FR2638607A1

FR2638607A1 - Process for regenerating and cloning Angiospermae, regenerants and clones obtained by this process

Info

Publication number: FR2638607A1
Application number: FR8814419A
Authority: FR
Inventors: Fabrice Pinard; Gerard Touraud; Claude Allard
Original assignee: Institut Francais de Recherche Scientifique pour Developpement en Cooperation ORSTOM; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut Francais de Recherche Scientifique pour Developpement en Cooperation ORSTOM; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1988-11-04
Filing date: 1988-11-04
Publication date: 1990-05-11

Abstract

The present invention relates to a process for regenerating Angiospermae, characterised: - in that the inflorescences or flowers of Angiospermae infected by an appropriate virescence agent are collected; - in that the said inflorescences or flowers collected are cultivated in vitro, under appropriate temperature and light conditions, on a medium comprising mineral macroelements, mineral microelements, EDTA, vitamins, agar and sucrose, hereinafter called basic nutrient medium MB and comprising, in addition, a substance promoting the expression of the virescence, chosen from the group which comprises especially a strong auxin or any other chemical substance with similar action, and optionally a cytokinin and/or benzyladenine and/or coconut milk, for an appropriate time; - in that the explants infected and cultivated according to step 2 are transferred onto an appropriate transplanting medium until buds are obtained which correspond to an infected vegetative structure; - in that rhizogenesis of the said infected buds is induced by transferring the said buds onto an appropriate medium containing auxins or analogues, for an appropriate time, the said transplanting being optionally performed several times, in order to obtain roots; - in that the said buds, optionally provided with roots, are transferred onto a medium containing a systemic fungicide, in order to obtain healthy plantlets, free of pests; Application of this process to the production of regenerants and clones.

Description

La présente invention est relative à un procédé de régénération et de clonage d'Angiospermes, notamment de
Graminées ainsi qu'aux régénérants et clones obtenus par ce procédé.The present invention relates to a process for the regeneration and cloning of angiosperms, in particular
Grasses and regenerants and clones obtained by this process.

Chez les Angiospermes, on distingue deux grandes divisions : les Monocotylédones, dont la plantule n'a qu'un seul cotylédon et les Dicotylédones, dont la plantule comporte deux cotylédons. Les arbres fruitiers des pays tempérés, des arbres forestiers comme le Chêne, le
Hêtre et d'assez nombreuses plantes herbacées (Pomme de terre, Betterave, Coquelicot etc...) sont des Dicotylédones. Certains arbres, tels que les Palmiers et surtout beaucoup de plantes herbacées (céréales, tulipes, muguet, orchidées etc...) sont des Monocotylédones.In Angiosperms, there are two major divisions: Monocotyledons, whose seedling has only one cotyledon and Dicotyledonous, whose seedling has two cotyledons. The fruit trees of temperate countries, forest trees such as oak,
Beech and quite a lot of herbaceous plants (Potato, Beetroot, Poppy etc.) are Dicotyledons. Some trees, such as Palm trees and especially many herbaceous plants (cereals, tulips, lily of the valley, orchids etc ...) are Monocotyledonous.

Bien qu'il soit fait référence, dans ce qui va suivre, aux Monocotylédones, il va de soi que l'invention s'applique aussi aux Dicotylédones. Although reference is made in what follows, Monocotyledon, it goes without saying that the invention also applies to Dicotyledonous.

Les Monocotylédones, notamment les Graminées, représentent un marché mondial très important. Monocotyledons, especially Gramineae, represent a very important global market.

I1 est essentlel, lorsque l'on dispose d'une variété présentant de nombreuses caractéristiques intéressantes, de pouvoir dégager ses conditions optimales de culture, de multiplication et d'amélioration. It is essential, when one has a variety with many interesting characteristics, to be able to identify its optimal conditions of cultivation, multiplication and improvement.

Les méthodes de culture in vitro, ou "vltro-mé- thodes" réalisent la culture in vitre d'organes, de méris- tèmes, de cals ou de cellules et sont de plus en plus utilisées pour les recherches sur l'organogénèse et leurs applications à la multiplication végétative et à l'amélioration des plantes. In vitro culture methods, or "vermro-methods", carry out the in vitro culture of organs, meristems, calli or cells and are increasingly used for organogenesis research and their applications to vegetative propagation and plant breeding.

De manière générale, on entend par méthode ln vitre (ou vitro-méthode, tous les types de culture de ma tériel végétai effectués en conditions aseptiques. In general, by glass method (or in vitro method) is meant all types of culture of my vegetable material carried out under aseptic conditions.

On peut citer notamment la culture d'embryons, la technique de mlcropropagation et la régénération de plantes à partir d'explants divers (cotylédon, racine, tige, feuille, fleur), de cultures de tissus indifférenciés ou de cellules. These include embryo culture, the technique of mlcropropagation and the regeneration of plants from various explants (cotyledon, root, stem, leaf, flower), undifferentiated tissue cultures or cells.

On entend par multiplication végétative in vitro, une technique récente qui permet de cultiver, a priori, n'importe quel fragment d'une plante sur un milieu nutritif artificiel approprié, en conditions aseptiques. A partir de ce fragment, de multiples "copies" de la plante de départ peuvent être régénérées, à la mutation prêt. In vitro vegetative propagation is understood to mean a recent technique which makes it possible to cultivate, a priori, any fragment of a plant on an appropriate artificial nutrient medium under aseptic conditions. From this fragment, multiple "copies" of the starting plant can be regenerated, with the mutation ready.

Les cultures d'organes en particulier, constituent des moyens d'investigation précieux. Organ cultures in particular are valuable means of investigation.

Cependant il faut remarquer que les vitro-méthodes permettent rarement le maintien d'une morphogenèse et d'une organogenèse identiques à celles de la plante en tière (CHEVAUGEON J., 1987, C.R. Acad. Agric. Fr., 73, 9, 21-32). However, it should be noted that the in vitro methods seldom allow the maintenance of a morphogenesis and an organogenesis identical to those of the plant (CHEVAUGEON J., 1987, CR Acad Agric Agric., 73, 9, 21 -32).

En plaçant les plantes dans un environnement complètement maitrisé, les vitro-méthodes se prêtent à des applications d'un haut intérêt agronomique. La micropropagation permet de multiplier du matériel sain sans aucun risque de contamination et il est possible de guérir des plantes atteintes de maladies parasitaires. La culture de méristèmes apicaux, associée ou non à la thermothérapie ou à la chimiothérapie, demeure un mode de traitement privilégié depuis les premiers succès de MOREL et MARTIN en 1952. By placing the plants in a completely controlled environment, the in vitro methods lend themselves to applications of agronomic interest. Micropropagation allows the multiplication of healthy material without any risk of contamination and it is possible to cure plants with parasitic diseases. The cultivation of apical meristems, associated or not with thermotherapy or chemotherapy, remains a favored mode of treatment since the first successes of MOREL and MARTIN in 1952.

D'autres techniques sont disponibles. Ainsi, dès 1975, MAIA et ses collaborateurs ont obtenu des tabacs guéris de la mosaïque par culture d'anthères. Pour les végétaux multipliés végétativement, les vitro-méthodes offrent les meilleurs et parfois les seuls moyens d'éliminer les virus et certaines bactéries comme les Xanthomonas des pélargonium hybrldes. Other techniques are available. Thus, in 1975, MAIA and his collaborators obtained tobacco cured mosaic by anther culture. For vegetatively propagated plants, in vitro methods offer the best and sometimes the only way to eliminate viruses and certain bacteria such as Xanthomonas pelargonium hybrids.

