FR2635116A1

FR2635116A1 - Process for determining the sex of embryos of ruminants, kit or box for implementing the process

Info

Publication number: FR2635116A1
Application number: FR8810706A
Authority: FR
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-08-08
Filing date: 1988-08-08
Publication date: 1990-02-09
Anticipated expiration: 2008-08-08
Also published as: FR2635116B1

Abstract

The invention relates to a process for determining the sex of embryos of ruminants by hybridisation between a DNA sample obtained from an embryo and a probe, characterised in that it comprises a plurality of units, especially from 2 to several hundreds, preferably of an order of magnitude of about a hundred units, either of the ACNGGN type in which N represents any one of the 4 nucleotides thymine (or uracil), guanine, adenine and cytosine, or of the TCAGGC type, or of both types at the same time, - or the nucleotide sequence complementary to the one above. The invention also relates to a nucleotide probe which can be used in the process for determining the sex of embryos of ruminants, as well as a kit or box for implementing the process of the invention.

Description

PROCEDE POUR LA DETERMINATION DU SEXE D'EMBRYONS DE
RUMINANTS, KIT OU NECESSAIRE POUR LA MISE EN OEUVRE DU
PROCEDE.METHOD FOR DETERMINING THE SEX OF EMBRYOS OF
RUMINANTS, KIT OR NECESSARY FOR THE IMPLEMENTATION OF
PROCESS.

L'invention concerne un procédé de détermination -du sexe d'embryons de ruminants, également désigné dans le cadre de la présente invention par l'expression "procédé de sexage d'embryons". The invention relates to a method for determining the sex of ruminant embryos, also designated in the context of the present invention by the expression "method of sexing embryos".

L'invention concerne également une sonde nu cléotidique utilisable dans le procédé de détermination du sexe d'embryons de ruminants, ainsi qu'un kit ou nécessaire pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention. The invention also relates to a naked keyotidic probe usable in the method of determining the sex of ruminant embryos, as well as a kit or necessary for implementing the method of the invention.

De même, on emploiera, pour la commodité du langage, l'expression "ADN mâle" pour désigner un échantillon d'ADN provenant d'un individu de sexe mâle, et l'expression *ADN femelle" pour désigner un échantillon d'ADN provenant d'un individu de sexe femelle. Likewise, for the convenience of language, the expression "male DNA" will be used to denote a DNA sample originating from a male individual, and the expression * female DNA "to denote a DNA sample. from a female individual.

La possibilité de déterminer le sexe d'animaux à l'état embryonnaire, constitue un sujet d'études et de recherches de première importance. Cette préoccupation revêt notamment un intérêt particulier dans le cas du bétail. En effet, la valeur économique du bétail dépend souvent du fait que les animaux sont de sexe mâle ou femelle. The possibility of determining the sex of animals in the embryonic state constitutes a subject of studies and research of primary importance. This concern is of particular interest in the case of livestock. Indeed, the economic value of livestock often depends on whether the animals are male or female.

Chez les mammifères, une méthode générale de sexage d'embryons consiste à séparer les spermatozoldes portant le chromosome sexuel Y (caractéristique du génone mâle), de ceux portant le chromosome sexuel X (caractéristique du génome femelle). In mammals, a general method of sexing embryos is to separate sperm carrying the sex chromosome Y (characteristic of the male genone) from those carrying the sex chromosome X (characteristic of the female genome).

Cependant, en dépit des nombreuses recherches réalisées, il n'existe pas à ce jour de méthode de sexage efficace basée sur la séparation des chromosomes X et
Y.However, despite the numerous studies carried out, there is to date no effective sexing method based on the separation of the X chromosomes and
Y.

te développement des techniques de transfert d'embryons, et des techniques de conservation des embryons, telles que la cryo-préservation, a conduit d'autre part les scientifiques à imaginer des méthodes de sexage utilisables avec des embryons dont le développement est à un stade précoce, notamment avant leur implantation dans une femelle réceptrice. The development of embryo transfer techniques, and embryo conservation techniques, such as cryo-preservation, has also led scientists to imagine sexing methods usable with embryos whose development is at a stage. early, especially before their implantation in a female recipient.

Ces différents procédés montrent des efficacités variables. Ils sont basés, soit sur une analyse cytogénétique des cellules embryonnaires, soit sur la recherche de la présence de l'antigène H-Y caractéristique du génome mâle. These different methods show variable efficiencies. They are based either on a cytogenetic analysis of embryonic cells, or on the search for the presence of the H-Y antigen characteristic of the male genome.

D'autres procédés consistent en des tests colorimétriques révélateurs de l'activité G6PD glucose 6-phosphate déshydrogénase (Réf. 1). Other methods consist of colorimetric tests revealing the G6PD glucose 6-phosphate dehydrogenase activity (Ref. 1).

La possibilité de déterminer le sexe d'embryons humains en utilisant des sondes d'ADN spécifiques du chromosome Y humain, a été également déjà montrée (réf. 2). The possibility of determining the sex of human embryos using DNA probes specific for the human Y chromosome has also already been shown (ref. 2).

La demande de brevet européen 235 046 publiée le 02/09/1987, décrit une sonde d'ADN spécifique du génome mâle de ruminants, pour la détermination du sexe d'embryons, permettant d'obtenir un résultat significatif avec 50 ng d'ADN. European patent application 235 046 published on 02/09/1987 describes a DNA probe specific for the male genome of ruminants, for determining the sex of embryos, making it possible to obtain a significant result with 50 ng of DNA. .

La demande de brevet PCT W0.86/07095 publiée le 04/12/1986, décrit également des sondes d'ADN spécifiques du génome mâle de bovins, s'hybridant d'une façon beaucoup plus importante avec un échantillon d'ADN mâle qu'avec un échantillon d'ADN femelle, lorsque les hybridations sont réalisées dans les mêmes conditions. PCT patent application W0.86 / 07095, published on 04/12/1986, also describes DNA probes specific for the male genome of cattle, which hybridize much more significantly with a sample of male DNA than 'with a sample of female DNA, when the hybridizations are carried out under the same conditions.

Le but de l'invention est de fournir un procédé de détermination du sexe d'embryons de ruminants utilisant d'autres séquences nucléotidiques et permettant l'obtention de résultats significatifs avec des échantillons étudiés en quantités beaucoup plus faibles que 50 ng. The object of the invention is to provide a method for determining the sex of ruminant embryos using other nucleotide sequences and allowing the obtaining of significant results with samples studied in quantities much lower than 50 ng.

Il était connu d'autre part, que le génome humain ou animal comporte des séquences hypervariables, consistant en de courts fragments d'ADN se répétant de façon monotone et dont une fraction est polymorphe : le nombre de fragments d'ADN répétés différant d'un individu à l'autre, pour un lieu donné, dans le génome. It was also known that the human or animal genome contains hypervariable sequences, consisting of short DNA fragments repeating monotonically and a fraction of which is polymorphic: the number of repeated DNA fragments differing from an individual to another, for a given place, in the genome.

Ces régions, appelées régions mini-satellites, ont été isolées pour la première fois dans le gène de la myoglobine humaine (réf. 3). D'autres régions mini-satellites ont été isolées depuis. These regions, called mini-satellite regions, were isolated for the first time in the human myoglobin gene (ref. 3). Other mini-satellite regions have since been isolated.

Ainsi, la publication de SHIN H.S. et al (réf. 4) décrit une séquence d'ADN isolée dans le gène
Per de la Drosophile, qui se répète de façon monotone et code pour environ 50 thréonines et glycines alternées.Thus, the publication by SHIN HS et al (ref. 4) describes a DNA sequence isolated from the gene
Per of Drosophila, which repeats monotonically and codes for approximately 50 alternating threonines and glycines.

Le bon fonctionnement de ce gène Per est nota ntntent responsable chez la Drosophile, de certains comportements périodiques. The proper functioning of this Per gene is notably responsible in Drosophila for certain periodic behaviors.

La séquence d'ADN codant pour ce gène Per présente également un haut degré de polymorphisme trek. 5). The DNA sequence encoding this Per gene also exhibits a high degree of trek polymorphism. 5).

Dans l'article de SHIN et al référencée cidessus, il a été montré que cette région mini-satellite du gène Per était capable de s'hybrider avec des échantillons d4ADN provenant de différentes espèces de vertébrés, telles que le poulet, le chat, la souris et l'hom- me. In the article by SHIN et al referenced above, it was shown that this mini-satellite region of the Per gene was able to hybridize with DNA samples from different vertebrate species, such as chicken, cat, mouse and man.

On a pu ainsi cloner un fragment d'ADN de souris homologue en partie au gène Per et dont la séquence nucléotidique comprend une région mini-satellite comportant les motifs ACNGGN et TCAGGC dans lesquels N représente l'un quelconque des 4 nucléotides adénine, cytosine, guanine, et thymine. It was thus possible to clone a fragment of mouse DNA partially homologous to the Per gene and whose nucleotide sequence comprises a mini-satellite region comprising the motifs ACNGGN and TCAGGC in which N represents any one of the 4 nucleotides adenine, cytosine, guanine, and thymine.

Ce fragment particulier d'ADN de souris a été également décrit comme reconnaissant une famille de régions mini-satellites chez l'homme (réf. 6). This particular fragment of mouse DNA has also been described as recognizing a family of mini-satellite regions in humans (ref. 6).

Les recherches poursuivies par les Inventeurs en ce domaine leur ont permis de mettre au point un nouveau procédé permettant la détermination du sexe d'embryons de ruminants (à un stade très précoce de leur développement), avec une efficacité maximale, et ne nécessitant qu'une quantité très faible de matériel biologique. The research carried out by the inventors in this field has enabled them to develop a new process allowing the sex determination of ruminant embryos (at a very early stage of their development), with maximum efficiency, and requiring only a very small amount of biological material.

L'objet principal de la présente invention concerne un tel procédé. The main object of the present invention relates to such a method.

Un deuxième objet de l'invention concerne un nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention. A second object of the invention relates to a kit or kit for implementing the method of the invention.

