EP2802874A1 - Method for capturing and concentrating a microorganism in a biological sample - Google Patents

Method for capturing and concentrating a microorganism in a biological sample

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EP2802874A1
EP2802874A1 EP13701841.2A EP13701841A EP2802874A1 EP 2802874 A1 EP2802874 A1 EP 2802874A1 EP 13701841 A EP13701841 A EP 13701841A EP 2802874 A1 EP2802874 A1 EP 2802874A1
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EP
European Patent Office
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microorganism
sponge
detection
container
microorganisms
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP13701841.2A
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German (de)
French (fr)
Inventor
Jean-Pierre Flandrois
Jean-Claude Raymond
David Mosticone
Pradip Patel
Thierry Sofia
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Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
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    • G01N2333/255—Salmonella (G)

Definitions

  • the present invention relates generally to the field of analysis for example biological analysis. More specifically, the present invention relates to a method for capturing and concentrating at least one microorganism or at least one protein excreted from a microorganism that may be present in a sample.
  • This process is particularly applicable to pathogenic microorganisms contained in complex media, in low concentration.
  • Microbiological analysis requires precise techniques whose time of obtaining the result must be as short as possible.
  • microbiological analysis therefore requires one or more pre-enrichment and / or enrichment phases, one or more detection phases, one or more enumeration phases of the microorganisms.
  • a confirmation phase may also be required to meet the standards in force in this area.
  • the pre-enrichment and / or enrichment phase requires culture media, selective or not, which are intended to promote the growth of target microorganisms in biological or environmental samples, while limiting the growth of non-target flora.
  • the target population which is often present at low levels compared to the subsidiary flora present in food, is amplified.
  • the enrichment thus makes it possible to obtain a concentration of the microorganisms of 10 4 to 10 6 cells / milliliter allowing their detection.
  • the culture can also revitalize microbial cells that may have been stressed during industrial processes.
  • the media are often used in containers of the sterile plastic bag type, in which they are brought into contact with the food or environmental samples, allowing resuspension and enrichment of the desired microorganisms.
  • This phase is necessary in order to meet the needs which is to reveal the potential initial presence of at least one target microorganism in a very variable and possibly very large sample quantity, eg 25 grams (g) at 375 g diluted in 225 to 3375 milliliters (mL) in the culture medium.
  • an aliquot (from 5 micro liters ( ⁇ ) to 5 ml) is taken to implement the target microorganism detection step.
  • the detection phase is based historically on the culture of microorganisms on agar media, for the demonstration of the metabolic characteristics of the desired microorganisms.
  • Specific enzyme substrates can be used. These enzymatic substrates are generally composed of two parts, a first specific part of the enzymatic activity to be revealed, also called target part, and a second part serving as a marker, called a marker part, generally constituted by a chromophore or a fluorophore. By the choice of these substrates, depending on whether there is reaction or not, it is possible to characterize the nature of a microorganism or to discriminate different groups of microorganisms.
  • the appearance or disappearance of a coloration or a fluorescence will be the signature of a kind or a type of microorganisms.
  • the use of chromogenic media allows the simultaneous detection and identification of germs research. It simplifies the process and significantly reduces the time to get the result.
  • ChromDl® media of the applicant. These chromogenic media are based on the detection of specific metabolic characteristics of the desired germs, for example the enzymatic activity beta-glucuronidase for Escherichia coll.
  • Immunoassays are another technology used for the detection test. They make use of the immunogenic characteristics of the desired microorganisms. Non-exhaustively, there may be mentioned ELISA techniques (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), by competition or sandwich type.
  • molecular biology techniques based on the genomic characteristics of the microorganisms sought, are also used to detect and identify target microorganisms.
  • amplification techniques such as PCR (Polymerase Chain Reaction) and NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), which can be coupled with real-time detection techniques known to the patient. skilled person.
  • the confirmation phase is more particularly attached to microbiological analysis in the agri-food sector. Indeed, when the result of the previously developed methods is positive, it is necessary to confirm the presence of the pathogen sought. This imposes a complementary test and the use of a detection principle different from that used during the first analysis. The techniques described above can again be used for confirmation.
  • Centrifugation and flocculation are also used. These methods, although referenced, have several major disadvantages. They are traumatic for the microorganisms to concentrate. Thus, at the end of these treatments, more than 50% of the microorganisms disappear or are destroyed.
  • the centrifuged or flocculated microorganisms are found in the presence of contaminants which will inhibit the subsequent analysis methods such as the Chain Polymerization Reaction. These contaminants can also distort the analyzes.
  • the document WO 2005/069005 describes a method for extracting microorganisms by the use of a sponge comprising steps of compression / decompression of the sponge in a washing buffer to facilitate the stalling of undesired substances and finally a step elution into a new container to recover the targeted analyte.
  • This method does not provide for a step of simultaneous enrichment with the capture of target microorganisms.
  • An object of the present invention is therefore to provide a process improving the capture and concentration of microorganisms or excreted proteins.
  • Another object of the present invention is to provide a method thus allowing better detection of target microorganisms by revitalization and efficient growth of these microorganisms.
  • Another objective is to propose a microorganism capture and concentration method suitable for the analysis of large volume samples from complex media.
  • complex media is meant media containing biological materials, organic and inorganic suspended, including target microorganisms.
  • Another object of the present invention is to provide a method for capturing and concentrating microorganisms that can easily be coupled with the various existing detection and identification techniques.
  • the invention relates to a method for capturing and concentrating at least one microorganism or at least one secreted protein of at least one microorganism that may be present in a sample placed in a container, the process comprising the following steps :
  • microorganism covers gram-positive or gram-negative bacteria, yeasts, molds and more generally, unicellular organisms, invisible to the naked eye, which can be manipulated and multiplied in the laboratory.
  • the present invention also makes it possible to detect the proteins secreted by the microorganisms. For example, the detection of toxins secreted by Staphylococcus aureus.
  • Sample means a small or small isolated quantity of one or more entities for analysis. It may have undergone prior treatment, such as mixing, dilution in a liquid medium or grinding especially if the entity is solid.
  • Samples can be food, environmental or clinical.
  • Examples of food-based samples include, but are not limited to, a sample of milk products (yogurt, cheese, etc.), meat, fish, eggs, fruits, vegetables, water, drink (milk, fruit juice, soda, etc). These food-based samples can also come from sauces or elaborate dishes. A food sample may finally be derived from a feed intended for animals, such as in particular animal meal. Environmental samples such as surface, water and air samples are also mentioned.
  • Clinical samples may be samples of biological fluids (whole blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid), stool, nose, throat, skin, wound, organ , isolated tissues or cells etc.
  • biological fluids whole blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid
  • stool nose, throat, skin, wound, organ , isolated tissues or cells etc.
  • culture medium a medium comprising all the elements necessary for the survival and / or growth of the microorganisms.
  • the culture medium may contain any additives, for example: peptones, one or more growth factors, carbohydrates, one or more selective agents, buffers, one or more gelling agents, etc.
  • This culture medium may be in the form of a liquid, a ready-to-use gel, that is to say ready for seeding in a tube, a bottle or a Petri dish.
  • one of the advantageous aspects of the invention is the growth of microorganisms simultaneously with their capture.
  • the growth of the target microorganisms then takes place directly on the sponge. Since the microorganism is less in contact with the microbial flora that is potentially present in the mixture, the growth of the microorganism is improved and its location facilitated. The concentration of the microorganism or the secreted protein is thus improved.
  • the term "sponge” means a compressible solid support formed of a porous material. It can be of natural, artificial or synthetic origin. The shape of the sponge and the pore size may vary depending on the desired applications.
  • the functionalized sponge is immersed in the culture medium.
  • the culture medium flows through the sponge.
  • the sponge is repeatedly pressed and decompressed.
  • the volume of the culture medium contacted with the sponge is increased by the pressure / decompression action.
  • this step allows an acceleration of the capture of the analyte in a volume much higher than that of the sponge itself.
  • the binding partner recognizing the microorganism or the secreted protein is immobilized specifically or non-specifically on the sponge.
  • the binding partner is chosen from proteins, antibodies, antigens, aptamers, phages, phage proteins, nucleic acids or carbohydrates. It can also be of polymeric nature (chitosan, poly-L-Lysine, poly-Aniline) so as to allow non-specific capture of the cells.
  • antigen denotes a compound that can be recognized by an antibody whose synthesis it has induced by an immune response.
  • antibody includes polyclonal or monoclonal antibodies, antibodies obtained by genetic recombination and antibody fragments.
  • Phage or bacteriophage, are viruses that infect only bacteria; they are also called bacterial viruses.
  • Fixation on the sponge may correspond to direct or indirect immobilization: direct immobilization means covalent attachment or passive adsorption.
  • Direct immobilization can be effected by means of a ligand chemically fixed on the sponge.
  • indirect immobilization is meant the ligand / antiligand interaction between a ligand fixed on the antigen, the antibody or the phage (more broadly, the functional compound) and the antiligand or complementary ligand fixed on the sponge.
  • ligand / antiligand pairs are well known to those skilled in the art, and there may be mentioned for example the following pairs: biotin / streptavidin, hapten / antibody, antigen / antibody, peptide / antibody, sugar / lectin, polynucleotide / complementary polynucleotide .