Les vitro-méthodes rendent également possible la sélection de micro-organismes utiles aux plantes. MASON (1980) a ainsi isolé et sélectionné des espèces et des souches de champignons ectomycorhiziens, puis obtenu la création de matériels résistants. In vitro methods also make possible the selection of microorganisms useful for plants. MASON (1980) isolated and selected species and strains of ectomycorrhizal fungi, and obtained the creation of resistant materials.

Dans le domaine des cultures d'organes, et plus particulièrement en ce qui concerne la régénération des plantes, on peut citer notamment
- les travaux de V. VASIL et al. (Amer. J.In the field of organ cultures, and more particularly with regard to the regeneration of plants, mention may in particular be made of
- the work of V. VASIL et al. (Amer J.

Bot., 1982, 69, 9, 1441-1449) qui décrivent une culture de suspension embryogénique établie à partir de segments d'inflorescences de Graminées de l'espèce Pennisetum amers canum, mis en culture dans un milieu de MURASHIGE et SKOOG (MS) additionné de 2,5 mg/l d'acide 2,4- di chlorophénoxyacétique (2,4-D) et de 5 % de lait de noix de coco. Les suspensions ont été transferées sur un milieu agar présentant des concentrations faibles en 2,4-D.Bot., 1982, 69, 9, 1441-1449) which describe a culture of embryogenic suspension established from grass inflorescence segments of the species Pennisetum amers canum, cultured in a medium of MURASHIGE and SKOOG (MS ) supplemented with 2.5 mg / l of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 5% of coconut milk. The suspensions were transferred to agar medium having low concentrations of 2,4-D.

Ceci a entraîné la production de centaines d'embryoides. This resulted in the production of hundreds of embryoids.

Le développement ultérieur de ces embryoïdes a été assuré par leur transfert sur un milieu contenant de l'acide abscissique. Beaucoup d'embryoides germent et produisent des plantes. Des embryoïdes atypiques ont également été observés. The subsequent development of these embryoids was ensured by their transfer to a medium containing abscisic acid. Many embryoids germinate and produce plants. Atypical embryoids have also been observed.

Z. HAYDU et al. ont décrit la régénération de plantes à partir de feuilles et d'anthères de Pennisetum purpureum Schurn, qui sont également des Graminées. Z. HAYDU et al. have described the regeneration of plants from leaves and anthers of Pennisetum purpureum Schurn, which are also grasses.

Les explants obtenus à partir des feuilles produisent des cals lorsqu'ils sont cultivés sur un milieu nutritif dit MS contenant du 2,4-D ou du 2,4-D additionné d'acide naphtalène acétique et/ou de 6-benzyl aminopurine. Explants obtained from the leaves produce calluses when grown on a nutrient medium called MS containing 2,4-D or 2,4-D supplemented with naphthalene acetic acid and / or 6-benzyl aminopurine.

Des embryoïdes se forment dans ces conditions et se développent ensuite en plantes. Les plantes obtenues à partir des cultures de feuilles et d'anthères croissent jusqu'a maturité et ont un nombre normal de chromosomes. Il s'agit donc d'induction de cal, d'embryogénèse somatique et de régénération de plantes à partir d'explants de feuilles ou d'anthères de Pennisetum purpureum.Embryids are formed under these conditions and then develop into plants. Plants obtained from leaf and anther cultures grow to maturity and have a normal number of chromosomes. It is therefore the induction of callus, somatic embryogenesis and regeneration of plants from explants of leaves or anthers of Pennisetum purpureum.

La culture d'inflorescences peut conduire à une néoformation de bourgeons, qui, repiqués, donnent des plantes entières. The cultivation of inflorescences can lead to a neoformation of buds, which, transplanted, give whole plants.

A partir de feuilles, il y a néoformation de bourgeons puis de plantes. Certaines cultures d'explants foliaires conduisent directement à la régénération d'embryons. From leaves, there is neoformation of buds and plants. Some leaf explant cultures lead directly to the regeneration of embryos.

La culture de cals peut, elle-aussi, conduire à la régénération de plantes. Callus culture can also lead to the regeneration of plants.

Le processus de multiplication végétative peut également débuter par la culture de cellules ou de protoplastes isolés. En ce cas, la régénération n'est pas immédiate. Les cellules isolées se multiplient, puis forment des cals de taille variable. C'est au sein de ces cals que s'organise une zone méristématique qui différencie des embryons somatiques ou des bourgeons. The vegetative propagation process can also start with the cultivation of isolated cells or protoplasts. In this case, the regeneration is not immediate. The isolated cells multiply and then form calluses of variable size. It is within these calluses that a meristematic zone is organized which differentiates somatic embryos or buds.

Chez les plantes qui se prêtent bien aux méthodes de culture in vitro, les procédés sont bien maitri- sés et les taux de régénération sont élevés. In plants which are well suited to in vitro culture methods, the methods are well controlled and the regeneration rates are high.

Comme il est précisé dans les travaux ci-dessus mentionnés, les cultures in vitro de Graminées sont classiquement initiées à partir d'embryons immatures, d'anthères et de jeunes feuilles. As stated in the above-mentioned work, in vitro Gramineae cultures are typically initiated from immature embryos, anthers and young leaves.

Cependant, dans le cas des Graminées, la régénération à partir d'organes différenciés (priScipale- ment les méristèmes) conduit à des résultats sporadiques et éphémères. Les plantes régénérées peuvent être, par ailleurs, très éloignées génétiquement et morphologiquement de la plante mère (Handbook of Plant Cell Culture, 1984, vol. However, in the case of grasses, regeneration from differentiated organs (mainly meristems) leads to sporadic and ephemeral results. The regenerated plants can be, moreover, very genetically and morphologically far removed from the parent plant (Handbook of Plant Cell Culture, 1984, vol.

3, Crop. Species, B. REISCH p 748-767 ; T.S. RANGAN et I.K.3, Crop. Species, B. REISCH p 748-767; T.S. RANGAN and I.K.

VASIL p 126-150). Les recherches actuelles (BIOFUTUR, 1985, 39, 31-45) s'orientent vers la régénération à partir de cellules uniques (protoplastes, gamètes), ce qui limite le développement des cilimères. Les techniques demeurent cependant la source d'une certaine variabilité, appréciable pour la création de nouvelles variétés, mais interdisant le clonage exact d'un individu donné (Handbook of Plant Cell Culture, vol. 3, Crop Species, P. KING et K. SHIMAMOTO, p 6989). VASIL p 126-150). Current research (BIOFUTUR, 1985, 39, 31-45) is directed towards regeneration from single cells (protoplasts, gametes), which limits the development of cilimers. The techniques however remain the source of a certain variability, appreciable for the creation of new varieties, but forbidding the exact cloning of a given individual (Handbook of Plant Cell Culture, Vol.3, Crop Species, P. KING and K. SHIMAMOTO, p 6989).

Il en résulte la situation suivante
- La qualité et les succès commerciaux des résultats obtenus sur la plupart des Dicotylédones par les méthodes in vitro tradltionnelles, ne sont pas transposables dans le domaine des Graminées (Monocotylédones).This results in the following situation
- The quality and commercial success of the results obtained on most Dicotyledons by traditional in vitro methods, are not transposable in the field of Gramineae (Monocotyledons).