La sonde nucléotidique mise en oeuvre dans l'invention, de préférence marquée, pour La détermination du sexe d'embryons de ruminants, par hybridation entre un échantillon d'ADN à tester et ladite sonde, est caractérisée en ce qu'elle comprend un fragment d'-ADN permettant l'identification de la présence du chromosome
Y de ruminants, ledit fragment d'ADN étant constitué par une séquence nucléotidique comprenant une pluralité, notamment de deux motifs à plusieurs centaines, de préférence de l'ordre de la centaine, de motifs soit du type ACNGGN, où N représente l'un quelconque des 4 nucléotides thymine (ou uracile) guanine, adénine et cytosine, soit du type TCAGGC, soit des deux à la fois.The nucleotide probe used in the invention, preferably labeled, for the determination of the sex of ruminant embryos, by hybridization between a DNA sample to be tested and said probe, is characterized in that it comprises a fragment of DNA allowing the identification of the presence of the chromosome
Y of ruminants, said DNA fragment consisting of a nucleotide sequence comprising a plurality, in particular of two motifs of several hundred, preferably of the order of one hundred, of motifs either of the ACNGGN type, where N represents one any of the 4 nucleotides thymine (or uracil) guanine, adenine and cytosine, either of the TCAGGC type, or of both at the same time.

Ceci étant, on peut noter que, si le plus souvent ces différents motifs sont, dans les régions les plus caractéristiques de la sonde d'hybridation, contenus dans des "séquences oligomères" contenant plusieurs motifs répétitifs comme indiqué ci-après, ils peuvent aussi être séparés les uns des autres par de courtes séquences qui leur sont respectivement étrangères, comme le montre un examen attentif de la séquence présentée ci-après (ou dans la figure 1). This being the case, it may be noted that, although most often these different motifs are, in the most characteristic regions of the hybridization probe, contained in "oligomeric sequences" containing several repeating motifs as indicated below, they can also be separated from each other by short sequences which are respectively foreign to them, as shown by a careful examination of the sequence presented below (or in FIG. 1).

En particulier, l'invention concerne un tel procédé mettant en oeuvre des séquences d'ADN contenant des motifs répétitifs soit du type (ACNGGN)m, soit du type (TCAGGC)n, soit encore des deux à la fois, avec m et n représentant respectivement des nombres dedw jusqu'à plusieurs centaines, de préférence jusqu'à respectivement un ordre de grandeur de la centaine. In particular, the invention relates to such a method using DNA sequences containing repeating motifs either of the type (ACNGGN) m, or of the type (TCAGGC) n, or even both at the same time, with m and n respectively representing dedw numbers up to several hundred, preferably up to an order of magnitude of one hundred respectively.

La sonde susdite permet d'obtenir des images d'hybridation avec un échantillon d'ADN mâle qui présentent une caractéristique visuelle supplémentaire les différenciant des images d'hybridation obtenues avec un échantillon d'ADN femelle. The aforementioned probe makes it possible to obtain hybridization images with a male DNA sample which have an additional visual characteristic which differentiates them from the hybridization images obtained with a female DNA sample.

Pour étonnant que ce résultat puisse paraitre, l'on n'avait pas découvert jusqu'à présent que la sonde mise en oeuvre dans l'invention, déjà connue pour sa capacité å détecter des régions d'ADN mini-satellites dans le génome humain ou animal, était également capable de détecter la présence du chromosome Y dans un échantillon d'ADN de ruminants. As surprising as this result may appear, we had not discovered until now that the probe used in the invention, already known for its ability to detect regions of mini-satellite DNA in the human genome or animal, was also able to detect the presence of the Y chromosome in a ruminant DNA sample.

Il convient de noter ici que la sonde mise en oeuvre dans l'invention n'est pas, à proprement parler, spécifique du génome mâle. En effet, elle permet d'obtenir des images d'hybridation, aussi bien avec un échantillon d'ADN mâle qu'avec un échantillon d'ADN femelle. It should be noted here that the probe used in the invention is not, strictly speaking, specific to the male genome. Indeed, it makes it possible to obtain hybridization images, both with a sample of male DNA and with a sample of female DNA.

Ceci étant, la sonde utilisée dans l'invention permet la détermination de la présence, ou de l'absence, du chromosome Y dans un échantillon biologique. Cette détermination est rendue possible par l'apparition d'une caractéristique visuelle sur l'image qui traduit le résultat de l'hybridation entre l'ADN et la sonde, lorsque l'hybridation est réalisée avec un échantillon d'ADN mâle. Cette caractéristique est par contre absente dans le cas où la sonde est mise à hybrider avec un échantillon d'ADN femelle. That said, the probe used in the invention allows the determination of the presence, or absence, of the Y chromosome in a biological sample. This determination is made possible by the appearance of a visual characteristic on the image which translates the result of the hybridization between the DNA and the probe, when the hybridization is carried out with a sample of male DNA. This characteristic is however absent in the case where the probe is put to hybridize with a sample of female DNA.

L'obtention de cette caractéristique visuelle dépend des conditions dans lesquelles est effectuée l'hybridation entre l'échantillon d'ADN à tester et la sonde. L'ajustement de ces conditions, notamment les milieux d'hybridation utilisés, la durée et la température des hybridations, les conditions de lavage, sera détaillé plus loin. Obtaining this visual characteristic depends on the conditions under which hybridization is carried out between the DNA sample to be tested and the probe. The adjustment of these conditions, in particular the hybridization media used, the duration and the temperature of the hybridizations, the washing conditions, will be detailed below.

Cette caractéristique se manifeste de différentes façons suivant le type d'hybridation mise en oeuvre. Ainsi, lorsque l'hybridation est réalisée suivant la méthode de Southern, on observe avec un échantillon d'ADN mâle la présence d'un signal intense obscurcissant la majeure partie de la piste d'hybridation, ce signal étant absent de la piste d'hybridation obtenue avec un échantillon d'ADN femelle. De plus, l'image d'hybridation obtenue avec un échantillon d'ADN mâle comporte des bandes supplémentaires absentes de l'image d'hybridation obtenue avec un échantillon d'ADN femelle. This characteristic manifests itself in different ways depending on the type of hybridization implemented. Thus, when the hybridization is carried out according to the Southern method, we observe with a male DNA sample the presence of an intense signal obscuring most of the hybridization track, this signal being absent from the hybridization obtained with a female DNA sample. In addition, the hybridization image obtained with a male DNA sample has additional bands absent from the hybridization image obtained with a female DNA sample.

Dans le cas où l'hybridation est réalisée selon la méthode de Dot blot, la caractéristique visuelle se manifeste par un signal d'une intensité environ 10 fois plus importante avec un échantillon d'ADN male qu'avec un échantillon d'ADN femelle. In the case where the hybridization is carried out according to the dot blot method, the visual characteristic is manifested by a signal of an intensity approximately 10 times greater with a sample of male DNA than with a sample of female DNA.

Des exemples particuliers utilisant ces différents types d'hybridation seront décrits plus loin. Particular examples using these different types of hybridization will be described later.

Selon une forme de réalisation préférée de la sonde de l'invention, le fragment d'ADN permettant la détermination de la présence du chromosome Y de ruminants, comprend une pluralité de deux motifs à plusieurs centaines de motifs, soit du type ACAGGC, soit du type
TCAGGC, soit encore des deux à la fois. Plus particulièrement, ce fragment d'ADN contient des motifs répétitifs soit (ACACC)m, respectivement, soit (TCAGGC)n, soit des deux à la fois avec m et n étant des nombres respectivement de 2 à plusieurs centaines, de préférence de l'ordre de grandeur d'une centaine. According to a preferred embodiment of the probe of the invention, the DNA fragment allowing the determination of the presence of the Y chromosome of ruminants, comprises a plurality of two motifs with several hundred motifs, either of the ACAGGC type, or of the type
TCAGGC, or both at the same time. More particularly, this DNA fragment contains repeating motifs either (ACACC) m, respectively, or (TCAGGC) n, or both at the same time with m and n being numbers respectively from 2 to several hundred, preferably l 'order of magnitude of a hundred.

Un fragment préféré utilisable dans le procédé selon l'invention, apparaît sur la page suivante. Il est contenu dans un plasmide pSP64.2.5EI contenant une séquence homologue d'une séquence du gène "per" de la souris décrite par SHIN et al, 1985, Nature, 317, 445-448. A preferred fragment which can be used in the process according to the invention appears on the next page. It is contained in a plasmid pSP64.2.5EI containing a sequence homologous to a sequence of the mouse "per" gene described by SHIN et al, 1985, Nature, 317, 445-448.