  • a water-soluble compound derived from a homopolymer or copolymer of maleic anhydride such as those developed by the applicant in the patent EP 0 561 722 can also be used to immobilize a biological molecule.
  • the binding partner is bound to the sponge via a dopamine polymer.
  • the method according to the present invention comprises an additional step of transferring all or part of the mixture constituted by said sample, the culture medium, the sponge and possibly a revealing system, the container, then called principal to at least one second container said secondary.
  • one or more washing steps can take place.
  • a revelation system capable of enabling detection is brought into contact in the main or secondary container.
  • Revelation system is understood to mean any molecule capable of coupling with the microorganisms, the secreted proteins or the binding partners of said microorganisms and which, by virtue of their transduction properties (fluorescence, coloration, radioactivity in particular), reveal the presence of said microorganisms. .
  • the detection step may be performed in real time or at the end of the growth step of said microorganism (s).
  • the method according to the present invention may comprise an additional step of detecting the microorganism or the secreted protein bound to the binding partner.
  • the sponge is transferred to a secondary container containing a culture medium which may additionally contain a substrate allowing the detection of an enzymatic or metabolic activity of the target microorganisms by means of a detectable signal directly or indirectly.
  • this substrate may be bound to a marker portion, fluorescent or chromogenic.
  • the culture medium according to the invention may additionally comprise a pH indicator, sensitive to the pH variation induced by the consumption of the substrate and revealing the growth of the target microorganisms.
  • the said pH indicator may be a chromophore or a fluorophore.
  • chromophores include neutral red, aniline blue, bromocresol blue.
  • the fluorophores include, for example, 4-methylumbelliferone, aminocoumarin derivatives or resorufin derivatives.
  • Another example of indirect detection may be the use of latex specifically sensitized with an antibody directed against the desired analyte.
  • the revelation system is an internal non-specific substrate of the microorganism (s) to be detected.
  • the disclosure system is based on TTC reduction by microorganisms.
  • the TTC colorless in its unreduced form
  • the latter is internalized by said microorganisms, then reduced by the latter to triphenyl-formazan (red) thus dyeing said microorganisms red and then allowing their revelation on the sponge.
  • the method of direct and real-time detection of microorganisms in a food sample, during the incubation period is performed by optical reading of the sponge, whether automated or not.
  • the incubation can be carried out at temperatures between 25 and 44 ° C for 6 to 48 hours.
  • the effective capture of a certain quantity of colored target microorganisms case of a positive sample
  • a red coloring on it ie transduction biological signal
  • This coloration of the capture medium is then detectable to the eye or measurable via the use of a reading automaton such as a camera.
  • a reading automaton such as a camera.
  • the sponge is no longer in contact with the culture medium.
  • the reading can be done in end point, in dotted lines or in real time.
  • the revelation system is a cellular dye of the microorganism (s) to be detected.
  • the detection step may be performed using a means selected from the optical detection means, the magnetic detection means, the electrochemical detection means, the electrical detection means, the acoustic detection means, the means thermal detection.
  • the detection step is performed directly on the sponge.
  • the sponge is pressed during the detection step thus allowing amplification of the signal.
  • the method according to the invention comprises an additional step of eluting the microorganism and / or the secreted protein captured by the sponge. This step takes place before the detection step. This step is particularly advantageous for detection methods using immunochemical techniques, amplification of nucleic acids, mass spectroscopy or RAMAN spectroscopy.
  • Example 1 Preparation of a sensitized capture support with at least one specific binding partner of the target microorganism for the capture of target microorganisms
  • a capture medium a sponge, consisting of a cube of polyurethane foam with an internal capacity of about 2 ml is sensitized in the following manner:
  • the cube of polyurethane foam (sponge) is "filled" by compression / decompression cycles with a solution of 3,4 dihydoxyphenylalanine at 2 g / l in Tris-HCl buffer pH 8.5 and then remains immersed in said solution at room temperature for 18- 24h.
  • the sponge is then rinsed in sterile demineralized water 3 times by compression / decompression cycles.
  • the sponge is then immersed for two hours at room temperature in a solution of specific binding partners (1 ⁇ g / ml at 40 ⁇ g / ml) in PBS buffer pH 7.2;
  • the sponge is finally passivated in a solution of BSA in Tris-Maleate buffer at pH 6.2 for 1 hour at room temperature.
  • the sponge is then rinsed in PBS buffer pH 7.2, 3 times in compression / decompression cycles.
  • the sensitized foam cube can be used for microorganism capture or stored at 2-8 ° C for later use.
  • Example 2 Optical detection of the presence of Escherichia coli O157: H7 in a food sample via the use of a sensitized sponge
  • the purpose of this experiment is to directly detect, via the use of a sensitized support, as described above, the presence of the target bacterium E. coli O157: H7 in a food sample being enriched.
  • the detection is carried out during the incubation period by immersing the sensitized capture medium with an anti-E recombinant phage protein.
  • coli 0157 H7 in a homogenisation bag which contains the food sample, diluted 1/10 in the reaction medium. Two samples are prepared as follows:
  • Sample A In a homogenizer bag, 25g of ground steak contaminated with 5 colony forming units (CFU) of E. coli O157: H7 are resuspended in 225 mL of EPT (bioMérieux, Ref. Olig / L vancomycin (Sigma, Cat No. 75423).
  • CFU colony forming units
  • Sample B In a homogenizer bag, 25 g of non-E. coli 0157: H7 minced steak was resuspended in 225 ml of EPT (buffered peptone water) supplemented with O.Olg / L vancomycin. For each sample, the analyzes are made in triplicate.
  • the sensitized sponges are immersed in the homogenization bags before incubation.
  • the bags are then closed with a closing bar and incubated in an oven at 41.5 ° C for 16-24h.
  • the bags are then placed in a system allowing the pressure / decompression of the functionalized sponges throughout the incubation period (frequency: 1 cycle in 10 seconds).
  • the sponges are removed from the enrichment bags and washed in a stomacher bag containing 90 ml of PBS buffer (30 seconds of stomachage). This operation aims to eliminate as much non-target elements that may be present in the cells of the sponge.
  • the sponges are placed in contact in a syringe with 500 ⁇ l of a conjugated solution of anti-E. coli 0157: H7 antibodies labeled with ALP (alkaline phosphatase) for 10 minutes.
  • ALP alkaline phosphatase
  • Washing steps are carried out in PBS-Tween buffer by several piston movements of the syringes.
  • the verification of the capture of E. coli 0157: H7 on the functionalized sponges is evidenced by the appearance of the fluorescence due to the action of the alkaline phosphatase (PAL) present in the conjugate on the substrate.
  • PAL alkaline phosphatase
  • the purpose is to concentrate the analyte during growth on the sponge to reduce the time of the enrichment phase and then proceed to the steps of elution and detection of the microorganism or microorganisms.
  • Example 3 Capture, elution then detection of target microorganisms.
  • a capture medium a sponge, consisting of a cube of polyurethane foam is functionalized with the phage protein E.coli 0157: H7: Sponge "+".
  • a non-functionalized polyurethane sponge is also used to evaluate the non-specific capture related to the structure of the sponge: Sponge "-”.
  • the bags are homogenized for 30 seconds using a stomacher system.
  • the bags are then incubated in an oven at 41.5 ° C and shaken with the above-mentioned system allowing compression / decompression of the sponges in the bags (1 cycle every 5 seconds).
  • the functionalized sponge is removed from the enrichment bag, drained and washed twice with a volume of 5 ml of PBS. Tween 20 at 0.05% in a plastic tube (spin between and after each wash). A volume of 1 mL of PBS buffer is introduced into the tube and it is placed in a water bath at 100 ° C for 10 min. to allow the elution of E. coli 0157: H7 cells captured on the sponge support.
  • VIDAS ECPT test E. coli Phage Technology marketed by the applicant (reference 30122) is carried out.
  • the sponge "+” has been functionalized and captures the target bacterium (E.coli 0157: H7).
  • a positive signal is detected with the VIDAS ECPT kit after washing the sponges and eluting steps by heating.
  • the RFV signal levels obtained from the functionalized sponge (and taken up in 1 mL) indicate a concentration of the analyte in comparison with the result obtained from the raw sample (500 ⁇ ).

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Abstract

The present invention relates, in a general manner, to the field of analysis for example biological analysis. More specifically, the present invention relates to a method for capturing and concentrating at least one microorganism or at least one protein secreted by a microorganism that may be present in a sample placed in a container, the method comprising the following steps: a) placing said sample in contact in the container with a culture medium and a sponge able to capture the microorganism(s) or the protein(s) secreted by at least one microorganism to be detected, functionalized by a binding partner for at least one microorganism or for at least one protein secreted; b) placing the container under conditions able to allow the growth of the microorganism(s); c) repeatedly pressing and decompressing the sponge while remaining in contact with said medium.