- Diverses tentatives de régénération ont cependant été concluantes sur les céréales. Elles concernent le maïs, le sorgho, le mil, la canne à sucre, le blé et l'orge (voir V. VASIL et al., Amer. J. Bot., 1982, 69, 9, 1441-1449 ; Z. HAYDU et al., Theor. Appl. Genet., 1981, 59, 269-273 ; V. VASIL et al. BOT. GAZ. , 1982, 143, 4, 454-465 ; B. SWEDLUND et al., Theor. Appl. Genet., 1985, 69, 575-581 ; TANNER et al., Plant Science, 1986, 45, 119124). - Various attempts at regeneration have, however, been conclusive on cereals. They relate to maize, sorghum, millet, sugarcane, wheat and barley (see V. VASIL et al., Amer J. Bot., 1982, 69, 9, 1441-1449; HAYDU et al., Theor Appl. Genet., 1981, 59, 269-273, V. VASIL et al., BOT, GAS, 1982, 143, 4, 454-465, B. SWEDLUND et al., Theor. Appl. Genet., 1985, 69, 575-581, TANNER et al., Plant Science, 1986, 45, 119124).

Cependant les résultats rapportés dans ces différentes publications montrent que les procédés décrits présentent un certain nombre d'inconvénients
- la régénération des Graminées, est de manière générale, difficile à provoquer
- la reproductibilité des protocoles expérimentaux est difficile à vérifier dans la plupart des cas
- les régénérations obtenues ne concernent généralement qu'une très faible partie des cultures réali- sées. Il en résulte un très faible rendement, rarement supérieur à 1/100, qui ne permet pas d'envisager l'application industrielle des procédés de régénération de
Graminées décrits à l'heure actuelle dans la littérature.However, the results reported in these various publications show that the methods described have a certain number of disadvantages.
- Gramineae regeneration, is generally difficult to provoke
- the reproducibility of experimental protocols is difficult to verify in most cases
the regenerations obtained generally concern only a very small part of the cultures produced. This results in a very low yield, rarely greater than 1/100, which does not allow to consider the industrial application of the regeneration processes of
Grasses described at present in the literature.

- en dépit de la popularité de ces méthodes, il existe un fort décalage entre les espoirs et les acquis en effet, l'épreuve du champ est décisive et les rendements sont souvent très médiocres (CHEVAUGEON, op. cité). - despite the popularity of these methods, there is a big gap between the hopes and the gains, the field trial is decisive and the returns are often very poor (CHEVAUGEON, op.cit.).

La Demanderesse s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à un nouveau procédé de régénération des Angiospermes, notamment des Graminées, ne présentant pas les inconvénients des procédés antérieurs et aux régénérants obtenus par ce procédé. It has therefore been the object of the Applicant to provide a new process for the regeneration of angiosperms, in particular grasses, which do not have the drawbacks of the prior processes and the regenerants obtained by this process.

C'est également un but de l'invention de fournir un nouveau modèle d'étude de physiopathologie des Angiospermes, notamment des Graminées ainsi qu'un nouveau procédé de clonage desdites Angiospermes. It is also an object of the invention to provide a new model for the study of the pathophysiology of Angiosperms, in particular Gramineae, as well as a new process for cloning Angiosperms.

La présente invention a pour objet un procédé de régénération d'Angiospermes, caractérisé
(1) en ce que l'on prélève des inflorescences ou des fleurs d'Angiospermes infectées par un agent de virescence approprié
(2) en ce que l'on cultive lfl vitro lesdites inflorescences ou fleurs prélevées, dans des conditions de température et de lumière appropriées, sur un milieu comprenant des macroéléments minéraux, des microéléments minéraux, de l'EDTA, des vitamines, de la gélose et du saccharose, ci-après dénommé milieu nutritif de base (MB) et comprenant en outre une substance favorisant l'expression de la virescence, choisie dans le groupe qui comprend notamment une auxine forte ou toute autre substance chimique à action analogue, et éventuellement une cytokinine et/ou de la benzyladénine et/ou du lait de noix de coco, pendant un temps approprié
(3) en ce qu'on transfère les explants infectés et cultivés selon l'étape (2) sur un milieu de repiquage approprié, 3usqu'à obtention de bourgeons, qui correspondent à une structure végétative infectée
(4) en ce que l'on induit la rhizogénèse desdits bourgeons infectés par transfert desdits bourgeons sur un milieu approprié contenant des auxines ou analogues, pendant un temps approprié, ledit repiquage étant éventuellement effectué plusieurs fois, pour obtenir des racines
(5 en ce que l'on transfère lesdits bourgeons, éventuellement munis de racines, sur un milieu contenant un fongicide systémique, pour obtenir des plantules saines, dépourvues de parasites
Les plantules saines, obtenues par régénération des explants infectés, sont prêtes à être repiquées en serre.The subject of the present invention is a process for the regeneration of angiosperms, characterized
(1) in that inflorescences or flowers of Angiosperms infected with an appropriate virescence agent are taken
(2) in vitro cultivation of said inflorescences or flowers taken, under appropriate temperature and light conditions, on a medium comprising inorganic macroelements, mineral microelements, EDTA, vitamins, agar and sucrose, hereinafter referred to as basic nutrient medium (MB) and further comprising a substance promoting the expression of virescence, selected from the group which comprises in particular a strong auxin or any other chemical substance with similar action, and possibly a cytokinin and / or benzyladenine and / or coconut milk, for a suitable time
(3) transferring the infected and cultivated explants according to step (2) to an appropriate transplanting medium, until buds are obtained, which correspond to an infected vegetative structure
(4) in that the rhizogenesis of said infected buds is induced by transfer of said buds onto a suitable medium containing auxins or the like for a suitable time, said transplanting being optionally carried out several times to obtain roots
(5) in that said buds, possibly with roots, are transferred to a medium containing a systemic fungicide, to obtain healthy seedlings, free from parasites
Healthy seedlings, obtained by regeneration of infected explants, are ready to be transplanted into the greenhouse.

Un tel procédé a l'avantage de présenter un rendement très élevé et une efficacité améliorée par rapport aux procédés de régénération proposés dans la littérature. De plus, toutes les inflorescences contaminées peuvent être placées en condition de culture in vitro et conduire à des régénérations en nombre important. Such a method has the advantage of having a very high yield and an improved efficiency compared to the regeneration methods proposed in the literature. In addition, all contaminated inflorescences can be placed in culture conditions in vitro and lead to regenerations in large numbers.

Un tel procédé a également l'avantage de fournir des plantes présentant une très faible variabilité, car les plantules qui régénèrent proviennent de la réversion d'organes déjà formés. Such a method also has the advantage of providing plants having a very low variability, because the seedlings that regenerate come from the reversion of already formed organs.

Les inflorescences ou fleurs infectées et soumises au procédé conforme à l'invention donnent naissance, de manière inattendue, à des plantules saines. The inflorescences or flowers infected and subjected to the process according to the invention give rise, unexpectedly, to healthy seedlings.

En condition naturelle, le champignon parasite provoque chez la plante infectée la virescence de l'inflorescence qui brunit et se déssèche deux à trois semaines après sa sortie. Under natural conditions, the parasitic fungus causes virescence of the inflorescence in the infected plant, which browns and dries two to three weeks after its release.

Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à l'invention, l'agent de virescence est un agent de mildiou, notamment les genres Sclerospora, Peronosclerospora, Sclerophthora, Basldlophora, Plasmopara. According to a preferred embodiment of the process according to the invention, the virescence agent is a mildew agent, in particular the genera Sclerospora, Peronosclerospora, Sclerophthora, Basldlophora, Plasmopara.

Bremla, Peronospora, Pseudoperonospora.Bremla, Peronospora, Pseudoperonospora.

Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à l'invention, le milieu de culture des inflorescences infectées comporte un milieu nutritif de base (MB) comprenant
comme macroéléments minéraux KAN03 à des concentrations comprises entre 606 et 2020 mg/l
NH4NO3 à des concentrations comprises entre 240 et 1600 mg/l MgSO4, 7H20 à des concentrations comprises entre 246 et 369mg/l
KH2PO4 à des concentrations comprises entre 136 et 170 mg/l
Ca(NO3)2, 4H20 à des concentrations comprises entre 0 et 590 mg/l
CaCl2, 2H20 à des concentrations comprises entre 0 et 441 mg/l
KC1 à des concentrations comprises entre 0 et 149 mg/l comme microéléments minéraux FeCl3, 6H20 à des concentrations comprises entre 10-6 et 10-5 g/cm3
ZnSO4, 7H20 à des concentrations comprises entre 10-6 et 10-5 g/cm3
H3BO3 à des concentrations comprises entre 10-6 et 10-5 g/cm3 MnSOn, 4H20 à des concentrations comprises entre 10-7 et 10-6 g/cm3
CuSO4, 5H20 à des concentrations comprises entre 3.10-8 et 3.10-7 g/cm3
AlCl3 à des concentrations comprises entre 3.10-8 et 3.10-7 g/cm3
NiCl2, 6H20 à des concentratrions comprises entre 3.10-8 et 3.10-7 g/cm3
KI à des concentrations comprises entre 10-8 et10-7 g/cm3 Comme vitamines inositol à une concentration comprise entre 0,1 et 100 mg/i pyridoxine à une concentration comprise entre 0,1 et 1 mg/l acide nicotinique à une concentration comprise entre 0,2 et 2 mg/l thiamine HCl à une concentration comprise entre 0,5 et 30 mg/l biotine à une concentration comprise entre 0,1 et 2 mg/l, ainsi que de 1'EDTA, de la gélose et du saccharose, lequel milieu est, en poutre, associé & une auxine forte ou toute autre substance chimique à action analogue, telles que le 2,4 D à une concentration comprise entre 10-5 et 107 M et l'acide a picolinique à une concentration comprise entre 10-6 et 10-6 M, et éventuellement associé à de la benzyladénine à une concentration comprise entre 10-s M et 5.10-5 M et/ ou du lait de noix de coco à 5 %.According to another advantageous embodiment of the process according to the invention, the culture medium of the infected inflorescences comprises a basic nutrient medium (MB) comprising
as mineral macroelements KAN03 at concentrations between 606 and 2020 mg / l
NH4NO3 at concentrations between 240 and 1600 mg / l MgSO4, 7H20 at concentrations between 246 and 369 mg / l
KH2PO4 at concentrations between 136 and 170 mg / l
Ca (NO 3) 2, 4H 2 O at concentrations between 0 and 590 mg / l
CaCl2, 2H2O at concentrations between 0 and 441 mg / l
KCl at concentrations between 0 and 149 mg / l as mineral microelements FeCl3, 6H20 at concentrations between 10-6 and 10-5 g / cm3
ZnSO4, 7H20 at concentrations between 10-6 and 10-5 g / cm3
H3BO3 at concentrations between 10-6 and 10-5 g / cm3 MnSOn, 4H20 at concentrations of between 10-7 and 10-6 g / cm3
CuSO4, 5H20 at concentrations between 3.10-8 and 3.10-7 g / cm3
AlCl3 at concentrations between 3.10-8 and 3.10-7 g / cm3
NiCl2, 6H20 at concentratrions ranging between 3.10-8 and 3.10-7 g / cm3
KI at concentrations between 10-8 and 10-7 g / cm3 As inositol vitamins at a concentration between 0.1 and 100 mg / i pyridoxine at a concentration between 0.1 and 1 mg / l nicotinic acid at a concentration between 0.2 and 2 mg / l thiamine HCl at a concentration between 0.5 and 30 mg / l biotin at a concentration between 0.1 and 2 mg / l, as well as EDTA, agar and sucrose, which medium is, in beam, associated with a strong auxin or other chemical substance with similar action, such as 2,4 D at a concentration between 10-5 and 107 M and picolinic acid at a concentration of between 10-6 and 10-6 M, and optionally associated with benzyladenine at a concentration of between 10 -5 M and 5.10-5 M and / or 5% coconut milk.

Selon un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, le milieu de repiquage de l'étape (3) est un milieu nutritif de base (MB). According to another embodiment of the process according to the invention, the subculture medium of step (3) is a basic nutrient medium (MB).

Selon encore un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, le milieu de l'étape (4) est un milieu nutritif de base comprenant en outre des auxines choisies dans le groupe qui comprend l'acide a naphtalène acétique (ANA) et l'acide lndolylbutyrique (AIB). According to yet another embodiment of the process according to the invention, the medium of step (4) is a basic nutrient medium further comprising auxins selected from the group which comprises naphthalene acetic acid ( ANA) and lindolylbutyric acid (AIB).

Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, la concentration en ANA est comprise entre 10-7 et 10-5 M et la concentration en AIB est comprise entre 10-6 et 10- 4 M. According to an advantageous arrangement of this embodiment, the concentration of ANA is between 10-7 and 10-5 M and the concentration of AIB is between 10-6 and 10- 4 M.

Selon encore un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à l'invention, le milieu de l'étape (5) comprend un milieu nutritif de base associé à du métalaxyl à une concentration comprise entre 10-5 M et 5.10-4 M. According to yet another embodiment of the process according to the invention, the medium of step (5) comprises a base nutrient medium associated with metalaxyl at a concentration of between 10-5 M and 5 × 10 -4 M .

Un certain nombre de milieux sont décrits dans la littérature et comprennent des éléments communs avec les milieux utilisés dans l'invention. On peut citer notamment le milieu de MARGARA (J. MARGARA, Acad. Agric. Fr., 1978, 654-661), le milieu de HELLER (thèse, 1953) et le milieu de
MURASHIGE et SKOOG (Physiol. Plant., 1962, 15, 473-497), qui décrivent des milieux comprenant notamment des éléments minéraux divers.A number of media are described in the literature and include elements common with the media used in the invention. The medium of MARGARA (J. MARGARA, Acad Agric., 1978, 654-661), the medium of HELLER (thesis, 1953) and the medium of
MURASHIGE and SKOOG (Physiol. Plant., 1962, 15, 473-497), which describe media comprising in particular various mineral elements.

La présente invention a également pour objet des régénérants obtenus au moyen du procédé de régénération conforme à l'invention. The subject of the present invention is also regenerants obtained by means of the regeneration method according to the invention.

La présente invention a également pour objet l'application des inflorescences ou fleurs infectées mises en culture conformément au procédé de régénération de la présente invention, en tant que modèle d'étude de physiopathologie et/ou du mécanisme de floraison des Angiospermes, notamment des Graminées. The subject of the present invention is also the application of inflorescences or infected flowers cultured in accordance with the regeneration method of the present invention, as a model for the study of pathophysiology and / or the flowering mechanism of angiosperms, in particular grasses. .