GAATTCTAGG TAAGTCTGAA CTACAAAGGG AGTTGAAGGC CAGCCTGAGC TACAAAGCAA SACCCTGTCT CATAAAACAA AAATAAATAA ACTATGGGGC CAATAGA6AT CCAGACAGCA
AGCCTACGGC CTTCCCCACT 6TCCATCCT6 TA6CTTTCCC CAGTCTGTCA CCTGCTACAC ACTACTSTCT TSCABAAGSC CTSASCTGTA TSAACAABGA TGATGGCTGT 6GTCACATCT
SCAAGGAGGC CCCAAGAGGC AGCGTTGCCT GTGAATGCAG GCCTGGTTTT GAACTGGCCA
AAAACCAGAA AGACTSCATC TGTAAGTATS AACTGTCAAT AASTGAGGTG 66TACA6CCT
ACACAGAGGT GAGAAAAACA ACCACGGGCA CAGCCACAGG TATAGCCACA GGTACATGCA
CAGGCACAGG CAGAGTCAAA GCCACAGGCA GAGGCACAGG AACAGACACA GACACAGGCA
GAGTCACAGC CAGAGCCACG GTCACAGCCA GAGTGACAGG GACAGGAACA GGAACAGCCA
GAGTCACAGA GACAGGCACA SCCAAASTCA GAGACACAGG CACAGGCACA GGCACAGCCA
AASTGACAGG CACAGCCAAA GTCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGTACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG TACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGC CAAAGTCACA GGCACAGGCA
CA6ACAGA66 CACAGGCACA GGCACAGGCA CA66CACA66 CACA66CACA 66CACA66CA
CAGGCACAGC CAAAGTCACA GGCACAGCCA AAGTCACAGG CAGAGGGACA GGCACAGCCA
AAGTCACAGG CACAGGGACA 66CACA66CA CA66CACA66 CACAGGCACA 66CACA66CA
CAGACACAGG CACAGGCACA GCCAAASTCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGTACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGTACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGCCAAA GTCACAGGCA
CAGGCACAGA CAGAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GCCAAAGTCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACASSCACA 66CACA66CA CA66CACA66 CACAGGCACA 66CACA66CT
CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCTCAGG CTCAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCTCAGG CTCAGGCACA GCCAAAGTCA GAGGCACAGC CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGACACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCTCA GGCTCAGGCA
GAGCCAAAGT CACAGGCACA GCCACGACCA CAGCCAGAGT GACAGAGACA GGCACAGCCA
AAGTCACAGG CACAGACACA GGCACAGCCA AAGTCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGGA GAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCTCA GGCTCAGGCA
CAGCCAAAGT CACAGGCACA GACACAGGCA CAGCCAAAGT CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCT
CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCC
TAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCACAGCCA AAGTCACAGG CACAGGCACA GCCAAAGTCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT
CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCC
TAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAAGCA CAGTCACAGT CAGAGGCACA GGTACAGGCA
CAGCCAGAGC CACAGGCACA GGTACAGGCA CAGGCACAGG TACAGGTACA GGTACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGACACA AGCACAGGCA CAGACAGAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGCTTAGGA ACAAAAGAGC AGCTTGTGGG AATCATTCTT TCCTTCTATT CTATGTGTCC
CGGGGATTTA ACTCAGTTAT AGATGTCTTT ACCCTGTTCT ATCTTACCCG ACCAACCAAT
AAACCTTTTT TCTTTTTCTT TTCACTAAAT GTTTTTTATT GTCACTGCTT AAATGCTTTT
GTTAGAACAT TTGCATTCCT GTGATCTCAG CACTTAGGAG GTAAAGGGAG GAGCATTGGG
AATTC
Selon une autre forme de réalisation, la sonde comprend un fragment d'ADN issu du génome de Drosophile, notamment un fragment d'ADN comprenant le gène Per de
Drosophile.GAATTCTAGG TAAGTCTGAA CTACAAAGGG AGTTGAAGGC CAGCCTGAGC TACAAAGCAA SACCCTGTCT CATAAAACAA AAATAAATAA ACTATGGGGC CAATAGA6AT CCAGACAGCA
AGCCTACGGC CTTCCCCACT 6TCCATCCT6 TA6CTTTCCC CAGTCTGTCA CCTGCTACAC ACTACTSTCT TSCABAAGSC CTSASCTGTA TSAACAABGA TGATGGCTGT 6GTCACATCT
SCAAGGAGGC CCCAAGAGGC AGCGTTGCCT GTGAATGCAG GCCTGGTTTT GAACTGGCCA
AAAACCAGAA AGACTSCATC TGTAAGTATS AACTGTCAAT AASTGAGGTG 66TACA6CCT
ACACAGAGGT GAGAAAAACA ACCACGGGCA CAGCCACAGG TATAGCCACA GGTACATGCA
CAGGCACAGG CAGAGTCAAA GCCACAGGCA GAGGCACAGG AACAGACACA GACACAGGCA
GAGTCACAGC CAGAGCCACG GTCACAGCCA GAGTGACAGG GACAGGAACA GGAACAGCCA
GAGTCACAGA GACAGGCACA SCCAAASTCA GAGACACAGG CACAGGCACA GGCACAGCCA
AASTGACAGG CACAGCCAAA GTCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGTACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG TACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGC CAAAGTCACA GGCACAGGCA
CA6ACAGA66 CACAGGCACA GGCACAGGCA CA66CACA66 CACA66CACA 66CACA66CA
CAGGCACAGC CAAAGTCACA GGCACAGCCA AAGTCACAGG CAGAGGGACA GGCACAGCCA
AAGTCACAGG CACAGGGACA 66CACA66CA CA66CACA66 CACAGGCACA 66CACA66CA
CAGACACAGG CACAGGCACA GCCAAASTCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGTACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGTACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGCCAAA GTCACAGGCA
CAGGCACAGA CAGAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GCCAAAGTCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACASSCACA 66CACA66CA CA66CACA66 CACAGGCACA 66CACA66CT
CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCTCAGG CTCAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCTCAGG CTCAGGCACA GCCAAAGTCA GAGGCACAGC CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGACACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCTCA GGCTCAGGCA
GAGCCAAAGT CACAGGCACA GCCACGACCA CAGCCAGAGT GACAGAGACA GGCACAGCCA
AAGTCACAGG CACAGACACA GGCACAGCCA AAGTCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGGA GAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCTCA GGCTCAGGCA
CAGCCAAAGT CACAGGCACA GACACAGGCA CAGCCAAAGT CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCT
CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCC
TAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCACAGCCA AAGTCACAGG CACAGGCACA GCCAAAGTCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT
CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCC
TAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAAGCA CAGTCACAGT CAGAGGCACA GGTACAGGCA
CAGCCAGAGC CACAGGCACA GGTACAGGCA CAGGCACAGG TACAGGTACA GGTACAGGCA
CAGGCACAGG CACAGACACA AGCACAGGCA CAGACAGAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA
CAGCTTAGGA ACAAAAGAGC AGCTTGTGGG AATCATTCTT TCCTTCTATT CTATGTGTCC
CGGGGATTTA ACTCAGTTAT AGATGTCTTT ACCCTGTTCT ATCTTACCCG ACCAACCAAT
AAACCTTTTT TCTTTTTCTT TTCACTAAAT GTTTTTTATT GTCACTGCTT AAATGCTTTT
GTTAGAACAT TTGCATTCCT GTGATCTCAG CACTTAGGAG GTAAAGGGAG GAGCATTGGG
AATTC
According to another embodiment, the probe comprises a DNA fragment originating from the Drosophila genome, in particular a DNA fragment comprising the Per gene.
Drosophila.

Avantageusement, la sonde comprend le fragment d'ADN PstI-BamHI de 1,3 kb (kilobases) du gène Per, tel que décrit dans la publication de SHIN et al (réf. 4). Advantageously, the probe comprises the 1.3 kb (kilobase) DNA fragment PstI-BamHI of the Per gene, as described in the publication by SHIN et al (ref. 4).

Selon un autre aspect de la présente invention, la sonde comprend un fragment d'ADN homologue au gène Per de Drosophile, notamment le fragment EcoRI de 2,5 kb du clone cp 2,2 de souris, tel que décrit par
SHIN et al (réf. 4).According to another aspect of the present invention, the probe comprises a DNA fragment homologous to the Drosophila Per gene, in particular the 2.5 kb EcoRI fragment of the mouse clone cp 2.2, as described by
SHIN et al (ref. 4).

De préférence, la sonde utilisée dans l'invention est incorporée dans un vecteur, notamment un plasmide ou un phage. Preferably, the probe used in the invention is incorporated into a vector, in particular a plasmid or a phage.

L'incorporation de la sonde mise en oeuvre dans l'invention dans un vecteur approprié ne posera aucun problème que l'homme du métier avec ses connaissances habituelles, ne saurait résoudre. The incorporation of the probe used in the invention into an appropriate vector will not pose any problem that a person skilled in the art with his usual knowledge cannot solve.

Une sonde préférée est constituée par le plasaide pSP64.2. 5EI décrit dans la publication de SHIN;et al (ref. 4). A preferred probe is constituted by the plasid pSP64.2. 5EI described in the publication by SHIN; et al (ref. 4).

L'invention entend protéger également la mise en oeuvre de tout fragment d'ADN différant de ceux préférés décrits dans ce qui précède par la substitution d'un petit nombre de nucléotide, notamment un ou deux, cette substitution n'ayant pas pour effet de réduire la capacité d'hybridation (et l'obtention du signal caractéristique du chromosome Y) de la séquence ainsi modifiée avec une séquence complémentaire des séquences préférées non modifiées. The invention also intends to protect the implementation of any DNA fragment different from the preferred ones described in the above by the substitution of a small number of nucleotides, in particular one or two, this substitution not having the effect of reducing the hybridization capacity (and obtaining the characteristic signal of the Y chromosome) of the sequence thus modified with a sequence complementary to the preferred unmodified sequences.

De même, des séquences plus courtes que celles préférées décrites ci-dessus peuvent être utilisées. Likewise, shorter sequences than the preferred ones described above can be used.

Constituent également des séquences analogues, celles s'hybridant avec les fragments préférés décrits ci-dessus en formant un hybride stable et détectable dans les conditions opératoires qui seront décrites plus loin. Analogous sequences also constitute those which hybridize with the preferred fragments described above, forming a stable and detectable hybrid under the operating conditions which will be described below.

De même, le mot "nucléotide" tel qu'utilisé dans le texte de la présente de la demande de brevet se réfère indistinctement à des ribonucléotides ou des désoxyribonucléotides. Likewise, the word "nucleotide" as used in the text of this patent application refers equally to ribonucleotides or deoxyribonucleotides.

L'expression "nucléotide" doit également être entendue comme comprenant ceux qui comportent des groupes de modification chimique n'affectant pas leur capacité d'hybridation. De tels groupes modifiés sont notamment utilisés pour faciliter le couplage de la sonde avec des marqueurs appropriés, et permettre ensuite la détection des sondes ainsi marqués, en particulier les fragments de la sonde hybridés avec un échantillon biologique. The term "nucleotide" should also be understood to include those which have chemical modification groups which do not affect their ability to hybridize. Such modified groups are used in particular to facilitate coupling of the probe with appropriate markers, and then allow the detection of the probes thus labeled, in particular the fragments of the probe hybridized with a biological sample.

De tels groupes de modification sont, par exemple, ceux susceptibles d'être reconnus par des anticorps qui, à leur tour, sont reconnus de façon spécifique par d'autres anticorps comportant un marqueur fluorescent ou enzymatique. Such modification groups are, for example, those capable of being recognized by antibodies which, in turn, are specifically recognized by other antibodies comprising a fluorescent or enzymatic label.

Des méthodes de marquage des sondes mises en oeuvre dans l'invention seront décrites plus loin. Methods for labeling the probes used in the invention will be described below.

Les sondes utilisées dans l'invention peuvent être également être préparées par clonage de plasmides recombinants contenant des inserts comprenant les fragments d'ADN préférés ci-dessus, par la coupure desdites séquences avec des endonucléases appropriées et le recueil des séquences correspondantes, par exemple par fractionnement selon le poids moléculaire. The probes used in the invention can also be prepared by cloning recombinant plasmids containing inserts comprising the DNA fragments preferred above, by cutting said sequences with appropriate endonucleases and collecting the corresponding sequences, for example by fractionation according to molecular weight.

