FR2600671A1 - Method for the cryogenic preservation of organic substances and materials, especially cells - Google Patents

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Abstract

The substance or material, such as cells, is disseminated or dispersed in a suspension either containing a gelling biopolymer, especially collagen, or gelatine, the mixture is cooled so as to initiate gelling and is adjusted to a low temperature, especially from -5 to -40 DEG C. The preservation can last for several months.

Description

Procédé de conservation cryogénique de substances et matières organiques, notamment de cellules.Process for cryogenic preservation of organic substances and materials, especially cells.

La présente invention a trait à un procédé de conservation cryogénique de substances et matières organiques, notamment de cellules, en particulier d'éléments figurés du sang, de gamètes, d'embryons à un stade très précoce et, d'une façon générale, de cellules individuellement isolées ou sous forme d'ensembles à petits nombres de cellules, lesdites cellules pouvant être animales, végétales ou procaryotes. The present invention relates to a method of cryogenic preservation of organic substances and materials, in particular cells, in particular figured elements of blood, gametes, embryos at a very early stage and, in general, cells individually isolated or in the form of assemblies with small numbers of cells, said cells possibly being animal, plant or prokaryotic.

La conservation des cellules vivantes par le froid est un problème mal maitrisé à ce jour. The conservation of living cells in the cold is a problem that has not been fully mastered to date.

On sait conserver certaines cellules telles que des gamètes, notamment des spermatozoides, à très basse température (azote liquide) mais avec des pertes importantes. La conservation d'embryons au niveau des toutes premières divisions cellulaires, destinés à la réimplantation, est également très difficile et s'accompagne d'un taux notable de perte. We know how to keep certain cells such as gametes, especially spermatozoa, at very low temperatures (liquid nitrogen) but with significant losses. The conservation of embryos at the level of the very first cell divisions, intended for reimplantation, is also very difficult and is accompanied by a notable rate of loss.

La conservation d'éléments figurés du sang1 et notamment d'érythrocytes, est encore plus délicate et, actuellement, cette conservation n'est possible que pendant quelques jours ou quelques semaines à température voisine de O-C.  The conservation of figurative elements of the blood1 and in particular of erythrocytes is even more delicate and, currently, this conservation is only possible for a few days or a few weeks at a temperature close to O-C.

Les techniques de conservation au froid profond (azote liquide) de telles matières nécessitent des vitesses de réfrigération extrêmement rapides en présence d'agents cryoprotecteurs, notamment de glycérol, de dimethylsulfoxide, de propane-diol ou d'autres substances similaires, et ne sont applicables qu'à de faibles volumes. Storage techniques in deep cold (liquid nitrogen) of such materials require extremely rapid refrigeration rates in the presence of cryoprotective agents, in particular glycerol, dimethylsulfoxide, propane-diol or other similar substances, and are not applicable only at low volumes.

La présente invention se propose de fournir un procédé de conservation cryogénique de substances et matières organiques, notamment de cellules, qui permette de- conserver, avec un taux de perte particulièrement faible, pouvant même être presque nul, ces substances et matières à des températures suffisamment basses pour autoriser une conservation pendant plusieurs mois, voire davantage , et ceci pratiquement sans altération décelable ou gênante des propriétés intéressantes de ces matières ou substances. The present invention proposes to provide a cryogenic preservation process for organic substances and materials, in particular cells, which makes it possible to conserve, with a particularly low loss rate, which may even be almost zero, these substances and materials at sufficiently high temperatures. low to allow conservation for several months or more, and this practically without detectable or annoying alteration of the interesting properties of these materials or substances.

Un autre objectif de l'invention est de permettre de refroidir et conserver de grands volumes de ces matières sans recourir à des vitesses de refroidissement particulièrement importantes. Another objective of the invention is to make it possible to cool and conserve large volumes of these materials without resorting to particularly high cooling rates.

Un autre objectif de l'invention est de fournir un tel procédé qui soit simple à mettre en oeuvre et, de ce fait, soit susceptible d'une diffusion importante avec des moyens relativement peu élaborés. Another objective of the invention is to provide such a method which is simple to implement and, therefore, is capable of being widely disseminated with relatively poorly developed means.

