FR2646917A1 - METHOD FOR DETERMINING ANTI-ALLERGEN SPECIFIC IGG ANTI-BODY, IGG4-RICH FRACTION OBTAINED ACCORDING TO THIS PROCESS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THIS FRACTION - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention concerne notamment le dosage des anticorps anti-allergènes et un procédé permettant d'obtenir des immunoglobulines ayant un titre élevé en IgG spécifiques anti-allergènes, notamment anti-pollen de graminées. The present invention relates in particular to the assay of anti-allergenic antibodies and to a process making it possible to obtain immunoglobulins having a high titer in specific IgG anti-allergenic, in particular anti-pollen of grasses.
Le brevet européen n" 86 9018S7.9 décrit un procédé permettant d'obtenir des immunoglobulines présentant un titre important en IgG spécifiques anti-allergènes. L'un des inconvénients de ce procédé, comme d'ailleurs d'un grand nombre de procédés de purification d'immunoglobulines, est qu'il doit partir de sérum de patients dont la teneur en IgG spécifiques anti-allergènes est la plupart du temps inconnue. Ceci d'autant moins que les sérums traités sont la plupart du temps des mélanges provenant de différents donneurs. European patent n ° 86 9018S7.9 describes a process making it possible to obtain immunoglobulins having a high titre in specific anti-allergenic IgGs. One of the drawbacks of this process, as indeed of a large number of methods of immunoglobulin purification, is that it must start from serum from patients whose specific anti-allergen IgG content is mostly unknown. This is all the less so since the treated sera are mostly mixtures coming from different donors.
Maintenant, grâce au procédé qui sera décrit ci-après, il a été montré que seul 1 à 2 % de donneurs présentent un titre appréciable en anticorps puisqu'aucune sélection préalable nTest effectuée par interroga toire, alors que la fréquence des sujets ayant un titre appréciable d'anticorps, lorsqu'ils ont été sélectionnés par un interrogatoire portant sur l'existence d'antécédents allergiques, est comprise entre 10 et 30 %. Now, thanks to the process which will be described below, it has been shown that only 1 to 2% of donors have an appreciable antibody titer since no prior selection is made by interrogation, whereas the frequency of subjects having a titer appreciable of antibodies, when they were selected by an interrogation relating to the existence of allergic antecedents, is between 10 and 30%.
Il est donc particulièrement intéressant de pouvoir disposer d'une méthode rapide qui permette de sélectionner les donneurs présentant des taux élevés d'anticorps recherchés, de même qu'il est particulièrement interessant de pouvoir ensuite standardiser les extraits d'immunoglobulines correspondants afin d'obtenir des traitements bien reproductibles et contrôlés. It is therefore particularly advantageous to be able to have a rapid method which makes it possible to select the donors having high levels of desired antibodies, just as it is particularly interesting to be able then to standardize the corresponding immunoglobulin extracts in order to obtain well reproducible and controlled treatments.
Enfin, le dosage des anticorps en cause permet de suivre l'efficacité du traitement, ce qui constitue également un avantage considérable lors du traitement de doésensibilisation par exemple. Finally, the assay of the antibodies in question makes it possible to monitor the effectiveness of the treatment, which also constitutes a considerable advantage during the treatment of desensitization for example.
3usqu'à présent les technologies mises en oeuvre afin de mesurer les teneurs en anticorps anti-allergènes spécifiques étaient inapplicables pour une application à grande échelle. 3 Until now, the technologies used to measure the levels of specific anti-allergen antibodies were inapplicable for large-scale application.
En effet, il est important pour pouvoir sélectionner les donneurs présentant des teneurs élevées en anticorps de pouvoir disposer d'une méthode de dosage fiable et facile à mettre en oeuvre, ce qui exclut en particulier les méthodes de type radio-immuno-essais qui nécessitent la manipulation de produits radio-actifs. In fact, in order to be able to select donors with high antibody contents, it is important to be able to have a reliable assay method which is easy to implement, which in particular excludes radio-immunoassay type methods which require handling of radioactive products.
Le procédé selon la présente invention est donc un procédé destiné à doser la teneur en IgG spécifiques d'allergènes contenues dans un milieu, caractérisé en ce qu 'on utilise la technique ELISA, dans laquelle les
IgG contenues dans l'échantillon du milieu sont fixées avec support par l'intermédiaire de l'allergène, les IgG spécifiques d'allergènes sont détectées grâce à un anticorps monoclonal non humain anti-IgG4 humain dont la présence est révélée par un anticorps marqué correspondant à la partie épitope non humaine de l'anticorps monclonal.The method according to the present invention is therefore a method intended for determining the content of specific IgG of allergens contained in a medium, characterized in that the ELISA technique is used, in which the
IgG contained in the sample of the medium are fixed with support via the allergen, the specific IgG of allergens are detected by means of a non-human monoclonal antibody anti-human IgG4 whose presence is revealed by a corresponding labeled antibody to the non-human epitope portion of the monclonal antibody.