Les sondes peuvent également être préparées en réalisant une hybridation dans les conditions opératoires qui seront décrites dans ce qui suit, entre un échantillon d'ADN mâle et une sonde préférée utilisés dans l'invention, par exemple la sonde pSP64.2.5EI. The probes can also be prepared by carrying out hybridization under the operating conditions which will be described below, between a sample of male DNA and a preferred probe used in the invention, for example the pSP64.2.5EI probe.

Les hybrides formés sont alors recueillis et clonés dans un vecteur approprié. On vérifie, par une nouvelle hybridation de ces vecteurs avec un échantillon d'ADN mâle et un échantillon d'ADN femelle, que l'on obtient un signal supplémentaire avec l'échantillon d'ADN mâle. The hybrids formed are then collected and cloned in an appropriate vector. It is verified, by a new hybridization of these vectors with a sample of male DNA and a sample of female DNA, that an additional signal is obtained with the sample of male DNA.

Les fragments hybridés avec l'ADN mâle sont alors recueillis, clonés dans un vecteur approprié et constituent une nouvelle sonde utilisable avec le procédé de l'invention. The fragments hybridized with the male DNA are then collected, cloned in an appropriate vector and constitute a new probe usable with the method of the invention.

Les sondes de l'invention peuvent etre préparées par synthèse chimique, en utilisant toute méthode connue en soi, par exemple la méthode phosphotriester. The probes of the invention can be prepared by chemical synthesis, using any method known per se, for example the phosphotriester method.

L'invention concerne un procédé de détermination du sexe d'embryons de ruminants par hybridation entre une sonde et un échantillon biologique. The invention relates to a method for determining the sex of ruminant embryos by hybridization between a probe and a biological sample.

Le procédé selon l'invention, pour la détermination du sexe. d'embryons de ruminants, par hybridation entre un échantillon d'ADN provenant d'un embryon et une sonde, est caractérisé en qu'il comprend - la mise en contact dans des conditions permettant leur hybridation mutuelle de l'échantillon d'ADN avec un fragment d'ADN, soit tel qu'il a été défini plus haut, soit un fragment ayant une séquence de nucléotides complémentai-re de la précédente, la mise en contact étant ajustée de façon à permettre la production d'une image comportant ou non un élément ca ractéristique spécifique reflétant la présence du chromosome Y dans l'échantillon, - la détection dans l'image produite de la présence ou non dudit élément caractéristique. The method according to the invention, for determining sex. of ruminant embryos, by hybridization between a DNA sample from an embryo and a probe, is characterized in that it comprises - contacting under conditions allowing their mutual hybridization of the DNA sample with a DNA fragment, either as defined above, or a fragment having a nucleotide sequence complementary to the previous one, the contacting being adjusted so as to allow the production of an image comprising or not a specific characteristic element reflecting the presence of the Y chromosome in the sample, - detection in the image produced of the presence or absence of said characteristic element.

Le procédé selon l'invention se caractérise en ce qu il comprend les étapes suivantes
- la fixation d'un échantillon biologique à tester sur un support approprié, l'ÂDN dudit échantillon biologique étant rendu accessible à une hybridation ultérieure, de façon à permettre l'obtention d'un signal d'hybridation
- la réalisation d'une préhybridation dudit échantillon biologique obtenu à l'étape précédente, de façon à diminuer l'adsorption non spécifique de la sonde sur le support
- la mise en contact dudit échantillon biologique obtenu à l'étape précédente, avec une sonde nucléotidique, de préférence marquée, ladite sonde consistant en un fragment d'ADN tel que décrit dans ce qui précède, la mise en contact étant réalisée dans un milieu et des conditions propres à permettre une hybridation de la sonde avec l'échantillon biologique,
- le lavage du support contenant les hybrides formés,
- la détection d'un signal visuel spécifique du chromosome Y.The method according to the invention is characterized in that it comprises the following steps
- the attachment of a biological sample to be tested on an appropriate support, the DNA of said biological sample being made accessible for subsequent hybridization, so as to allow a hybridization signal to be obtained
- carrying out a prehybridization of said biological sample obtained in the previous step, so as to reduce the non-specific adsorption of the probe on the support
- bringing said biological sample obtained in the previous step into contact with a nucleotide probe, preferably labeled, said probe consisting of a DNA fragment as described in the above, the contacting being carried out in a medium and conditions suitable for allowing hybridization of the probe with the biological sample,
- washing the support containing the hybrids formed,
- detection of a specific visual signal of the Y chromosome.

Selon l'invention, l'échantillon biologique est fixé sur un support approprié. According to the invention, the biological sample is fixed on an appropriate support.

La nature du support ainsi que celui de l'échantillon biologique dépendent du type d'hybridation utilise. The nature of the support as well as that of the biological sample depend on the type of hybridization used.

En effet, le procédé de l'invention s'applique particulièrement bien aux différents types connus d'hybridation, tels que l'hybridation de Southern, l'hybri- dation Dot Blot, l'hybridation dite de "taches d'embryons" (en anglais : embryo blot hybridization. In fact, the process of the invention applies particularly well to the various known types of hybridization, such as Southern hybridization, Dot Blot hybridization, so-called "embryo stain" hybridization ( in English: embryo blot hybridization.

Dans le cas où le procédé de l'invention est utilisé en mettant en oeuvre une hybridation de
Southern, la première étape du procédé de l'invention comprendra généralement la digestion de l'échantillon biologique, consistant en un échantillon d'ADN, par une ou plusieurs endonucléases appropriées. In the case where the method of the invention is used by implementing a hybridization of
Southern, the first step of the process of the invention will generally comprise the digestion of the biological sample, consisting of a DNA sample, with one or more appropriate endonucleases.

Les fragments d'ADN ainsi obtenus sont ensuite soumis à une électrophorèse, par exemple sur gel d'agarose, de façon à séparer les différents fragments d'ADN en fonction de leur taille, puis ceux-ci sont transférés sur un support, par exemple une feuille de nitrocellulose. The DNA fragments thus obtained are then subjected to electrophoresis, for example on agarose gel, so as to separate the different DNA fragments according to their size, then these are transferred to a support, for example a nitrocellulose sheet.

Les conditions dans lesquelles sont effectués la dénaturation, la séparation par électrophorèse, le transfert sur un support approprié ne poseront aucun probl*e que l'homme de métier, habitué à ces techniques, ne saurait résoudre par de simples essais de routine. The conditions under which denaturation, separation by electrophoresis and transfer to an appropriate support are carried out will not pose any problem that the skilled person, accustomed to these techniques, cannot resolve by simple routine tests.

On pourra se référer, en ce qui concerne la technique d'hybridation de Southern, à l'article (réf.11) ainsi qu'à l'exemple de réalisation particulier qui sera décrit plus loin. Reference may be made, with regard to the Southern hybridization technique, to the article (ref. 11) as well as to the particular embodiment which will be described below.

L'hybridation de Southern présente cependant l'inconvénient de nécessiter une quantité relativement importante d'ADN, allant de 1 à 10 pg. However, Southern hybridization has the disadvantage of requiring a relatively large amount of DNA, ranging from 1 to 10 μg.

Il est fréquent que de telles quantités d'ADN ne soient pas disponibles, et l'on aura alors recours à un type d'hybridation différent, par exemple l'hybridation Dot Blot, ne nécessitant qu'une quantité d'ADN variant entre 10 3 et 1 pg. Frequently, such quantities of DNA are not available, and a different type of hybridization will then be used, for example Dot Blot hybridization, requiring only a quantity of DNA varying between 10 3 and 1 pg.

Dans le cas où le procédé de l'invention est mis en oeuvre avec une hybridation Dot Blot, la première étape du procédé de l'invention comprendra généralement la fixation de l'échantillon biologique, consistant en un échantillon d'ADN, sur un support, notamment une feuille de nitrocellulose, ledit échantillon ayant été au préalable dénaturé par une ou plusieurs endonucléases appropriées. In the case where the method of the invention is implemented with Dot Blot hybridization, the first step of the method of the invention will generally comprise the fixing of the biological sample, consisting of a DNA sample, on a support , in particular a nitrocellulose sheet, said sample having been denatured beforehand by one or more appropriate endonucleases.

Il va de soi que l'on peut utiliser d'autres supports que la nitrocellulose et ce, quel que soit.le type d'hybridation utilisé. It goes without saying that one can use other supports than nitrocellulose and this, whatever the type of hybridization used.

On citera à titre d'exemples non limitatifs, des filtres de cellulose, des feuilles de fibres de verre, des filtres de NYLONR. Mention will be made, by way of nonlimiting examples, of cellulose filters, glass fiber sheets, NYLONR filters.

L'ADN à étudier est déposé sur le support sous la forme d'une tâche. De la même façon que précédemment, l'homme du métier sera à même de définir, par de simples essais de routine, les conditions dans lesquelles doivent être réalisées les opérations décrites ci-dessus. The DNA to be studied is deposited on the support in the form of a task. In the same way as previously, the person skilled in the art will be able to define, by simple routine tests, the conditions under which the operations described above must be carried out.

Pour ce qui concerne la technique générale d'hybridation Dot Blot, on pourra se référer notamment à l'article (12), ainsi qu'à l'exemple de réalisation particulier qui sera décrit plus loin. As regards the general Dot Blot hybridization technique, reference may be made in particular to article (12), as well as to the particular embodiment which will be described below.

L'un des avantages du procédé de l'invention est de permettre la détection du sexe de ruminants à l'état embryonnaire. One of the advantages of the method of the invention is to allow the detection of the sex of ruminants in the embryonic state.

Dans ce cas, le procédé de l'invention est mis en oeuvre en réalisant une hybridation dite de tâches d'embryons ( de l'anglais : Embryo Blot Hybridization)
Dans cette variante de mise en oeuvre de l'invention, la première étape du procédé de l'invention comprendra la fixation sur un support approprié, par exemple une feuille de nitrocellulose, de l'échantillon biologique consistant en l'embryon entier, par exemple au stade morula, ou de seulement quelques cellules embryonnaires.In this case, the method of the invention is implemented by carrying out a so-called hybridization of embryo spots (from English: Embryo Blot Hybridization)
In this variant implementation of the invention, the first step of the process of the invention will comprise the fixing on a suitable support, for example a nitrocellulose sheet, of the biological sample consisting of the whole embryo, for example in the morula stage, or only a few embryonic cells.