Un tel modèle permet l'étude tant des mécanismes de floraison des Monocotylédones et des Dicotylédones que de la pathogénicité du parasite. Such a model allows the study of both the flowering mechanisms of monocotyledonous and dicotyledonous plants and the pathogenicity of the parasite.

Conformément à l'invention, pour une telle application, ledit modèle est mis en oeuvre dans une méthode d'étude et d'identification des systèmes physiologiques et physiopathologiques dont l'expression est impliquée dans les mécanismes de floraison, laquelle méthode est caractérisée en ce que ledit modèle est repiqué sur un/des milieu(x) de culture approprié(s). According to the invention, for such an application, said model is implemented in a method for studying and identifying the physiological and physiopathological systems whose expression is involved in the flowering mechanisms, which method is characterized in that that said model is transplanted to a suitable culture medium (s).

La présente invention a également pour objet un procédé de clonage d'Angiospermes, caractérisé
(a) en ce que l'on sélectionne une plante appropriée ;
(b) en ce que l'on inocule à ladite plante un agent de virescence approprié, pour obtenir des inflorescences ou des fleurs infectées
(c) en ce que l'on prélève lesdites inflorescences ou fleurs infectées
(d) en ce que l'on cultive in vitro lesdites inflorescences ou fleurs infectées selon le procédé de ré géneration conforme à l'inventlon, pour obtenir des plantes saines identiques au parent.The present invention also relates to a process for cloning angiosperms, characterized
(a) in that a suitable plant is selected;
(b) in that said plant is inoculated with a suitable virescence agent, to obtain inflorescences or infected flowers
(c) in that the said inflorescences or infected flowers are taken
(d) in vitro cultivation of said inflorescences or infected flowers by the regeneration method according to the inventlon, to obtain healthy plants identical to the parent.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de clonage, conforme à l'invention, l'inoculation de l'agent de virescence est effectuée in vivo sur la plante entière. According to an advantageous embodiment of the cloning method according to the invention, the inoculation of the virescence agent is carried out in vivo on the whole plant.

Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de clonage, l'inoculation de l'agent de virescence est effectuée in vitro sur les inflorescences ou fleurs. According to another advantageous embodiment of the cloning process, the inoculation of the virescence agent is carried out in vitro on the inflorescences or flowers.

Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de clonage, conforme à l'invention, l'agent de virescence est un agent de mildiou, notamment les genres Sclerospora, Peronosclerospora, Sclerophthora,
Basidlophora, Plasmopara, Bremla, Peronospora, Pseudoperonospora.According to yet another advantageous embodiment of the cloning process, according to the invention, the virescence agent is a mildew agent, in particular the genera Sclerospora, Peronosclerospora, Sclerophthora,
Basidlophora, Plasmopara, Bremla, Peronospora, Pseudoperonospora.

Un tel procédé de clonage peut avantageusement être utilisé pour une variété donnée d'une espèce végétale qui ne se multiplie pas ou peu végétativement et qui possède un mode de reproduction sexuée allogame. Un tel procédé permet alors de multiplier sans variabilité un individu de structure génétique complexe et hétérogène, dont l'originalité serait perdue après croisement. Such a cloning method can advantageously be used for a given variety of a plant species that does not multiply or little vegetatively and that has an allogamous sexual reproduction mode. Such a method then makes it possible to multiply without variability an individual of complex and heterogeneous genetic structure, the originality of which would be lost after crossing.

L'application de ce procédé notamment au maïs, au sorgho et au mil est intéressante, car les sélectionneurs sont souvent confrontés au problème de la faiblesse en effectifs, des géniteurs de lignées, qu'ils ne peuvent multiplier sans en perdre la structure. The application of this process especially to maize, sorghum and millet is interesting because breeders are often confronted with the problem of the low number of breeders, the breeders of lines, which they can not multiply without losing their structure.

Ceci est le cas notamment, et ce de manière non limitative, lors de prospections sur le terrain de formes sauvages rares ou lorsque le géniteur est issu de manipula tlons complexes à faible rendement, l.e. des manipulations génétiques, des croisements forcés successifs. This is particularly the case, and this in a non-limiting manner, during field surveys of rare wild forms or when the parent is derived from complex manipulations with low yield, l.e. genetic manipulation, successive forced crossings.

Dans le domaine de la création variétale, en particulier, le problème des géniteurs de lignées est d'importance cruciale, ce qui souligne l'intérêt que peut apporter le procédé de clonage conforme à l'invention. In the field of varietal creation, in particular, the problem of lineage spawners is of crucial importance, which underlines the interest that the cloning process according to the invention can bring.

La présente invention a également pour objet des clones obtenus au moyen du procédé de clonage conforme à l'invention. The subject of the present invention is also clones obtained by means of the cloning method according to the invention.

La présente invention a, en outre, pour objet un kit pour la mise en oeuvre du procédé de régénération et/cu de clonage et/ou de modélisation, conformes à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend
- un milieu nutritif de base comprenant en outre une substance favorisant l'expression de la virescence et éventuellement une cytokinine et/ou de la benzyladénine et/ou du lait de noix de coco
- un milieu de repiquage
- un milieu approprié comprenant des auxines ou analogues
- un milieu approprié contenant un fongicide systémique ; et
éventuellement un agent de virescence approprié.The present invention further relates to a kit for implementing the regeneration and / cu cloning and / or modeling method, in accordance with the invention, characterized in that it comprises
- a basic nutrient medium further comprising a substance promoting the expression of virescence and optionally a cytokinin and / or benzyladenine and / or coconut milk
- a transplanting medium
an appropriate medium comprising auxins or the like
- a suitable medium containing a systemic fungicide; and
optionally a suitable virescence agent.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de la présente invention. In addition to the foregoing, the invention further comprises other arrangements, which will become apparent from the following description, which refers to examples of implementation of the present invention.

Il doit être bien entendu, toutefois, que cet exemple est donné uniquement à titre d'illustration de l'invention, dont il ne constitue en aucune manière une limutation. It should be understood, however, that this example is given solely by way of illustration of the invention, of which it does not in any way constitute a limutation.

Exemple : Procédé de régénération conforme à l'invention appliqué au mil. Example: Regeneration method according to the invention applied to millet.

On utilise une lignée de mil 23-DB-, de forte homogénéité génétique infectée par S. graminicola par inoculation par injection d'une suspension de zoospores dans la pseudotige. A 23-DB- millet line of high genetic homogeneity infected with S. graminicola is used by inoculation by injecting a zoospore suspension into the pseudotige.

45 jours après l'inoculation, lorsque des symptômes foliaires traduisant l'infection apparâissent, des plantes contaminées, ainsi que des plantes témoins, en phase de morphogénèse florale sont prélevées, puis nettoyées et désinfectées par immersion dans l'hypochlorite de calcium à 5 % pendant 5 minutes, suivie de 4 rinçages successifs à l'eau stérile. 45 days after inoculation, when foliar symptoms resulting in infection appear, contaminated plants, as well as control plants, in floral morphogenesis phase are removed, then cleaned and disinfected by immersion in 5% calcium hypochlorite for 5 minutes, followed by 4 successive rinses with sterile water.