Description

PROCEDE POUR CAPTURER ET CONCENTRER UN MICROORGANISME DANS UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE  PROCESS FOR CAPTURING AND CONCENTRATING MICROORGANISM IN A BIOLOGICAL SAMPLE
La présente invention concerne, de façon générale, le domaine de l'analyse par exemple l'analyse biologique. Plus spécifiquement, la présente invention concerne un procédé pour capturer et concentrer au moins un microorganisme ou au moins une protéine excrétée d'un microorganisme susceptible d'être présent dans un échantillon. The present invention relates generally to the field of analysis for example biological analysis. More specifically, the present invention relates to a method for capturing and concentrating at least one microorganism or at least one protein excreted from a microorganism that may be present in a sample.
Ce procédé est particulièrement applicable aux microorganismes pathogènes contenus dans les milieux complexes, en faible concentration.  This process is particularly applicable to pathogenic microorganisms contained in complex media, in low concentration.
L'analyse microbiologique nécessite des techniques précises et dont le temps d'obtention du résultat doit être le plus court possible.  Microbiological analysis requires precise techniques whose time of obtaining the result must be as short as possible.
Dans le domaine médical, il est nécessaire de prévoir et diagnostiquer le risque infectieux : plus le diagnostic est rapide et précis, plus la prise en charge des malades est efficace et le risque de transmission minimisé. L'approche est similaire pour la santé animale.  In the medical field, it is necessary to predict and diagnose the risk of infection: the faster and more accurate the diagnosis, the more effective the management of the patients and the reduced risk of transmission. The approach is similar for animal health.
Dans le domaine agroalimentaire, la problématique est identique. Elle distingue cependant :  In the agri-food sector, the problem is identical. It distinguishes however:
• les microorganismes pathogènes et leurs toxines dont la recherche s'applique aux matières premières, produits intermédiaires, produits finis commercialisés,  • pathogenic microorganisms and their toxins whose research applies to raw materials, intermediate products, finished products marketed,
• les microorganismes non pathogènes, utilisés comme indicateurs-qualité du processus de production, des matières premières aux produits finis, tout au long de la chaîne, et  • non-pathogenic microorganisms, used as quality indicators of the production process, from raw materials to finished products, all along the chain, and
• les bactéries d'intérêt technologique telles que les ferments. • bacteria of technological interest such as ferments.
Dans le cadre de la présence de microorganismes pathogènes, la détection rapide et précise de contaminations présumées permet de les contrôler et d'engager ainsi des actions correctives. In the context of the presence of pathogenic microorganisms, the rapid and precise detection of presumed contaminations makes it possible to control them and thus to initiate corrective actions.
Pour pouvoir mettre en évidence la présence de ces microorganismes, il est nécessaire de réaliser des prélèvements suffisamment importants afin de s'assurer de récupérer une quantité minimale de microorganismes. Il faut ensuite augmenter leur concentration, les isoler et les identifier.  In order to be able to demonstrate the presence of these microorganisms, it is necessary to take sufficiently large samples to ensure that a minimum quantity of microorganisms is recovered. It is then necessary to increase their concentration, isolate them and identify them.
L'analyse microbiologique nécessite donc une ou plusieurs phases de préenrichissement et/ou d'enrichissement, une ou plusieurs phases de détection, une ou plusieurs phases d'énumération des microorganismes. Pour des applications particulières telles le contrôle microbiologique agroalimentaire, une phase de confirmation peut également être requise, afin de répondre aux normes en vigueur dans ce domaine. The microbiological analysis therefore requires one or more pre-enrichment and / or enrichment phases, one or more detection phases, one or more enumeration phases of the microorganisms. For particular applications such as microbiological microbiological control, a confirmation phase may also be required to meet the standards in force in this area.
A l'heure actuelle, il n'existe pas de méthode pour détecter directement un microorganisme cible dans une quantité d'échantillon initiale importante, sans faire appel à une étape d'enrichissement.  At present, there is no method for directly detecting a target microorganism in a large initial sample amount, without resorting to an enrichment step.
La phase de pré-enrichissement et/ou d'enrichissement nécessite des milieux de culture, sélectifs ou non, qui ont pour but de promouvoir la croissance des microorganismes cibles dans les échantillons biologiques ou environnementaux, tout en limitant la croissance des flores non cibles. Ainsi, la population cible, qui est souvent présent à des niveaux bas par rapport à la flore annexe présente dans les aliments, est amplifié. L'enrichissement permet donc d'obtenir une concentration des microorganismes de 104 à 106 cellules/millilitre permettant leur détection. La culture peut également revitaliser les cellules microbiennes qui peuvent avoir été stressées lors des process industriels. The pre-enrichment and / or enrichment phase requires culture media, selective or not, which are intended to promote the growth of target microorganisms in biological or environmental samples, while limiting the growth of non-target flora. Thus, the target population, which is often present at low levels compared to the subsidiary flora present in food, is amplified. The enrichment thus makes it possible to obtain a concentration of the microorganisms of 10 4 to 10 6 cells / milliliter allowing their detection. The culture can also revitalize microbial cells that may have been stressed during industrial processes.
Les milieux sont souvent utilisés dans des conteneurs du type sac en plastique stérile, dans lesquels ils sont mis en contact avec les échantillons alimentaires ou environnementaux, permettant une remise en suspension et un enrichissement des microorganismes recherchés. Cette phase est nécessaire afin de répondre aux besoins qui est de révéler la présence initiale potentielle d'au moins un microorganisme cible dans une quantité d'échantillon très variable et éventuellement très grande, e.g. 25 grammes (g) à 375 g dilué dans 225 à 3375 millilitres (mL) dans le milieu de culture. A l'issue de cette étape d'enrichissement, un aliquote (de 5 micro litres (μί) à 5 mL) est prélevé pour mettre en œuvre l'étape de détection des microorganismes cibles. Or, dans cet aliquote, il est nécessaire de disposer d'une quantité suffisante de microorganismes cibles pour s'assurer de leur détection systématique.  The media are often used in containers of the sterile plastic bag type, in which they are brought into contact with the food or environmental samples, allowing resuspension and enrichment of the desired microorganisms. This phase is necessary in order to meet the needs which is to reveal the potential initial presence of at least one target microorganism in a very variable and possibly very large sample quantity, eg 25 grams (g) at 375 g diluted in 225 to 3375 milliliters (mL) in the culture medium. At the end of this enrichment step, an aliquot (from 5 micro liters (μί) to 5 ml) is taken to implement the target microorganism detection step. However, in this aliquot, it is necessary to have a sufficient quantity of target microorganisms to ensure their systematic detection.
La phase de détection se base historiquement sur la culture des microorganismes sur milieux gélosés, pour la mise en évidence des caractères métaboliques des microorganismes recherchés. On peut utiliser des substrats enzymatiques spécifiques. Ces substrats enzymatiques sont généralement composés de deux parties, une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler, appelée également partie cible, et une seconde partie faisant office de marqueur, appelée partie marqueur, généralement constituée par un chromophore ou un fluorophore. Par le choix de ces substrats, selon qu'il y a réaction ou non, il est possible de caractériser la nature d'un microorganisme ou de discriminer différents groupes de microorganismes. Ainsi, l'apparition ou la disparition d'une coloration ou d'une fluorescence sera la signature d'un genre ou d'un type de microorganismes. A cet égard, l'utilisation de milieux chromogènes permet la détection et l'identification simultanées des germes recherchés. Elle simplifie le processus et diminue sensiblement le délai d'obtention du résultat. On citera à titre d'exemple concret les milieux ChromlD® de la demanderesse. Ces milieux chromogènes sont basés sur la détection de caractères métaboliques spécifiques des germes recherchés comme par exemple l'activité enzymatique beta-glucuronidase pour Escherichia coll. The detection phase is based historically on the culture of microorganisms on agar media, for the demonstration of the metabolic characteristics of the desired microorganisms. Specific enzyme substrates can be used. These enzymatic substrates are generally composed of two parts, a first specific part of the enzymatic activity to be revealed, also called target part, and a second part serving as a marker, called a marker part, generally constituted by a chromophore or a fluorophore. By the choice of these substrates, depending on whether there is reaction or not, it is possible to characterize the nature of a microorganism or to discriminate different groups of microorganisms. Thus, the appearance or disappearance of a coloration or a fluorescence will be the signature of a kind or a type of microorganisms. In this regard, the use of chromogenic media allows the simultaneous detection and identification of germs research. It simplifies the process and significantly reduces the time to get the result. By way of concrete example, mention may be made of the ChromDl® media of the applicant. These chromogenic media are based on the detection of specific metabolic characteristics of the desired germs, for example the enzymatic activity beta-glucuronidase for Escherichia coll.
Les immuno-essais constituent une autre des technologies utilisées pour le test de détection. Ils font appel aux caractéristiques immunogènes des microorganismes recherchés. De façon non exhaustive, on peut citer les techniques ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), par compétition ou de type sandwich.  Immunoassays are another technology used for the detection test. They make use of the immunogenic characteristics of the desired microorganisms. Non-exhaustively, there may be mentioned ELISA techniques (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), by competition or sandwich type.