Un exemple particulier de mise en oeuvre du procédé de l'invention avec une telle hybridation sera donné dans ce qui suit. A particular example of implementation of the method of the invention with such hybridization will be given in the following.

Quel que soit le type d'hybridation, l'échan- tillon biologique, à la fin de la première étape du procédé selon l'invention, est devenu accessible à une sonde et autorise l'hybridation de cette sonde avec les éventuelles séquences complémentaires contenues dans l'échantillon. Whatever the type of hybridization, the biological sample, at the end of the first step of the method according to the invention, has become accessible to a probe and authorizes hybridization of this probe with the possible complementary sequences contained in the sample.

La seconde étape du procédé de l'invention consiste en une pré-hybridation destinée à réduire l'adsorption non spécifique de la sonde sur le support utilisé. The second step of the process of the invention consists of a pre-hybridization intended to reduce the non-specific adsorption of the probe on the support used.

Un milieu préféré contient 6 x scc (1ssc = NaCl à 0,15 M, citrate de sodium à 0,015 M, pH 7,0), 5 uN EDTA, du formamide 35 'C, du lait en poudre écrêmé à 0,25 8 (10). A preferred medium contains 6 x scc (1ssc = 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 5 uN EDTA, 35 'C formamide, 0.25 8 skimmed milk powder (10).

D'autres milieux préférés sont constitués à base d'héparine. Other preferred media are based on heparin.

La pré-hybridation est réalisée pendant un temps variant de 1 à 24 heures, de préférence pendant 2 heures, et à une température de préférence à 42'C. The pre-hybridization is carried out for a time varying from 1 to 24 hours, preferably for 2 hours, and at a temperature preferably at 42 ° C.

La troisième étape du procédé selon l'invention consiste en l'hybridation de l'échantillon biologique obtenu à l'étape précédente, avec une sonde telle que décrite dans ce qui précède. The third step of the process according to the invention consists in the hybridization of the biological sample obtained in the previous step, with a probe as described in the above.

De préférence, la sonde est marquée. Toute méthode conventionnelle de marquage peut être utilisée. Preferably, the probe is labeled. Any conventional marking method can be used.

Par exemple, la sonde peut être marquée radio-activement grâce à des isotopes radio-actifs, tels que 32p, 35S, 1251, 3 et 14c. For example, the probe can be radioactive labeled with radioactive isotopes, such as 32p, 35S, 1251, 3 and 14c.

Le marquage radio-actif peut être réalisé selon tout procédé connu en soi, tel que le marquage d'une extrêmité en position 5' ou 3' , en utilisant un nucléotide marqué radio-activement, une kinase polynucléotidique (avec ou sans déphosphorylation par une phosphatase) ou une ADN polymérase (selon l'extrêmité devant être marquée). Radioactive labeling can be carried out according to any method known per se, such as labeling an end in the 5 ′ or 3 ′ position, using a radioactive labeled nucleotide, a polynucleotide kinase (with or without dephosphorylation by a phosphatase) or DNA polymerase (depending on the end to be marked).

Dans le cas où la sonde est marquée radioactivement, la méthode de détection de l'hybridation dépendra du marqueur radio-actif utilisé. D'une façon générale, on pourra utiliser tout procédé permettant de détecter un rayonnement ionisant provenant de marqueurs, tel què l'autoradiographie, la scintigraphie liquide, le comptage gamma. In the case where the probe is radioactively labeled, the method of detecting hybridization will depend on the radioactive marker used. In general, any method can be used to detect ionizing radiation from markers, such as autoradiography, liquid scintigraphy, gamma counting.

Un marquage non radio-actif peut également être utilisé en associant une sonde de l'invention avec des résidus présentant : des propriétés immunologiques (par exemple antigène ou haptène), une affinité spécifique pour certains réactifs (par exemple un ligand), des propriétés permettant la détection d'une réaction enzymatique (par exemple un enzyme, un co-enzyme), ou des propriétés physiques telles que la fluorescence, l'émission ou l'adsorption de lumière à une longueur d'onde donnée. Des anticorps détectant de façon spécifique les hybrides formés par la sonde et l'échantillon d'ADN peuvent également être utilises. Non-radioactive labeling can also be used by associating a probe of the invention with residues having: immunological properties (for example antigen or hapten), a specific affinity for certain reagents (for example a ligand), properties allowing the detection of an enzymatic reaction (for example an enzyme, a co-enzyme), or physical properties such as fluorescence, emission or adsorption of light at a given wavelength. Antibodies specifically detecting the hybrids formed by the probe and the DNA sample can also be used.

Un marquage non radio-actif de la sonde peut être obtenu en synthétisant chimiquement une sonde dans laquelle l'adénosine, la guanpsine, la cytidine, la thymidine sont capables de se coupler à d'autres résidus chimiques permettant la détection de la sonde ou des hybrides formés entre la sonde et un fragment d'ADN complémentaire. Non-radioactive labeling of the probe can be obtained by chemically synthesizing a probe in which adenosine, guanpsine, cytidine, thymidine are capable of coupling with other chemical residues allowing the detection of the probe or of the hybrids formed between the probe and a complementary DNA fragment.

L'hybridation à proprement parler est réalisée en mettant en contact l'échantillon biologique pré-hybridé obtenu à l'étape précédente, avec une sonde nucléotidique telle que décrite dans ce qui précède, la mise en contact étant réalisée dans un milieu et des conditions propres à permettre une hybridation de la sonde avec l'échantillon biologique. The actual hybridization is carried out by bringing the pre-hybridized biological sample obtained in the previous step into contact with a nucleotide probe as described in the above, the contacting being carried out in a medium and under conditions suitable for allowing hybridization of the probe with the biological sample.

Il va de soi que les différentes sondes préférées qui ont été décrites dans ce qui précède sont utilisables avec une grande efficacité pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention. It goes without saying that the various preferred probes which have been described in the foregoing can be used with great efficiency for implementing the method of the invention.

Parmi celles-ci, la sonde constituée par le plasmide pSP64.2.5EI est la sonde préférée. Among these, the probe constituted by the plasmid pSP64.2.5EI is the preferred probe.

Les conditions dans lesquelles l'hybridation est réalisée sont fonction du réglage de différents paramètres, tels que la température d'hybridation, la nature et la concentration des constituants du milieu d'hybridation, la durée de l'hybridation. The conditions under which the hybridization is carried out depend on the setting of various parameters, such as the hybridization temperature, the nature and the concentration of the constituents of the hybridization medium, the duration of the hybridization.

Selon l'invention, la température d'hybridation préférée est égale à 42'C. According to the invention, the preferred hybridization temperature is 42 ° C.

Un milieu d'hybridation particulièrement préféré contient 5 mM EDTA, 6 x ssc, du formamide à 35 ', du lait en poudre crémé à 0,25 E. A particularly preferred hybridization medium contains 5 mM EDTA, 6 x ssc, formamide at 35 ', creamy milk powder at 0.25 E.

L'hybridation est poursuivie pendant, de préférence de 1 heure à 48 heures. Hybridization is continued for, preferably from 1 hour to 48 hours.

Le procédé de l'invention comprend également une étape de lavage des supports sur lesquels les fragments hybridés sont fixés. The method of the invention also comprises a step of washing the supports on which the hybridized fragments are fixed.

Une solution de lavage préférée comprend 2 x ssc, 0,1 \ SDS, pH 7. A preferred washing solution includes 2 x ssc, 0.1 \ SDS, pH 7.

De préférence, la température de lavage est égale à 65"C. Preferably, the washing temperature is equal to 65 "C.

Le procédé de l'invention comprend enfin une étape de détection des hybrides formés et du signal caractéristique du chromosome Y. The method of the invention finally comprises a step of detecting the hybrids formed and the signal characteristic of the Y chromosome.

Le moyen de détection dépend du type de marqueur utilisé pour le marquage de la sonde. The means of detection depends on the type of marker used for labeling the probe.

On pourra utiliser toute méthode connue en soi, telles que celles qui ont été décrites dans ce qui précède. Any method known per se may be used, such as those which have been described in the foregoing.

Le procédé de l'invention permet donc une détermination aisée du sexe d'un embryon, ainsi qu'une interprétation rapide du résultat du test, consistant simplement en l'examen visuel de la bande d'hybridation obtenue et la constation de la présence (ou de l'absence) d'un signal obscurcissant l'ensemble de la bande d'hybridation dans le cas d'une hybridation de Southern, ou d'un signal beaucoup plus intense autour des tâches d'hybridation dans le cas d'une hybridation Dot Blot. The method of the invention therefore allows an easy determination of the sex of an embryo, as well as a rapid interpretation of the test result, consisting simply in visual examination of the hybridization band obtained and the determination of the presence ( or the absence) of a signal obscuring the entire hybridization band in the case of Southern hybridization, or of a much more intense signal around the hybridization tasks in the case of a Dot Blot hybridization.

Le procédé de l'invention s'applique également à des tests d'hybridation in situ d'embryons dans lesquels des biopsies de cellules embryonnaires sont fixées de façon histologique sur la lame du microscope, en utilisant des composés chimiques tels que le méthanol et l'acide acétique et mises directement à hybrider, sur la lame du microscope. The method of the invention also applies to in situ hybridization tests of embryos in which biopsies of embryonic cells are fixed histologically on the microscope slide, using chemical compounds such as methanol and l acetic acid and put directly to hybridize, on the microscope slide.

L'invention concerne également un kit ou nécessaire pour la détermination du sexe d'embryons de ruminants, notamment de bovins, comprenant - au moins une sonde sélectionnée parmi celles qui ont été décrites dans ce qui précède, - les solutions tampons et composés nécessaires pour la préparation des milieux d'hybridation et de pré-hybridation, - un échantillon d'ADN mâle témoin servant à vérifier la bonne conservation et/ou le bon fonctionnement de la sonde, - le cas échéant, des moyens appropriés pour la détection des hybrides éventuellement formés et du signal spécifique du chromosome Y. The invention also relates to a kit or kit for determining the sex of ruminant embryos, in particular bovine, comprising - at least one probe selected from those which have been described in the above, - the buffer solutions and compounds necessary for preparation of hybridization and pre-hybridization media, - a sample of male control DNA used to verify the good conservation and / or the proper functioning of the probe, - if necessary, appropriate means for the detection of hybrids possibly formed and the specific signal of the Y chromosome.

