker, by example). An examination of the mid-microscopic membrane, with the naked eye or by image recognition techniques, then makes it possible to distinguish the presence (or to note the absence) of the germ sought.
Ces techniques ont pour avantages principaux leur rapidité, leur aspect quantitatif (possibilité de mesurer le nombre approximatif de germes contenus dans l'échantillon) et la spécificité correspondant à celle du couple antigène-anticorps choisi. Cependant, l'immunodiagnostic a pour inconvénients principaux, une spécificité correspondant au couple antigène-anticorps choisi, qu'il n'est pas toujours possible de trouver suffisamment spécifique du germe précis recherché et une sensibilité généralement insuffisante pour détecter la présence, par exemple, d'une seule bactérie dans plusieurs grammes d'échantillons, comme exigé notamment dans le contrôle de qualité des aliments. The main advantages of these techniques are their speed, their quantitative aspect (possibility of measuring the approximate number of germs contained in the sample) and the specificity corresponding to that of the antigen-antibody couple chosen. However, immunodiagnosis has the main drawbacks, a specificity corresponding to the chosen antigen-antibody pair, which it is not always possible to find sufficiently specific for the precise germ sought and a sensitivity generally insufficient to detect the presence, for example, of a single bacterium in several grams of samples, as required in particular in the quality control of food.
On peut également citer la détection par sondes nucléiques, qui utilise la propriété que possède une sonde constituée d'un brin d'acide nucléique (ADN, par exemple), de se lier très sélectivement avec un autre brin d'acide nucléique comportant les bases complémentaires du premier brin (séquence complémentaire). En marquant la sonde par un marqueur approprié, radioactif ou fluorescent par exemple, il est possible de détecter la présence d'une séquence d'acide nucléique spécifique du germe particulier à détecter. Mention may also be made of detection by nucleic probes, which uses the property possessed by a probe consisting of a strand of nucleic acid (DNA, for example), to bind very selectively with another strand of nucleic acid comprising the bases complementary to the first strand (complementary sequence). By labeling the probe with an appropriate marker, radioactive or fluorescent for example, it is possible to detect the presence of a nucleic acid sequence specific for the particular germ to be detected.
De manière générale, cette méthode consiste à lyser l'échantillon, à en extraire l'ADN, à en amplifier sélectivement les brins recherchés, dont la présence est détectée par hybridation avec la sonde spécifique choi sie. In general, this method consists in lysing the sample, in extracting the DNA from it, in selectively amplifying the strands sought, the presence of which is detected by hybridization with the specific probe chosen.
La technique par hybridation a pour avantages principaux : sa rapidité, car l'ensemble des opérations sur l'échantillon peut s'effectuer dans une journée, compte-tenu de la rapidité des techniques d'amplification, sa spécificité, sa sensibilité et sa semi-quantitativité ; cependant, la technique par hybridation présente comme inconvénient principal, la difficulté, sinon l'impossibilité, technico-économique, d'extraire l'acide nucléique d'un échantillon aussi important que ce qu'exige certaines normes, de l'industrie agroalimentaire notamment, et de procéder à l'amplification et à la détection sélective d'une séquence particulière avec le fort bruit de fond engendré lorsqu'il s'agit par exemple de détecter la présence d'une seule bactérie dans un échantillon de viande de plusieurs grammes. The main advantages of the hybridization technique are its speed, since all the operations on the sample can be carried out in one day, taking into account the speed of the amplification techniques, its specificity, its sensitivity and its semi -quantitativity; However, the main disadvantage of the hybridization technique is the difficulty, if not the technico-economic impossibility, of extracting the nucleic acid from a sample as large as that required by certain standards, in particular in the food industry. , and to carry out the amplification and the selective detection of a particular sequence with the strong background noise generated when it is a question, for example, of detecting the presence of a single bacteria in a sample of meat weighing several grams .
Cet inconvénient est une limitation majeure pour l'utilisation de sondes nucléiques pour le contrôle de qualité dans l'industrie agro-alimentaire. This drawback is a major limitation for the use of nucleic acid probes for quality control in the food industry.
