FR2576107A1 - METHOD OF SEARCHING FOR ANTIBODIES AND EQUIPMENT OR KIT FOR THE IMPLEMENTATION OF THIS METHOD - Google Patents
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Abstract
LA RECHERCHE D'ANTICORPS DE RETROVIRUS, PAR EXEMPLE DE VIRUS DU SIDA, EST EFFECTUEE SUR DES ECHANTILLONS DE SANG EN UTILISANT UN ANTIGENE INSOLUBILISE COMPRENANT DES ANTIGENES RETROVIRAUX LIES A UNE GLOBULINE, LA GLOBULINE ETANT LIEE A UN SUPPORT SOLIDE, ET UNE IMMUNOGLOBULINE CONTENANT UN ANTICORPS SPECIFIQUE DES ANTIGENES RETROVIRAUX ET QUI EST MARQUEE PAR UN TRACEUR REVELATEUR NON RADIOACTIF, LA PHASE LIQUIDE EST ENSUITE SEPAREE DE LA PHASE SOLIDE ET ON DETERMINE LES QUANTITES DE TRACEUR REVELATEUR ASSOCIEES A LA PHASE LIQUIDE ET A LA PHASE SOLIDE.THE SEARCH FOR RETROVIRUS ANTIBODIES, FOR EXAMPLE FROM AIDS VIRUS, IS CARRIED OUT ON BLOOD SAMPLES USING AN INSOLUBILIZED ANTIGEN COMPRISING A RETROVIRAL ANTIGENS BOUND TO GLOBULIN AND A CONTAINING A SOLID SUPPORT. ANTIBODY SPECIFIC TO RETROVIRAL ANTIGENS AND WHICH IS MARKED BY A NON-RADIOACTIVE DEVELOPER, THE LIQUID PHASE IS THEN SEPARATED FROM THE SOLID PHASE AND THE DETERMINANTS OF THE DEVELOPER TRACE ASSOCIATED WITH THE LIQUID PHASE AND THE SOLID PHASE ARE DETERMINED.
Description
Procédé de recherche d'anticorps et équipement ou kitAntibody search method and equipment or kit
pour la mise en oeuvre de ce procédé. for the implementation of this process.
L'invention est relative à un procédé d'analyse pour la recherche d'anticorps de rétrovirus, ainsi qu'à de nouveaux The invention relates to an analytical method for the search for antibodies to retroviruses, as well as to new ones.
isolats viraux utilisables dans ce procédé, et plus spéci- viral isolates usable in this process, and more specifically
fiquement à l'isolation d'un virus lié au virus T-lympho- the isolation of a virus linked to the T-lympho- virus
trope humain et à ses utilisations ainsi qu'à l'utili- human trope and its uses as well as its use
sation d'autres rétrovirus dans l'analyse de sérums pour other retroviruses in the analysis of sera for
déterminer la présence d'anticorps de rétrovirus, en parti- determine the presence of retrovirus antibodies, in particular
culier de ceux associés au syndrome immuno-déficitaire especially those associated with immunodeficiency syndrome
acquis (SIDA).acquired (AIDS).
Il apparaît vraisemblable depuis quelques années que le syndrome immunodéficitaire acquis (SIDA) est provoqué par un agent infectieux. Les symptômes de cette maladie sont limités à certains groupes à risque bien définis It has probably appeared in recent years that acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) is caused by an infectious agent. Symptoms of this disease are limited to certain well-defined risk groups
selon un schéma qui suggère fortement un agent transmis- according to a scheme which strongly suggests a transmitted agent-
sible par contact sexuel ou sanguin. Bien que la maladie ait été détectée initialement aux Etats-Unis d'Amérique, susceptible to sexual or blood contact. Although the disease was first detected in the United States of America,
elle se manifeste de façon croissante dans d'autres ré- it is increasingly manifested in other re-
gions, y compris en Europe.regions, including in Europe.
On pense que l'un des moyens par lesquels la maladie se répand est la transfusion de sang donné par des donneurs qui sont eux-mêmes contaminés par le virus du SIDA. La mise en commun de sang donné implique que si du sang fourni par un donneur porteur du virus du SIDA est mis en commun avec des échantillons de sang provenant d'autres donneurs, la totalité du sang et des autres produits dérivés de ce fond commun peut être contaminée, quelle que soit la taille de l'échantillon. Beaucoup de donneurs de sang porteurs du virus du SIDA sont dans l'ignorance de leur contamination, en particulier dans les phases initiales de celle-ci, et d'autres donneurs contaminés, même s'ils sont conscients de cet état de fait, peuvent ne pas être One of the means by which the disease is spread is believed to be the transfusion of donated blood from donors who are themselves infected with the AIDS virus. Pooling of donated blood means that if blood supplied by a donor carrying the AIDS virus is pooled with blood samples from other donors, all of the blood and other products derived from that pool can be contaminated, regardless of the sample size. Many blood donors with the AIDS virus are unaware of their contamination, especially in the initial stages, and other infected donors, even if they are aware of this fact, may not to be
disposés à révéler soit qu'ils sont atteints par la mala- willing to reveal either that they are affected by the mala-
die, soit qu'ils appartiennent à un groupe à haut risque. die, or that they belong to a high risk group.
Une demande croissante existe donc pour des tests relati- A growing demand therefore exists for relative tests.
vement simples mais entièrement fiables permettant d'effec- Simple but fully reliable, making it possible
tuer sur des échantillons de sang donné aux fins de trans- kill on blood samples donated for trans-
fusion une recherche de routine de la présence de virus du SIDA ou d'anticorps du virus du SIDA. Les dons de sang merge a routine search for the presence of the AIDS virus or AIDS virus antibodies. Blood donation
qui donnent un résultat-positif au test peuvent être reje- who give a positive test result can be rejected.
tés pour la transfusion et la contamination d'autres échan- for transfusion and contamination of other samples
tillons de sang par mise en commun avec l'échantillon tillings of blood by pooling with the sample
contaminé peut être évitée.contaminated can be avoided.