Isolées en conditions aseptiques, les jeunes inflorescences infectées, de même que les inflorescences saines, de 0,5 cm à 3 cm de longueur, sont placées verticalement sur le milieu de culture. Isolated under aseptic conditions, infected young inflorescences, as well as healthy inflorescences, 0.5 cm to 3 cm in length, are placed vertically on the culture medium.

Les cultures sont conduites en boîtes de Petri ou en tubes de Pyrex, à une température de 23'C et placées sous un éclairage de 4000 lux de photopériode 16 heures. The cultures are conducted in Petri dishes or in Pyrex tubes, at a temperature of 23 ° C. and placed under a lighting of 4000 lux of photoperiod 16 hours.

Le milieu de culture de l'étape (3) du procédé de régénération est le suivant
- macroéléments
KNO3 1313 mg/l
NH4NO3 480 mg/l
Ca(NO3)2,4H2O 590 mg/l
MgSO4,7H20 246 mg/l
KH2PO4 136 mg/l
KCl 74,5 mg/l
Cette composition en macroéléments corres
pond à la solution N3oK de MARGARA.The culture medium of step (3) of the regeneration process is as follows
- macro elements
KNO3 1313 mg / l
NH4NO3 480 mg / l
Ca (NO3) 2.4H2O 590 mg / l
MgSO4, 7H20 246 mg / l
KH2PO4 136 mg / l
KCl 74.5 mg / l
This composition in macroelements corres
to the N3oK solution from MARGARA.

- Microéléments
ZnSO4, 7H20 5 mg/l
MnCl2 5 mg/l
H3BO3 3 mg/l
CuSOI, 5H20 0,01 mg/l
Na2MoO4 0,05 mg/l
KI 0,01 mg/l
Cette composition en microéléments corres
pond à la solution de MARGARA.- Microelements
ZnSO4, 7H2O 5 mg / l
MnCl2 5 mg / l
H3BO3 3 mg / l
CuSOI, 5H2O 0.01 mg / l
Na2MoO4 0.05 mg / l
KI 0.01 mg / l
This composition in microelements corres
to the MARGARA solution.

- FeSO( 30 mg/l
- EDTA disodique 30 mg/l
- Vitamines
pyridoxine 0,1 mg/l
acide nicotinique 0,5 mg/l
thiamine HCl 1 mg/l
biotine 0,5 mg/l
inositol 2 mg/l
- saccharose à 30 g/l
- gélose à 8 g/l
- 2,4-D à 2.106 M
Ce milieu sera dénommé ci-après MB1 ; Si, on ajoute au milieu MB1 de la benzyladénine à 0,5 mg/l et du lait de noix de coco à 5 %, on obtient un milieu dénommé ci-après MB2. - FeSO (30 mg / l
- disodium EDTA 30 mg / l
- Vitamins
pyridoxine 0.1 mg / l
nicotinic acid 0.5 mg / l
thiamine HCl 1 mg / l
biotin 0.5 mg / l
inositol 2 mg / l
- sucrose at 30 g / l
- agar at 8 g / l
-2.4-D to 2.106 M
This medium will be hereinafter referred to as MB1; If benzyl adenine at 0.5 mg / l and 5% coconut milk are added to the MB1 medium, a medium, hereinafter referred to as MB2, is obtained.

Le milieu de repiquage peut être soit un milieu ci-après dénommé MS et dont la composition est celle définie par MURASHIGE et SKOOG (Physio. Plant., 1962, 476497), soit le milieu nutritif MB. The subculture medium can be either a medium hereinafter called MS and whose composition is that defined by MURASHIGE and SKOOG (Physio Plant, 1962, 476497), or the nutrient medium MB.

La production de racines sur les explants caulogenes est favorisée par deux passages sur milieu auxi nique (MB + ANA à 10-6 M + AIB 10-5 M) et l'élimination du parasite est provoquée par l'incorporation de métalaxyl (10 mg/l) dans le milieu. Root production on caulogenic explants is favored by two passages on auxilic media (MB + ANA at 10-6 M + AIB 10-5 M) and elimination of the parasite is caused by incorporation of metalaxyl (10 mg / l) in the middle.

Le calendrier des opérations est schématisé dans le tableau
I ci-après. The schedule of operations is shown schematically in the table
I below.

Tableau I

Table I

<tb> <SEP> Milieux <SEP> de <SEP> culture
<tb> <SEP> Date <SEP> Temps <SEP> Durée <SEP> de <SEP> Inflorescences <SEP> Inflorescences
<tb> <SEP> jours <SEP> chaque <SEP> saines <SEP> infectées
<tb> <SEP> phase
<tb> <SEP> (jours)
<tb> 12.10. <SEP> 0 <SEP> , <SEP> <SEP> MB1 <SEP> MB2 <SEP> MB1 <SEP> MB2
<tb> 1987 <SEP> (8) <SEP> (12) <SEP> (8) <SEP> (14)
<tb> <SEP> 53
<tb> <SEP> (2) <SEP> (2) <SEP> (8) <SEP> (14)
<tb> 24.11. <SEP> 53 <SEP> ....... <SEP> <SEP> MS <SEP> MS <SEP> MS <SEP> MS
<tb> 1987 <SEP> 24
<tb> <SEP> (1) <SEP> (0) <SEP> (2) <SEP> (1)
<tb> 18.12. <SEP> 77 <SEP> .......<SEP> <SEP> MB <SEP> MB <SEP> + <SEP> ANA <SEP> 10- <SEP> 6 <SEP> M
<tb> 1987 <SEP> + <SEP> AIB <SEP> 10-5 <SEP> M
<tb> <SEP> 25
<tb> <SEP> (1) <SEP> (3)
<tb> 12.01. <SEP> 102 <SEP> ....... <SEP> MB <SEP> MB <SEP> + <SEP> métalaxyl
<tb> 1988 <SEP> (10 <SEP> ppm)
<tb> <SEP> 29
<tb> <SEP> 3 <SEP> plantes <SEP> sur <SEP> (3)
<tb> 10.02. <SEP> 131 <SEP> ' <SEP> ....... <SEP> <SEP> argile <SEP> expan- <SEP> MB
<tb> 1988 <SEP> sée
<tb> <SEP> 29
<tb> <SEP> (3) <SEP>
<tb> 10.03. <SEP> 160 <SEP> ....... <SEP> <SEP> 3 <SEP> plantes <SEP> en <SEP> MB+ANA <SEP> 10-6 <SEP> M <SEP> +
<tb> 1988 <SEP> terre <SEP> AIB <SEP> 10-5 <SEP> M
<tb> <SEP> 10
<tb> <SEP> 36 <SEP> plantes <SEP> sur
<tb> 20.03. <SEP> 170 <SEP> .......<SEP> <SEP> argile <SEP> expansée
<tb> 1988 <SEP> 33
<tb> 22.04 <SEP> 203 <SEP> ....... <SEP> <SEP> 36 <SEP> plantes <SEP> en
<tb> 1988 <SEP> terre
<tb>
Les chiffres entre parenthèses indiquent le nombre d'explants vivants aux différentes dates
Après cinquante trois jours de culture, les milieux MB1 et MB2 n'ont pas eu d'influence sur l'évolution des explants, mais un effet significatif dû à la présence du parasite est observé.<tb><SEP> Backgrounds <SEP> of <SEP> culture
<tb><SEP> Date <SEP> Time <SEP> Time <SEP> of <SEP> Inflorescences <SEP> Inflorescences
<tb><SEP> days <SEP> each <SEP> healthy <SEP> infected
<tb><SEP> phase
<tb><SEP> (days)
<tb> 12.10. <SEP> 0 <SEP>, <SEP><SEP> MB1 <SEP> MB2 <SEP> MB1 <SEP> MB2
<tb> 1987 <SEP> (8) <SEP> (12) <SEP> (8) <SEP> (14)
<tb><SEP> 53
<tb><SEP> (2) <SEP> (2) <SEP> (8) <SEP> (14)
<tb> 24.11. <SEP> 53 <SEP> ....... <SEP><SEP> MS <SEP> MS <SEP> MS <SEP> MS
<tb> 1987 <SEP> 24
<tb><SEP> (1) <SEP> (0) <SEP> (2) <SEP> (1)
<tb> 18.12. <SEP> 77 <SEP> ....... <SEP><SEP> MB <SEP> MB <SEP> + <SEP> ANA <SEP> 10- <SEP> 6 <SEP> M
<tb> 1987 <SEP> + <SEP> AIB <SEP> 10-5 <SEP> M
<tb><SEP> 25
<tb><SEP> (1) <SEP> (3)
<tb> 12.01. <SEP> 102 <SEP> ....... <SEP> MB <SEP> MB <SEP> + <SEP> metalaxyl
<tb> 1988 <SEP> (10 <SEP> ppm)
<tb><SEP> 29
<tb><SEP> 3 <SEP> plants <SEP> on <SEP> (3)
<tb> 10.02. <SEP> 131 <SEP>'<SEP> ....... <SEP><SEP> clay <SEP> expan- <SEP> MB
<tb> 1988 <SEP> sée
<tb><SEP> 29
<tb><SEP> (3) <SEP>
<tb> 10.03. <SEP> 160 <SEP> ....... <SEP><SEP> 3 <SEP> plants <SEP> in <SEP> MB + ANA <SEP> 10-6 <SEP> M <SEP> +
<tb> 1988 <SEP> earth <SEP> AIB <SEP> 10-5 <SEP> M
<tb><SEP> 10
<tb><SEP> 36 <SEP> plants <SEP> on
<tb> 20.03. <SEP> 170 <SEP> ....... <SEP><SEP> expanded <SEP> clay
<tb> 1988 <SEP> 33
<tb> 22.04 <SEP> 203 <SEP> ....... <SEP><SEP> 36 <SEP> plants <SEP> in
<tb> 1988 <SEP> earth
<Tb>
Numbers in parentheses indicate the number of live explants on different dates
After fifty-three days of culture, the MB1 and MB2 media had no influence on the evolution of the explants, but a significant effect due to the presence of the parasite is observed.