L'ensemble des techniques précitées ne permettent donc pas la détection, dans un délai court et sur des échantillons de plusieurs grammes, comme l'exige la réglementation, de la présence ou de l'absence d'une seule bactérie. All of the above techniques therefore do not allow the detection, within a short time and on samples of several grams, as required by regulation, of the presence or absence of a single bacterium.
En conséquence, la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à un procédé et à un dispositif de détection et de numération de micro-organismes, qui répond mieux aux besoins de la pratique que les procédés et dispositifs de l'Art antérieur, notamment en ce qu'il permet de répondre aux exigences réglementaires dans le domaine du contrôle de qualité des denrées alimentaires, à savoir la détection de la présence ou de l'absence d'un micro-organisme, dans un échantillon important, de l'ordre de plusieurs grammes. Consequently, the Applicant has set itself the goal of providing a method and a device for detecting and counting microorganisms, which better meets the needs of practice than the methods and devices of the prior art, in particular in that it makes it possible to meet regulatory requirements in the field of quality control of foodstuffs, namely the detection of the presence or absence of a microorganism, in a large sample, of the order several grams.
La présente invention a pour objet un procédé de détection d'au moins un micro-organisme ou germe dans un échantillon de grand volume et/ou de grande taille, notamment un produit alimentaire, un produit d'hygiène ou un fluide biologique, caractérisé en ce qu'il comprend
(1) une étape de criblage des micro-organismes recherchés, par immunoséparation des différents germes éventuellement présents dans l'échantillon de depart, par fixation sélective de chacun desdits germes sur un support approprié comprenant des anticorps convenables (ler réactif) ; et
(2) une étape de détection des germes éventuellement fixés sur le support approprié par
(a) libération de l'acide nucléique desdits germes, par tout moyen convenable
(b) amplification de l'acide nucléique libéré et recherché, si nécessaire
(c) hybridation de l'acide nucléique libéré avec au moins une sonde appropriée (2ème réactif), spécifique du germe dont la présence est soumise à contrôle et
(d) détection de l'hybride éventuellement formé, par tout moyen approprié. The subject of the present invention is a method for detecting at least one microorganism or germ in a large volume and / or large sample, in particular a food product, a hygiene product or a biological fluid, characterized in what he understands
(1) a step of screening for the desired microorganisms, by immunoseparation of the various germs possibly present in the starting sample, by selective fixation of each of said germs on an appropriate support comprising suitable antibodies (the reagent); and
(2) a step of detecting germs possibly fixed on the appropriate support by
(a) release of the nucleic acid from said germs, by any suitable means
(b) amplification of the nucleic acid released and sought, if necessary
(c) hybridization of the released nucleic acid with at least one appropriate probe (2nd reagent), specific for the germ whose presence is subject to control and
(d) detection of the hybrid possibly formed, by any appropriate means.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à l'invention, lorsque l'échantillon de départ est solide, préalablement à l'étape (1), ledit échantillon est soumis à une congélation puis à un cryobroyage, jusqu'à obtention de fines particules ne détruisant pas les germes recherchés et à une dilution appropriée de l'échantillon pulvérisé. According to an advantageous embodiment of the process according to the invention, when the starting sample is solid, prior to step (1), said sample is subjected to freezing and then to cryogrinding, until obtaining fine particles which do not destroy the germs sought and at an appropriate dilution of the sprayed sample.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à l'invention, l'étape (1), c'est-à-dire le criblage immunologique des germes recherchés présents dans l'échantillon liquide ou rendu liquide (immunoséparation), comme précisé ci-dessus, est réalisée par filtration sur au moins une membrane sur laquelle sont greffés des anticorps spécifiques du(des) microorganisme(s) à détecter, laquelle membrane retient ainsi le germe ou la famille de germes correspondant à l'anticorps greffé, et laisse passer le reste de l'échantillon. According to another advantageous embodiment of the method according to the invention, step (1), that is to say the immunological screening of the desired germs present in the liquid sample or made liquid (immunoseparation), as specified above, is carried out by filtration on at least one membrane on which are grafted antibodies specific for the microorganism (s) to be detected, which membrane thus retains the germ or family of germs corresponding to the grafted antibody , and let the rest of the sample pass.
Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à l'invention, l'étape (1), c'est-à-dire le criblage immunologique des germes recherchés présents dans l'échantillon liquide ou rendu liquide (immunoséparation), est réalisée par percolation de l'échantillon sur au moins un lit de microbilles greffées avec au moins un anticorps spécifiques du(des) micro-organisme(s) à détecter, puis élimination de l'échantillon non retenu. According to yet another advantageous embodiment of the method according to the invention, step (1), that is to say the immunological screening of the desired germs present in the liquid sample or made liquid (immunoseparation) , is carried out by percolation of the sample on at least one bed of microbeads grafted with at least one antibody specific for the micro-organism (s) to be detected, then elimination of the sample not retained.
Conformément à l'invention, l'étape (a), c'est-à-dire la libération de l'acide nucléique des germes retenus sur le support convenable, est réalisée par lyse. According to the invention, step (a), that is to say the release of the nucleic acid from the germs retained on the suitable support, is carried out by lysis.
Selon encore un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, préalablement à l'étape (c) d'hybridation, l'acide nucléique, éventuellement digéré par des enzymes de restriction appropriées, est amplifié à l'aide d'amorces choisies pour amplifier, la/les séquences spécifiques recherchées. According to yet another mode of implementation of the method according to the invention, prior to step (c) of hybridization, the nucleic acid, optionally digested with appropriate restriction enzymes, is amplified using primers chosen to amplify the specific sequence (s) sought.
Dans le cas de la détection de plusieurs germes de types différents, dans le même échantillon, l'étape (1) du procédé conforme à l'invention est réalisée en série sur plusieurs supports, greffés, chacun avec un anticorps différent, spécifique de chaque germe à détecter, afin d'assurer l'identification séparée et simultanée de ces germes distincts. In the case of the detection of several germs of different types, in the same sample, step (1) of the method according to the invention is carried out in series on several supports, grafted, each with a different antibody, specific for each germ to be detected, in order to ensure the separate and simultaneous identification of these distinct germs.
Le procédé conforme à l'invention, outre le fait qu'il résout de manière simple et rapide, c'est-àdire pratiquement sans délai, le problème posé par les normes réglementaires dans le domaine des tests de qualité des produits agro-alimentaires, présente les avantages suivants
- rapidité d'examen : le procédé conforme à l'invention ne nécessite pas de préculture et l'ensemble des opérations peut être réalisé en quelques heures
- possibilité d'examiner des échantillons de volume et/ou de taille important, dans la mesure où l'étape de concentration en micro-organismes permet d'éliminer l'essentiel de l'échantillon, de ramener à un volume raisonnable la portion d'échantillon à traiter par les techniques de la biologie moléculaire et d'éliminer l'essentiel du bruit de fond important constitué par l'ADN de germes non pathogènes et surtout 1'ADN propre à l'échantillon étudié
- spécificité améliorée par l'utilisation successive d'un crible immunitaire (immunoséparation) et d'un crible nucléique ; en effet, la combinaison des étapes (1) de criblage immunologique (immunodiagnostic), avec utilisation d'un anticorps comme premier réactif et (2) d'identification d'acide nucléique (détection par hybridation), avec utilisation d'une sonde nucléique comme deuxième réactif, permet de manière inattendue d'obtenir un procédé très spécifique vis-à-vis du/des germes à détecter, même si chacun des réactifs utilisé n'est ni très spécifique, ni très sélectif vis-à-vis des germes à contrôler.Ceci permet notamment d'utiliser des réactifs moins coûteux
- capacité à détecter la présence d'un seul germe dans l'échantillon initial : la capacité de piégeage immunitaire peut être augmentée en jouant sur le choix du couple antigène-anticorps choisi, sur la concentration en anticorps (loi d'action de masse) et le temps de contact ; de plus, la capacité de détection par sonde nucléique n'est pas limitée par le fait qu'un seul germe soit initialement présent, du fait de l'amplification possible
- l'étape (1) a également l'avantage majeur d'éliminer le bruit de fond dû à la présence notamment de l'acide nucléique issu de germes non recherchés et de la fraction cellulaire de l'échantillon.The process according to the invention, in addition to the fact that it solves in a simple and rapid manner, that is to say practically without delay, the problem posed by regulatory standards in the field of quality testing of food products, has the following advantages