Des recherches sont conduites activement depuis quelque Research has been actively carried out for some
deux ans en vue d'identifier et d'isoler l'agent respon- two years to identify and isolate the responsible agent
sable du SIDA, mais un désaccord subsiste entre divers chercheurs dans ce domaine quant-à l'identité et à la nomenclature précises de celui-ci. Ce qui a été appelé sand of AIDS, but a disagreement remains between various researchers in this field as for the identity and the precise nomenclature of this one. What was called
un isolat de virus SIDA a d'abord fait l'objet d'un rap- an AIDS virus isolate was first reported
port en 1983 par Montagnier et ses collaborateurs en France qui l'ont appelé "Lymphadenopathy Associated Virus One" (LAV-l) (Virus Associé à la Lymphadénopathie Un). Presqu'un an plus tard, Gallo et ses collaborateurs aux Etats-Unis ont publié des précisions sur l'isolement d'un autre virus port in 1983 by Montagnier and his collaborators in France who called it "Lymphadenopathy Associated Virus One" (LAV-1) (Virus Associated with Lymphadenopathy One). Almost a year later, Gallo and his collaborators in the United States published details on the isolation of another virus
appelé virus du SIDA qu'ils ont désigné par "Human T- called the AIDS virus which they called "Human T-
Lymphotropic Virus Type III", (HTLV-III), (Virus T-Lympho- Lymphotropic Virus Type III ", (HTLV-III), (T-Lympho- Virus
trope Humain Type III).Human Type III trope).
Nous avons maintenant pu isoler, à partir d'une tumeur du ganglion lymphatique, un rétrovirus T-lymphotrope humain apparenté au HTLV-III et au LAV que nous avons appelé CBL-l. Notre CBL-l est un isolat stable qui peut être We have now been able to isolate, from a tumor of the lymph node, a human T-lymphotropic retrovirus related to HTLV-III and LAV which we have called CBL-1. Our CBL-l is a stable isolate that can be
cultivé dans une lignée cellulaire hôte et peut être uti- grown in a host cell line and can be used
lisé dans une analyse pour la détection d'anticorps de read in an analysis for the detection of antibodies to
virus du SIDA dans des échantillons de sérum. AIDS virus in serum samples.
En conséquence, l'invention fournit un rétrovirus T-lym- Consequently, the invention provides a T-lym- retrovirus.
photrope humain CBL-l lié étiologiquement au SIDA. human photrope CBL-l etiologically linked to AIDS.
Nous avons constaté que le CBL-l peut être maintenu pen- We have found that CBL-1 can be maintained for
dant des périodes de temps prolongées dans une lignée cellulaire leucémique T appelée CCRF-CEM et décrite par Foley et al, Cancer 18, 522529 (1965) et un autre aspect de l'invention prévoit des cellules CCRFCEM hébergeant for extended periods of time in a leukemic T cell line called CCRF-CEM and described by Foley et al, Cancer 18, 522529 (1965) and another aspect of the invention provides CCRFCEM cells harboring
notre virus CBL-l.our CBL-1 virus.
Aux fins de confirmation, nous avons déposé des échan- For confirmation, we have submitted samples
tillons de cellules CCRF-CEM hébergeant notre virus CBL-l auprès de la National (maintenant European) Collection of Animal Cell Cultures (NCACC) au Public Health Laboratory Service Centre for Applied Microbiology and Research, tillings of CCRF-CEM cells harboring our CBL-1 virus at the National (now European) Collection of Animal Cell Cultures (NCACC) at the Public Health Laboratory Service Center for Applied Microbiology and Research,
Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG Angleterre. Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG England.
La NCACC (ECACC) a été désignée comme Autorité Interna- NCACC (ECACC) has been designated as the International Authority
tionale de Dépôt selon le traité de Budapest de 1977. National Deposit under the Budapest Treaty of 1977.
Notre dépôt a été effectué le 11 janvier 1985 et a reçu Our deposit was made on January 11, 1985 and received
le numéro de dépôt 85 01 1101.deposit number 85 01 1101.
Notre produit CBL-l a été isolé à partir de lymphocytes Our CBL-l product was isolated from lymphocytes
cultivés en provenance d'une biopsie d'une tumeur du gan- cultured from a biopsy of a tumor of the gan-
glion lymphatique d'un patient britannique subissant un traitement pour un lymphome immunoblastique associé au SIDA. On a maintenu des fragments de la biopsie dans un milieu de culture auquel ont été ajoutées des cellules T et, après deux jours environ, les cellules CCRF-CEM ont été ajoutées à la culture qui a été maintenue dans lymphatic glion of a British patient undergoing treatment for an immunoblastic lymphoma associated with AIDS. Fragments of the biopsy were kept in a culture medium to which T cells were added and, after approximately two days, the CCRF-CEM cells were added to the culture which was kept in
des conditions telles que les lymphocytes primaires dis- conditions such as primary lymphocytes dis-
paraissent sur une période d'environ un mois tandis que les cellules CCRFCEM prolifèrent et sont infectées de appear over a period of about a month as CCRFCEM cells proliferate and become infected with
façon chronique par le virus CBL-l. chronically by the CBL-1 virus.
On a montré que le virus CBL-1 est apparenté aux isolats de HTLV-III précédemment décrits (a) par une activité de transcriptase inverse avec une préférence pour les cations Mg++; (b) par la morphologie des particules de virus visualisées par microscopie électronique; (c) par immunofluorescence indirecte spécifique pour les antigènes viraux dans des cellules CCRF-CEM infectées The CBL-1 virus has been shown to be related to the HTLV-III isolates previously described (a) by reverse transcriptase activity with a preference for Mg ++ cations; (b) by the morphology of the virus particles visualized by electron microscopy; (c) by indirect immunofluorescence specific for viral antigens in infected CCRF-CEM cells
par CBL-l avec des sérums préparés en provenance de pa- by CBL-l with sera prepared from pa-
tients atteints du SIDA; (d) par comparaison avec HTLV-III et LAV-l en analyse patients with AIDS; (d) by comparison with HTLV-III and LAV-l in analysis
radioimmunologique (radioimmunoassay - RIA) en phase solide. radioimmunological (radioimmunoassay - RIA) in solid phase.
et est ainsi compris dans le groupe taxonomique des Retro- and is thus included in the taxonomic group of Retro-
viridae contenant les virus lymphotropes de cellules T humaines. Une analyse préliminaire de séquence de DNA indique que la séquence du virus CBL-1, bien qu'étroitement apparentée à celles des autres rétrovirus Tlymphotropes humains décrits jusqu'ici, n'est pas identique à celles des produits décrits précédemment mais présente un certain écart de viridae containing lymphotropic viruses of human T cells. Preliminary DNA sequence analysis indicates that the sequence of the CBL-1 virus, although closely related to that of the other human Olympophotropic retroviruses described so far, is not identical to that of the products described above, but has some variation of
séquence en divers endroits.sequence in various places.