Parmi les allergènes plus particulièrement importants à détecter par le procédé de la présente invention, il faut mentionner le pollen, les extraits de pollen d'arbres ou de graminées et d'acariens dermatophagoides farinae et pteronyssinus. Among the more particularly important allergens to be detected by the method of the present invention, mention should be made of pollen, pollen extracts from trees or grasses and dermatophagoides farinae and pteronyssinus mites.
La technique ELISA qui ne sera pas décrite en détail, elle sera simplement mentionnée dans le cadre des exemples, est une technologie qui est parfaitement connue de l'homme de métier et du spécialiste des méthodes de dosage immunologique. The ELISA technique which will not be described in detail, it will simply be mentioned in the context of the examples, is a technology which is perfectly known to those skilled in the art and to those skilled in the art of immunoassay methods.
Cependant, selon la présente invention, cette technique ELISA est appliquée de manière originale à des allergènes de type extraits de pollen et d'acariens et utilise des anticorps monoclonaux anti-IgG4 qui permettent la détection des lgG4 spécifiques. However, according to the present invention, this ELISA technique is applied in an original manner to allergens of the pollen and mite extract type and uses anti-IgG4 monoclonal antibodies which allow the detection of specific IgG4.
Ainsi, à la différence de la seule technique proposée actuellement en laboratoire, ctest-à-dire la technique nRIA qui est inadaptée au dépistage en grand nombre et qui ne permet pas d'estimer précisément le taux des anticorps présents dans le sérum, la technique
ELISA selon l'invention ne présente pas les inconvénients précités et permet d'exprimer les résultats en valeur absolue (mg/ml).Thus, unlike the only technique currently proposed in the laboratory, that is to say the nRIA technique which is unsuitable for screening in large numbers and which does not allow precise estimation of the level of antibodies present in serum, the technique
ELISA according to the invention does not have the aforementioned drawbacks and makes it possible to express the results in absolute value (mg / ml).
La présente invention concerne plus particulièrement l'incorporation de ce procédé de dosage dans un procédé d'obtention d'immunoglobulines anti-allergènes hyper-immunes, procédé dans lequel, préalablement à la purification des sérums par toute méthode appropriée, on dose le sérum des donneurs et on sélectionne les sérums présentant des teneurs d'immunoglobulines anticorps IgG spécifiques anti-allergènes d'au moins 0,2 pg/ml et de préférence d'au moins 1 pg/ml. The present invention relates more particularly to the incorporation of this assay method into a method for obtaining anti-allergen hyperimmune immunoglobulins, method in which, before the purification of the sera by any suitable method, the serum of the donors and the sera having immunoglobulin specific anti-allergen IgG antibody contents of at least 0.2 pg / ml and preferably at least 1 pg / ml are selected.
Parmi les procédés de purification qui peuvent être utilisés il faut citer le procédé de purification mentionné au début de la présente description, c'est-à-dire un procédé qui, dans les fractions I+II+III de Cohn, précipite les immunoglobulines spécifiques grâce à l'acide caprylique après remise en solution du précipité I+II+III. Among the purification methods which can be used, mention should be made of the purification method mentioned at the beginning of this description, that is to say a method which, in the fractions I + II + III of Cohn, precipitates the specific immunoglobulins thanks to caprylic acid after redissolving the precipitate I + II + III.
Ainsi la présente invention peut être mise en oeuvre selon le procédé qui comporte les étapes suivantes a) dosage des échantillons de sérum selon l'invention b) élimination des échantillons présentant une teneur en immunoglobulines
anticorps IgG spécifiques anti-allergènes inférieure à 0,2 ug/ml c) purification des échantillons de sérum pour obtenir ladite fraction
riche en IgG4.Thus, the present invention can be implemented according to the method which comprises the following steps a) assaying of the serum samples according to the invention b) elimination of the samples having an immunoglobulin content
specific anti-allergen IgG antibodies lower than 0.2 ug / ml c) purification of serum samples to obtain said fraction
rich in IgG4.
La présente invention a également pour objet une fraction riche en IgG4, pouvant être obtenue par le procédé ci-dessus. The present invention also relates to a fraction rich in IgG4, which can be obtained by the above method.
La présente invention a, en outre, pour objet une composition pharmaceutique utilisable dans les traitements de désensibilisation contenant la fraction riche en IgG4 visée ci-dessus. The present invention further relates to a pharmaceutical composition usable in desensitization treatments containing the fraction rich in IgG4 referred to above.