Enfin, les techniques de biologie moléculaire, basées sur les caractères génomiques des microorganismes recherchés, sont également mises en œuvre pour détecter et identifier les microorganismes cibles. On citera, à titre d'exemple, les techniques d'amplification classiques telles la PCR (Polymerase Chain Reaction) et la NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification), qui peuvent être couplées à des techniques de détection en temps réel connues de l'homme du métier.  Finally, molecular biology techniques, based on the genomic characteristics of the microorganisms sought, are also used to detect and identify target microorganisms. By way of example, mention may be made of conventional amplification techniques such as PCR (Polymerase Chain Reaction) and NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), which can be coupled with real-time detection techniques known to the patient. skilled person.
La phase de confirmation, quant à elle, est plus particulièrement attachée à l'analyse microbiologique dans le domaine agroalimentaire. En effet, lorsque le résultat des méthodes développées précédemment est positif, il est nécessaire de confirmer la présence du pathogène recherché. Ceci impose un test complémentaire et l'utilisation d'un principe de détection différent de celui utilisé lors de la première analyse. Les techniques décrites supra peuvent à nouveau être utilisées pour la confirmation.  The confirmation phase, in turn, is more particularly attached to microbiological analysis in the agri-food sector. Indeed, when the result of the previously developed methods is positive, it is necessary to confirm the presence of the pathogen sought. This imposes a complementary test and the use of a detection principle different from that used during the first analysis. The techniques described above can again be used for confirmation.
L'identification complète et précise d'un microorganisme dans un échantillon nécessite donc l'enchaînement de plusieurs étapes : enrichissement, détection et confirmation. La standardisation des tests utilisés en routine a permis l'automatisation des méthodes de détection. Les étapes préalables à la détection sont les plus chronophages, 6 à 24 heures sont classiquement nécessaires. Ces étapes nécessitent donc la mise en place de nouvelles solutions techniques pour obtenir rapidement les résultats à partir de l'échantillon initial.  The complete and accurate identification of a microorganism in a sample therefore requires the sequencing of several stages: enrichment, detection and confirmation. The standardization of the tests used in routine allowed the automation of detection methods. The steps prior to detection are the most time-consuming, 6 to 24 hours are usually required. These steps therefore require the implementation of new technical solutions to quickly obtain the results from the initial sample.
Des procédés de capture de microorganismes réalisés postérieurement à la phase d'enrichissement ont déjà été décrits. Ainsi les filtres sont largement utilisés. Ils sont néanmoins peu adaptés pour traiter des échantillons de grand volume. Ils sont utilisés davantage pour des échantillons contenant peu de matière alimentaire tels que l'eau ou les boissons. Leur efficacité est, en effet, largement diminuée dès lors que l'échantillon est complexe entraînant l'encombrement des pores des filtres. Des filtres plus sophistiqués ont été élaborés. Ainsi le document WO 2009/018544 décrit un filtre à plusieurs couches comprenant notamment une couche de microbilles poreuses. Processes for capturing microorganisms produced after the enrichment phase have already been described. Thus filters are widely used. They are nevertheless not very suitable for processing large volume samples. They are used more for samples containing little food material such as water or beverages. Their effectiveness is, in fact, greatly reduced when the sample is complex causing congestion of the pores of the filters. More sophisticated filters have have been developed. Thus, document WO 2009/018544 describes a multi-layer filter comprising in particular a layer of porous microbeads.
La centrifugation et la floculation sont également utilisés. Ces méthodes, bien que référencées, présentent plusieurs inconvénients majeurs. Elles sont traumatisantes pour les microorganismes à concentrer. Ainsi, à l'issue de ces traitements, plus de 50% des microorganismes disparaissent ou sont détruits.  Centrifugation and flocculation are also used. These methods, although referenced, have several major disadvantages. They are traumatic for the microorganisms to concentrate. Thus, at the end of these treatments, more than 50% of the microorganisms disappear or are destroyed.
Elles sont également peu sélectives : les microorganismes centrifugés ou floculés se retrouvent en présence de contaminants qui inhiberont les méthodes d'analyses ultérieures telles que la Réaction de Polymérisation en Chaîne. Ces contaminants peuvent également fausser les analyses.  They are also not very selective: the centrifuged or flocculated microorganisms are found in the presence of contaminants which will inhibit the subsequent analysis methods such as the Chain Polymerization Reaction. These contaminants can also distort the analyzes.
Le document WO 2005/069005 décrit une méthode d'extraction des microorganismes par l'utilisation d'une éponge comprenant des étapes de compression/décompression de l'éponge dans un tampon de lavage pour faciliter le décrochage des substances non souhaitées et enfin une étape d'élution dans un nouveau récipient afin de récupérer l'analyte ciblé. Ce procédé ne prévoit pas une étape d'enrichissement simultanée à la capture des microorganismes cibles.  The document WO 2005/069005 describes a method for extracting microorganisms by the use of a sponge comprising steps of compression / decompression of the sponge in a washing buffer to facilitate the stalling of undesired substances and finally a step elution into a new container to recover the targeted analyte. This method does not provide for a step of simultaneous enrichment with the capture of target microorganisms.
Des systèmes plus complexes ont été également décrits. C'est le cas par exemple du système Pathatrix développé par la société Matrix Micro Science. Ce système est constitué d'une phase de capture, comprenant des anticorps immobilisés sur des billes magnétiques, et sur lesquelles l'échantillon circule. Ce procédé ne prévoit pas non plus une étape d'enrichissement simultanée à la capture des microorganismes cibles. Un autre inconvénient de ce système est que la surface de capture des billes magnétiques reste limitée.  More complex systems have also been described. This is the case, for example, of the Pathatrix system developed by Matrix Micro Science. This system consists of a capture phase, comprising antibodies immobilized on magnetic beads, and on which the sample circulates. This method also does not provide for a step of simultaneous enrichment with the capture of target microorganisms. Another disadvantage of this system is that the capture surface of the magnetic beads remains limited.
Il existe donc un réel besoin pour un nouveau procédé de préparation de l'échantillon permettant de diminuer le temps nécessaire à l'analyse de l'échantillon tout en permettant une détection rapide et efficace des microorganismes cibles.  There is therefore a real need for a new sample preparation process which makes it possible to reduce the time required for analyzing the sample while allowing rapid and efficient detection of target microorganisms.
Un objectif de la présente invention est donc de fournir un procédé améliorant la capture et la concentration des microorganismes ou des protéines excrétées.  An object of the present invention is therefore to provide a process improving the capture and concentration of microorganisms or excreted proteins.
Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé permettant ainsi une meilleure détection des microorganismes cibles par une revitalisation et une croissance efficace de ces microorganismes.  Another object of the present invention is to provide a method thus allowing better detection of target microorganisms by revitalization and efficient growth of these microorganisms.
Un autre objectif est de proposer un procédé de capture et de concentration de microorganismes adapté à l'analyse d'échantillons de grand volume, issus de milieux complexes. Par milieux complexes, on entend les milieux contenant des matières biologiques, organiques et minérales en suspension, et notamment les microorganismes cibles. Un autre objectif de la présente invention est de proposer un procédé de capture et de concentration de microorganismes qui puisse facilement être couplé avec les différentes techniques de détection et d'identification existantes. A ce titre, l'invention concerne un procédé pour capturer et concentrer au moins un microorganisme ou au moins une protéine sécrétée d'au moins un microorganisme susceptible d'être présent(e) dans un échantillon placé dans un conteneur, le procédé comprenant les étapes suivantes : Another objective is to propose a microorganism capture and concentration method suitable for the analysis of large volume samples from complex media. By complex media is meant media containing biological materials, organic and inorganic suspended, including target microorganisms. Another object of the present invention is to provide a method for capturing and concentrating microorganisms that can easily be coupled with the various existing detection and identification techniques. As such, the invention relates to a method for capturing and concentrating at least one microorganism or at least one secreted protein of at least one microorganism that may be present in a sample placed in a container, the process comprising the following steps :
a) mettre en contact dans le conteneur ledit échantillon avec un milieu de culture et une éponge apte à capturer le(s) microorganisme(s) ou la (les) protéine(s) sécrétée(s) d'un microorganisme à détecter, fonctionnalisée par un partenaire de liaison d'au moins un microorganisme ou d'au moins une protéine excrétée, a) contacting in the container said sample with a culture medium and a sponge able to capture the microorganism (s) or the secreted protein (s) of a microorganism to be detected, functionalized by a binding partner of at least one microorganism or at least one excreted protein,
b) placer le conteneur dans des conditions aptes à permettre la croissance du ou des microorganismes(s) b) placing the container in conditions that are suitable for allowing the growth of the microorganism (s)
c) presser et décompresser répétitivement l'éponge en restant en contact avec ledit milieu. c) repeatedly pressing and decompressing the sponge while remaining in contact with said medium.
Au sens de la présente invention, le terme « microorganisme » recouvre les bactéries gram positif ou gram négatif, les levures, les moisissures et plus généralement, les organismes unicellulaires, invisibles à l'œil nu, qui peuvent être manipulés et multipliés en laboratoire. For the purposes of the present invention, the term "microorganism" covers gram-positive or gram-negative bacteria, yeasts, molds and more generally, unicellular organisms, invisible to the naked eye, which can be manipulated and multiplied in the laboratory.
La présente invention permet également de détecter les protéines sécrétées par les microorganismes. On citera par exemple la détection de toxines sécrétées par Staphylococcus aureus.  The present invention also makes it possible to detect the proteins secreted by the microorganisms. For example, the detection of toxins secreted by Staphylococcus aureus.