Des caractéristiques et avantages supplémentaires de l'invention apparaitront encore à la lumière de la description plus détaillée qui suit, d'exemples de mise en oeuvre et du procédé dé l'invention, donnée à titre illustratif et non limitatif, ainsi qu'aux figures qui s'y rapportent et dans lesquelles
- La figure 1 représente une séquence nucléotidique homologue du gène Per de Drosophile.Additional characteristics and advantages of the invention will become apparent in the light of the more detailed description which follows, of examples of implementation and of the method of the invention, given by way of illustration and not limitation, as well as in the figures related to it and in which
- Figure 1 shows a nucleotide sequence homologous to the Drosophila Per gene.

- La figure 2 représente les bandes d'hybridation obtenues avec de l'ADN bovin digéré par l'endonucléase HaeIII et la sonde pSP64.2.5EI, par la méthode d'hybridation de Southern. - Figure 2 shows the hybridization bands obtained with bovine DNA digested with the endonuclease HaeIII and the pSP64.2.5EI probe, by the Southern hybridization method.

Dans la figure 2, les individus 1 à 8 sont des taureaux sans lien de parenté entre eux. Les animaux 10, 12, 14 et 16 sont des animaux appartenant à la descendance du taureau 8 et des vaches 9, 11, 13 et 15 respectivement. L'animal 12 est le seul de sexe mâle parmi la descendance du taureau 8. In Figure 2, individuals 1 to 8 are unrelated bulls. Animals 10, 12, 14 and 16 are animals belonging to the descendants of bull 8 and cows 9, 11, 13 and 15 respectively. Animal 12 is the only male among the descendants of bull 8.

Le symbole 8 entourant le numéro des différents animaux représente les animaux de sexe mâle, le symbole Ç représente les animaux de sexe femelle. The symbol 8 surrounding the number of the different animals represents male animals, the symbol Ç represents female animals.

Les indications de taille figurant à gauche de la figure 2 sont données en kilobases (kb). The size indications on the left of Figure 2 are given in kilobases (kb).

- La figure 3 représente les tâches d'hybridation obtenues par hybridation Dot Blot d'échantillons d'ADN mâle (M) et femelle (F) hybridés avec la sonde pSP64.2.5EI (Per) d'une part, et de l'ADN génomique total (Gen. DNA) d'autre part. FIG. 3 represents the hybridization tasks obtained by Dot Blot hybridization of male (M) and female (F) DNA samples hybridized with the pSP64.2.5EI (Per) probe on the one hand, and Total genomic DNA (Gen. DNA) on the other hand.

Les taches d'hybridation sont obtenues avec des quantités décroissantes d'ADN variant de 1 (10 ) à 10-3 pg. The hybridization spots are obtained with decreasing amounts of DNA varying from 1 (10) to 10-3 pg.

- La figure 4 représente les tâches d'hybridation de deux embryons de bovins (stade morula) de sexe différent obtenues successivement avec la sonde pSP64.2.5EI (Per) et de l'ADN génomique de bovins (Gen). - Figure 4 shows the hybridization tasks of two bovine embryos (morula stage) of different sex obtained successively with the pSP64.2.5EI probe (Per) and bovine genomic DNA (Gen).

Les résultats obtenus avec la sonde "Gen" montrent que les deux embryons contiennent approximativement la même quantité d'ADN, tandis que la sonde "Per' permet d'obtenir un signal différentiable à l'oeil nu entre les deux embryons présumés de sexes différents. The results obtained with the "Gen" probe show that the two embryos contain approximately the same amount of DNA, while the "Per 'probe makes it possible to obtain a signal differentiable with the naked eye between the two alleged embryos of different sexes. .

A - MATERIEL ET METHODES
1) Hobridation de Southern
De 1'ADN est extrait du sang entier tel que décrit par GEORGES et al (réf. 7), puis est dirigé par l'endonucléase Hae III suivant les indications du fabricant.A - MATERIAL AND METHODS
1) Southern Hobridation
DNA is extracted from whole blood as described by GEORGES et al (ref. 7), then is directed by the endonuclease Hae III according to the manufacturer's instructions.

10 pg de l'ADN ainsi digéré sont placés dans un gel d'agarose à 1 z contenant une solution tampon TAE (Tris-acetate 40 mM, EDTA 1 mM), à une tension constante de 3 v/cm pendant 24 heures, avec une recirculation constante de la solution tampon. 10 μg of the DNA thus digested are placed in an agarose gel at 1 z containing a TAE buffer solution (Tris-acetate 40 mM, EDTA 1 mM), at a constant voltage of 3 v / cm for 24 hours, with constant recirculation of the buffer solution.

Les gels sont colorés avec du bromure d'éthidium et photographiés sous lumière ultra-violette, puis ils sont plongés dans NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M pendant deux périodes de 30 minutes, et équilibrés dans de l'acétate d'ammonium 1 M, NaOH 0,03 M, pendant encore deux périodes de 30 minutes. Les gels sont ensuite transférés sur des membranes de nitrocellulose (Schleicher et Schuell, BA 85) pendant la nuit, en utilisant la même solution comme milieu de transfert. The gels are stained with ethidium bromide and photographed under ultraviolet light, then they are immersed in 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl for two periods of 30 minutes, and equilibrated in acetate. 1 M ammonium, 0.03 M NaOH, for two more 30 minute periods. The gels are then transferred to nitrocellulose membranes (Schleicher and Schuell, BA 85) overnight, using the same solution as the transfer medium.

Après le transfert, les filtres sont lavés dans une solution 3 x ssc puis ils sont cuits à 80"C pendant deux heures.After the transfer, the filters are washed in a 3 x ssc solution and then they are cooked at 80 "C for two hours.

1 pg du clone de souris pSP64.2.5EI (réf. 4), homologue en partie au gène Per de Drosophile, est marqué avec l'isotope 32 radioactif du phosphore par la méthode décrite par FEINBERG et al (réf. 8), à des activités spécifiques variant de 0,5 x 109 à 1 x 109 cpm/pg. 1 pg of the mouse clone pSP64.2.5EI (ref. 4), partially homologous to the Drosophila Per gene, is labeled with the radioactive isotope 32 of phosphorus by the method described by FEINBERG et al (ref. 8), specific activities varying from 0.5 x 109 to 1 x 109 cpm / pg.

Les filtres sont préhybridés pendant au.moins deux heures à 42*C dans du formamide 35 2, 6 x ssc, EDTA 5 mM, du lait en poudre écrêmé à 0,25 %, et hybridés ensuite pendant au moins 12 heures à 42-C après addition de la sonde à une concentration finale d'environ 5 x 105 cpm/ml. The filters are prehybridized for at least two hours at 42 ° C in formamide 35 2, 6 x ssc, EDTA 5 mM, skimmed milk powder at 0.25%, and then hybridized for at least 12 hours at 42- C after addition of the probe to a final concentration of approximately 5 x 105 cpm / ml.

Les filtres sont lavés pendant 1 heure à 65"C dans 2 x ssc, 0,1 8 SDS et autoradiographiés à -80-C avec des écrans intensifiants. The filters are washed for 1 hour at 65 "C in 2 x ssc, 0.1 8 SDS and autoradiographed at -80-C with intensifying screens.

2) Hybridation Dot Blot
Une feuille de nitrocellulose est immergée dans l'eau, transférée sur du papier Whatman 3MM et transférée pendant 30 minutes dans une solution 20 x ssc. Le filtre est séché à la température ambiante.2) Dot Blot Hybridization
A nitrocellulose sheet is immersed in water, transferred to Whatman 3MM paper and transferred for 30 minutes in a 20 x ssc solution. The filter is dried at room temperature.

Des quantités variables d'ADN génomique bovin (de 1 ijg à 1 mg) sont appliquées sur le filtre sous la forme d'échantillons de 1 pl dans un tampon TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, pH 8). Varying amounts of bovine genomic DNA (1 µg to 1 mg) are applied to the filter as 1 µl samples in TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA, pH 8 ).

Les échantillons sont mis à sécher à la température ambiante. The samples are allowed to dry at room temperature.

L'ADN est dénaturé en plaçant le filtre pendant 5 minutes sur une feuille de papier Whatman 3 MM saturée avec NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M. The DNA is denatured by placing the filter for 5 minutes on a sheet of Whatman 3 MM paper saturated with 1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH.

Ensuite, le filtre est transféré pendant 30 secondes sur un papier Whatman 3 MM saturé avec du Tris-HCl 0,5 M, pH 7,4, puis sur un papier Whatman 3 MM saturé avec NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 7,4 pendant 5 minutes. Then, the filter is transferred for 30 seconds to Whatman 3 MM paper saturated with 0.5 M Tris-HCl, pH 7.4, then to Whatman 3 MM paper saturated with 1.5 M NaCl, Tris-HCl 0 , 5 M, pH 7.4 for 5 minutes.

Le filtre est mis à sécher à l'air et cuit à 80*C pendant 2 heures. The filter is put to air dry and baked at 80 ° C for 2 hours.

Les conditions de préhybridation, d'hybridation et de lavage sont identiques à celles décrites en 9) ci-dessus. The prehybridization, hybridization and washing conditions are identical to those described in 9) above.

Afin de permettre une normalisation du signal obtenu avec la sonde de l'invention, des doubles des filtres sont mis à hybrider dans les mêmes conditions avec 500 ng d'ADN génomique bovin, marqué radioactivemént avec l'isotope 32 du phosphore par la méthode référencée ci-dessus (réf. 8). In order to allow normalization of the signal obtained with the probe of the invention, duplicates of the filters are put to hybridize under the same conditions with 500 ng of bovine genomic DNA, radioactively labeled with the isotope of phosphorus by the method referenced above (ref. 8).

Le lavage est réalisé dans les mêmes conditions que précédemment. Les signaux obtenus avec cette procédure ont mis en évidence les quantités relatives d'ADN présent sur le filtre. Washing is carried out under the same conditions as above. The signals obtained with this procedure highlighted the relative amounts of DNA present on the filter.

3) Hybridation Dot Blot d'embrvons
Des cellules d'embryons de bovin au stade morula et des blastocystes sont séparés de la zona pellucida par des passages répétés à travers un tube capillaire.3) Kiss Blot Dot Blot Hybridization
Cattle embryo cells in the morula stage and blastocysts are separated from the shingles pellucida by repeated passages through a capillary tube.

