FR2597504A1 - Procede de determination de l'activite des dnaases - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE LA DETERMINATION DE L'ACTIVITE DES DNAASES DANS LES LIQUIDES BIOLOGIQUES. ON AJOUTE LE LIQUIDE BIOLOGIQUE A EXAMINER A UN MILIEU DE REACTION COMPOSE D'UNE SOLUTION TAMPON, D'UN SEL SOLUBLE DE MAGNESIUM, D'UN SEL SOLUBLE DE CALCIUM ET D'ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE; ON MAINTIENT LE MELANGE AINSI OBTENU PENDANT UN TEMPS FIXE PREDETERMINE A UNE TEMPERATURE DE 40 A 63C, ON AJOUTE UN SEL SOLUBLE POUR RELARGUER LES PROTEINES, PUIS ON DENATURE LE MELANGE, ON SEPARE LES SUBSTANCES INSOLUBLES ET ON SOUMET LE LIQUIDE RESTANT A UNE MESURE SPECTROPHOTOMETRIQUE A 260NM PAR RAPPORT A UNE SOLUTION DE REFERENCE NON INCUBEE OU QUI CONTIENT EN PLUS UN INHIBITEUR DES DNAASES. LE PROCEDE PEUT ETRE UTILISE POUR DEPISTER NOTAMMENT DES TUMEURS ET DES METASTASES, POUR CONTROLER LE PRONOSTIC D'UN TRAITEMENT DE TUMEURS, POUR SUIVRE L'EVOLUTION CLINIQUE DE MALADES PORTEURS DES TUMEURS TRAITEES OU NON TRAITEES ET POUR CONFIRMER LE DIAGNOSTIC.
Description
La présente invention concerne un procédé de détermination de l'activité du complexe d'enzymes désoxyribonucléique (DNAases) dans les liquides biolo giques, cette détermination trouvant son application notamment au diagnostic du cancer et à l'évaluation de l'efficacité des thérapies appliquées à son traitement.
I1 a été constaté que l'activité des DNAases dans les liquides biologiques est modifiée chez des sujets porteurs de tumeurs malignes (par rapport à cette activité des DNAases chez des sujets sains).
I1 a également été constaté que le traitement des patients cancéreux provoque un changement de l'activité des DNAases dans leurs liquides biologiques, tout au moins lorsque la réaction au traitement est positive.
C'est ainsi qu'on a pu observer que la moyenne d'activité sérique des DNAases chez les patients porteurs de tumeurs malignes est significativement (p < 0,01) plus basse que la moyenne observée chez les personnes saines.
Par ailleurs, lors du traitement thérapeutique de patients cancéreux, on n'observe pas de changement de l'activité sérique des DNAases, dans le cas de tumeurs résistant au traitement, tandis que lorsque la réaction au traitement est positive, on constate une nette diminution de l'activité sérique des DNAases durant les quelques jours qui suivent le début du traitement.
Ces phénomènes sont montrés aux dessins annexés, dans lesquels
- Fig. 1 est la distribution des DNAases alcalines dans le sérum des sujets sains et des patients cancéreux non traités;
- Fig. 2 est le profil d'évolution de l'activité des DNAases alcalines telle que déterminée par le procédé suivant la présente invention chez un patient cancéreux traité par radiothérapie;
- Fig. 3 montre deux courbes analogues pour un patient cancéreux traité par deux traitements successifs de chimiothérapie. Une de ces deux courbes indiquée "55*C" montre l'évolution de l'activité des
DNAases alcalines telle que déterminée par le procédé suivant l'invention. L'autre courbe indiquée "37 C", qui est donnée à titre de comparaison, sera commentée plus loin dans le présent mémoire descriptif.
- Fig. 1 est la distribution des DNAases alcalines dans le sérum des sujets sains et des patients cancéreux non traités;
- Fig. 2 est le profil d'évolution de l'activité des DNAases alcalines telle que déterminée par le procédé suivant la présente invention chez un patient cancéreux traité par radiothérapie;
- Fig. 3 montre deux courbes analogues pour un patient cancéreux traité par deux traitements successifs de chimiothérapie. Une de ces deux courbes indiquée "55*C" montre l'évolution de l'activité des
DNAases alcalines telle que déterminée par le procédé suivant l'invention. L'autre courbe indiquée "37 C", qui est donnée à titre de comparaison, sera commentée plus loin dans le présent mémoire descriptif.
Dans l'exemple illustré par la Fig. 2, le traitement de radiothérapie a couvert une période de 25 jours. On constate d'abord une diminution de l'activité sérique des DNAases jusqu'au troisième jour, ce qui indique une réaction positive au traitement.
Ensuite, on constate une augmentation de l'activité au point de dépasser la valeur d'origine et d'atteindre lEa moyenne observée chez les personnes saines, ce qui indique une rémission totale.