On entend par « échantillon » une petite partie ou petite quantité isolée d'une ou plusieurs entités pour l'analyse. Il peut avoir subi un traitement préalable, tels que le mélange, la dilution dans un milieu liquide ou encore le broyage notamment si l'entité est solide.  "Sample" means a small or small isolated quantity of one or more entities for analysis. It may have undergone prior treatment, such as mixing, dilution in a liquid medium or grinding especially if the entity is solid.
Les échantillons peuvent être d'origine alimentaire, environnementale ou clinique.  Samples can be food, environmental or clinical.
Parmi les échantillons d'origine alimentaire, on peut citer de façon non exhaustive un échantillon de produits lactés (yaourts, fromages...), de viande, de poisson, d'œufs, de fruits, de légumes, d'eau, de boisson (lait, jus de fruits, soda, etc). Ces échantillons d'origine alimentaire peuvent aussi provenir de sauces ou de plats élaborés. Un échantillon alimentaire peut enfin être issu d'une alimentation destinée aux animaux, telle que notamment des farines animales. On mentionnera aussi les échantillons liés à l'environnement tels les prélèvements de surface, d'eau, d'air. Examples of food-based samples include, but are not limited to, a sample of milk products (yogurt, cheese, etc.), meat, fish, eggs, fruits, vegetables, water, drink (milk, fruit juice, soda, etc). These food-based samples can also come from sauces or elaborate dishes. A food sample may finally be derived from a feed intended for animals, such as in particular animal meal. Environmental samples such as surface, water and air samples are also mentioned.
Les échantillons d'origine clinique peuvent correspondre à des prélèvements de fluides biologiques (sang total, sérum, plasma, urine, liquide céphalo-rachidien), de selles, des prélèvements de nez, de gorge, de peau, de plaie, d'organes, de tissus ou de cellules isolées etc.  Clinical samples may be samples of biological fluids (whole blood, serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid), stool, nose, throat, skin, wound, organ , isolated tissues or cells etc.
L'échantillon est mis en contact avec un milieu de culture permettant la croissance des microorganismes. Par « milieu de culture », on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à la survie et/ou à la croissance des microorganismes. Le milieu de culture peut contenir d'éventuels additifs comme par exemple : des peptones, un ou plusieurs facteurs de croissance, des hydrates de carbone, un ou plusieurs agents sélectifs, des tampons, un ou plusieurs gélifiants etc. Ce milieu de culture peut se présenter sous forme de liquide, de gel prêt à l'emploi, c'est-à-dire prêt à l'ensemencement en tube, flacon ou sur boite de Pétri. The sample is brought into contact with a culture medium for the growth of microorganisms. By "culture medium" is meant a medium comprising all the elements necessary for the survival and / or growth of the microorganisms. The culture medium may contain any additives, for example: peptones, one or more growth factors, carbohydrates, one or more selective agents, buffers, one or more gelling agents, etc. This culture medium may be in the form of a liquid, a ready-to-use gel, that is to say ready for seeding in a tube, a bottle or a Petri dish.
Ainsi, un des aspects avantageux de l'invention est la croissance des microorganismes simultanément à leur capture. La croissance des microorganismes cibles a alors lieu directement sur l'éponge. Le microorganisme étant moins en contact avec la flore microbienne annexe potentiellement présente dans le mélange, la croissance du microorganisme est améliorée et sa localisation facilitée. La concentration du microorganisme ou de la protéine sécrétée est donc améliorée. Thus, one of the advantageous aspects of the invention is the growth of microorganisms simultaneously with their capture. The growth of the target microorganisms then takes place directly on the sponge. Since the microorganism is less in contact with the microbial flora that is potentially present in the mixture, the growth of the microorganism is improved and its location facilitated. The concentration of the microorganism or the secreted protein is thus improved.
On entend par « éponge », un support solide compressible formé d'un matériel poreux. Elle peut être d'origine naturelle, artificielle ou synthétique. La forme de l'éponge et la taille des pores peut varier en fonction des applications souhaitées.  The term "sponge" means a compressible solid support formed of a porous material. It can be of natural, artificial or synthetic origin. The shape of the sponge and the pore size may vary depending on the desired applications.
Dans un mode de réalisation particulier, l'éponge fonctionnalisée est immergée dans le milieu de culture.  In a particular embodiment, the functionalized sponge is immersed in the culture medium.
Dans un autre mode de réalisation, le milieu de culture circule à travers l'éponge.  In another embodiment, the culture medium flows through the sponge.
Selon le procédé de la présente invention, l'éponge est pressée et décompressée de façon répétitive. Le volume du milieu de culture mis en contact avec l'éponge est augmenté par l'action de pression / décompression. Ainsi cette étape permet une accélération de la capture de l'analyte dans un volume bien supérieur à celui de l'éponge même. According to the method of the present invention, the sponge is repeatedly pressed and decompressed. The volume of the culture medium contacted with the sponge is increased by the pressure / decompression action. Thus this step allows an acceleration of the capture of the analyte in a volume much higher than that of the sponge itself.
La pression / décompression peut se faire manuellement ou mécaniquement par tout moyen connu de l'homme du métier. Le partenaire de liaison reconnaissant le microorganisme ou la protéine sécrétée est immobilisé spécifiquement ou non-spécifiquement sur l'éponge. Préférentiellement le partenaire de liaison est choisi parmi les protéines, les anticorps, les antigènes, les aptamères, les phages, les protéines de phages, les acides nucléiques ou les carbohydrates. Il peut être également de nature polymérique (chitosan, poly-L-Lysine, poly-Aniline) de manière à permettre une capture non spécifique des cellules. Pressure / decompression can be done manually or mechanically by any means known to those skilled in the art. The binding partner recognizing the microorganism or the secreted protein is immobilized specifically or non-specifically on the sponge. Preferably, the binding partner is chosen from proteins, antibodies, antigens, aptamers, phages, phage proteins, nucleic acids or carbohydrates. It can also be of polymeric nature (chitosan, poly-L-Lysine, poly-Aniline) so as to allow non-specific capture of the cells.
Le terme antigène désigne un composé susceptible d'être reconnu par un anticorps dont il a induit la synthèse par une réponse immune.  The term "antigen" denotes a compound that can be recognized by an antibody whose synthesis it has induced by an immune response.
Le terme anticorps inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique et des fragments d'anticorps.  The term antibody includes polyclonal or monoclonal antibodies, antibodies obtained by genetic recombination and antibody fragments.
Les phages, ou bactériophages, sont des virus n'infectant que des bactéries ; ils sont également appelés virus bactériens.  Phage, or bacteriophage, are viruses that infect only bacteria; they are also called bacterial viruses.
La fixation sur l'éponge peut correspondre à une immobilisation directe ou indirecte : par immobilisation directe, on entend la fixation par covalence ou adsorption passive. Une immobilisation directe peut être effectuée au moyen d'un ligand fixé chimiquement sur l'éponge. Par immobilisation indirecte, on entend l'interaction ligand/antiligand entre un ligand fixé sur l'antigène, l'anticorps ou le phage (plus largement, le composé fonctionnel) et l'antiligand ou ligand complémentaire fixé sur l'éponge.  Fixation on the sponge may correspond to direct or indirect immobilization: direct immobilization means covalent attachment or passive adsorption. Direct immobilization can be effected by means of a ligand chemically fixed on the sponge. By indirect immobilization is meant the ligand / antiligand interaction between a ligand fixed on the antigen, the antibody or the phage (more broadly, the functional compound) and the antiligand or complementary ligand fixed on the sponge.
Les couples ligand/antiligand sont bien connus de l'homme du métier, et on peut citer par exemple les couples suivants : biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide.  The ligand / antiligand pairs are well known to those skilled in the art, and there may be mentioned for example the following pairs: biotin / streptavidin, hapten / antibody, antigen / antibody, peptide / antibody, sugar / lectin, polynucleotide / complementary polynucleotide .
Un composé hydrosoluble dérivé d'un homopolymère ou copolymère d'anhydride maléique tels ceux développés par la demanderesse dans le brevet délivré EP 0 561 722 peut également être utilisé pour immobiliser une molécule biologique.  A water-soluble compound derived from a homopolymer or copolymer of maleic anhydride such as those developed by the applicant in the patent EP 0 561 722 can also be used to immobilize a biological molecule.
De façon avantageuse, le partenaire de liaison est lié à l'éponge via un polymère de dopamine. Advantageously, the binding partner is bound to the sponge via a dopamine polymer.
Selon un mode de réalisation, le procédé selon la présente invention comporte une étape supplémentaire consistant à transférer tout ou partie du mélange constitué par ledit échantillon, le milieu de culture, l'éponge et éventuellement un système de révélation, du conteneur, dit alors principal vers au moins un deuxième conteneur dit secondaire.  According to one embodiment, the method according to the present invention comprises an additional step of transferring all or part of the mixture constituted by said sample, the culture medium, the sponge and possibly a revealing system, the container, then called principal to at least one second container said secondary.