Les cellules embryonnaires sont appliquées sous la forme d'une goutte sur un filtre de nitrocellu lose traité au préalable tel que décrit en 2) ci-dessus. The embryonic cells are applied in the form of a drop on a nitrocelluose filter treated beforehand as described in 2) above.

L'hybridation et le lavage sont réalisés de la meme façon que décrite en 2) ci-dessus. Hybridization and washing are carried out in the same way as described in 2) above.

B - RESULTATS
Dans la publication de GEORGES et al (réf. 6), il a été montré que la sonde pSP64.2.5EI était capable de reconnaitre une famille de régions mini-satellites dans le génome humain.B - RESULTS
In the publication by GEORGES et al (ref. 6), it was shown that the pSP64.2.5EI probe was able to recognize a family of mini-satellite regions in the human genome.

Lorsque des tâches d'ADN de vache sont mises à hybrider avec la sonde de l'invention selon la méthode de Southern, des empreintes (de l'anglais "fingerprints") d'ADN similaires sont obtenues. When cow DNA spots are hybridized with the probe of the invention according to the Southern method, fingerprints (of the English "fingerprints") of similar DNA are obtained.

Cependant, la majeure partie du signal d'hybridation obtenu avec de l'ADN provenant de taureau est obscurcie par un signal très intense.. Le signal spécifique du génome male montre également un haut degré de polymorphisme et est transmis fidèlement, à partir d'un taureau, à toute sa descendance de sexe mâle, comme le montre la figure 2. However, most of the hybridization signal obtained with DNA from bulls is obscured by a very intense signal. The specific signal from the male genome also shows a high degree of polymorphism and is transmitted faithfully from a bull, with all its male descendants, as shown in Figure 2.

Ces résultats peuvent etre interprétés comme résultant de la présence sur le chromosome Y bovin d'une séquence hautement répétitive, présentant une homologie avec la séquence mini-satellite du gène Per de
Drosophile. Cette séquence est probablement une région mini-satellite (réf. 9) comportant un grand nombre de séquences répétées en tandem, soit de façon groupée, soit de façon dispersée le long du chromosome Y.These results can be interpreted as resulting from the presence on the bovine Y chromosome of a highly repetitive sequence, exhibiting homology with the mini-satellite sequence of the Per gene.
Drosophila. This sequence is probably a mini-satellite region (ref. 9) comprising a large number of sequences repeated in tandem, either grouped or dispersed along the Y chromosome.

Dans les expériences d'hybridation de Dot
Blot, un rapport d'intensité d'environ 10 entre un signal mâle et un signal femelle a été observé, permettant de faire une distinction claire entre les deux sexes (figure 3). La fréquence de répétition des séquences explorées sur le chromosome Y est suffisante pour obtenir un signal distinctif avec de très faibles quantités d'ADN. In Dot's hybridization experiments
Blot, an intensity ratio of about 10 between a male signal and a female signal was observed, allowing a clear distinction to be made between the two sexes (Figure 3). The frequency of repetition of the sequences explored on the Y chromosome is sufficient to obtain a distinctive signal with very small amounts of DNA.

La figure 4 montre en effet que les expériences réalisées avec des cellules embryonnaires au stade morula et la sonde de l'invention marquée radioativement (109 cpm/pg) permettent d'obtenir un signal clair et distinctif pour un échantillon de sexe mâle avec moins de t ng d'ADN (environ 100 cellules, 7 pg d'ADN par cellule). FIG. 4 indeed shows that the experiments carried out with embryonic cells at the morula stage and the radioactive labeled probe of the invention (109 cpm / pg) make it possible to obtain a clear and distinctive signal for a sample of male sex with less than t ng of DNA (approximately 100 cells, 7 pg of DNA per cell).

La possibilité de détecter une séquence minisatellite spécifique du chromosome Y en utilisant la sonde de l'invention, rend possible le développement de méthodes pour la détermination du sexe d'embryons de -préimplantation. The possibility of detecting a minisatellite sequence specific for the Y chromosome using the probe of the invention makes it possible to develop methods for determining the sex of pre-implantation embryos.

De telles procédures, réalisées sur des biopsies d'embryons, peuvent notamment reposer sur des expériences d'hybridations in situ, d'hybridations sur filtre, sur des expériences utilisant la réaction en chaîne de polymérase (réaction RCP) ou toute combinaison de ces méthodes. Such procedures, performed on embryo biopsies, can in particular be based on in situ hybridization experiments, filter hybridizations, on experiments using the polymerase chain reaction (RCP reaction) or any combination of these methods. .

Comme il a déjà été dit et ainsi qu'il résulte de ce qui précède, l'invention ne se limite pas aux exemples de réalisation particuliers qui ont été décrits, mais en embrasse au contraire toute les variantes. As has already been said and as follows from the foregoing, the invention is not limited to the particular embodiments which have been described, but on the contrary embraces all variants thereof.

REFERENCES 1 - ANDERSON, G.B., 1986
identification du sexe dans des embryons de mammifè
res.REFERENCES 1 - ANDERSON, GB, 1986
identification of sex in mammalian embryos
res.

(Identification of sex in mammalian embryos). (Identification of sex in mammalian embryos).

Dans Genetic engineering of animals. An agricultural
perspective.In Genetic engineering of animals. An agricultural
perspective.

Ed. Warren Evans and Alexander Hollaender, Plenum. Ed. Warren Evans and Alexander Hollaender, Plenum.

2 - WEST, J.D., GOSDEN, J.R., ANGELL, R.R., HASTIE,
N.B., THATCHER, S.S., GLASIER, A.F., DAIRD, D.T.,
1987
Détermination du sexe d'un pré-embryon humain par
hybridation in situ d'ADN-ADN.2 - WEST, JD, GOSDEN, JR, ANGELL, RR, HASTIE,
NB, THATCHER, SS, GLASIER, AF, DAIRD, DT,
1987
Sex determination of a human pre-embryo by
in situ DNA-DNA hybridization.

(Sexing the human pre-embryo by DNA-DNA in -situ
hydridization).(Sexing the human pre-embryo by DNA-DNA in -situ
hydridization).

Lancet, 1, (8546) , 1345-1346. Lancet, 1, (8546), 1345-1346.

3 - JEFFREYS, A.J., 1985
Régions mini-satellites hypervariables dans l'ADN
humain.3 - JEFFREYS, AJ, 1985
Hypervariable mini-satellite regions in DNA
human.

(Hypervariable minisatellite regions in human DNA). (Hypervariable minisatellite regions in human DNA).

Nature, vol. 314, (7 mars 1985) 4 - SHIN, H.S., BARGIELLO, T.A., CLARK, B.T., JACKSON,
F.R., YOUNG, N.W., 1985
Une séquence codante non usuelle isolée à partir du
gène périodique de Drosophile est conservée chez les
vertébrés.Nature, vol. 314, (March 7, 1985) 4 - SHIN, HS, BARGIELLO, TA, CLARK, BT, JACKSON,
FR, YOUNG, NW, 1985
An unconventional coding sequence isolated from the
periodic Drosophila gene is conserved in
vertebrates.

(An unusual coding sequence from a Drosophila dock
gene is conserved in vertebrates).(An unusual coding sequence from a Drosophila dock
gene is conserved in vertebrates).

Nature, 317, 445-448. Nature, 317, 445-448.

5 - YU, Q., COLOT, H.V., KYRIACOU, C.P., HALL, J.C.,
ROSBACH, M., 1987
Modification du comportement par mutagénèse in vitro
d'une région variable à l'intérieur du gène périodi
que de Drosophile. 5 - YU, Q., COLOT, HV, KYRIACOU, CP, HALL, JC,
ROSBACH, M., 1987
Behavior modification by in vitro mutagenesis
of a variable region within the periodi gene
than Drosophila.

(Behaviour modification by in vitro mutagenesis of a
variable region within the period gene of Drosophi
la).(Behavior modification by in vitro mutagenesis of a
variable region within the period gene of Drosophi
the).

Nature, 326, 765-769. Nature, 326, 765-769.

6 - GEORGES, M., COCHAUX, p., LEQUARRE, A.S., YOUNG,
M.W., VASSART, G., 1987b
Détermination 'd'empreintes" d'ADN chez l'homme en
utilisant une sonde de souris présentant en partie
une similitude avec le gène "Por" de Drosophile.6 - GEORGES, M., COCHAUX, p., LEQUARRE, AS, YOUNG,
MW, VASSART, G., 1987b
Determination of DNA fingerprints in humans by
using a mouse probe partially showing
similarity to the Drosophila "Por" gene.

(DNA fingerprinting in man using a mouse probe
related to part of the Drosophila "Per" gene).(DNA fingerprinting in man using a mouse probe
related to part of the Drosophila "Per" gene).

Nucleic Acids Research, 15 , (17), 7193. Nucleic Acids Research, 15, (17), 7193.

7 - GEORGES, M., LEQUARRE, A.S., HANSET, R., VASSART,
G., 1987a
Variation génétique du gene de la thyroglobuline
étudiée au niveau de l'ADN.7 - GEORGES, M., LEQUARRE, AS, HANSET, R., VASSART,
G., 1987a
Genetic variation of the thyroglobulin gene
studied at the DNA level.

(Genetic variation of the bovine thyroglobulin gene
studied at the DNA level).(Genetic variation of the bovine thyroglobulin gene
studied at the DNA level).

Animal Genetics 18, 41-50. Animal Genetics 18, 41-50.

8 - FEINBERG, A.P., VOLGESTEIN , B., 1983
Une méthode pour marquer radioactivement des frag
ments d'endonucléases de restriction à une activité
spécifique.8 - FEINBERG, AP, VOLGESTEIN, B., 1983
A method for radioactively marking frags
activity restriction endonucleases
specific.

(A technique for radiolabelling DNA restriction
endonuclease fragments to high specific activity.(A technique for radiolabelling DNA restriction
endonuclease fragments to high specific activity.

Analytical biochemistry, 132, 6-13). Analytical biochemistry, 132, 6-13).