Les exemples ci-après permettront de mieux mettre en évidence certaines caractéristiques du procédé de dosage et de purification selon l'invention. The examples below will make it possible to better highlight certain characteristics of the assay and purification process according to the invention.
Exemple I
Obtention des sérums
Les sérums de sujets allergiques au pollen et désensibilisés depuis plusieurs années ont été adressés par le Dr. Guinnepain de l'Institut
Pasteur, ainsi que par les Centres de Transfusion de Lille : Dr. Descamps,
Lyon : Dr. Chèvre, Rouen : Dr. Gilbert et Angers : Dr. Bidet.Example I
Obtaining sera
The sera of subjects allergic to pollen and desensitized for several years were sent by Dr. Guinnepain from the Institute
Pasteur, as well as by the Lille Transfusion Centers: Dr. Descamps,
Lyon: Dr. Chèvre, Rouen: Dr. Gilbert and Angers: Dr. Bidet.
Environ 12 000 sérums provenant des cabines de prélèvement pour plasmaphérèse du Centre National de Transfusion Sanguine ainsi que des Centres Régionaux de Transfusion de Montpellier, Bordeaux et Nantes ont été prélevés sans sélection préalable des donneurs et stockés à -250C. About 12,000 sera from the plasmapheresis collection booths of the National Center for Blood Transfusion as well as the Regional Transfusion Centers of Montpellier, Bordeaux and Nantes were collected without prior selection of donors and stored at -250C.
Antigènes extraits du pollen
Les extraits solubles du pollen de graminées (Dactylis
Glomerata) proviennent de l'institut Pasteur, Paris (Professeur David).Antigens extracted from pollen
Soluble extracts of grass pollen (Dactylis
Glomerata) come from the Pasteur Institute, Paris (Professor David).
Les anticorps monoclonaux anti sous classe d'IgG humaines proviennent des anticorps et immunsérums Merck, Nogent-sur-Marne,
France). L'immunsérum de chèvre anti-immunoglobulines G de souris conjugué à la phosphatase alcaline provient des Laboratoires Sigma
Chemical Co. (Saint-Louis, USA). Il a été absorbé par les IgG humaines pour éviter les réactions croisées avec les IgG humaines.The anti-human IgG monoclonal antibodies come from Merck, Nogent-sur-Marne antibodies and immunsera,
France). The goat anti-immunoglobulin G mouse immune serum conjugated with alkaline phosphatase comes from Laboratoires Sigma
Chemical Co. (Saint-Louis, USA). It was absorbed by human IgG to avoid cross-reactions with human IgG.
Technique ímmuno-enzymatique de dosage des IgG anti-pollen de graminées
Après des essais préliminaires pour déterminer la concentration optimale d'antigènes, 0,1 ml d'une solution d'antigènes solubles de pollen (Dactylis Glomerata) à 2 ugiml en tampon phosphate saline pH 7 sont déposés dans les puits de plaques de microtitration. Après une incubation de 18 heures à 4"C, les puits sont lavés 5 fois en tampon phosphate saline,
PH 7, avec 0,5 % de Twenn 20.La saturation des plaques est obtenue par incubation 1 heure à 37"C d'une solution d'albumine à 2 % suivie de lavages en tampon phosphate saline avec 0,05 % de Tween 20. 0,1 ml de dilution de sérum en tampon phosphate saline et albumine à 1 % sont pipettés dans chaque puits. Après une incubation de 2 heures à 37"C, les puits sont lavés en tampon phosphate saline avec 0,05 % de Tween 20.Immuno-enzymatic technique for assaying grass pollen IgG
After preliminary tests to determine the optimal concentration of antigens, 0.1 ml of a solution of soluble pollen antigens (Dactylis Glomerata) at 2 ugiml in phosphate saline buffer pH 7 are deposited in the wells of microtitration plates. After an incubation of 18 hours at 4 "C, the wells are washed 5 times in phosphate saline buffer,
PH 7, with 0.5% Twenn 20. The saturation of the plates is obtained by incubation for 1 hour at 37 "C with a 2% albumin solution followed by washes in phosphate-buffered saline with 0.05% Tween. 20. 0.1 ml of serum dilution in 1% phosphate buffered saline and albumin are pipetted into each well. After a 2 hour incubation at 37 ° C, the wells are washed in phosphate buffered saline with 0.05% Tween 20.