Il est possible de réaliser dans le conteneur secondaire éventuellement un enrichissement secondaire, en ajoutant préalablement dans ledit conteneur secondaire, les éléments nutritifs et agents sélectifs ad hoc. Un tel enrichissement secondaire permet d'augmenter la population du ou des microorganisme(s) cible(s) par rapport à celle des microorganismes non cibles, ce qui améliore la spécificité. It is possible to realize in the secondary container possibly a secondary enrichment, by adding previously in said secondary container, the nutrients and selective agents ad hoc. Such secondary enrichment increases the population target microorganism (s) relative to non-target microorganisms, which improves specificity.
Préalablement à l'étape de détection et après l'étape c), une ou plusieurs étapes de lavage peuvent avoir lieu.  Prior to the detection step and after step c), one or more washing steps can take place.
Selon un mode de réalisation, un système de révélation apte à permettre la détection est mis en contact dans le conteneur principal ou secondaire. On entend par « système de révélation », toute molécule capable de se coupler avec les microorganismes, les protéines sécrétées ou les partenaires de liaison desdits microorganismes et permettant par leurs propriétés de transduction (fluorescence, coloration, radioactivité notamment) de révéler la présence desdits microorganismes.  According to one embodiment, a revelation system capable of enabling detection is brought into contact in the main or secondary container. "Revelation system" is understood to mean any molecule capable of coupling with the microorganisms, the secreted proteins or the binding partners of said microorganisms and which, by virtue of their transduction properties (fluorescence, coloration, radioactivity in particular), reveal the presence of said microorganisms. .
L'étape de détection peut être réalisée en temps réel ou à l'issue de l'étape de croissance du ou desdits microorganismes.  The detection step may be performed in real time or at the end of the growth step of said microorganism (s).
Ainsi, le procédé selon la présente invention, peut comprendre une étape supplémentaire de détection du microorganisme ou de la protéine sécrétée lié(e) au partenaire de liaison.  Thus, the method according to the present invention may comprise an additional step of detecting the microorganism or the secreted protein bound to the binding partner.
Selon un mode de réalisation, l'éponge est transférée dans un conteneur secondaire contenant un milieu de culture qui peut en sus contenir un substrat permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique des microorganismes cibles grâce à un signal détectable directement ou indirectement. Pour une détection directe, ce substrat peut être lié à une partie faisant office de marqueur, fluorescent ou chromogène. Pour une détection indirecte, le milieu de culture selon l'invention peut comporter en sus un indicateur de pH, sensible à la variation de pH induite par la consommation du substrat et révélant la croissance des microorganismes cibles. Ledit indicateur de pH peut être un chromophore ou un fluorophore. On citera comme exemples de chromophores le rouge neutre, le bleu d'aniline, le bleu de bromocresol. Les fluorophores comprennent par exemple la 4-méthylumbelliferone, les dérivés de l'aminocoumarine ou les dérivés de la résorufine. Un autre exemple de détection indirecte peut consister en l'utilisation de latex sensibilisé spécifiquement avec un anticorps dirigé contre l'analyte recherché.  According to one embodiment, the sponge is transferred to a secondary container containing a culture medium which may additionally contain a substrate allowing the detection of an enzymatic or metabolic activity of the target microorganisms by means of a detectable signal directly or indirectly. For direct detection, this substrate may be bound to a marker portion, fluorescent or chromogenic. For indirect detection, the culture medium according to the invention may additionally comprise a pH indicator, sensitive to the pH variation induced by the consumption of the substrate and revealing the growth of the target microorganisms. The said pH indicator may be a chromophore or a fluorophore. Examples of chromophores include neutral red, aniline blue, bromocresol blue. The fluorophores include, for example, 4-methylumbelliferone, aminocoumarin derivatives or resorufin derivatives. Another example of indirect detection may be the use of latex specifically sensitized with an antibody directed against the desired analyte.
Selon un mode de réalisation, le système de révélation est un substrat non spécifique internalisé du ou des microorganismes à détecter. Selon un exemple particulier, le système de révélation est basé sur la réduction du TTC par les microorganismes. Simultanément à la croissance, le TTC (incolore sous sa forme non réduite) est internalisé par lesdits microorganismes, puis réduit par ces derniers en triphényl-formazan (rouge) colorant ainsi lesdits microorganismes en rouge et permettant alors leur révélation sur l'éponge. Le procédé de détection directe et en temps réel de microorganismes dans un échantillon alimentaire, pendant la période d'incubation, est effectué par lecture optique de l'éponge, de manière automatisée ou non. L'incubation peut être réalisée à des températures comprises entre 25 et 44°C pendant 6 à 48h. Aussi une fois la capture effective d'une certaine quantité de microorganismes cibles colorés (cas d'un échantillon positif), il se produit un changement des propriétés optiques de l'éponge par apparition d'une coloration rouge sur celui-ci (i.e. transduction du signal biologique). Cette coloration du support de capture est alors détectable à l'œil ou mesurable via l'utilisation d'un automate de lecture tel qu'une caméra. Pour faciliter la lecture, il est préférable que l'éponge ne soit plus en contact avec le milieu de culture. A cette fin, il peut être envisagé par exemple de pencher le sac d'homogénéisation. Comme explicité supra, la lecture peut être faite en point final, en pointillés ou en temps réel. According to one embodiment, the revelation system is an internal non-specific substrate of the microorganism (s) to be detected. In a particular example, the disclosure system is based on TTC reduction by microorganisms. At the same time as the growth, the TTC (colorless in its unreduced form) is internalized by said microorganisms, then reduced by the latter to triphenyl-formazan (red) thus dyeing said microorganisms red and then allowing their revelation on the sponge. The method of direct and real-time detection of microorganisms in a food sample, during the incubation period, is performed by optical reading of the sponge, whether automated or not. The incubation can be carried out at temperatures between 25 and 44 ° C for 6 to 48 hours. Also once the effective capture of a certain quantity of colored target microorganisms (case of a positive sample), there is a change in the optical properties of the sponge by appearance of a red coloring on it (ie transduction biological signal). This coloration of the capture medium is then detectable to the eye or measurable via the use of a reading automaton such as a camera. To facilitate reading, it is preferable that the sponge is no longer in contact with the culture medium. For this purpose, it may be envisaged, for example, to lean the homogenization bag. As explained above, the reading can be done in end point, in dotted lines or in real time.
Selon un autre mode de réalisation, le système de révélation est un colorant cellulaire du ou des microorganismes à détecter.  According to another embodiment, the revelation system is a cellular dye of the microorganism (s) to be detected.
L'étape de détection peut être réalisée à l'aide d'un moyen choisi parmi les moyens de détection optiques, les moyens de détection magnétiques, les moyens de détection électrochimiques, les moyens de détection électriques, les moyens de détection acoustiques, les moyens de détection thermiques.  The detection step may be performed using a means selected from the optical detection means, the magnetic detection means, the electrochemical detection means, the electrical detection means, the acoustic detection means, the means thermal detection.
Selon un mode de réalisation, l'étape de détection est réalisée directement sur l'éponge. Selon un mode de réalisation particulier, l'éponge est pressée au cours de l'étape de détection permettant ainsi une amplification du signal.  According to one embodiment, the detection step is performed directly on the sponge. According to a particular embodiment, the sponge is pressed during the detection step thus allowing amplification of the signal.
Dans un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend une étape supplémentaire d'élution du microorganisme et/ou de la protéine sécrétée capturé(e) par l'éponge. Cette étape a lieu avant l'étape de détection. Cette étape est particulièrement avantageuse pour les méthodes de détection mettant en œuvre des techniques immunochimiques, l'amplification des acides nucléiques, la spectroscopie de masse ou encore la spectroscopie RAMAN.  In another embodiment, the method according to the invention comprises an additional step of eluting the microorganism and / or the secreted protein captured by the sponge. This step takes place before the detection step. This step is particularly advantageous for detection methods using immunochemical techniques, amplification of nucleic acids, mass spectroscopy or RAMAN spectroscopy.
Les exemples présentés ci-après ont pour but de présenter différents modes de réalisation du procédé selon l'invention et les résultats obtenus. Ils ne sont nullement limitatifs de l'invention. EXEMPLE The examples presented below are intended to show different embodiments of the process according to the invention and the results obtained. They are in no way limitative of the invention. EXAMPLE
Exemple 1 : Elaboration d'un support de capture sensibilisé avec au moins un partenaire de liaison spécifique du microorganisme cible permettant la capture des microorganismes cibles Example 1 Preparation of a sensitized capture support with at least one specific binding partner of the target microorganism for the capture of target microorganisms
Un support de capture, une éponge, constitué d'un cube de mousse en polyuréthane d'une contenance interne d'environ 2 ml est sensibilisé de la manière suivante : A capture medium, a sponge, consisting of a cube of polyurethane foam with an internal capacity of about 2 ml is sensitized in the following manner:
Le cube de mousse en polyuréthane (éponge) est « rempli » par des cycles de compression/décompression par une solution de 3,4 dihydoxyphénylalanine à 2 g/1 en tampon Tris-HCl pH 8.5 puis reste immergé dans ladite solution à température ambiante pendant 18- 24h. The cube of polyurethane foam (sponge) is "filled" by compression / decompression cycles with a solution of 3,4 dihydoxyphenylalanine at 2 g / l in Tris-HCl buffer pH 8.5 and then remains immersed in said solution at room temperature for 18- 24h.