L'exemple illustré par la Fig. 3 concerne un patient cancéreux traité par chimiothérapie. La courbe marquée "55.C1 montre que pendant une première phase de traitement couvrant la première semaine, on constate une diminution de l'activité sérique des DNAases puis, après 30 jours, on constate une importante augmentation de cette activité. Lors d'une seconde phase de traitement chimiothérapique qui couvre la semaine allant du 53ème au 60ème jour, on constate à nouveau une nette diminution de l'activité des DNAases. Puis après le 80ème jour, on constate une nouvelle augmentation de l'activité sérique des DNAases qui atteint la moyenne observée chez les personnes saines, ce qui indique une rémission totale.
Dans le cas d'une réponse immédiate favorable au traitement thérapeutique durant les semaines qui suivent la fin du traitement, l'activité sérique des
DNAases alcalines peut évoluer de trois manières a) l'activité sérique des DNAases augmente au point de dépasser la valeur d'origine et atteint la moyenne observée chez les personnes saines, Cette évolution indique une rémission totale (Fig. 2 et Fig. 3); b) l'augmentation n'atteint pas la moyenne et la rémission observée est considérée comme partielle; c) l'activité des DNAases n'augmente pas dans les semaines qui suivent le traitement et une progression fatale de la tumeur est à craindre.
DNAases alcalines peut évoluer de trois manières a) l'activité sérique des DNAases augmente au point de dépasser la valeur d'origine et atteint la moyenne observée chez les personnes saines, Cette évolution indique une rémission totale (Fig. 2 et Fig. 3); b) l'augmentation n'atteint pas la moyenne et la rémission observée est considérée comme partielle; c) l'activité des DNAases n'augmente pas dans les semaines qui suivent le traitement et une progression fatale de la tumeur est à craindre.
Si on disposait donc d'une méthode fiable et sensible permettant de mesurer l'activité des DNAases, on pourrait dépister l'existence d'une tumeur et vérifier si tel traitement est efficace ou non et, dans l'affirmative, suivre son déroulement et son degré de succès. Les variations d'activité enzymatique qui suivent directement le traitement pourraient donner des indications précieuses pour établir ou corriger la thérapie pour chaque patient individuellement.
Pour qu'une telle méthode de mesure de l'activité des DNAases puisse être efficace, il faudrait qu'elle soit 1) suffisamment sensible pour déterminer de manière probante le niveau d'activité des DNAases chez l'homme, 2) qu'elle soit parfaitement reproductible et 3) qu'elle soit simple au point de pouvoir être utilisée par le personnel habituel d'un laboratoire d'analyse médicale.
Les procédés connus pour la détermination de l'activité des DNAases ne remplissent pas l'ensemble de ces conditions. Deux procédés se distinguent par leur relative simplicité et sont basés sur la mesure de l'extinction spectrophotométrique à 260 nm des polynucléotides solubles en milieu acide libérés par l'hydrolyse du DNA, à savoir a) la méthode de Loiselle et Carrier (Rev. Can. Biol., 22, 341-346 (1963)).
On ajoute 0,5 ml d'un sérum à 'examiner à 0,3 ml d'une solution à 0,4% de DNA (de sperme de saumon) dans 2 ml d'une solution tampon de pH 7,6 (TrisiHC1, 0,05 M) et de 0,1 ml d'une solution de chlorure de magnésium (0,342 M) et de chlorure de calcium (0,0162 M), ensuite on dilue avec une solution de sucrose à 0,35 M pour obtenir 3,6 ml. Après une incubation de 3 heures, à 37 C, on y ajoute 1,2 ml d'acide perchlorique à 25% (ce qui correspond à 4 M), et après 10 minutes, on centrifuge la solution à 2800 g. On mesure l'extinction de la solution à 260 nm.
b) la méthode de Spandidos et al. (Europ. J. Cancer, 16, 1615-1616 (1980)).
On dilue 100)Lg de DNA (de thymus de veau) dans une solution tampon à pH 8 (Tris-HCl). On y ajoute 25 du sérum à examiner, et on maintient la solution pendant 15 minutes à 25C. Ensuite, on y ajoute 2 ml d'acide perchlorique (1,5 M) & 40C et on centrifuge la solution à 3000 g. L'extinction de la solution est mesurée à 260 nm.
Ces deux procédés ne sont malheureusement pas suffisamment sensibles.
Ainsi, pour la méthode de Loiselle et Carrier, malgré un temps d'incubation de 3 heures, un volume important de sérum, une quantité importante de DNA il arrive souvent qu'on ne parvient pas à mettre en évidence l'activité enzymatique.
D'autre part, la méthode de Spandidos utilise une quantité faible de DNA, un volume faible de sérum, pas d'ions ajoutés et l'incubation dure 15 minutes relargage, on peut utiliser tous les sulfates solubles.