- speed of examination: the process according to the invention does not require preculture and all of the operations can be carried out in a few hours
- possibility of examining samples of large volume and / or size, insofar as the stage of concentration of microorganisms makes it possible to eliminate most of the sample, to bring the portion d to a reasonable volume sample to be treated by molecular biology techniques and to eliminate most of the significant background noise constituted by the DNA of non-pathogenic germs and especially the DNA specific to the sample studied
- specificity improved by the successive use of an immune screen (immunoseparation) and a nucleic screen; indeed, the combination of the steps (1) of immunological screening (immunodiagnosis), with the use of an antibody as the first reagent and (2) of nucleic acid identification (detection by hybridization), with the use of a nucleic probe as second reagent, unexpectedly makes it possible to obtain a very specific process with respect to the germ (s) to be detected, even if each of the reagents used is neither very specific nor very selective with regard to germs This allows in particular the use of less expensive reagents
- ability to detect the presence of a single germ in the initial sample: the immune trapping capacity can be increased by playing on the choice of the antigen-antibody pair chosen, on the antibody concentration (law of mass action) and contact time; in addition, the detection capacity by nucleic probe is not limited by the fact that a single germ is initially present, due to the possible amplification
- step (1) also has the major advantage of eliminating the background noise due to the presence in particular of the nucleic acid originating from undesired germs and of the cell fraction of the sample.
La présente invention a également pour objet un dispositif de recherche et de détection de microorganismes dans un échantillon de taille et/ou de volume important, caractérisé en ce qu'il comprend
- au moins un support recouvert d'anticorps appropriés
- des moyens de mises en suspension et/ou de dilution de l'échantillon à analyser
- des moyens de mise en contact échantillonsupport, pendant un temps approprié
- des moyens de traitement du/des supports pour libérer l'acide nucléique du germe à détecter, éventuellement fixé sur ledit/lesdits supports
- des moyens d'amplification sélective de l'acide nucléique recherché, si nécessaire
- des moyens d'hybridation de l'acide nucléique libéré
- des moyens de détection appropriés de l'hybride ; et
- un moyen d'automatisation pour la commande séquentielle, dudit moyen de mise en contact échantillonsupport, des moyens de traitement du support, des moyens d'hybridation et des moyens de détection, si nécessaire.The present invention also relates to a device for searching and detecting microorganisms in a sample of large size and / or volume, characterized in that it comprises
- at least one support covered with appropriate antibodies
- means for suspending and / or diluting the sample to be analyzed
- means of contacting samples support, for an appropriate time
means for processing the support (s) to release the nucleic acid from the germ to be detected, possibly attached to said support (s)
- means for selective amplification of the nucleic acid sought, if necessary
- means for hybridizing the released nucleic acid
- appropriate means for detecting the hybrid; and
an automation means for the sequential control of said means for bringing samples into contact, means for processing the support, means for hybridization and means for detection, if necessary.
Lorsque ledit dispositif comprend plusieurs supports, il inclut en outre des moyens de séparation des supports. When said device comprises several supports, it also includes means for separating the supports.
Ledit support est avantageusement choisi dans le groupe qui comprend des membranes appropriées, notamment des membranes filtrantes et des microbilles appropriées, lequel support est en outre apte à greffer des anticorps appropriés. Said support is advantageously chosen from the group which comprises suitable membranes, in particular filtering membranes and suitable microbeads, which support is further capable of grafting appropriate antibodies.
Les moyens de mise en contact échantillon-support peuvent avantageusement être constitués par de simples moyens d'agitation ou des moyens de circulation de l'échantillon liquide ou préalablement rendu liquide, en boucle, afin d'assurer plusieurs circulations de l'échantillon sur le support et garantir ainsi le piégeage du germe éventuellement présent dans l'échantillon. The means for bringing the sample into support can advantageously be constituted by simple stirring means or means for circulating the liquid sample or previously made liquid, in a loop, in order to ensure several circulations of the sample over the support and thus guarantee the trapping of any germ present in the sample.