On a montré que les cellules infectées que nous avons déposées auprès de la ECACC continuent de synthétiser le virus et les antigènes viraux sur une période d'au It has been shown that the infected cells that we have deposited with ECACC continue to synthesize the virus and viral antigens over a period of at least
moins six mois.minus six months.
Bien que nous ayons constaté que les cellules CCRF-CEM sont un hôte idéal pour notre virus CBL-l, nous avons constaté que les cellules peuvent aussi être utilisées pour héberger un virus similaire que nous avons isolé à partir du sang périphérique du même patient sur qui Although we have found that CCRF-CEM cells are an ideal host for our CBL-1 virus, we have found that cells can also be used to harbor a similar virus that we isolated from the peripheral blood of the same patient on who
la biopsie de tumeur du ganglion lymphatique a été pré- the lymph node tumor biopsy was pre-
levée et des virus similaires isolés à partir d'autres patients contaminés par des virus liés au SIDA. Nous avons ainsi montré que cette lignée cellulaire peut fournir un hôte utile pour la culture in vitro non seulement de levee and similar viruses isolated from other patients infected with AIDS-related viruses. We have thus shown that this cell line can provide a useful host for the in vitro culture not only of
notre produit CBL-l mais d'autres produits apparentés. our product CBL-l but other related products.
Selon un autre aspect de la présente invention, nous pro- According to another aspect of the present invention, we pro-
posons un procédé d'analyse d'un échantillon biologique let's set up a method for analyzing a biological sample
pour la recherche d'un anticorps de rétrovirus, caracté- for the detection of a retrovirus antibody, characteristic
risé en ce qu'on met l'échantillon biologique en contact avec (1) un antigène insolubilisé comprenant des antigènes rétroviraux liés à une globuline, la globuline elle-même étant liée à un support solide inerte; et in that the biological sample is brought into contact with (1) an insolubilized antigen comprising retroviral antigens linked to a globulin, the globulin itself being linked to an inert solid support; and
(2) une immunoglobuline qui contient un anticorps spéci- (2) an immunoglobulin which contains a specific antibody
fique des antigènes rétroviraux et qui est-marquée par un traceur révélateur non radioactif, et qu'on sépare of retroviral antigens and which is marked with a non-radioactive revealing tracer, and which is separated
la phase liquide de la phase solide et détermine la quan- the liquid phase of the solid phase and determines the amount
tité de traceur révélateur associée à l'une ou l'autre developer tracer associated with one or the other
de ces phases.of these phases.
Selon encore un autre aspect de l'invention, on fournit un équipement d'essai ou kit d'essai comprenant (1) un premier composant qui est un antigène insolubilisé comprenant des antigènes rétroviraux liés à une globuline, la globuline elle-même étant liée à un support solide inerte; et According to yet another aspect of the invention, there is provided a test equipment or test kit comprising (1) a first component which is an insolubilized antigen comprising retroviral antigens linked to a globulin, the globulin itself being linked to an inert solid support; and
(2) un second composant qui est une immunoglobuline conte- (2) a second component which is an immunoglobulin containing
nant un anticorps spécifique des antigènes rétroviraux an antibody specific for retroviral antigens
et marquée par un révélateur non radioactif. and marked with a non-radioactive developer.
Comme indiqué plus haut, CBL-l trouve une utilisation principale comme composant d'un système d'essai pour le contrôle de routine de sang destiné à la transfusion pour déterminer s'il provient d'un sujet contaminé par le virus du SIDA. Nous avons développé un système basé sur une analyse compétitive simultanée utilisant des antigènes CBL-1 immobilisés ou d'autres antigènes rétroviraux comme As noted above, CBL-1 finds primary use as a component of a test system for the routine monitoring of blood intended for transfusion to determine whether it is from a subject infected with the AIDS virus. We have developed a system based on simultaneous competitive analysis using immobilized CBL-1 antigens or other retroviral antigens such as
phase solide, et le sérum à tester comme phase liquide. solid phase, and the serum to be tested as a liquid phase.
Plus précisément, notre analyse compétitive simultanée est basée sur l'immobilisation de l'antigène CBL-1 ou autre antigène rétroviral par sa liaison à une phase solide, au moyen d'un ligand, par exemple une globuline ou un autre anticorps, et permettant aux sites de liaison de More specifically, our simultaneous competitive analysis is based on the immobilization of the CBL-1 antigen or other retroviral antigen by its binding to a solid phase, by means of a ligand, for example a globulin or another antibody, and allowing to the binding sites of
cet antigène immobilisé de faire l'objet d'une compéti- this immobilized antigen to be the subject of a competi-
tion de la part d'un mélange d'un anticorps du sérum à tester et d'un anticorps connu pour le virus du SIDA qui peut être identifié par l'agent révélateur. Nous avons constaté que les résultats les plus satisfaisants sont tion from a mixture of a serum antibody to be tested and a known antibody to the AIDS virus which can be identified by the revealing agent. We have found that the most satisfactory results are
obtenus quand l'agent révélateur est un traceur enzyme. obtained when the revealing agent is an enzyme tracer.
L'utilisation d'un traceur enzyme plutôt que d'un traceur radioactif présente l'avantage de supprimer le risque biologique de la radiation et une conséquence inattendue The use of an enzyme tracer rather than a radioactive tracer has the advantage of eliminating the biological risk of radiation and an unexpected consequence
est qu'elle permet de réduire l'incubation immune de l'es- is that it reduces the immune incubation of the es
sai à une heure ou moins.sai an hour or less.
Une autre possibilité est d'utiliser l'immunofluorescence Another possibility is to use immunofluorescence
pour révéler la présence de l'anticorps connu lié à l'anti- to reveal the presence of the known antibody linked to the anti
gène immobilisé.immobilized gene.