Le.. Demandeur a constaté que l'utilisation du sulfate de magnésium représente un avantage supplé dentaire. Du fait que le culot obtenu avec le sulfate de magnésium est plus solide, il est plus facile à manipuler. Ceci pourrait être dû au fait que la Mg++ lie le DNA aux protéines.
Après dénaturation, les substances non solubles seront éliminées du mélange de réaction par une centrifugation à basse vitesse, par exemple à 1000 g.
On mesure de manière connue l'extinction à 260 nm de la solution filtrée et on la compare à une solution de référence. On prépare la solution de référence dans les mêmes conditions opératoires en ajoutant de 1'EDTA avant incubation.
Le procédé de l'invention peut être utilisé pour le dépistage de tumeurs et des métastases, pour contrôler le pronostic d'un traitement de tumeurs, pour suivre l'évolution clinique de malades porteurs des tumeurs traitées ou non traitées, et pour confirmer le diagnostic.
Le procédé de l'invention peut être effectué par le personnel habituel d'un laboratoire d'analyse médicale et il donne des résultats fiables et bien reproductibles.
Pour comparer la technique de l'invention avec les procédés Loiselle et Spandidos connus, on a soumis des échantillons de sérum de cinq personnes saines et quatre patients atteints d'une tumeur aux trois méthodes de détermination de l'activité des DNAases, à savoir celle de Loiselle, celle de Spandidos et celle suivant l'invention. Les conditions opératoires de ce test comparatif sont données dans le tableau récapitulatif suivant.
TABLEAU RECAPITULATIF
Méthode I II III
Loiselle Spandidos méthode
de l'in
vent ion1
Type de DNA utilisé sperme thymus thymus
de de de
saumon veau veau
Quantité de DNA/test 1200 g 100 g 500,eq
Tampon Tris-HCl 0,05 M 0,1 M 0,1 M pH 7,6 8 8
MgC12 342 mM - 5 mM
CaCl2 16,2 mM - 0,25 mM
Vol. de sérum 500 l 25 l 25 l 100 l
Sucrose 0,35 M 700 l-
Vol. final d'incub. 3,6 ml 1 ml 1 ml
Température d'incub. 370C 25 C 55-C
Temps d'incubation 180 min 15 min 60 min
Relargage par sulfate soluble saturé (MgS04) - - 500 l
Acide perchlorique (PCA) 4 M 1,5 M 2,25 M
Volume de PCA 1,2 ml 2 ml 1,5 111
Centrifugation 2800 g 3000 g 1000 g
Le tableau II montre les résultats des mesures spectrophotométriques faites à 260 nm pour les trois méthodes par rapport aux blancs respectifs.
Méthode I II III
Loiselle Spandidos méthode
de l'in
vent ion1
Type de DNA utilisé sperme thymus thymus
de de de
saumon veau veau
Quantité de DNA/test 1200 g 100 g 500,eq
Tampon Tris-HCl 0,05 M 0,1 M 0,1 M pH 7,6 8 8
MgC12 342 mM - 5 mM
CaCl2 16,2 mM - 0,25 mM
Vol. de sérum 500 l 25 l 25 l 100 l
Sucrose 0,35 M 700 l-
Vol. final d'incub. 3,6 ml 1 ml 1 ml
Température d'incub. 370C 25 C 55-C
Temps d'incubation 180 min 15 min 60 min
Relargage par sulfate soluble saturé (MgS04) - - 500 l
Acide perchlorique (PCA) 4 M 1,5 M 2,25 M
Volume de PCA 1,2 ml 2 ml 1,5 111
Centrifugation 2800 g 3000 g 1000 g
Le tableau II montre les résultats des mesures spectrophotométriques faites à 260 nm pour les trois méthodes par rapport aux blancs respectifs.
tude à la température ambiante ou physiologique, en quelques minutes et, en général, ne peuvent supporter les températures au-dessus de 400C. I1 en ressort que la température utilisée pour l'invention est supérieure à la température habituelle. En effet, les températures de réaction du procédé de l'invention se trouvent dans une zone où, normalement, les protéines comme les enzymes, les albumines ou les histones accompagnant le
DNA se dénaturent, de sorte qu'il n'y a plus de réaction biochimique. A cette température élevée, le spécialiste s'attend donc à n'avoir aucune amélioration, mais plutôt une diminution drastique de l'activité.
DNA se dénaturent, de sorte qu'il n'y a plus de réaction biochimique. A cette température élevée, le spécialiste s'attend donc à n'avoir aucune amélioration, mais plutôt une diminution drastique de l'activité.
Mais le Demandeur a découvert que jusque 400C l'activité des DNAases ne subit qu'une légère augmentation avec l'augmentation de la température. L'augmen tation de l'activité s'accentue à 400C et à partir de 45'C, fait un bond qui ne s'explique plus par une activation normale due à une hausse de température, mais par le fait que l'enzyme est liée, au moins partiellement, à une substance complexante, et que ce complexe est scindé ou détruit à partir de 40"C et principalement à partir de 45ex.