Inflorescences infectées. On observe, sur les explants, le développement de lames foliacées courbes et épaisses, traduisant la réversion du méristème de l'inflorescence et des fleurs. La sporulation asexuée du parasite est parfois visible à leur surface. Un début de callogénèse sur les tissus de l'inflorescence est par ailleurs noté. Inflorescences infected. The explants show the development of curved and thick leaf blades, reflecting the reversion of the meristem of the inflorescence and flowers. The asexual sporulation of the parasite is sometimes visible on their surface. An early callogenesis on the tissues of the inflorescence is also noted.

Vingt quatre jours après le repiquage sur le milieu MS, seules 3 cultures sont demeurées vivantes. Les explants supportent de nombreux massifs foliacés, constitués de 3 ou 4 feuilles vrillées et gaufrées révélatrices de la présence du parasite (confirmée après prélèvements et coloration au calcofluor 0,05 %). Sur l'ensemble de l'inflorescence, on note, par ailleurs, la multiplication de cals blanchâtres, rigides et plissés, sur lesquels se développent des structures chlorophylliennes embryonnaires. Twenty-four days after transplanting to the MS medium, only 3 cultures remained alive. The explants support numerous foliose masses, consisting of 3 or 4 twisted and embossed leaves revealing the presence of the parasite (confirmed after sampling and staining with 0.05% calcofluor). On the whole of the inflorescence, we note, moreover, the multiplication of whitish calluses, rigid and wrinkled, on which develop embryonic chlorophyllian structures.

Après traitements aux auxines (T= 77 j) et au métalaxyl (T= 102 ), un enracinement limité et l'élimination du parasite ont pu entre provoqués. Sur les fragments de culture obtenus, de nombreuses plantes d'aspect normal se sont développées. Les observations réalisées alors indiquent que la plupart d'entre elles sont issues du développement réverse de fleurs. Quelques unes seulement résultent d'une embryogénèse somatique dans les zones callogènes. Les dernières étapes de multiplication, suivies par un traitement rhizogène, ont permis l'individualisation de 11, 18 et 7 plantes selon l'inflorescence d'origine. After treatment with auxins (T = 77 days) and metalaxyl (T = 102), limited rooting and elimination of the parasite could be induced. On the obtained culture fragments, many normal-looking plants have developed. The observations made then indicate that most of them come from the reverse flower development. Only a few result from somatic embryogenesis in the callogenic zones. The last stages of propagation, followed by a rhizogenic treatment, allowed the individualization of 11, 18 and 7 plants according to the original inflorescence.

Inflorescences saines. Cinquante trois jours après culture sur MB1 ou MB2, 4 inflorescences sur 20 sont demeurées vivantes, exprimant une callogènèse faible. Lors du troisième repiquage (T. 102 ), une élaboration de cals blanchâtres, d'aspect lipoïde, est intense sur l'unique explant ayant survécu, associée à la nécrose des fleurs. Aucune organogénèse n'est à ce moment observée. Ce n'est qu'après 131 jours de culture que l'apparition de bourgeons et de racines est visible sur certains cals, traduisant ainsi leur origine somatique. Seuls 3 d'entre eux donneront naissance à une plantule transférée sur argile expansée. Healthy inflorescences. Fifty three days after culture on MB1 or MB2, 4 out of 20 inflorescences remained alive, expressing low callogenesis. During the third transplanting (T. 102), a whitish callus formation, of lipoidal appearance, is intense on the single surviving explant, associated with necrosis of the flowers. No organogenesis is observed at this time. It is only after 131 days of culture that the appearance of buds and roots is visible on certain calluses, thus reflecting their somatic origin. Only 3 of them will give birth to a seedling transferred on expanded clay.

Evolution des plantes régénérées en serre. La croissance et le développement des plantes repiquées se sont avérés conformes au phénotype 23 DB original quant à la taille, au délai de floraison et à la fertilité (taille moyenne de un mètre en pot, floraison en 30 jours après introduction en serre). On note cependant un tallage important, 2 à 3 fois supérieur à la normale : jusqu'à 25 talles filles sont dénombrées sur certaines plantes, 50 jours après repiquage. Evolution of regenerated plants in the greenhouse. Growth and development of transplanted plants were found to be consistent with the original 23 DB phenotype in size, flowering time, and fertility (average one-meter in size, flowering in 30 days after introduction into the greenhouse). However, there is significant tillering, 2 to 3 times higher than normal: up to 25 tillers are counted on some plants, 50 days after transplanting.

La présence du parasite dans les inflorescences apparaît, dans le cadre de la présente invention, comme un facteur favorisant la survie de l'organe en culture in vitro. A 53 jours, ce phénomène est particulièrement net. The presence of the parasite in the inflorescences appears, in the context of the present invention, as a factor promoting the survival of the organ in vitro culture. At 53 days, this phenomenon is particularly clear.