L'éponge est ensuite rincée en eau déminéralisée stérile 3 fois par des cycles de compression / décompression.  The sponge is then rinsed in sterile demineralized water 3 times by compression / decompression cycles.
L'éponge est alors immergée pendant deux heures à température ambiante dans une solution de partenaires de liaison spécifiques (1 μg/mL à 40μg/mL) en tampon PBS pH 7.2;  The sponge is then immersed for two hours at room temperature in a solution of specific binding partners (1 μg / ml at 40 μg / ml) in PBS buffer pH 7.2;
L'éponge est enfin passivée dans une solution de BSA en tampon Tris-Maléate à pH 6.2, pendant 1 heure à température ambiante. The sponge is finally passivated in a solution of BSA in Tris-Maleate buffer at pH 6.2 for 1 hour at room temperature.
L'éponge est ensuite rincée dans un tampon PBS pH 7.2, 3 fois par cycles de compression / décompression.  The sponge is then rinsed in PBS buffer pH 7.2, 3 times in compression / decompression cycles.
Le cube de mousse sensibilisé peut être utilisé pour la capture des microorganismes ou conservé à 2-8°C en vue d'une utilisation ultérieure. Exemple 2 : Détection optique de la présence d'Escherichia coli 0157:H7 dans un échantillon alimentaire via l'utilisation d'une éponge sensibilisés The sensitized foam cube can be used for microorganism capture or stored at 2-8 ° C for later use. Example 2: Optical detection of the presence of Escherichia coli O157: H7 in a food sample via the use of a sensitized sponge
Le but de cette expérimentation est de détecter directement, via l'utilisation d'un support sensibilisé, tel que décrit supra, la présence de la bactérie cible E. coli 0157:H7 dans un échantillon alimentaire en cours d'enrichissement. The purpose of this experiment is to directly detect, via the use of a sensitized support, as described above, the presence of the target bacterium E. coli O157: H7 in a food sample being enriched.
Comme détaillé ci-après, la détection s'effectue pendant la période d'incubation en immergeant le support de capture sensibilisé avec une protéine de phage recombinante anti-E. coli 0157:H7 dans un sac d'homogénéisation qui contient l'échantillon alimentaire, dilué au l/10ème dans le milieu réactionnel. Deux échantillons sont préparés comme suit : As detailed below, the detection is carried out during the incubation period by immersing the sensitized capture medium with an anti-E recombinant phage protein. coli 0157: H7 in a homogenisation bag which contains the food sample, diluted 1/10 in the reaction medium. Two samples are prepared as follows:
Echantillon A : Dans un sac d'homogénéisation, 25g de steak haché contaminés par 5 unités formant colonies (UFC) de E. coli 0157:H7 sont remis en suspension dans 225 mL d'EPT (bioMérieux, Réf. 42043) supplémentés par O.Olg/L de vancomycine (Sigma, Cat. No. 75423).  Sample A: In a homogenizer bag, 25g of ground steak contaminated with 5 colony forming units (CFU) of E. coli O157: H7 are resuspended in 225 mL of EPT (bioMérieux, Ref. Olig / L vancomycin (Sigma, Cat No. 75423).
Echantillon B : Dans un sac d'homogénéisation, 25g de steak haché non contaminés par E. coli 0157:H7 sont remis en suspension dans 225 ml d'EPT (eau peptonée tamponnée) supplémentés par O.Olg/L de vancomycine. Pour chaque échantillon, les analyses sont faites en trois exemplaires.  Sample B: In a homogenizer bag, 25 g of non-E. coli 0157: H7 minced steak was resuspended in 225 ml of EPT (buffered peptone water) supplemented with O.Olg / L vancomycin. For each sample, the analyzes are made in triplicate.
Les éponges sensibilisées sont immergées dans les sacs d'homogénéisation avant incubation. Les sacs sont ensuite refermés à l'aide d'une barrette de fermeture et incubés dans une étuve à 41.5°C pendant 16-24h. The sensitized sponges are immersed in the homogenization bags before incubation. The bags are then closed with a closing bar and incubated in an oven at 41.5 ° C for 16-24h.
Les sacs sont ensuite placés dans un système permettant la pression / décompression des éponges fonctionnalisées pendant toute la durée de l'incubation (fréquence : 1 cycle en 10 seconde). The bags are then placed in a system allowing the pressure / decompression of the functionalized sponges throughout the incubation period (frequency: 1 cycle in 10 seconds).
Au terme de la période d'incubation (20h à 41.5°C) les éponges sont retirées des sacs d'enrichissement et lavées dans un sac stomacher contenant 90 ml de tampon PBS (30 secondes de stomachage). Cette opération a pour but d'éliminer au maximum les éléments non cibles susceptibles d'être présents dans les alvéoles de l'éponge.  At the end of the incubation period (20h at 41.5 ° C.) the sponges are removed from the enrichment bags and washed in a stomacher bag containing 90 ml of PBS buffer (30 seconds of stomachage). This operation aims to eliminate as much non-target elements that may be present in the cells of the sponge.
La présence des microorganismes cibles est révélée sur les éponges sensibilisées : The presence of target microorganisms is revealed on sensitized sponges:
Les éponges sont mises en contact dans une seringue avec 500 μΐ d'une solution conjuguée d'anticorps anti- E.coli 0157 :H7 marqués à la PAL (phosphatase alcaline) pendant 10 minutes. The sponges are placed in contact in a syringe with 500 μl of a conjugated solution of anti-E. coli 0157: H7 antibodies labeled with ALP (alkaline phosphatase) for 10 minutes.
Des étapes de lavages sont effectués en tampon PBS-Tween par plusieurs mouvements de piston des seringues.  Washing steps are carried out in PBS-Tween buffer by several piston movements of the syringes.
Mise en contact de 400 μΐ de substrat 4 methyl-umbelliferone phosphate afin de révélé la présence éventuelle de conjugué PAL si le test est positif.  Contacting 400 μΐ of substrate 4 methyl-umbelliferone phosphate to reveal the possible presence of PAL conjugate if the test is positive.
La vérification de la capture de E.coli 0157 :H7 sur les éponges fonctionnalisées est mise en évidence par l'apparition de la fluorescence due à l'action de la phosphatase alcaline (PAL) présente dans le conjugué sur le substrat. Il s'agit ici d'un mode de réalisation afin de confirmer la capture de E.coli 0157 :H7 sur le support type éponge. La finalité est bien de concentrer l'analyte en cours de croissance sur l'éponge afin de diminuer le temps de la phase d'enrichissement et de procéder ensuite aux étapes d'élution et de détection du ou des microorganismes. The verification of the capture of E. coli 0157: H7 on the functionalized sponges is evidenced by the appearance of the fluorescence due to the action of the alkaline phosphatase (PAL) present in the conjugate on the substrate. This is an embodiment to confirm the capture of E. coli 0157: H7 on the sponge type support. The purpose is to concentrate the analyte during growth on the sponge to reduce the time of the enrichment phase and then proceed to the steps of elution and detection of the microorganism or microorganisms.
Exemple 3 : Capture, élution puis détection de microorganismes cibles. Example 3 Capture, elution then detection of target microorganisms.
Un support de capture, une éponge, constitué d'un cube de mousse en polyuréthane est fonctionnalisé avec la protéine de phage E.coli 0157 :H7: Eponge « + ». A capture medium, a sponge, consisting of a cube of polyurethane foam is functionalized with the phage protein E.coli 0157: H7: Sponge "+".
Une éponge polyuréthane non fonctionnalisée est également utilisée pour évaluer la capture non spécifique liée à la structure de l'éponge : Eponge «-». A non-functionalized polyurethane sponge is also used to evaluate the non-specific capture related to the structure of the sponge: Sponge "-".
Dans un sac d'homogénéisation, 25g de steak haché sont remis en suspension dans 225 ml d'EPT préchauffé à 41.5°C : contrôle négatif. In a homogenization bag, 25 g of ground beef are resuspended in 225 ml EPT preheated to 41.5 ° C: negative control.
Dans un autre sac d'homogénéisation, 25g de steak haché contaminés artificiellement par 100 unités formant colonies (UFC) de E.coli 0157 :H7 sont remis en suspension dans 225 ml d'EPT (réf. bioMérieux 42043) préchauffé à 41.5°C : contrôle positif. In another homogenizer bag, 25 g of artificially-contaminated ground steak with 100 colony forming units (CFU) of E. coli 0157: H7 are resuspended in 225 ml of EPT (bioMérieux 42043 ref.) Preheated to 41.5 ° C. : positive control.
Les sacs sont homogénéisés pendant 30 secondes à l'aide d'un système stomacher. The bags are homogenized for 30 seconds using a stomacher system.