A la Fig. 3, la courbe marquée "55 C" montre le profil de l'évolution de l'activité des DNAases alcalines sérique chez un patient cancéreux traité par deux traitements successifs de chimiothérapie, étant entendu que l'activité des DNAases est déterminée par le procédé conforme à l'invention, avec une incubation à 550C pendant une heure. A cette même Fig. 3, la courbe marquée "37*C" a été obtenue en déterminant l'activité des DNAases chez le même patient (et pendant la même période) en utilisant un procédé de détermination similaire, mais avec une incubation à 37ex, toutes les autres conditions étant par ailleurs égales.
En comparant les deux courbes de 11 Fig. 3, on observe que le procédé avec incubation à 550C donne une forte augmentation de l'activité (par rapport à l'incubation à 37-C), ce qui augmente la sensibilité du procédé d'un facteur pouvant aller jusqu'à 30. Avec le procédé & à 55-C, on observe également une très nette variation de cette activité en fonction du traitement administré. Cette dernière information, essentielle pour les applications cliniques de la mesure, ne peut être obtenue que grâce à l'action de la température qui débloque le complexe enzymatique.
Le Demandeur a constaté qu'il est avantageux de conduire cette incubation à une température voisine de 55-C. En effet, à partir de 60in, on peut observer une dénaturation de l'enzyme, qui, à partir de 63in, est si forte que la chute d'activité empêche toute détermination.
Le Demandeur a alors trouvé qu'on peut obtenir une séparation totale de toutes les substances solides du mélange dénaturé et de là une très bonne reproductibilité, si on sépare le mélange de réaction dénaturé par précipitation et une centrifugation à basse vitesse, ce qui permet une utilisation universelle du procédé.
Le procédé de détermination comprend la réaction du liquide biologique avec une quantité déterminée de DNA qui se trouve dans le milieu de réaction et par un maintien de ce milieu de réaction pendant un temps déterminé à une température constante.
Ensuite, on ajoute au mélange un sel soluble dont l'anion est capable d'engendrer un processus de relargage et, on arrête la réaction par l'addition d'une substance dénaturante, qui bloque l'activité enzymatique.
En principe, pour engendrer ce processus de relargage, on peut utiliser tous les sulfates solubles.
Le Demandeur a constaté que l'utilisation du sulfate de magnésium représente un avantage supplémentaire. Du fait que le culot obtenu avec le sulfate de magnésium est plus solide, il est plus facile à manipuler. Ceci pourrait être dû au fait que la Mg++ lie le DNA aux protéines.
Après dénaturation, les substances non solubles seront éliminées du mélange de réaction par une centrifugation à basse vitesse, par exemple à 1000 g.
On mesure de manière connue l'extinction à 260 nm de la solution filtrée et on la compare à une solution de référence. On prépare la solution de référence dans les mêmes conditions opératoires en ajoutant de 1'EDTA avant incubation.
Le procédé de l'invention peut être utilisé pour le dépistage de tumeurs et des métastases, pour contrôler le pronostic a d'un traitement de tumeurs, pour suivre l'évolution clinique de malades porteurs des tumeurs traitées ou non traitées, et pour confirmer le diagnostic.
Le procédé de l'invention peut être effectué par le personnel habituel d'un laboratoire d'analyse médicale et il donne des résultats fiables et bien reproductibles.
Pour comparer la technique de l'invention avec les procédés Loiselle et Spandidos connus, on a soumis des échantillons de sérum de cinq personnes saines et quatre patients atteints d'une tumeur aux trois méthodes de détermination de l'activité des DNAases, à savoir celle de Loiselle, celle de Spandidos et celle suivant l'invention. Les conditions opératoires de ce test comparatif sont données dans le tableau récapitulatif suivant.
TABLEAU RECAPITULATIF
Méthode I II III
Loiselle Spandidos Méthode
de l'in
vent ion"
Type de DNA utilisé sperme thymus thymus
de de de
saumon veau veau
Quantité de DNA/test 1200 g 100 g 500+ g
Tampon Tris-HCl 0,05 M 0,1 M 0,1 M pH 7,6 8 8 MgC12 342 mM - 5 mM
CaCl2 16,2 mM - 0,25 mM
Vol. de sérum 500 g 100 l Sucrose 0,35 M 700 l 1 -
Vol. final d'incub. 3,6 ml 1 ml 1 ml
Température d'incub. 370C 25C 55 C
Temps d'incubation 180 min 15 min 60 min
Relargage par sulfate soluble saturé (MgSO4) - - 500 l
Acide perchlorique (PCA) 4 M 1,5 M 2,25 M
Volume de PCA 1,2 ml 2 ml 1,5 ml
Centrifugation 2800 g 3000 g 1000 g
Le tableau II montre les résultats des mesures spectrophotométriques faites à 260 nm pour les trois méthodes par rapport aux blancs respectifs.