Un objectif particulier de l'invention est de fournir un procédé permettant la conservation cryogénique d'éléments figurés du sang tels que globules blancs, plaquettes et surtout érythrocytes, pendant une durée de plusieurs mois, et le réchauffage et la récupération de ces cellules sous forme utilisable, par une simple opération de lavage. A particular objective of the invention is to provide a process allowing the cryogenic preservation of figured elements of the blood such as white blood cells, platelets and especially erythrocytes, for a period of several months, and the heating and the recovery of these cells in the form usable, by a simple washing operation.

L'invention a pour objet un procédé de conservation cryogénique de substances et matières organiques, notamment de cellules, caractérisé en ce que l'on dissémine ou disperse la substance ou matière dans une solution ou suspension contenant un biopolymère gélifiant tel qu'un collagène, ou un collagène modifié, ou un produit de dégradation du collagène, tel que de la gélatine, et que l'on refroidit l'ensemble pour provoquer la gélification jusqu'à une température basse, par exemple de l'ordre de -5.C à -40-C.  The subject of the invention is a method for cryogenic preservation of organic substances and materials, in particular cells, characterized in that the substance or material is disseminated or dispersed in a solution or suspension containing a gelling biopolymer such as a collagen, or a modified collagen, or a product of degradation of collagen, such as gelatin, and which the whole is cooled to cause gelation to a low temperature, for example of the order of -5.C at -40-C.

La concentration en biopolymère gélifiant avant adjonction de la matière à conserver est, de préférence, comprise entre 0,1% et 3% ou plus en poids (g) par volume (1) pour le collagène et de 5% à 30% pour la gélatine. The concentration of gelling biopolymer before adding the material to be preserved is preferably between 0.1% and 3% or more by weight (g) by volume (1) for collagen and from 5% to 30% for gelatin.

Le pH du milieu est avantageusement physiologique, et généralement compris entre 6 et 8. The pH of the medium is advantageously physiological, and generally between 6 and 8.

Dans un mode de mise en oeuvre particulièrement préféré, le gel peut contenir un ose ou un polyose ayant tendance à former une solution très visqueuse et dont le point isoélectrique est relativement neutre. Le sucre préféré est le saccharose, d'autres sucres pouvant être, par exemple, le mannitol. In a particularly preferred embodiment, the gel may contain a ose or a polyose which tends to form a very viscous solution and the isoelectric point of which is relatively neutral. The preferred sugar is sucrose, other sugars being, for example, mannitol.

La concentration de ce sucre est de préférence d'environ 30% ou plus. The concentration of this sugar is preferably about 30% or more.

Lorsque l'on souhaite conserver des substances destinées à être ensuite administrées à l'homme, notamment par voie parentérale, par exemple intraveineuse, on peut avantageusement réaliser la conservation dans un gel de collagène humain, tel que par exemple un gel de collagène placentaire, de préférence hémocompatible enrichi en type
IV, ou de collagène modifié chimiquement pour en supprimer les propriétés agrégantes, ou de gélatine d'origine animale ou humaine.When it is desired to preserve substances intended to be subsequently administered to humans, in particular parenterally, for example intravenously, the preservation can advantageously be carried out in a human collagen gel, such as for example a placental collagen gel, preferably hemocompatible enriched in type
IV, or chemically modified collagen to suppress its aggregating properties, or gelatin of animal or human origin.

A titre d'exemple, un gel contenant des éléments organiques, par exemple des globules rouges, comprenant notamment environ 1% de collagène ou 10% de gélatine et environ 30% de saccharose, la phase liquide étant constituée par un tampon neutre physiologique usuel convenable, est tout à fait adapté à la conservation des globules rouges pendant une durée de l'ordre de 3 mois ou plus. By way of example, a gel containing organic elements, for example red blood cells, comprising in particular approximately 1% of collagen or 10% of gelatin and approximately 30% of sucrose, the liquid phase consisting of a suitable usual physiological neutral buffer. , is entirely suitable for the conservation of red blood cells for a period of the order of 3 months or more.

Pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention, on peut mélanger, à température suffisamment élevée, par exemple à une température de 30 à 35-C, les divers constituants, à savoir les matières ou substances notamment cellules ou globules rouges à conserver, la phase liquide telle que le tampon physiologique, le biopolymère gélifiant tel que le collagène ou gélatine, et le saccharose et refroidir l'ensemble. To implement the process according to the invention, it is possible to mix, at a sufficiently high temperature, for example at a temperature of 30 to 35 ° C., the various constituents, namely the materials or substances, in particular cells or red blood cells to be preserved, the liquid phase such as the physiological buffer, the gelling biopolymer such as collagen or gelatin, and the sucrose and cool the whole.

Cependant, dans un mode de mise en oeuvre particulièrement préféré pour les collagènes non fibrillaires ou pour la gélatine, on prépare, à une température supérieure à la température de gélification, de préférence 30 à 35il, une solution ou suspension contenant, dans la phase liquide, le biopolymère gélifiant tel que le collagène ou gélatine, le sucre tel que le saccharose, et l'on injecte dans cette solution ou suspension, une suspension de la matière organique à conserver telles que des cellules, cette dernière suspension étant à une température plus basse, de façon à provoquer, pendant l'injection et la dissémination ou diffusion de ces substances ou matières. organiques, un abaissement de la température de la suspension ou solution à gélifier, ce qui provoque rapidement la gélification, après quoi on passe au refroidissement proprement dit, de préférence lent si le milieu est très visqueux (par exemple de l'ordre de 5*C par minute), ou plus rapide, (par exemple de l'ordre de 50.C par minute) Si le milieu est moins visqueux. However, in a particularly preferred embodiment for non-fibrillar collagens or for gelatin, a solution or suspension containing, in the liquid phase, is prepared at a temperature above the gelation temperature, preferably 30 to 35 μl. , the gelling biopolymer such as collagen or gelatin, sugar such as sucrose, and is injected into this solution or suspension, a suspension of the organic material to be preserved such as cells, the latter suspension being at a temperature more low, so as to cause, during the injection and the dissemination or diffusion of these substances or materials. organic, a lowering of the temperature of the suspension or solution to gel, which quickly causes gelation, after which we pass to the actual cooling, preferably slow if the medium is very viscous (for example of the order of 5 * C per minute), or faster (for example of the order of 50.C per minute) If the medium is less viscous.

Pour les collagènes fibrillairess, dont la viscosité augmente avec la température jusque par exemple vers 37-C, on procède tout d'abord à un réchauffage jusqu'à la gélification en masse puis on effectue le refroidissement. For fibrillar collagens, whose viscosity increases with temperature up to, for example, around 37 ° C., first of all heating is carried out until mass gelling is carried out, then cooling is carried out.

Conformément à l'invention, on arrete le refroidissement au-dessus de la température à laquelle le gel peut subir une transition de phase irréversible, notamment par congélation à l'état cristallisé. According to the invention, the cooling is stopped above the temperature at which the gel can undergo an irreversible phase transition, in particular by freezing in the crystallized state.

Lorsque l'on veut récupérer la substance congelée pour l'utiliser, on réchauffe de façon usuelle, sans précaution particulière, le gel contenant la substance jusqu'à provoquer son passage en phase liquide, après quoi on récupère le. éléments désirables par tous moyens usuels tels que filtration, centrifugation et/ou lavage. When the frozen substance is to be recovered for use, the gel containing the substance is heated in the usual way, without any special precautions, until it passes into the liquid phase, after which it is recovered. elements desirable by any usual means such as filtration, centrifugation and / or washing.

Le cas échéant, on peut ajouter au milieu contenant le biopolymère, un solvant organique connu pour provoquer un état de surfusion, tel que par exemple le glycérol ou le dimethylsulfoxyde ou le propane-diol. Avec les agents quI', comme le propane-diol, exercent un effet sur la structure du collagène, il est indiqué d'augmenter la concentration en collagène utilisée. Il est ainsi possible d'augmenter encore l'abaissement de température, bien endessous des températures qu'il était possible d'obtenir jusqu à présent, en utilisant des solutions de ces solvants organiques. If necessary, one can add to the medium containing the biopolymer, an organic solvent known to cause a state of supercooling, such as for example glycerol or dimethylsulfoxide or propane-diol. With agents which, like propane-diol, exert an effect on the structure of collagen, it is indicated to increase the concentration of collagen used. It is thus possible to further increase the lowering of temperature, well below the temperatures which have hitherto been possible, by using solutions of these organic solvents.