0,175 ml d'anticorps monoclonaux anti sous classe d'lgG4 (clone RJ4) sont ajoutés et incubés 1 heure à 370cri Après 5 lavages, 0,175 ml d'anticorps anti-lgG de souris conjugués à la phosphatase alcaline sont ajoutés à chaque puits et incubés 1 heure à 370C. Le substrat p-nitrophényl phosphate est utilisé selon les recommandations du fabricant (Sigma). L'absorption à 405 nm est lue par un lecteur Titerteck Multiscan (Laboratoires Flow).0.175 ml of anti-IgG4 monoclonal antibodies (clone RJ4) are added and incubated for 1 hour at 370cri After 5 washes, 0.175 ml of anti-mouse IgG antibodies conjugated with alkaline phosphatase are added to each well and incubated 1 hour at 370C. The p-nitrophenyl phosphate substrate is used according to the manufacturer's recommendations (Sigma). The absorption at 405 nm is read by a Titerteck Multiscan reader (Flow Laboratories).
Les résultats sont exprimés en densité optique (DO). La valeur minimale requise pour un sérum positif étant 0,2 DO à la dilution au 1/50 du sérum. The results are expressed in optical density (OD). The minimum value required for a positive serum is 0.2 OD at a 1/50 dilution of the serum.
Ces résultats peuvent être également exprimés en valeur absolue grâce à un sérum étalon contenant 110 pg/ml d'Ig spécifique. Cette valeur a été mesurée par des absorptions sur des colonnes de Sépharose sur lesquelles ont été immobilisés des extraits de pollen. These results can also be expressed in absolute value using a standard serum containing 110 pg / ml of specific Ig. This value was measured by absorptions on Sepharose columns on which pollen extracts were immobilized.
Dans ces conditions, le taux minimum d'IgG4 spécifique est de 1 llg/ml, ce qui correspond à une DO de 0,2 pour une dilution au 1/50. Under these conditions, the minimum specific IgG4 level is 1 llg / ml, which corresponds to an OD of 0.2 for a 1/50 dilution.
Exemple 2
Un dépistage des sujets ayant des taux d'anticorps IgG anti-pollen de graminées élevés a été effectué chez 12 500 donneurs de phasmaphérèse. Les mesures ont été effectuées à une dilution unique du 50ème et exprimés en densité optique comme cela est décrit à l'exemple 1.Example 2
12,500 phasmapheresis donors were screened for subjects with high grass anti-pollen IgG antibody levels. The measurements were carried out at a single dilution of the 50th and expressed in optical density as described in Example 1.
Ce dépistage a été réalisé soit à partir de sujets sélectionnés par un interrogatoire portant sur l'existence d'antécédents allergiques, soit de sujets pris au hasard dans la population de donneurs de plasmaphérèse.This screening was carried out either from subjects selected by an interrogation relating to the existence of allergic history, or from subjects taken at random from the population of plasmapheresis donors.
Les plasmas sélectionnés ont été "poolés". Le taux des anticorps IgG spécifiques anti-pollen est de 7 Uug/ml d'lgG4 spécifiques, mesurées par ELISA, dans le "pool" de plasmas. Les immunoglobulines ont été fractionnés par une technique utilisant le fraction à l'éthanol et à l'acide caprylique. On précipite la fraction alcoolique II+III (précipité A du schéma de fractionnement de Kitler et Nisehman) selon un procédé utilisant l'acide caprylique. The plasmas selected have been "pooled". The level of specific anti-pollen IgG antibodies is 7 Uug / ml of specific IgG4, measured by ELISA, in the “pool” of plasmas. The immunoglobulins were fractionated by a technique using the ethanol and caprylic acid fraction. The alcohol fraction II + III is precipitated (precipitate A from the Kitler and Nisehman fractionation scheme) according to a method using caprylic acid.
Des IgG pures à 95 % ont été obtenues. L'activité spécifique en anticorps anti-pollen de graminées dans ces immunoglobulines est 12 fois supérieure à celle du "pool" des donneurs, soit environ 90 pg d'anticorps spécifiques par mi de de solution d'immunoglobulines. 95% pure IgG was obtained. The specific anti-pollen antibody activity of grasses in these immunoglobulins is 12 times greater than that of the donor "pool", ie approximately 90 μg of specific antibodies per mi of immunoglobulin solution.
Cependant, le taux d'IgE totales passe de 240 UI/ml dans le plasma de départ à 14 Ul/ml dans les immunoglobulines purifiées. Cette diminution est également observée pour les IgE spécifiques anti-pollen qui passent de classe 4 à la classe 1 lors de cette purification. However, the total IgE level goes from 240 IU / ml in the starting plasma to 14 IU / ml in the purified immunoglobulins. This decrease is also observed for the specific anti-pollen IgEs which pass from class 4 to class 1 during this purification.
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