Comme indiqué plus haut, nous avons constaté que les meil- As noted above, we found that the best
leurs résultats sont obtenus quand l'antigène est attaché à la phase solide par l'intermédiaire d'un ligand qui est un anticorps. Une technique est d'utiliser un sérum their results are obtained when the antigen is attached to the solid phase via a ligand which is an antibody. One technique is to use a serum
humain de titre élevé prélevé sur quelqu'un qui est conta- high titer human taken from someone who is conta-
miné de façon asymptomatique par le virus du SIDA. Le sérum idéal possède un titre élevé d'anticorps au virus undermined asymptomatically by the AIDS virus. The ideal serum has a high titer of antibodies to the virus
du SIDA mais provient d'un patient dont les niveaux d'immu- from AIDS but comes from a patient whose immune levels
noglobulines se situent dans la gamme normale.-Une autre approche est d'utiliser un anticorps monoclonal dirigé contre le rétrovirus. Si celuici est cultivé de façon classique en utilisant des souris, certains avantages peuvent en être tirés comme il sera décrit plus en détail ciaprès. Le matériau de phase solide est de façon convenable le polystyrène qui peut être utilisé sous forme de tubes, noglobulins are in the normal range.-Another approach is to use a monoclonal antibody against the retrovirus. If this is grown conventionally using mice, some benefits can be obtained as will be described in more detail below. The solid phase material is suitably polystyrene which can be used in the form of tubes,
perles ou de préférence plaques présentant une-multipli- pearls or preferably plates presenting a-multipli-
cité-de puits de surface ou d'autres cavités de surface. city-surface wells or other surface cavities.
La gamma-globuline préparée à partir du sérum choisi, ou autre anticorps, est alors étendue sur le polystyrène, The gamma globulin prepared from the chosen serum, or other antibody, is then spread over the polystyrene,
puis l'antigène est lié au polystyrène revêtu de globu- then the antigen is linked to the polystyrene coated with globu-
line pour former le premier composant du test. Ce compo- line to form the first component of the test. This compound
sant peut être conservé à l'état humide ou sec pendant health can be kept wet or dry for
plusieurs mois.several months.
Le second composant du test comprend la fraction IgG iso- The second component of the test comprises the iso- IgG fraction
lée à partir du sérum à tester et, quand il est prévu de révéler au moyen d'un traceur enzyme, cette fraction IgG peut être conjuguée avec par exemple la peroxydase linked from the test serum and, when it is planned to reveal by means of an enzyme tracer, this IgG fraction can be conjugated with, for example, peroxidase
du raifort (HRPO) selon des techniques connues. horseradish (HRPO) according to known techniques.
On peut utiliser l'équipement de test selon l'invention en mélangeant le composant IgG marqué avec le sérum à tester et en mettant ensuite le mélange d'IgG et de sérum The test equipment according to the invention can be used by mixing the labeled IgG component with the serum to be tested and then putting the mixture of IgG and serum
à tester en contact avec l'antigène insolubilisé, en sépa- to be tested in contact with the insolubilized antigen, separately
rant l'une de l'autre les phases solide et liquide et rant from one another the solid and liquid phases and
en déterminant à quel degré -l'IgG s'est liée à l'antigène. by determining to what degree the IgG has bound to the antigen.
Conformément aux analyses compétitives simultanées, plus le composant IgG de la phase liquide est lié à la phase According to concurrent competitive analyzes, the more the IgG component of the liquid phase is bound to the phase
solide, plus faible est la quantité d'anticorps ou d'anti- solid, the lower the amount of antibody or anti
gènes dans le sérum à tester. En choisissant des valeurs de contrôle appropriées, il est ainsi possible d'avoir un test de routine dans lequel, si la HRPO est utilisée genes in the test serum. By choosing appropriate control values, it is thus possible to have a routine test in which, if HRPO is used
comme agent révélateur, le sérum à tester peut être consi- as a revealing agent, the serum to be tested can be considered
déré comme exempt d'anticorps ou d'antigènes du SIDA dès lors que la densité optique (OD) de l'échantillon à tester atteint un niveau minimum prédéterminé. Tout échantillon 8 - de sérum à tester qui donne lieu à l'enregistrement d'une valeur d'OD inférieure au niveau prédéterminé peut par conséquent être rejeté, évitant ainsi une contamination possible d'un don de sang à transfuser par un virus ou dere as free from AIDS antibodies or antigens as soon as the optical density (OD) of the test sample reaches a predetermined minimum level. Any sample of serum 8 to be tested which gives rise to the recording of an OD value below the predetermined level can therefore be rejected, thus avoiding possible contamination of a blood donation to be transfused with a virus or
un anticorps du SIDA.an AIDS antibody.
Il est possible d'utiliser d'autres rétrovirus à titre d'alternative au CBL-l comme antigènes rétroviraux dans Other retroviruses can be used as an alternative to CBL-1 as retroviral antigens in
la méthode d'analyse et dans l'équipement d'essai de diag- the method of analysis and in the diag test equipment
nostic de l'invention. Il peut s'agir d'autres rétro- nostic of the invention. It can be other retro-
virus humains étiologiquement liés au SIDA tels que le human viruses etiologically linked to AIDS such as
rétrovirus T-lymphotrope humain HTLV-III ou d'autres rétro- Human T-lymphotropic retrovirus HTLV-III or other retro-
virus humains tels que le virus leucémique T HTLV-II ou HTLV-I, ou de rétrovirus animaux tels que le virus du human viruses such as leukemic virus HTLV-II or HTLV-I, or animal retroviruses such as
maedi-visna ou celui de la leucose bovine. maedi-visna or that of bovine leukosis.
Comme il sera décrit plus en détail ci-après, la liaison indirecte d'antigènes rétroviraux humains à la phase solide par l'intermédiaire de globuline procure une certaine amplification des résultats et la formule du test permet une détermination simple, rapide et précise de la présence ou de l'absence de contamination dans des échantillons de sang par des techniciens relativement peu qualifiés As will be described in more detail below, the indirect binding of human retroviral antigens to the solid phase via globulin provides a certain amplification of the results and the test formula allows a simple, rapid and precise determination of the presence or absence of contamination in blood samples by relatively unskilled technicians
et inexpérimentés.and inexperienced.