L'invention est particulièrement indiquée pour la conservation des éléments figurés-du sang tels que les érythrocytes, les différents types de globules blancs, notamment lymphocytes et granulocytes, les plaquettes, les ovocytes, les spermatozoldes, les embryons notamment au stade de la morula, les hybridomes, les souches et lignées cellulaires cultivables (par-exemples cellules humaines MRC 5 et VERO (de singe)), les parasites monocellulaires, les levures et les procaryotes. The invention is particularly indicated for the conservation of the figured elements of blood such as erythrocytes, the various types of white blood cells, in particular lymphocytes and granulocytes, platelets, oocytes, sperm, embryos in particular at the stage of the morula, hybridomas, cultivable strains and cell lines (for example human cells MRC 5 and VERO (monkey)), single-cell parasites, yeasts and prokaryotes.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description suivante, faite à titre d'exemple non limitatif.  Other advantages and characteristics of the invention will appear on reading the following description, given by way of nonlimiting example.

ExemPle 1. EXAMPLE 1.

On prépare une solution de 5 à 7% (en poids) de gélatine dans un tampon phosphate ou acétate à pH 7,0, à une température de 40il, que l'on ramène ensuite à 30vC
On prépare d'autre part un culot d'érythrocytes frais, à une température de 4*C-. A solution of 5 to 7% (by weight) of gelatin is prepared in a phosphate or acetate buffer at pH 7.0, at a temperature of 40 μl, which is then brought back to 30 vC
On the other hand, a fresh erythrocyte pellet is prepared at a temperature of 4 * C-.

A l'aide d'une seringue, on injecte rapidement dans le milieu liquide contenant la gélatine, la suspension de cellules à raison de 1 ml de culot de globules rouges pour 2 ml de solution de gélatine. Les globules rouges se dispersent dans le milieu et la température descend à 20-C alors que se produit la gélification. Using a syringe, the cell suspension is rapidly injected into the liquid medium containing the gelatin at the rate of 1 ml of red blood cell pellet for 2 ml of gelatin solution. The red blood cells disperse in the medium and the temperature drops to 20-C while gelation occurs.

On effectue ensuite un refroidissement lent à une vitesse de 5.C par minute. Slow cooling is then carried out at a speed of 5.C per minute.

Le gel amorphe, vitreux, reste stable jusqu'à environ -10.C. La stabilité est très grande entre O et -8'C.  The amorphous, glassy gel remains stable until around -10.C. The stability is very high between 0 and -8'C.

On conserve un tel gel refroidi de -6-C à -8-C pendant deux mois. Such a gel is kept cooled from -6-C to -8-C for two months.

Après quoi on réchauffe le gel à 30ru, on récupère les érythrocytes par centrifugation, et les érythrocytes sont lavés en tampon physiologique. After which the gel is warmed to 30 ru, the erythrocytes are recovered by centrifugation, and the erythrocytes are washed in physiological buffer.

Les érythrocytes n'ont subi aucune hémolyse et présentent un aspect normal. The erythrocytes have not undergone any hemolysis and have a normal appearance.

ExemPle 2. EXAMPLE 2.

On répète l'exemple 1 mais en ajoutant au milieu initial du saccharose jusqu'à une concentration finale de 30% en poids. Le gel peut etre refroidi sans inconvénient jusqu'à -20'C. Il reste très stable entre -10 et -15.C et peut facilement assurer la bonne conservation des globules rouges pendant au moins 3 mois. Example 1 is repeated, but adding sucrose to the initial medium until a final concentration of 30% by weight. The gel can be cooled without inconvenience to -20 ° C. It remains very stable between -10 and -15 ° C and can easily ensure the good conservation of red blood cells for at least 3 months.

Le saccharose reste pris dans le gel et ne pénètre pratiquement pas dans les globules, qui n'ont donc pas à être traités spécialement pour l'élimination du saccharose, lors de la décongélation et de la récupération.  The sucrose remains trapped in the gel and practically does not penetrate into the globules, which therefore do not have to be treated specially for the elimination of the sucrose, during thawing and recovery.

Exemple 3. Example 3.

On répète l'exemple 2 mais en ajoutant au milieu initial du glycérol, à une concentration finale de 30% en volume. Example 2 is repeated, but adding glycerol to the initial medium, to a final concentration of 30% by volume.