Les moyens de traitement sont avantageusement constitués par des moyens d'introduction de réactifs de lyse appropriés éventuellement associés à un poste de traitement par digestion desdits acides nucléiques libérés et à un poste d'amplification de l'acide nucléique. The processing means advantageously consist of means for introducing suitable lysis reagents possibly associated with a processing station by digestion of said released nucleic acids and with a nucleic acid amplification station.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention et à une description détaillée du dispositif avec référence aux dessins annexés dans lesquels
- la figure 1 représente une vue schématique illustrant un dispositif conforme à l'invention dans lequel le support est représenté par une pluralité de membranes amovibles
- la figure 2 représente un support sous forme d'une membrane filtrante divisée en une pluralité de zones différentes
- la figure 3 représente un autre dispositif conforme à l'invention dans lequel le support est représenté par des microbilles de verre.In addition to the foregoing provisions, the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the method according to the invention and to a detailed description of the device with reference to the accompanying drawings in which
- Figure 1 shows a schematic view illustrating a device according to the invention in which the support is represented by a plurality of removable membranes
- Figure 2 shows a support in the form of a filter membrane divided into a plurality of different zones
- Figure 3 shows another device according to the invention in which the support is represented by glass microbeads.
Il doit être bien entendu, toutefois, que les exemples, les dessins et les parties descriptives correspondantes, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. It should be understood, however, that the examples, the drawings and the corresponding descriptive parts, are given solely by way of illustration of the subject of the invention, of which they do not in any way constitute a limitation.
Le dispositif représenté aux figures 1 à 3 est destiné à la détection rapide de micro-organismes dans un échantillon de grande taille et/ou de grand volume, conformément au procédé décrit ci-dessus qui comprend essentiellement deux étapes
(1) une étape de criblage immunologique des germes par immunoséparation, et
(2) une étape de détection qui comprend
(a) la libération de l'acide nucléique,
(b) l'amplification de l'acide nucléique libéré, si nécessaire,
(c) l'hybridation dudit acide nucléique avec une sonde appropriée et
(d) la détection de l'hybride, et qui permet la recherche de germes tels que ceux mentionnés dans l'Arrêté du 21 décembre 1979 cité ci-dessus.The device shown in Figures 1 to 3 is intended for the rapid detection of microorganisms in a large sample and / or large volume, according to the method described above which essentially comprises two steps
(1) a step of immunological screening of the germs by immunoseparation, and
(2) a detection step which includes
(a) the release of the nucleic acid,
(b) amplification of the released nucleic acid, if necessary,
(c) hybridization of said nucleic acid with an appropriate probe and
(d) the detection of the hybrid, and which allows the search for germs such as those mentioned in the Decree of December 21, 1979 cited above.
La figure 1 représente une vue schématique d'un dispositif conforme à l'invention comprenant une enceinte E contenant un empilement de membranes A, B,...Z montées entre une tubulure 10 d'entrée de l'échantillon sous forme liquide et une tubulure de sortie 12 de l'échantillon à recycler, lesquelles tubulures sont reliées entre elles par une canalisation 13. FIG. 1 represents a schematic view of a device according to the invention comprising an enclosure E containing a stack of membranes A, B, ... Z mounted between a tube 10 for entering the sample in liquid form and a outlet tube 12 of the sample to be recycled, which tubes are connected together by a pipe 13.
Un conduit 11 d'évacuation de l'échantillon non retenu, par exemple après traitement, est également prévu. A pipe 11 for discharging the sample not retained, for example after treatment, is also provided.
Chaque membrane comprend un anticorps distinct non spécifique et/ou spécifique (ler réactif) et permet ainsi une fixation sélective à sa surface, du germe à retenir. Each membrane comprises a distinct non-specific and / or specific antibody (the reagent) and thus allows selective attachment to its surface of the germ to be retained.
Des moyens d'entrée T1 de réactifs, et notamment de tampons de traitement permettent de lyser les germes retenus sur lesdites membranes, afin de permettre l'hybridation et la détection desdits acides nucléiques lesdits tampons sont notamment évacués par le conduit 11. Input means T1 for reagents, and in particular for treatment buffers, make it possible to lyse the germs retained on said membranes, in order to allow hybridization and detection of said nucleic acids, said buffers are in particular removed via line 11.