L'invention sera mieux comprise grâce aux exemples de réalisation décrits ci-après à titre illustratif, et des dessins annexés, dans lesquels: - la figure 1 représente une micrographie électronique au grandissement de 81 000 montrant des particules de The invention will be better understood thanks to the exemplary embodiments described below by way of illustration, and to the appended drawings, in which: FIG. 1 represents an electron micrograph at magnification of 81,000 showing particles of
CBL-l qui se détachent de cellules hôtes CCRF-CEM et si- CBL-1 that detach from CCRF-CEM host cells and if-
tuées à la limite de celles-ci; - la figure 2 montre l'efficacité-de l'ELISA (essai connu sous le nom d'"Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay", Analyse par immunoabsorption avec liaison d'enzyme) en phase solide pour les anti-HTLV III. La figure présente les densités optiques obtenues en testant un certain nombre de sérums cliniques, les uns réactifs et les autres non réactifs pour les anti-HTLV III, résultats connus à l'avance par analyse radioimmunologique; - la figure 3 montre des données semblables à celles de killed at the limit of these; - Figure 2 shows the effectiveness of ELISA (test known as "Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay", Analysis by immunoabsorption with enzyme binding) in solid phase for anti-HTLV III. The figure presents the optical densities obtained by testing a certain number of clinical sera, some reactive and others not reactive for anti-HTLV III, results known in advance by radioimmunological analysis; - Figure 3 shows data similar to that of
la figure 2, mais cette fois pour des anti-HTLV I, déter- Figure 2, but this time for anti-HTLV I, deter-
minées par un ELISA compétitif simultané en une étape undermined by a competitive one step ELISA
semblable au précédent.similar to the previous one.
EXEMPLE 1.EXAMPLE 1.
ISOLATION ET CARACTERISATION DE CBL-1. ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF CBL-1.
Le virus CBL-1 a été isolé à partir de lymphocytes culti- The CBL-1 virus was isolated from cultured lymphocytes
vés en provenance d'une biopsie de tumeur du ganglion ves from a lymph node tumor biopsy
lymphatique d'un patient britannique subissant un traite- of a British patient undergoing treatment
ient pour un lymphome immunoblastique associé au syndrome immunodéficitaire acquis (SIDA). On a découpé la biopsie du ganglion lymphatique en petits fragments et on les a placés dans un milieu de culture composé du milieu de base RPMI-1640 complété par 10% de sérum de veau foetal et 10 pg/ml de phytohémagglutinine. Après 24 heures, on a ajouté un milieu conditionné contenant un facteur de croissance de cellules T récolté à partir de cultures are for immunoblastic lymphoma associated with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). The lymph node biopsy was cut into small fragments and placed in a culture medium consisting of RPMI-1640 base medium supplemented with 10% fetal calf serum and 10 µg / ml phytohemagglutinin. After 24 hours, conditioned medium containing T cell growth factor harvested from cultures was added.
mixtes de lymphocytes d'amygdales, et on a retiré la phyto- mixed tonsil lymphocytes, and the phyto-
hémagglutinine. 48 heures après le commencement de la hemagglutinin. 48 hours after the start of the
culture, on a ajouté de l'antisérum d'interféron alpha. culture, interferon alpha antiserum was added.
On a aussi ajouté à 48 heures des cellules CCRF-CEM (appe- CCRF-CEM cells (called -
lées ci-après cellules CEM). Les cellules CEM sont une lignée cellulaire leucémique T en croissance permanente see below CEM cells). CEM cells are a constantly growing leukemic T cell line
décrite par Foley et al (1965) Cancer 18; 522-9. described by Foley et al (1965) Cancer 18; 522-9.
Dans ces conditions de culture en commun les lymphocytes primaires ont disparu en quatre semaines de culture tandis que les cellules CEM ont proliféré exponentiellement. Le virus CBL-1 produit par les lymphocytes primaires a infecté les cellules CEM et après huit semaines en culture les cellules CEM étaient infectées de façon chronique par le virus CBL-l. Le maintien des cellules CEM infectées par CBL-l n'a pas nécessité de facteur de croissance de cellules T ni d'anti-interféron alpha. Ces cellules CEM infectées par CBL-l ont été déposées comme indiqué plus Under these conditions of common culture the primary lymphocytes disappeared in four weeks of culture while the CEM cells proliferated exponentially. The CBL-1 virus produced by primary lymphocytes infected CEM cells and after eight weeks in culture the CEM cells were chronically infected with the CBL-1 virus. Maintaining CEM cells infected with CBL-1 did not require T cell growth factor or anti-alpha interferon. These CEM cells infected with CBL-1 were deposited as indicated more
haut auprès de la NCACC sous le numéro de dépôt 85 01 1101. top with the NCACC under the deposit number 85 01 1101.
On a montré que le virus CBL-l est apparenté aux isolats CBL-1 virus has been shown to be related to isolates
de HTLV-III/LAV décrits antérieurement (a) par une acti- HTLV-III / LAV previously described (a) by an acti-
vité de transcriptase inverse avec une préférence pour les cations Mg++, par la morphologie des particules de speed of reverse transcriptase with a preference for the cations Mg ++, by the morphology of the particles of
virus visualisées par microscopie électronique (voir fi- viruses visualized by electron microscopy (see fi-
gure 1) et (b) par immunofluorescence indirecte spécifi- gure 1) and (b) by specific indirect immunofluorescence
que pour les antigènes viraux dans des cellules CEM infec- than for viral antigens in infected CEM cells
tées par CBL-l avec des sérums préparés en provenance de patients atteints du SIDA et par comparaison avec un CBL-1 with sera prepared from AIDS patients and by comparison with a
autre isolat- de virus du SIDA en RIA en phase solide. another isolate of AIDS virus in RIA in solid phase.
Les cellules CEM/CBL-l ont continué de synthétiser le CEM / CBL-1 cells continued to synthesize the
virus et les antigènes viraux sur une période de six mois. viruses and viral antigens over a period of six months.