Méthode I II III
Loiselle Spandidos Méthode
de l'in
vent ion"
Type de DNA utilisé sperme thymus thymus
de de de
saumon veau veau
Quantité de DNA/test 1200 g 100 g 500+ g
Tampon Tris-HCl 0,05 M 0,1 M 0,1 M pH 7,6 8 8 MgC12 342 mM - 5 mM
CaCl2 16,2 mM - 0,25 mM
Vol. de sérum 500 g 100 l Sucrose 0,35 M 700 l 1 -
Vol. final d'incub. 3,6 ml 1 ml 1 ml
Température d'incub. 370C 25C 55 C
Temps d'incubation 180 min 15 min 60 min
Relargage par sulfate soluble saturé (MgSO4) - - 500 l
Acide perchlorique (PCA) 4 M 1,5 M 2,25 M
Volume de PCA 1,2 ml 2 ml 1,5 ml
Centrifugation 2800 g 3000 g 1000 g
Le tableau II montre les résultats des mesures spectrophotométriques faites à 260 nm pour les trois méthodes par rapport aux blancs respectifs.
<SEP> LOISELLE <SEP> SPANDIDOS <SEP> METHODE <SEP> SELON
<tb> <SEP> L'INVENTION
<tb> Echantillon <SEP> 370C <SEP> 250C <SEP> 550C
<tb> <SEP> Normal
<tb> <SEP> 1 <SEP> 115 <SEP> -63 <SEP> 1358
<tb> <SEP> 2 <SEP> 80 <SEP> -106 <SEP> 919
<tb> <SEP> 3 <SEP> 92 <SEP> -57 <SEP> 991
<tb> <SEP> 4 <SEP> 37 <SEP> -16 <SEP> 219
<tb> <SEP> 5 <SEP> 55 <SEP> -78 <SEP> 608
<tb> Pathologique
<tb> <SEP> 6 <SEP> 21 <SEP> -144 <SEP> 370
<tb> <SEP> 7 <SEP> ILLIS <SEP> ILLIS <SEP> 120
<tb> <SEP> 8 <SEP> 98 <SEP> -39 <SEP> 1150
<tb> <SEP> 9 <SEP> ILLIS <SEP> ILLIS <SEP> 20
<tb>
<tb> <SEP> L'INVENTION
<tb> Echantillon <SEP> 370C <SEP> 250C <SEP> 550C
<tb> <SEP> Normal
<tb> <SEP> 1 <SEP> 115 <SEP> -63 <SEP> 1358
<tb> <SEP> 2 <SEP> 80 <SEP> -106 <SEP> 919
<tb> <SEP> 3 <SEP> 92 <SEP> -57 <SEP> 991
<tb> <SEP> 4 <SEP> 37 <SEP> -16 <SEP> 219
<tb> <SEP> 5 <SEP> 55 <SEP> -78 <SEP> 608
<tb> Pathologique
<tb> <SEP> 6 <SEP> 21 <SEP> -144 <SEP> 370
<tb> <SEP> 7 <SEP> ILLIS <SEP> ILLIS <SEP> 120
<tb> <SEP> 8 <SEP> 98 <SEP> -39 <SEP> 1150
<tb> <SEP> 9 <SEP> ILLIS <SEP> ILLIS <SEP> 20
<tb>
Les chiffres sont donnés en millièmes de densité optique.
ILLIS - illisible.
Cé tableau montre que la méthode Spandidos ne donne que des résultats négatifs non interprétables.
D'autre part, la diminution de l'activité des DNAases due aux tumeurs chez le patient cancéreux peut être telle qu'elle n'est plus décelable par la méthode trop peu sensible de Loiselle. Quand la mesure d'extinction n'est que de quelques dizaines de millièmes de densité optique au départ et que l'on désire examiner si un traitement est positif par une diminution de la densité optique, cela n'est plus possible avec la méthode
Loiselle, trop peu sensible dès le départ. De plus, dans deux cas pathologiques sur quatre, la lecture était illisible probablement due à l'interférence des substances solides en suspension.Enfin les chiffres dans le tableau étant des moyennes de plusieurs expériences du même échantillon, on a pu constater une divergence de résultats pour les procédés connus et une reproductibilité fiable pour le procédé de l'invention.
Loiselle, trop peu sensible dès le départ. De plus, dans deux cas pathologiques sur quatre, la lecture était illisible probablement due à l'interférence des substances solides en suspension.Enfin les chiffres dans le tableau étant des moyennes de plusieurs expériences du même échantillon, on a pu constater une divergence de résultats pour les procédés connus et une reproductibilité fiable pour le procédé de l'invention.
On constate, en tout cas, que la méthode selon l'invention, à 55il, est nettement plus sensible que celle de Loiselle, la sensibilité étant augmentée d'un facteur qui peut dépasser 50.