Le refroidissement est effectué à une vitesse de 5iC par minute jusqu'à -40-C. Sa stabilité est très grande à une température comprise entre -22 et -30iC.  Cooling is carried out at a speed of 5 ° C. per minute down to -40 ° C. Its stability is very high at a temperature between -22 and -30iC.

Le glycérol qui se trouve ainsi pris dans le réseau polymérique gélifié, osmotiquement inactif r ne diffuse pratiquement pas dans les érythrocytes. Lorsque ceux-ci sont récupérés après réchauffage, ils présentent un aspect normal. The glycerol which is thus taken up in the gelled, osmotically inactive polymeric network r hardly diffuses in the erythrocytes. When these are recovered after reheating, they have a normal appearance.

ExemPle 4. EXAMPLE 4.

On prépare une solution de collagène placentaire humain type I +III dans le même tampon à 10vC à pH 7 pour obtenir une concentration de 0,5% (en poids/volume) de collagène. On ajoute un volume équivalent de culot de globules rouges à température ambiante. On porte à 37-C, provoquant la gélification et on refroidit jusqu'à -15-C. Les résultats sont identiques à ceux de l'exemple 1. A solution of human placental collagen type I + III is prepared in the same buffer at 10vC at pH 7 to obtain a concentration of 0.5% (w / v) of collagen. An equivalent volume of pellet of red blood cells is added at room temperature. It is brought to 37-C, causing gelation and cooled to -15-C. The results are identical to those of Example 1.

Exemple 5. Example 5.

On prépare une solution de collagène humain ou animal de type I dans le même tampon à une température de 40-C à pH 7, pour obtenir une concentration de 3% (en poids/volume) de collagène. A solution of human or animal collagen type I is prepared in the same buffer at a temperature of 40-C at pH 7, to obtain a concentration of 3% (w / v) of collagen.

On répète, avec cette solution, les conditions de l'exemple 1 et on obtient des résultats similaires. The conditions of Example 1 are repeated with this solution and similar results are obtained.

Exemple 6. Example 6.

On répète les conditions de l'exemple 5 avec du collagène de type IV, sans dépasser 30-C, avec des résultats similaires. The conditions of Example 5 are repeated with type IV collagen, without exceeding 30-C, with similar results.

Exemple 7. Example 7.

On répète les conditions de 11 exemple 5 avec du collagène animal ou humain de type I modifié par succinylation. Les résultats sont similaires. The conditions of Example 5 are repeated with animal or human type I collagen modified by succinylation. The results are similar.

Exemple 8.  Example 8.

On répète l'exemple 5 mais en ajoutant au milieu inital du saccharose, dans les conditions de l'exemple 2. On obtient des résultats similaires à ceux de l'exemple 2. Example 5 is repeated, but adding sucrose to the initial medium, under the conditions of Example 2. Results similar to those of Example 2 are obtained.

Exemple 9. Example 9.

On répète l'exemple 6 mais en ajoutant au milieu initial du glycérol, dans les conditions de l'exemple 3, avec des résultats similaires. Example 6 is repeated, but adding glycerol to the initial medium, under the conditions of Example 3, with similar results.

Exemple 10. Example 10.

On reprend les conditions de l'exemple 1 en remplaçant les globules rouges par une suspension de plaquettes. The conditions of Example 1 are repeated, replacing the red blood cells with a suspension of platelets.

Exemple 11. Example 11.

On reprend les conditions de l'exemple 1 en remplaçant les globules rouges par une suspension de globules blancs. The conditions of Example 1 are repeated, replacing the red blood cells with a suspension of white blood cells.

Exemple 12. Example 12.

On répète les conditions de l'exemple 6 en remplaçant les globules rouges par des globules blancs. The conditions of Example 6 are repeated, replacing the red blood cells with white blood cells.

ExemPle 13. EXAMPLE 13.

On répète les conditions de l'exemple 7, mais sans dépasser 30-C, et en remplaçant les globules rouges par des globules blancs.  The conditions of Example 7 are repeated, but without exceeding 30-C, and replacing the red blood cells with white blood cells.