EXEMPLE 2EXAMPLE 2
1. Préparation de l'antigène.1. Preparation of the antigen.
On a préparé un lysat brut de cellules gelées-dégelées A raw lysate of frozen-thawed cells was prepared
de la façon suivante. On a laissé des cellules HT-H9 infec- as follows. HT-H9 cells were left infected
tées par HTLV-IIIB se développer à la densité maximale en culture en suspension. On a refroidi les cultures à 4 C et on a ajouté 0,25 % v/v de f-propiolactone pendant deux heures. On a alors séparé du fluide de culture et ted by HTLV-IIIB grow at maximum density in suspension culture. The cultures were cooled to 4 ° C and 0.25% v / v f-propiolactone was added for two hours. We then separated the culture fluid and
aggloméré les cellules par centrifugation à basse vitesse. agglomerated the cells by centrifugation at low speed.
On a remis le culot de cellules en suspension dans l'eau distillée et lui a fait subir trois cycles gel/dégel. A chaque cycle, on remettait soigneusement en suspension le résidu du culot de cellules. Après le troisième cycle, The cell pellet was resuspended in distilled water and subjected to three freeze / thaw cycles. At each cycle, the residue from the cell pellet was carefully resuspended. After the third cycle,
on a porté l'extrait à 0,25% vol/vol avec la -propiolac- the extract was brought to 0.25% vol / vol with -propiolac-
tone et on l'a conservé à 4 C pendant deux heures; on tone and kept at 4 C for two hours; we
l'a ensuite réchauffé à 37 C pendant une demi-heure. Pen- then warmed it to 37 C for half an hour. Pen-
dant ce temps, le pH était maintenu dans la région de During this time, the pH was maintained in the region of
7,4. Le lysat brut a été clarifié et conservé à -20 C. 7.4. The crude lysate was clarified and stored at -20 C.
Avant utilisation, on l'a dilué dans le tampon TRIS (2- Before use, it was diluted in TRIS buffer (2-
amino-2-hydroxyméthyl-l,3 propanediol) additionné de 0,1% d'albumine de sérum bovin (BSA) et de détergent. Le choix du détergent et sa concentration ont été importants et on a observé un optimum par l'utilisation de Tween 20 amino-2-hydroxymethyl-1,3 propanediol) containing 0.1% bovine serum albumin (BSA) and detergent. The choice of detergent and its concentration were important and an optimum was observed by the use of Tween 20
à 0,1% de concentration, amplifiant l'activité de la pré- at 0.1% concentration, amplifying the activity of the pre-
paration d'antigènes d'un facteur trois ou parfois même plus. Après dilution dans TRIS BSA/Tween 20, l'antigène a été incubé pendant 30 minutes à 37 C. C'est à ce stade paration of antigens by a factor of three or sometimes even more. After dilution in TRIS BSA / Tween 20, the antigen was incubated for 30 minutes at 37 C. It is at this stage
que se produit l'accroissement de l'activité des antigènes. that there is an increase in the activity of antigens.
De cette façon, la préparation d'antigène peut être uti- In this way, the antigen preparation can be used.
lisée pour surveiller l'expression de l'antigène HTLV-III to monitor the expression of the HTLV-III antigen
dans des conditions de culture définies diverses. L'anti- under various defined culture conditions. The anti
génicité peut être quantifiée par RIA en phase solide en utilisant de l'anti-HTLV-III en phase solide et un second réactif, comprenant de l'anti-HTLV-III marqué par I. Dans l'analyse finale, l'antigène a été utilisé àune dilution qui permet un rapport P:N de 10:1 avec genicity can be quantified by RIA in solid phase using anti-HTLV-III in solid phase and a second reagent, comprising anti-HTLV-III marked with I. In the final analysis, the antigen has been used at a dilution that allows a P: N ratio of 10: 1 with
1 à 2% de liaison au traceur en présence de sérums néga- 1 to 2% binding to the tracer in the presence of negative sera
tifs (voir ci-après méthode d'analyse). On a observé une perte variable d'antigènes viraux dans le fluide surnageant sur les cellules mais en termes relatifs la masse d'antigène détectable est restée dans le culot de cellules. Ceci tifs (see analysis method below). Variable loss of viral antigens in the supernatant fluid was observed on the cells but in relative terms the mass of detectable antigen remained in the cell pellet. This
est vrai pour le CBL-1 et pour d'autres isolats de HTLV- is true for CBL-1 and other HTLV- isolates
III portés dans des cellules CEM ou des cellules HT/H9. III carried in CEM cells or HT / H9 cells.
Il n'y a pas de contraintes sur la pureté de l'antigène There are no constraints on the purity of the antigen
(voir ci-après) et il convient de porter au maximum l'ex- (see below) and the ex-
pression de l'antigène dans des cellules. La préparation pressure of the antigen in cells. The preparation
d'antigène utilisée ici est facile à fabriquer, probable- of antigen used here is easy to manufacture, likely-
ment d'un rendement plus élevé par volume de culture cellu- higher yield per volume of cell culture
laire que l'antigène préparé à partir du fluide surnageant et apparaït stable à -200C. Elle peut facilement être laire that the antigen prepared from the supernatant fluid and appears stable at -200C. It can easily be
inactivée par la'n-propiolactOne. On peut également s'at- inactivated by la'n-propiolactOne. We can also expect
tendre à ce que l'utilisation du Tween 20 réduise forte- tend to reduce the use of Tween 20
ment le titre d'un virus infectieux quelconque. the title of any infectious virus.
2. Antisérums.2. Antisera.
Le réactif pour l'analyse a été préparé à partir de sérums The reagent for the analysis was prepared from sera
humains de titre élevé prélevés sur des personnes conta- high titer humans taken from infected people
minées de façon asymptomatique par le rétrovirus du SIDA. asymptomatically undermined by the AIDS retrovirus.
La sélection des sérums pour la préparation du réactif est importante. Le sérum avait un titre élevé d'anti-HTLV-III The selection of sera for the preparation of the reagent is important. Serum had high anti-HTLV-III titer
par RIA mais provenait d'un patient dont les niveaux d'immu- by RIA but came from a patient whose immunity levels
noglobulines étaient dans la gamme normale. En pratique, il est habituellement nécessaire de préparer des réactifs à partir d'un petit nombre de sérums satisfaisant aux critères ci-dessus et de tester l'efficacité des réactifs à l'analyse. De façon à rendre ces réactifs non infectieux, les sérums de départ ont été traités par chauffage à 56 C noglobulins were in the normal range. In practice, it is usually necessary to prepare reagents from a small number of sera meeting the above criteria and to test the effectiveness of the reagents for analysis. In order to make these reagents non-infectious, the starting sera were treated by heating at 56 ° C.
pendant 30 minutes.during 30 minutes.