Les liquides biologiques susceptibles d'être testés sont notamment le sang, le liquide céphalora chilien, les liquides de ponctions notamment pleurales, péritonéales, etc., le liquide lymphatique, le suc pancréatique et le liquide biliaire, l'urine ou les parties solubles séparées des particules solides d'homogénats de tissu ou de glandes.
Pour la détermination, on utilise avantageusement de 25 à 250ul, de préférence 100 W, de liquide biologique qui sera incubé dans le milieu de réaction préparé au préalable. Le milieu de réaction contient une certaine quantité de DNA dans une solution tampon, qui garde le pH å un degré optimal et à laquelle on ajoute une petite quantité de sel de magnésium (de 0,1 à 50 mM) et de calcium (de 0,01 à 3mM). La quantité de
DNA utilisée se situe avantageusement entre 250 et 750)lu, de préférence à 500 > zg. Cette quantité est si grande que les fluctuations mineures de quantité qui surviennent par une divergence de pesage ou par des matériaux additionnés (par exemple histone) n'occasionnent aucune influence notable ou erreur à la détermination de l'activité.
DNA utilisée se situe avantageusement entre 250 et 750)lu, de préférence à 500 > zg. Cette quantité est si grande que les fluctuations mineures de quantité qui surviennent par une divergence de pesage ou par des matériaux additionnés (par exemple histone) n'occasionnent aucune influence notable ou erreur à la détermination de l'activité.
L'origine de DNA est d'une importance secon daire, même si les DNA de différentes provenances se distinguent d'après leur contenu en substances secondaires et d'après leur degré de polymérisation. La préférence est donnée au substrat DNA hautement polymérisé provenant des thymus de veau.
On peut choisir comme solution tampon une solution dont le pH se situe entre 7 et 9. On préférera utiliser une solution tampon qui se compose de 0,5 à 2 ml d'une solution) de TRIS(tris(hydroxyméthyl)-aminométhane)-HCl d'une concentration de 0,1 M. On dilue dans cette solution tampon de petites quantités de chlorure de magnésium (de préférence pour avoir une concentration comprise entre 3 à 8 mmoles dans le mélange de réaction) et de chlorure de calcium (de préférence pour avoir une concentration comprise entre 0,1 à 0,5 mmole dans le mélange de réaction).
Le mélange de réaction contenant le liquide à incuber est maintenu pendant 45 à 90 minutes à une température de 40 à 630C. Vu que l'activité des enzymes sera mesurée en fonction du temps, il est important de mettre fin à l'activité des enzymes immédiatement après le temps d'incubation. Cela se fait par addition d'une petite quantité (1-3 ml) de substance dénaturante usuelle. De préférence, on utilise une solution d'acide perchlorique de 1-3 M, pour avoir une concentration comprise entre 0,5-2 M dans le mélange de réaction.
Le relargage se fait juste avant la dénatu ration par addition d'une quantité de 100 à 1000 (de préférence 500)li) d'un sulfate soluble. Pour engendrer le processus de relargage, on peut utiliser tous les sulfates solubles, par exemple le sulfate de magnésium, le sulfate de zinc, le sulfate de sodium, le sulfate d'ammonium, etc.
De préférence, on ajoute au mélange de réaction une solution saturée de sulfate de magnésium.
On peut également ajouter au mélange de réaction une solution de sulfate en dessous de la saturation mais, pour assurer une bonne reproductibilité de la méthode de dosage, il importe que la concentration du sulfate dans le mélange final soit au moins de 10 mM.
Les volumes donnés sont recommandés pour des travaux microanalytiques. I1 va de soi que le même procédé de détermination est réalisable de façon macroanalytique avec de plus grandes quantités.
Le test effectué avec le liquide biologique des patients est répété plusieurs fois avant, pendant et après le traitement thérapeutique. La détermination de l'activité des DNAases avant, et pendant le traitement des tumeurs malignes rend possible le contrôle du déroulement et des résultats de la thérapie.
Les exemples suivants illustreront mieux l'invention
EXEMPLE 1.
On ajoute 500rg de DNA (de thymus de veau) à 900)W1 d'une solution tampon à pH 8 (0,1 M TRIS/HC1) contenant 5 mmoles de MgC12 et 0,25 mmole de Cal2.
EXEMPLE 1.
On ajoute 500rg de DNA (de thymus de veau) à 900)W1 d'une solution tampon à pH 8 (0,1 M TRIS/HC1) contenant 5 mmoles de MgC12 et 0,25 mmole de Cal2.
Dans le milieu de réaction, 1009 1 de sérum de sang sera incubé pendant 60 minutes à 55ex. Ensuite, on ajoute 500/cL1 d'une solution saturée de sulfate de magnésium. On dénature le mélange de réaction avec 1,5 ml d'une solution d'acide perchlorique glacée (2,25 M) et après une courte agitation on le laisse reposer dans la glace pendant 30 minutes, ensuite la solution sera centrifugée à 1000 g pendant +20 minutes.