Dans deux des sacs contenant le steak haché artificiellement contaminé, on introduit une éponge « + » fonctionnalisée et une éponge « - » Les éponges sont fixées à une tige plastique permettant leur maintien dans le bouillon d'enrichissement pendant le temps d'incubation et de compression / décompression dans le système tel que décrit dans la demande de brevet français déposée par la demanderesse et portant le numéro de dépôt 1260566. In two of the bags containing the artificially contaminated ground steak, a functionalized "+" sponge and a "-" sponge are introduced. The sponges are attached to a plastic rod allowing them to be kept in the enrichment broth during the incubation and incubation period. compression / decompression in the system as described in the French patent application filed by the applicant and bearing the deposit number 1260566.
Les sacs sont ensuite incubés dans une étuve à 41.5°C et agités avec le système mentionné ci- dessus permettant la compression / décompression des éponges dans les sacs (1 cycle toutes les 5 secondes). The bags are then incubated in an oven at 41.5 ° C and shaken with the above-mentioned system allowing compression / decompression of the sponges in the bags (1 cycle every 5 seconds).
Au terme de la période d'incubation définie (dans le cas présent 5h), l'éponge fonctionnalisée est retirée du sac d'enrichissement, essorée et lavée 2 fois avec un volume de 5ml de PBS- Tween 20 à 0.05% dans un tube plastique (essorage entre et après chaque lavage). Un volume de 1 mL de tampon PBS est introduit dans le tube et celui-ci est placé au bain-marie à 100°C pendant 10 min. pour permettre l'élution des cellules E.coli 0157 :H7 capturées sur le support éponge. At the end of the defined incubation period (in this case 5h), the functionalized sponge is removed from the enrichment bag, drained and washed twice with a volume of 5 ml of PBS. Tween 20 at 0.05% in a plastic tube (spin between and after each wash). A volume of 1 mL of PBS buffer is introduced into the tube and it is placed in a water bath at 100 ° C for 10 min. to allow the elution of E. coli 0157: H7 cells captured on the sponge support.
Des fractions aliquotes de 1.5 mL des bouillons d'enrichissement provenant des sacs témoins ne contenant pas d'épongés (sacs négatif et positifs) sont prélevés après 5h d'enrichissement. Les échantillons sont placés dans un tube Eppendorf 2 mL et chauffés au bain-marie à 100°C pendant 10 min. 1.5 ml aliquots of the enrichment broths from control bags containing no sponges (negative and positive bags) are taken after 5 hours of enrichment. The samples are placed in a 2 mL Eppendorf tube and heated in a water bath at 100 ° C for 10 min.
A partir des échantillons chauffés (v=500 μί), on procède à la réalisation d'un test VIDAS ECPT (E. coli Phage Technology) commercialisée par la demanderesse (réf. 30122). From the heated samples (v = 500 μl), a VIDAS ECPT test (E. coli Phage Technology) marketed by the applicant (reference 30122) is carried out.
Les résultats obtenus en RFV (relative fluorescence value) sont notés dans le tableau 1. The results obtained in RFV (relative fluorescence value) are noted in Table 1.
Tableau 1 : Valeurs RFV obtenues à partir des différents échantillons testés, après 5h d' enrichissement  Table 1: RFV values obtained from the different samples tested, after 5 hours of enrichment
On voit à partir du résultat obtenu avec les éponges que l'éponge « + » a été fonctionnalisée et capture la bactérie cible (E.coli 0157 :H7). Un signal positif est détecté avec le kit VIDAS ECPT après lavage des éponges et étapes d'élution par chauffage. Les niveaux de signaux RFV obtenus à partir de l'éponge fonctionnalisée (et reprises dans 1 mL) indiquent une concentration de l'analyte en comparaison du résultat obtenu à partir de l'échantillon brut (500 μί). It can be seen from the result obtained with the sponges that the sponge "+" has been functionalized and captures the target bacterium (E.coli 0157: H7). A positive signal is detected with the VIDAS ECPT kit after washing the sponges and eluting steps by heating. The RFV signal levels obtained from the functionalized sponge (and taken up in 1 mL) indicate a concentration of the analyte in comparison with the result obtained from the raw sample (500 μί).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour capturer et concentrer au moins un microorganisme ou au moins une protéine sécrétée d'un microorganisme susceptible d'être présent(e) dans un échantillon placé dans un conteneur, la procédé comprenant les étapes suivantes : A method for capturing and concentrating at least one microorganism or at least one secreted protein from a microorganism that may be present in a sample placed in a container, the method comprising the steps of:
a) mettre en contact dans le conteneur ledit échantillon avec un milieu de culture et une éponge apte à capturer le(s) microorganisme(s) ou la (les) protéine(s) sécrétée(s) d'au moins un microorganisme à détecter, fonctionnalisée par un partenaire de liaison d'au moins un microorganisme ou d'au moins une protéine sécrétée, a) contacting in the container said sample with a culture medium and a sponge capable of capturing the microorganism (s) or the protein (s) secreted from at least one microorganism to be detected functionalized by a binding partner of at least one microorganism or at least one secreted protein,
b) placer le conteneur dans des conditions aptes à permettre la croissance du ou des microorganismes(s), b) placing the container in conditions that are suitable for allowing the growth of the microorganism (s),
c) presser et décompresser répétitivement l'éponge en restant en contact avec ledit milieu. c) repeatedly pressing and decompressing the sponge while remaining in contact with said medium.
2. Procédé selon la revendication 1 dans laquelle l'éponge est immergée dans ledit milieu. 2. Method according to claim 1 wherein the sponge is immersed in said medium.
3. Procédé selon la revendication 1 dans laquelle ledit milieu circule à travers l'éponge. 3. The method of claim 1 wherein said medium flows through the sponge.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant une étape supplémentaire consistant à transférer tout ou partie du mélange constitué par ledit échantillon, le milieu de culture, l'éponge et éventuellement un système de révélation, du conteneur, dit alors principal vers au moins un deuxième conteneur dit secondaire. 4. Method according to any one of the preceding claims, comprising an additional step of transferring all or part of the mixture consisting of said sample, the culture medium, the sponge and optionally a revealing system, the container, then called principal to at least one second container said secondary.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 comprenant une étape supplémentaire de détection d'au moins un microorganisme ou d'au moins une protéine sécrétée lié(e) à l'éponge. 5. Method according to any one of claims 1 to 4 comprising an additional step of detecting at least one microorganism or at least one secreted protein bound to the sponge.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel un système de révélation apte à permettre la détection est mis en contact dans le conteneur principal ou secondaire préalablement à l'étape de détection. The method of claim 5, wherein a revelation system capable of enabling detection is contacted in the primary or secondary container prior to the detecting step.
7. Procédé selon la revendication 6 dans laquelle l'étape de détection est réalisée à l'aide d'un moyen choisi parmi les moyens de détection optiques, les moyens de détection magnétiques, les moyens de détection électrochimiques, les moyens de détection électriques, les moyens de détection acoustiques, les moyens de détection thermiques. 7. The method of claim 6 wherein the detection step is performed using a means selected from the optical detection means, the magnetic detection means, the electrochemical detection means, the electrical detection means, the acoustic detection means, the thermal detection means.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 7 dans lequel le système de révélation est un substrat non spécifique internalisé du ou des microorganismes à détecter. 8. Method according to any one of claims 6 to 7 wherein the revelation system is an internal non-specific substrate of the microorganism (s) to be detected.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 7 dans lequel le système de révélation est un colorant cellulaire du ou des microorganismes à détecter. 9. Method according to any one of claims 6 to 7 wherein the developing system is a cellular dye or microorganisms to be detected.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9 dans laquelle l'étape de détection est réalisée directement sur l'éponge. 10. Method according to any one of claims 6 to 9 wherein the detection step is performed directly on the sponge.
11. Procédé selon la revendication 10 dans lequel l'éponge est pressée. 11. The method of claim 10 wherein the sponge is pressed.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 comprenant une étape supplémentaire d'élution du microorganisme ou de la protéine sécrétée capturé(e) par l'éponge. The method of any one of claims 1 to 9 comprising an additional step of eluting the secreted microorganism or protein (e) by the sponge.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 11 dans laquelle l'étape de détection est réalisée en temps réel. 13. Method according to any one of claims 6 to 11 wherein the detection step is performed in real time.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 12 dans laquelle l'étape de détection est réalisée à l'issue de l'étape de croissance du ou desdits microorganismes. 14. Method according to any one of claims 6 to 12 wherein the detection step is carried out at the end of the growth step of said microorganism (s).
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 dans laquelle un partenaire de liaison spécifique ou non spécifique d'au moins un microorganisme ou d'au moins une protéine sécrétée est lié(e) à l'éponge. 15. Method according to any one of claims 1 to 14 wherein a specific or nonspecific binding partner of at least one microorganism or at least one secreted protein is bound (e) sponge.
16. Procédé selon la revendication 15 dans laquelle le partenaire de liaison spécifique est sélectionné dans un groupe comprenant les protéines, les anticorps, les antigènes, les phages, les protéines de phage, les aptamères, les acides nucléiques. The method of claim 15 wherein the specific binding partner is selected from a group consisting of proteins, antibodies, antigens, phages, phage proteins, aptamers, nucleic acids.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16 dans laquelle le partenaire de liaison est lié à l'éponge via un polymère de dopamine. 17. The method of any one of claims 15 or 16 wherein the binding partner is bound to the sponge via a dopamine polymer.
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