(a) Préparation de globuline anti-HTLV-IIIB. Ce produit a été utilisé pour purifier l'antigène HTLV-IIIB in situ (a) Preparation of anti-HTLV-IIIB globulin. This product was used to purify the HTLV-IIIB antigen in situ
sur une phase solide. Cette stratégie entraîne des avan- on a solid phase. This strategy leads to
tages considérables. La globuline provenant du sérum traité a été précipitée deux fois par le sulfate d'ammonium à % de la saturation. Il s'agit du réactif le plus simple pour le recouvrement par la globuline bien qu'il soit possible d'utiliser soit un sérum entier soit une IgG considerable tages. The globulin from the treated serum was precipitated twice by ammonium sulfate at% of saturation. It is the simplest reagent for recovery with globulin although it is possible to use either whole serum or IgG
purifiée. On a utilisé la globuline à une dilution opti- purified. Globulin was used at an optimal dilution.
male qu'il a fallu déterminer par titration individuelle male that had to be determined by individual titration
du réactif. Le matériau de phase solide était le polysty- of the reagent. The solid phase material was polysty-
rène sous forme de puits; on l'a recouvert de globuline et on a ensuite neutralisé les sites de liaison en excès par une protéine inerte - dans le cas présent l'albumine de sérum bovin (BSA) à 0,1%. La phase solide recouverte reins as a sink; it was coated with globulin and then the excess binding sites were neutralized with an inert protein - in this case 0.1% bovine serum albumin (BSA). The solid phase covered
et neutralisée a été conservée à l'état humide à 4 C pen- and neutralized was kept wet at 4 C for
dant des mois; le séchage donne un produit plus stable. for months; drying gives a more stable product.
Pour le recouvrement de la phase solide, on a dilué le lysat HT-H9/HTLVIIIB décrit ci-dessus dans le tampon For recovery of the solid phase, the HT-H9 / HTLVIIIB lysate described above was diluted in the buffer.
TRIS/BSA/Tween à une dilution qui, lors de tests subsé- TRIS / BSA / Tween to a dilution which, in subsequent tests
quents, permettait la liaison de 1 à 2% du traceur avec un sérum négatif. Le recouvrement a été réalisé de la façon la plus efficace par une incubation de deux jours d'antigène à température ambiante dans la phase solide suivie d'une conservation à l'état humide à 4 C jusqu'à utilisation. Les expériences préliminaires ont montré que la phase solide était stable sous cette forme pendant plusieurs mois. Néanmoins, elle peut aussi être séchée sans perte sensible d'activité et rester stable pendant quents, allowed the binding of 1 to 2% of the tracer with a negative serum. The recovery was carried out in the most efficient way by a two-day incubation of antigen at room temperature in the solid phase followed by storage in a wet state at 4 ° C. until use. Preliminary experiments have shown that the solid phase was stable in this form for several months. However, it can also be dried without significant loss of activity and remain stable for
plusieurs mois.several months.
(b) Marquage de la globuline.(b) Labeling of globulin.
On a conjugué l'IgG décrite ci-dessus en 2(a) avec la HRPO en utilisant des dérivés hétérobifonctionnels de la façon usuelle pour fournir un rapport de substitution molaire de 1:3. Ce produit a été utilisé en association avec la phase solide décrite en 2(a) ci-dessus dans une The IgG described above in 2 (a) was conjugated with HRPO using heterobifunctional derivatives in the usual manner to provide a molar substitution ratio of 1: 3. This product was used in combination with the solid phase described in 2 (a) above in a
analyse immunologique avec enzyme pour la détection d'anti- enzyme immunoassay for the detection of
corps de rétrovirus du SIDA dans des échantillons de fluide corporel. Aux fins de comparaison, un autre échantillon de l'IgG a été marqué par 125I à une activité spécifique de 15 AIDS retrovirus body in body fluid samples. For comparison, another IgG sample was labeled with 125I at a specific activity of 15
i/Ci par pg de protéine.i / Ci per pg of protein.
EXEMPLE 3.EXAMPLE 3.
ELISA compétitif en une étape pour anti-CEM/CBL 1. Competitive one-step ELISA for anti-CEM / CBL 1.
Réactifs de sérum.Serum reagents.
On a utilisé un sérum humain contenant un titre élevé We used a human serum containing a high titer
d'anti-HTLV-III pour la préparation de globuline de recou- anti-HTLV-III for the preparation of coated globulin
vrement comme décrit précédemment dans l'exemple 2.2. strictly as described previously in Example 2.2.
On a recouvert des puits de polystyrène présentant une configuration à fond rond avec une dilution optimale de globuline, puis on les a neutralisés par une protéine inerte, dans le cas présent la BSA à 0,1%. Le même sérum a été utilisé comme source d'immunoglobuline, qui a été purifiée par chromatographie à écnange d'ions sur DE 52 comme décrit précédemment. L'IgG a été-couplée avec la Polystyrene wells having a round bottom configuration were covered with an optimal dilution of globulin, then they were neutralized with an inert protein, in this case 0.1% BSA. The same serum was used as the source of immunoglobulin, which was purified by ion exchange chromatography on DE 52 as previously described. IgG has been coupled with
peroxydase du raifort à un degré de substitution approxi- horseradish peroxidase to an approximate degree of substitution
matif de trois molécules de peroxydase du raifort pour matif of three molecules of horseradish peroxidase for
une molécule d'IgG.an IgG molecule.
L'efficacité du conjugué a été déterminée par incubation par rapport à des puits préalablement recouverts, par The efficiency of the conjugate was determined by incubation with respect to previously covered wells, by
l'intermédiaire d'un anticorps indirect, par des anti- through an indirect antibody, through anti
gènes viraux provenant de cellules infectées par HTLV-III et par des cellules non infectées par des antigènes. On a considéré comme dilution optimale du conjugué celle qui donnait la liaison colorée maximale avec l'antigène viral genes from cells infected with HTLV-III and by cells not infected with antigens. We considered as optimal dilution of the conjugate that which gave the maximum colored bond with the antigen
des cellules infectées et la production de couleur maxi- infected cells and maximum color production
male avec les cellules non infectées. male with uninfected cells.