9 - NAKAMURA, Y., JULIER, C., WOLFF, R., HOLM, T.,
O'CONNELL, P., LEPPERT, M., WHITE, R., 1987
Caractérisation d'une séquence "midi-satellite" hu
maine.9 - NAKAMURA, Y., JULIER, C., WOLFF, R., HOLM, T.,
O'CONNELL, P., LEPPERT, M., WHITE, R., 1987
Characterization of a "midi-satellite" sequence hu
Maine.

(Characterization of a human "midisetellite"
sequence).(Characterization of a human "midisetellite"
sequence).

Nucleic Acids Research 15(6 > , 2537-2547. Nucleic Acids Research 15 (6>, 2537-2547.

10- JOHNSON, D.A., 1984
Gene. Anal. Techn. 3-5. 10- JOHNSON, DA, 1984
Uncomfortable. Anal. Techn. 3-5.

11- SOUTHERN, E.M., 1975
Detection of specific sequences among DNA fragments
separated by gel electrophoresis
J. Mol. Biol., 98, 503-547, 12- MASON, P.J., WILLIAMS, J.G.11- SOUTHERN, EM, 1975
Detection of specific sequences among DNA fragments
separated by gel electrophoresis
J. Mol. Biol., 98, 503-547, 12- MASON, PJ, WILLIAMS, JG

in "Nucleic Acid Hybridization: a practical
approach"
B.D. Hames and S.J. Higgins editors - IRL Pess
OXFORD - WASINGTON in "Nucleic Acid Hybridization: a practical
approach "
BD Hames and SJ Higgins editors - IRL Pess
OXFORD - WASINGTON

Claims

1. Method for determining the sex of ruminant embryos by hybridization between a DNA sample from an embryo and a probe characterized in that it comprises a plurality, in particular from 2 to several hundred, preferably of the order of the size of a hundred units, either of the ANGON type in which N represents any one of the 4 nucleotides thymine (or uracil), guanine, adenine and cytosine, either of the TCACGC type, or of both types at the same time, - either -the nucleotide sequence complementary to the previous one, the contacting being adjusted so as to allow the production of an image comprising or not a specific characteristic element reflecting the presence of chromosane Y in the sample, - detection in the image produced of the presence or absence of said characteristic element.

2. Method according to claim 1, characterized in that the ACNGGN units are ACAGGC units.

3. Method according to claim 1 or claim 2, characterized in that the probe contains sequences containing repeating units of the type either (ACNGGN) m, or of the type (TCAGGC) n, or both at the same time, with m and n varying respectively from 2 to several hundred, in particular up to orders of magnitude of the hundred.

4. Method according to any one of claims I to 3, characterized in that it comprises the following steps - the fixing of the biological sample on an appropriate support, the DNA of said sample being made accessible for subsequent hybridization, so as to make it possible to obtain a hybridization band, - carrying out a pre-hybridization of said biological sample obtained in the previous step, so as to reduce the non-specific adoption of the probe on the support, bringing said biological sample obtained in the previous step into contact with said nucleotide probe, contacting being carried out in a medium and under conditions suitable for allowing hybridization of the probe with the biological sample, - washing of the support containing the hybrids formed, - the detection of a specific visual signal of the Y chromosome.

5. Method according to any one of claims 1 4, characterized in that the biological sample consists of a DNA fragment, an entire embryo or embryonic cells.

6. Method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the biological sample is denatured and fixed on one. support, in particular on a sheet of nitrocellulose, of cellulose, a paper filter, a sheet of glass fibers, a polyamide filter of the NYLO type.

7. Method according to any one of claims 4 to 6, characterized in that the prehybridization medium preferably comprises 6 x ssc, 5 mM EDTA, formamide at 35, skimmed milk powder at 0.25%.

8. Method according to any one of claims 4 to 7, characterized in that the pre-hybridization temperature is preferably 42-C.

9. Method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the hybridization is carried out for a time preferably ranging from 1 hour to 48 hours.

10. Method according to claim 9, characterized in that the hybridization medium preferably comprises 6 x ssc, 5 mM EDTA, 35% formamide, skimmed milk powder at 0.25 k.

t1. Method according to claim 9 or 10, characterized in that the hybridization is carried out at a temperature preferably of 42 ° C.

12. Method according to any one of claims 2 to 10, characterized in that the washing of the supports containing the hybrids formed is carried out in a medium preferably comprising 2 x SSC, 0.1% SDS.

13. The method of claim 12, characterized in that the washing is preferably carried out for a time varying from 120 minutes, at a temperature of 65'C.

14. Method according to any one of claims 1 to 13, characterized in that the detection means include autoradiography, gamma counting, liquid lascintigraphy.

15. Method according to any one of claims 1 to 14, characterized in that the visual signal characteristic of the presence of the Y chromosome consists of an intense signal obscuring the major part of the hybridization track obtained when the hybridization is of the type Southern.

16. Method according to any one of claims I to 14, characterized in that the characteristic visual signal of the presence of a Y chromosome consists of an intense signal surrounding the hybridization tasks obtained when the hybridization is of the dot type. -blot.

17. Method according to any one of claims 1 to 16, characterized in that the probe comprises the following nucleotide sequence

GAATTCTAGG TAAGTCTGAA CTACAAAG66 AGTTGAAGGC CAGCCTGAGC TACAAAGCAA

GACCCTGTCT CATAAAACAA AAATAAATAA ACTATGGGGC CAATAGAGAT CCAGACAGCA

AGCCTACGGC CTTCCCCACT GTCCATCCTG TAGCTTTCCC CAGTCTGTCA CCTGCTACAC ACTACTGTCT T6CA6AAGGC CTGAGCTSTA TGAACAAGGA TCATGGCTGT 6GTCACATCT

GCAAGGAGGC CCCAAGAGGC AGCGTTGCCT GTGAATGCAG GCCTGGTTTT GAACTGGCCA

AAAACCAGAA AGACTGCATC TGTAAGTATG AACTGTCAAT AAGTGAGGTG GGTACAGCCT ACACAGAGST CAGAAAAACA ACCACGGGCA CAGCCACAGG TATAGCCACA GGTACATGCA

CAGGCACAGG CAGAGTCAAA GCCACAGGCA GAGGCACAGG AACAGACACA GACACAGGCA

CAGTCACAGC CAGAGCCACG GTCACAGCCA GAGTGACAGG CACAGGAACA GGAACAGCCA

CAGTCACAGA GACAGGCACA GCCAAAGTCA CAGACACAGG CACAGGCACA GGCACAGCCA

AAGTCACAGG CACAGCCAAA GTCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGTACA GGCACAGGCA

CAGGCACAGG TACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGC CAAAGTCACA GGCACAGGCA

CAGACAGA66 CACAGGCACA GGCACAGGCA CA66CACA66 CACAGGCACA 66CACA66CA

CAGGCACAGC CAAAGTCACA GGCACAGCCA AAGTCACAGG CACAGGGACA GGCACAGCCA

AAGTCACAGG CACAGGGACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA

CAGACACA66 CACAGGCACA GCCAAAGTCA CA66CACA66 CACAGGCACA 66TACA66CA

CAGGCACAGG CACAGGTACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGCAAA GTCACAGGCA

CAGGCACAGA CAGAGSCACA 6GCACAG6CA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA

CAGGCACAGG CACAGGCACA GCCAAAGTCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA

CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCT

CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCTCAGG CTCAGGCACA GGCACAGGCA

CAGGCTCAGG CTCAGGCACA GCCAAAGTCA CAGGCACAGC CACAGGCACA GGCACAGGCA

CAGACACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCTCA GGCTCAGGCA

CAGCCAAAGT CACAGGCACA GCCACGACCA CAGCCACAGT CACAGAGACA GGCACAGCCA

AAGTCACAGG CACAGAGACA GGCACAGCCA AAGTCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA

CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA GAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA

CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCTCA GGCTCAGGCA

CAGCCAAAGT CACAGGCACA GACACAGGCA CAGCCAAAGT CACAGGCACA GGCACAGGCA

CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCT

CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCC

TAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCACAGCCA AAGTCACAGG CACAGGCACA GCCAAAGTCA

CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT

CAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCT CAGGCTCAGG CACAGGCACA GGCACAGGCC

TAGGCTCAGG CTCAGGCTCA GGCTCAGGCA CAGGCACAGG CACAGGCACA GGGACAGGCA

CAGGCACAGG CACAGGCACA GGCACAAGCA CAGTCACAGT CAGAGGCACA GGTACAGGCA

CAGCCAGAGC CACAGGCACA GGTACAGGCA CAGGCAGAGG TACAGGTACA GGTACAGGCA

CAGGCACAGG CACAGACACA AGCACAGGCA CAGACAGAGG CACAGGCACA GGCACAGGCA

CAGCTTAGGA ACAAAAGAGC AGCTTGTGGG AATCATTCTT TCCTTCTATT CTATGTGTCC

CGGGGATTTA ACTCAGTTAT AGATGTCTTT ACCCTGTTCT ATCTTACCCG ACCAACCAAT

AAAGCTTTTT TCTTTTTCTT TTCACTAAAT GTTTTTTATT GTCACAGCTT AAATGCTTTT

GTTAGAACAT TTGCATTCCT GTGATCTCAG CACTTAGGAG GTAAAGGGAG GAGCATTGGG

AATTC

18. Method according to any one of claims 1 to 17, characterized in that the probe comprises a DNA fragment from the Drosophila genome, in particular a DNA fragment from the genome comprising the gene

Per of Drosophila.

19. The method of claim 18, characterized in that the probe comprises the 1.3 Kb PstI RACHI fragment of the Drosophila Per gene.

20. Method according to any one of claims 1 to 19, characterized in that the probe comprises a DNA fragment homologous to the Per gene.

Drosophila, in particular the 2.5 kb EcoRI fragment of the mouse clone cp 2.2.

21. Method according to any one of claims 1 to 20, characterized in that the probe is incorporated into a vector, in particular a plasmid or a phage, said vector preferably not comprising sequences capable of entering into competition with the above sequences.

22. Method according to claim 21, characterized in that the probe consists of the plasmid pSP64.2.5EI.

23. Kit or kit for determining the sex of ruminant embryos, in particular bovine, characterized in that it comprises - at least one probe as defined in any one of claims 1 or 17 to 22, - the solutions buffers and compounds necessary for the preparation of hybridization and pre-hybridization media, - optionally a male control DNA used to verify the good conservation and / or the proper functioning of the probe, - optionally suitable means for the detection of hybrids possibly formed and of the specific signal of the Y chromosome.