En procédant de la sorte, le mélange dénaturé ne contient plus de substances solides qui dérangeraient la reproductibilité de la mesure d'extinction. La densité optique du liquide restant est mesurée à 260 nm. L'extinction est comparée à une solution de référence préparée avec le même sérum de sang dans les mêmes conditions opératoires, mais avec de 1'EDTA (acide édétique). L'extinction mesurée est 991. Cette extinction est exprimée en millièmes de densité optique; il en est de même dans les exemples suivants.
EXEMPLE 2.
L'exemple 1 est répété avec un autre échantillon de sérum de sang et, après l'incubation, on ajoute dans le milieu de réaction 500)Ll d'une solution saturée de sulfate de zinc. L'extinction mesurée est 821.
L'exemple 1 est répété avec un autre échantillon de sérum de sang et, après l'incubation, on ajoute dans le milieu de réaction 500)Ll d'une solution saturée de sulfate de zinc. L'extinction mesurée est 821.
EXEMPLE 3.
L'exemple 1 est répété avec un autre échantillon de sérum de sang et, après l'incubation, on ajoute dans le milieu de réaction 200Scl d'une solution saturée de sulfate de sodium. L'extinction mesurée est 661.
L'exemple 1 est répété avec un autre échantillon de sérum de sang et, après l'incubation, on ajoute dans le milieu de réaction 200Scl d'une solution saturée de sulfate de sodium. L'extinction mesurée est 661.
EXEMPLE 4.
L'exemple 1 est répété avec un autre échantillon de sérum de sang et, après 11 incubation, on ajoute dans le milieu de réaction 200)li 1 d'une solution saturée de sulfate d'ammonium. L'extinction mesurée est 694.
L'exemple 1 est répété avec un autre échantillon de sérum de sang et, après 11 incubation, on ajoute dans le milieu de réaction 200)li 1 d'une solution saturée de sulfate d'ammonium. L'extinction mesurée est 694.
EXEMPLE 5.
L'exemple 1 est répété avec un autre échantillon de sérum de sang et, après l'incubation, on ajoute dans le milieu de réaction 500 > ul d'une solution saturée de sulfate de magnésium. L'extinction mesurée est 219.
L'exemple 1 est répété avec un autre échantillon de sérum de sang et, après l'incubation, on ajoute dans le milieu de réaction 500 > ul d'une solution saturée de sulfate de magnésium. L'extinction mesurée est 219.
EXEMPLE 6.
L'exemple 5 est répété, mais après l'incubation, on ajoute dans le milieu de réaction 500/ul d'une solution non saturée de sulfate de magnésium. La concentration du sulfate de magnésium dans le mélange obtenu est de 70 mM. L'extinction mesurée est 200.
L'exemple 5 est répété, mais après l'incubation, on ajoute dans le milieu de réaction 500/ul d'une solution non saturée de sulfate de magnésium. La concentration du sulfate de magnésium dans le mélange obtenu est de 70 mM. L'extinction mesurée est 200.
Claims (33)
1.- Procédé de détermination de l'activité des désoxyribonucléases dans des liquides biologiques, par la détermination spectrophotométrique à 260 nm des produits de décomposition de l'acide désoxyribonu- cléique, après incubation pendant un temps déterminé, caractérisé en ce qu'on ajoute le liquide biologique à examiner à un milieu de réaction composé d'une solution tampon, d'acide désoxyribonucléique, d'un sel soluble de magnésium et d'un sel soluble de calcium, qu'on maintient le mélange de réaction ainsi obtenu pendant un temps fixe prédéterminé à une température de 40 à 630c, qu'on ajoute un sel soluble dont l'anion est capable d'engendrer un processus de relargage, qu'on dénature le mélange, qu'on sépare les substances insolubles du mélange de réaction par centrifugation et qu'on soumet le liquide restant à une mesure spectrophotométrique à 260 nm par rapport à une solution de référence non incubée ou contenant en plus un inhibiteur des DNAases.
2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange de réaction est maintenu pendant 45 à 90 minutes à une température de 45 à 63"C.
3.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le mélange de réaction est maintenu pendant 50 à 70 minutes à une température de 55 à 60il.
4.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le sel soluble dont l'anion est capable d'engendrer un processus de relargage est un sulfate.
5.- Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que le sulfate est ajouté au mélange de réaction sous la forme d'une solution saturée.
6.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que la concentration de sulfate dans le mélange de réaction est d'au moins 10 mM.
7.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que le sulfate soluble est le sulfate de magnésium.
8.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que le sulfate soluble est le sulfate de zinc.
9.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que le sulfate soluble est le sulfate de sodium.
10.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que le sulfate soluble est le sulfate d'ammonium.
11.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la séparation des substances insolubles est effectuée par une centrifugation à environ 500 à 5000 g.
12.- Procédé suivant la revendication 11, caractérisé en ce que la centrifugation est effectuée à environ 1000 g.