Claims (14)

REVENDICATIONS 1. Procédé de conservation cryogénique de substances et matières organiques, notamment de cellules, caractérisé en ce que l'on dissémine ou disperse la substance ou matière à conserver dans une solution ou suspension contenant un biopolymère gélifiant tel qu'un collagène ou un collagène modifié ou un produit de dégradation de collagène tel que de la gélatine et que l'on refroidit l'ensemble pour provoquer la gélification, jusqu'à une température basse 1. A method of cryogenic preservation of organic substances and materials, especially cells, characterized in that the substance or material to be preserved is disseminated or dispersed in a solution or suspension containing a gelling biopolymer such as a collagen or a modified collagen or a collagen degradation product such as gelatin and which is cooled together to cause gelation, to a low temperature 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'après la gélîfiction, on refroidit le gel jusqu à une température de l'ordre de -5C à -40-C.  2. Method according to claim 1, characterized in that after gelification, the gel is cooled to a temperature of the order of -5C to -40-C. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le gel de biopolymère est à base de collagène. 3. Method according to one of claims 1 and 2, characterized in that the biopolymer gel is based on collagen. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le gel de biopolymère est à base de collagène modifié. 4. Method according to one of claims 1 and 2, characterized in that the biopolymer gel is based on modified collagen. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le gel de hiopolymère est-à base de gélatine. 5. Method according to one of claims 1 and 2, characterized in that the hiopolymer gel is based on gelatin. 6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le gel de biopolymère est à base de collagène de type I, I + III, ou encore IV. 6. Method according to claim 2, characterized in that the biopolymer gel is based on collagen type I, I + III, or even IV. 7. Procédé selon l'une des revendications 3, 4 ou 6, caractérisé en ce que la concentration de collagène est de 0,1 à 3% en poids/volume. 7. Method according to one of claims 3, 4 or 6, characterized in that the collagen concentration is 0.1 to 3% w / v. 8. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la concentration en gélatine est de 5 à 30% en poids/volume. 8. Method according to claim 5, characterized in that the gelatin concentration is 5 to 30% w / v. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le gel contient un sucre, notamment le saccharose. 9. Method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the gel contains a sugar, in particular sucrose. 10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la concentration de sucre est d'environ 30% ou plus. 10. The method of claim 9, characterized in that the sugar concentration is about 30% or more. 11. Procédé selon l'une quelconque -des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le gel contient un solvant organique provoquant un état de surfusion, notamment le glycérol, le propane-diol ou le dimethylsulfoxyde. 11. Method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that the gel contains an organic solvent causing a state of supercooling, in particular glycerol, propane-diol or dimethylsulfoxide. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'on prépare, à une température supérieure à la température de gélification! une phase liquide contenant le biopolymère gélifiant, en ce que l'on disperse la substance ou matière à conserver, à une température plus basse, dans cette phase pour provoquer la gélification, et en ce que l'on procède ensuite au refroidissement. 12. Method according to any one of claims 1 to 11, characterized in that one prepares, at a temperature higher than the gelation temperature! a liquid phase containing the gelling biopolymer, in that the substance or material to be preserved is dispersed, at a lower temperature, in this phase to cause gelation, and in that the cooling is then carried out. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, notamment pour les collagènes fibrillaires, caractérisé en ce que l'on prépare, à une température inférieure à la température de gélification, une phase liquide contenant le biopolymère gélifiant, en ce que l'on disperse la substance ou matière à conserver, que l'on provoque une aumentation de température jusqu'à gélification, puis que l'on procède ensuite au refroidissement. 13. Method according to any one of claims 1 to 11, in particular for fibrillar collagens, characterized in that a liquid phase containing the gelling biopolymer is prepared, at a temperature below the gelling temperature, in that the substance or material to be preserved is dispersed, a temperature rise is brought about until gelling, and then the cooling is carried out. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que les matières ou substances sont des cellules, notamment éléments figurés du sang, gamètes, embryons, hybridomes, souches et lignées cellulaires notamment MRC 5 et VERO, parasites monocellulaires, levures et procaryotes.  14. Method according to any one of claims 1 to 13, characterized in that the materials or substances are cells, in particular figured elements of blood, gametes, embryos, hybridomas, strains and cell lines in particular MRC 5 and VERO, single-cell parasites , yeasts and prokaryotes.
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