Toutes les inflorescences infectées ont survécu, contre 4 sur 20 des inflorescences saines.All infected inflorescences survived, compared with 4 out of 20 healthy inflorescences.

L'influence du parasite, dans le procédé conforme à l'invention, parait aussi déterminante quant aux modalités des processus de régénération observée. Alors que seule la callogenèse caractérise les explants sains, on note simultanément sur les explants infectés la réversion complète des bourgeons floraux (à l'origine de la plupart des régénérants), la réversion du méristème apical de l'inflorescence et une callogenèse importante. The influence of the parasite, in the process according to the invention, also seems decisive as to the modalities of the regeneration processes observed. While only healthy explants characterize callogenesis, the complete reversion of flower buds (responsible for most regenerants), the reversion of the apical meristem of the inflorescence, and an important callogenesis can be seen on the infected explants.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mlse en oeuvre, et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite : elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention. As is apparent from the foregoing, the invention is not limited in any way to those of its modes of implementation, and application that have just been described more explicitly: it encompasses all variants that may come to the attention of the skilled person without departing from the scope or scope of the present invention.

Claims

RF VBNDICATIQNX

Bremia, Peronospora, Pseudoperonospora.

2 l regeneration process according to claim 1, characterized in that the virescence agent is a mildew agent, including the genera Sclerospora, Peronosclerospora, Sclerophthora, Basidiophora, Plasmopara,

(5) in that said buds, possibly with roots, are transferred to a medium containing a systemic fungicide, to obtain healthy plantlets free of parasites

(4) in that the rhizogenesis of said infected buds is induced by transfer of said buds to a suitable medium containing auxines or the like for a suitable time, said transplanting being optionally carried out several times to obtain roots

(3) transferring the infected and cultivated explants according to step (2) to a suitable transplanting medium until buds are obtained which correspond to an infected vegetative structure

(2) in vitro cultivation of said inflorescences or flowers taken, under appropriate temperature and light conditions, on a medium comprising inorganic macroelements, mineral microelements, EDTA, vitamins, agar and sucrose, hereinafter referred to as basic nutrient medium (MB) and further comprising a substance promoting the expression of virescence, selected from the group which comprises in particular a strong auxin or any other chemical substance with similar action, and optionally a cytokinin and / or benzyladenine and / or coconut milk, for a suitable time;

(1) in that inflorescences or flowers of Angiosperms infected with an appropriate virescence agent are taken

1 ') Angiosperm regeneration process, characterized

3) Regeneration method according to claim 1 or claim 2, characterized in that the culture medium of the infected inflorescences comprises a basic nutrient medium (MB) comprising as mineral macroelements

KNO3 at concentrations between 606 and 2020 mg / l

NH4NO3 at concentrations between 240 and 1600 mg / l

MgSO4, 7H20 at concentrations of between 246 and 369 mg / l

KH2PO4 at concentrations between 136 and 170 mg / l Ca (NO3) 2, 4H20 at concentrations between 0 and 590 mgii

CaCl2, 2H2O at concentrations between 0 and 441 mg / l

KC1 at concentrations between 0 and 149 mg / l as mineral microelements

FeCl3, 6H20 at concentrations between 10-6 and 10-5 g / cm3

ZnSO4, 7H20 at concentrations between 10-6 and 10-5 g / cm3

H3BO3 at concentrations between 10-6 and 10- g / cm3

MnSO4, 4HzO at concentrations between 10-7 and 10-6 g / cm3

CuSO4, 5H20 at concentrations between 3.10-8 and 3.10-7 g / cm

AlCl3 at concentrations between 3.10-8 and 3.10-7 g / cm3

NiCl2, 6H20 at concentratrions ranging from 3.10-a to 3.10-g / cm

KI at concentrations between 10- and 10-7 g / cm As inositol vitamins at a concentration between 0.1 and 100 mg / l pyridoxine at a concentration of between 0.1 and 1 mg / l nicotinic acid at a concentration between 0.2 and 2 mg / l thiamine HCl at a concentration between 0.5 and 30 mg / l biotin at a concentration between 0.1 and 2 mg / l, as well as EDTA, agar and sucrose, which medium is further associated with a strong auxin or any other chemical substance of similar action, such as 2,4 D at a concentration of between 10-5 and 10 M, and picolinic acid at a concentration between 10-6 and 10'8 M, and optionally combined with benzyladenine at a concentration of between 10 -5 M and 5.10-5 M and / or 5% coconut milk.

4 ') Regeneration process according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the subculture of step t3) is a basic nutrient medium (MB).

5) regeneration method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the medium of step (4) is a basic nutrient medium further comprising auxins selected from the group which comprises the acid a naphthalene acetic acid (ANA) and indolylbutyric acid (AIB).

6 ') regeneration process according to claim 5, characterized in that the concentration of ANA is between 10-7 and 10-5 M and the concentration of AIB is between 10-6 and 10-r M.

7) regeneration method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the medium of step (5) comprises a base nutrient medium associated with metalaxyl at a concentration between 10-5 M and 5.10 -4 M.

Regenerating agents, characterized in that they are obtained by means of the regeneration method according to any one of claims 1 to 7.

9 ') Model of study of pathophysiology and / or the flowering mechanism of Angiosperms, in particular Gramineae, characterized in that it consists of infected inflorescences cultured in accordance with the regeneration method according to any one of the claims 1 to 7.

10.) Method for studying and identifying the physiological and physiopathological systems whose expression is involved in the flowering mechanisms, which method is characterized in that the model according to claim 9 is transplanted onto a medium (s) (x ) appropriate culture (s).

(d) in vitro cultivating said inflorescences or infected flowers according to the regeneration method according to any one of claims 1 to 7, to obtain healthy plants identical to the parent.

(c) in that said inflorescences or infected flowers are taken;

(b) in that said plant is inoculated with a suitable virescence agent, to obtain inflorescences or infected flowers

(a) in that a suitable plant is selected;

11.) A process for cloning angiosperms, characterized

12 ') cloning method according to claim 11, characterized in that the inoculation of the virescence agent is performed in vi vo on the whole plant.

13 '> Cloning method according to claim 11, characterized in that the inoculation of the virescence agent is carried out in vitro on the inflorescences or flowers.

14-) cloning method according to any one of claims 11 to 13, characterized in that the virescence agent is a blight agent, including the genera Scierospora, Peronosclerospora, Sclerophthora, Basidiophora, Plasmopara, Bremia, Peronospora, Pseudoperonospora .

15-) Clones, characterized in that they are obtained by means of the cloning method according to any one of claims 11 to 14.

an appropriate medium containing a systemic fungicide according to claim 1 or claim 7 and optionally a suitable virescence agent.

an appropriate medium comprising auxins or the like according to any one of claims 1, 5 or 6

a subculture medium according to claim 1 or claim 4; ;

- a basic nutrient medium further comprising a substance promoting the expression of virescence and optionally a cytokinin and / or benzyla denine and / or coconut milk according to claim 1 or claim 3

16 ') kit or box ready for use for carrying out the regeneration method according to any one of claims 1 to 7 and / or cloning according to any one of claims 11 to 14 and / or modeling according to claim 9 or claim 10, characterized in that it comprises