13.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution tampon a un pH de 7 à 9.
14.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution tampon a un pH 8.
15.- Procédé suivant l'une quelconques des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution tampon consiste en une solution aqueuse de chlorhydrate de tris-(hydroxyméthyl )-aminométhane.
16.- Procédé suivant la revendication 15, caractérisé en ce qu'on utilise 0,5 à 2 ml d'une solution aqueuse à 0,1 M de chlorhydrate de tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane.
17.- Procédé suivant la revendication 16, caractérisé en ce qu'on utilise un échantillon de 25 à 250 l du liquide biologique.
18.- Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce qu'on utilise un échantillon de 100 ,U1 du liquide biologique.
19.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisé en ce qu'on utilise 250 à à 750 g d'acide désoxyribonucléique.
20.- Procédé suivant la revendication 19, caractérisé en ce qu'on utilise 500,gg d'acide désoxyribonucléique.
21.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications 16 à 20, caractérisé en ce qu'on utilise 100 & 1000j d'une solution de sulfate.
22.- Procédé suivant la revendication 21, caractérisé en ce qu'on utilise 500 1 de solution de sulfate.
23.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le sel soluble de magnésium est le chlorure de magnésium et que sa concentration dans le mélange de réaction est de Oil à 50 mM.
24.- Procédé suivant la revendication 23, caractérisé en ce que la concentration du chlorure de magnésium dans le mélange de réaction est de 3 à 8 mM.
25.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le sel soluble de calcium est le chlorure de calcium et que sa concentration dans le mélange de réaction est de 0,01 & 3 mM.
26.- Procédé suivant la revendication 25, caractérisé en ce que la concentration du chlorure de calcium dans le mélange de réaction est de 0,1 & 0,5 mM.
27.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le produit de dénaturation est l'acide perchlorique à une concentration de 1 à 3 M.
28.- Procédé suivant la revendication 27, caractérisé en ce qu'on utilise de 1 à 3 ml de solution d'acide perchlorique et que la concentration de l'acide perchlorique dans le mélange de réaction est comprise entre 0,5 et 2M.
29.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'inhibiteur des DNAases est 4'acide éthylène-bis-(oxy éthylènenitrile)-tétracétique.
30.- Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le liquide biologique est choisi parmi le sang, le liquide céphalorachidien, les liquides de ponctions notamment pleurales, péritonéales, etc., le liquide lymphatique, le suc pancréatique et le liquide biliaire, l'urine et les parties solubles séparées des particules solides d'homogénats de tissu ou de glandes.
31.- Procédé suivant la revendication 30, caractérisé en ce que le liquide biologique est du sérum sanguin.
32.- Utilisation du procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, pour le dépistage de tumeurs et des métastases.
33.- Utilisation du procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 30, pour contrôler le pronostic d'un traitement de tumeurs, pour suivre l'évolution clinique de malades porteurs des tumeurs traitées et non traitées, et confirmer le diagnostic.
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8605635A FR2597504B1 (fr) | 1986-04-18 | 1986-04-18 | Procede de determination de l'activite des dnaases |
| AU64184/86A AU6418486A (en) | 1985-10-25 | 1986-10-17 | Determination of deoxyribonuclease in biological fluid |
| DE1986870155 DE224463T1 (de) | 1985-10-25 | 1986-10-24 | Verfahren zur bestimmung der aktivitaet von dna-asen. |
| ES86870155T ES2000017A4 (es) | 1985-10-25 | 1986-10-24 | Procedimiento de determinacion de la actividad de las dnaasas. |
| EP86870155A EP0224463A1 (fr) | 1985-10-25 | 1986-10-24 | Procédé de détermination de l'activité des DNAases |
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|---|---|---|---|
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| FR2242685A1 (fr) * | 1973-09-04 | 1975-03-28 | Behringwerke Ag |
-
1986
- 1986-04-18 FR FR8605635A patent/FR2597504B1/fr not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2242685A1 (fr) * | 1973-09-04 | 1975-03-28 | Behringwerke Ag |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 86, no. 17, 25 avril 1977, page 157, no. 116483q, Columbus, Ohio, US; L.SNECKIENE et al.: "Determination of the activity of acid nucleases" & METODY BIOKHIM., MATER. S'EZDU BIOKHIM. LIT. SSSR, 2nd 1975, 191-2 * |
| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 94, no. 15, 13 avril 1981, page 10, no. 114161z, Columbus, Ohio, US; H.S.TAPER et al.: "Increase in nuclease activity as a possible means for detecting tumor cell sensitivity to anticancer agents" & CANCER (PHILADELPHIA) 1981, 47(3), 523-9 * |
| H.U.BERGMEYER: "METHODEN DER ENZYMATISCHEN ANALYSE", 3ième édition, vol. 1, 1974, page 475, Verlag Chemie, Weinheim, DE * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2597504B1 (fr) | 1988-07-08 |
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