Les différentes membranes sont séparées, dans la réalisation représentée, par pivotement autour de l'axe Y, qui amène lesdites membranes, successivement dans la zone H, par exemple à l'aide d'un automate de type connu, qui comprend notamment des tubulures d'entrée de réactifs 161-163 (sondes, enzymes de restriction, amorces, notamment) et un conduit d'évacuation des milieux usés, et notamment des sondes non fixées. The various membranes are separated, in the embodiment shown, by pivoting about the Y axis, which brings said membranes, successively into the zone H, for example using an automaton of known type, which in particular comprises pipes inlet for reagents 161-163 (probes, restriction enzymes, primers, in particular) and a conduit for discharging spent media, and in particular non-fixed probes.
L'hybridation puis la détection de l'hybride éventuellement formé est réalisée au niveau de cette zone
H, successivement sur chaque membrane.The hybridization then the detection of the hybrid possibly formed is carried out in this zone
H, successively on each membrane.
La figure 2 représente un support sous forme de membrane filtrante séparée en zones A, B, C. Z, comportant chacune un anticorps distinct. FIG. 2 represents a support in the form of a filtering membrane separated into zones A, B, C. Z, each comprising a distinct antibody.
L'échantillon liquide est passé à travers lesdites zones (mise en contact suffisante assurée par capillarité). The liquid sample is passed through said zones (sufficient contact ensured by capillarity).
Sur chaque zone séparée, une hybridation appropriée est réalisée, puis on détecte l'hybride éventuellement formé. On each separate zone, an appropriate hybridization is carried out, then the hybrid possibly formed is detected.
A la figure 3, dans laquelle le support, inclus dans une enceinte E, est constitué de microbilles notamment en verre, éventuellement confinées entre deux membranes appropriées, l'échantillon liquide est mis en contact avec lesdites billes recouvertes d'un anticorps approprié, par la tubulure d'entrée 10'. In FIG. 3, in which the support, included in an enclosure E, consists of microbeads in particular in glass, possibly confined between two appropriate membranes, the liquid sample is brought into contact with said beads covered with an appropriate antibody, by the inlet tubing 10 '.
On récupère les différentes microbilles qui peuvent varier selon leur taille et qui ont éventuellement piégé les germes à détecter, puis on lyse lesdits germes et on élue au moyen d'un tampon approprié, afin de récupérer, dans une enceinte, dite d'amplification, non représentée, l'acide nucléique, qui peut éventuellement être amplifié. The various microbeads which can vary according to their size and which have possibly trapped the germs to be detected are recovered, then the said germs are lysed and eluted by means of an appropriate buffer, in order to recover, in an enclosure, known as an amplification, not shown, nucleic acid, which can optionally be amplified.
L'acide nucléique amplifié est ensuite hybridé, par exemple sur membrane, avec une sonde appropriée, puis l'hybride est détecté. The amplified nucleic acid is then hybridized, for example on a membrane, with an appropriate probe, then the hybrid is detected.
En variante, l'enceinte E est fermée à sa partie inférieure ; après réalisation de l'étape (1) de criblage immunologique, les autres opérations sont réalisées après rotation de 180. de l'enceinte E. As a variant, the enclosure E is closed at its lower part; after completion of step (1) of immunological screening, the other operations are carried out after rotation of 180. of enclosure E.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente. As is apparent from the above, the invention is in no way limited to those of its modes of implementation, embodiment and application which have just been described more explicitly; on the contrary, it embraces all the variants which may come to mind of the technician in the matter, without departing from the framework, or the scope, of the present.
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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1991
- 1991-03-29 FR FR9103848A patent/FR2674632B1/en not_active Expired - Fee Related
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Proceedings of the National Academy of Sciences, USA vol. 87, no. 8, avril 1990, Washington, DC pages 2867 - 2871; Jansen et al.: "Molecular epidemiology of human hepatitis A virus defined by an antigen-capture polymerase chain reaction method" * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2674632B1 (en) | 1994-07-22 |
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