Antigène CEM/CBL 1.CEM / CBL antigen 1.
Des cellules infectées de façon persistante par le virus CEM/CBL 1 ont été cultivées jusqu'à la densité maximale Cells persistently infected with CEM / CBL 1 virus were grown to maximum density
dans des cultures sous agitation non adhérentes. Les cul- in non-adherent shaking cultures. The cul-
tures sous agitation ont été refroidies à 4 C puis portés à 0,25% en volume avec la P-propiolactone. Après deux heures d'incubation à 4 C, le culot de cellules a été récolté et soumis à des cycles gel/dégel, puis clarifié comme précédemment par centrifugation. L'extrait de culture tures with stirring were cooled to 4 ° C. and then brought to 0.25% by volume with P-propiolactone. After two hours of incubation at 4 ° C., the cell pellet was harvested and subjected to freeze / thaw cycles, then clarified as above by centrifugation. Culture extract
tissulaire a ensuite été traité pour une nouvelle incuba- tissue was then treated for a new incubation
tion de deux heures à 4 C par 0,25% de '-propiolactone puis hydrolysé comme précédemment. Dans le cas présent, le diluant pour l'éclatement des cellules et le cyclage tion for two hours at 4 ° C. with 0.25% of '-propiolactone and then hydrolyzed as above. In this case, the diluent for cell bursting and cycling
gel/dégel était le sérum physiologique tamponné au phos- freeze / thaw was physiological buffered phos-
phate, additionné de 0,1% de Tween 20. On a ensuite titré phate, supplemented with 0.1% Tween 20. We then titrated
les préparations d'antigène sur une phase solide recou- antigen preparations on a solid phase coated
verte de globuline anti-HTLV-III de titre élevé, et on anti-HTLV-III high titer globulin green, and
a utilisé comme dilution de travail pour les essais subsé- used as working dilution for subsequent tests
quents la dilution donnant une OD à 450 nm comprise entre quents the dilution giving an OD at 450 nm between
* 1,0 et 1,2 dans les conditions définies ci-après.* 1.0 and 1.2 under the conditions defined below.
Optimisation et formule d'essai.Optimization and test formula.
On a incubé des puits recouverts de globuline à titre élevé, et ensuite neutralisés, avec 100 y1 de la dilution Wells covered with high titer globulin, and then neutralized, were incubated with 100 µl of the dilution
optimale d'antigène CEM/CBL 1. Après une nuit d'incuba- optimal CEM / CBL 1 antigen.
tion à température ambiante, on a éliminé l'extrait d'anti- tion at room temperature, the anti-extract was removed
gène par lavage des puits et séché ceux-ci dans des condi- gene by washing the wells and drying them under conditions
tions qu'on a trouvées propres à promouvoir la stabilité des antigènes viraux CEM/CBL 1 immobilisés. Pour l'essai, on a placé 25 pl de sérums positifs pour l'anticorps et négatifs pour l'anticorps dans des puits séparés, et ajouté aux puits 75 p1 de conjugué ELISA dans de l'eau distillée additionnée de détergent. On a incubé le mélange de sérum à tester et de conjugué (incubation immune) dans les puits which have been found to promote the stability of immobilized CEM / CBL 1 viral antigens. For the assay, 25 µl of antibody positive and antibody negative sera were placed in separate wells, and 75 µl of ELISA conjugate was added to the wells in distilled water supplemented with detergent. The mixture of test serum and conjugate (immune incubation) was incubated in the wells
pendant des temps variables dans différentes conditions. for varying times under different conditions.
On a ensuite lavé les puits trois fois au Tween salin (solution de chlorure de sodium à 0,8% additionnée de 0,1% de Tween 20). Après trois lavages, on a rempli les puits de Tween salin et on les a laissés tremper deux minutes à température ambiante, après quoi la procédure The wells were then washed three times with saline Tween (0.8% sodium chloride solution supplemented with 0.1% Tween 20). After three washes, the wells were filled with saline Tween and allowed to soak for two minutes at room temperature, after which the procedure
de lavage a été répétée avec trois cycles de lavage. En- was repeated with three wash cycles. In-
suite, on a ajouté 100 ivl de substrat chromogène, dans subsequently, 100 ivl of chromogenic substrate was added to
le cas présent la 3,3',5,5'tétraméthylbenzidine (TMB). in this case 3.3 ', 5.5'tetramethylbenzidine (TMB).
Après vingt minutes d'incubation à température ambiante, on a interrompula réaction chromogène par addition de il d'acide sulfurique quatre fois normal. On a mesuré After twenty minutes of incubation at room temperature, the chromogenic reaction was stopped by adding four times normal sulfuric acid. We measured
la formation de couleur par spectrophotométrie à 450 nm. color formation by spectrophotometry at 450 nm.
On a considéré comme dilution de travail pour chaque anti- We considered as working dilution for each anti
gène CEM/CBL 1 particulier celle qui donnait de façon fiable une densité optique comprise entre 1 et 1,2 avec un sérum négatif lors de l'utilisation dans l'ELISA dans particular CEM / CBL 1 gene that which reliably gave an optical density between 1 and 1.2 with a negative serum when used in ELISA in
les conditions optimales, définies comme étant une incuba- optimal conditions, defined as an incubation
tion immune d'une heure à 450C.one hour immune response at 450C.
Résultats. La comparaison entre les résultats obtenus dans un RIA classique utilisant la phase solide et une IgG marquée par 1251 décrit dans l'exemple 2 et les résultats ELISA obtenus dans le présent exemple a démontré deux avantages inattendus en faveur de l'ELISA. En premier lieu, des préparations d'antigènes sous-optimales qui donnaient Results. The comparison between the results obtained in a conventional RIA using the solid phase and an IgG labeled with 1251 described in Example 2 and the ELISA results obtained in the present example demonstrated two unexpected advantages in favor of ELISA. First, suboptimal antigen preparations which gave
des résultats médiocres en RIA ont été capables de pro- poor RIA results have been able to pro-
duire, au même titre, des bons résultats en ELISA. En second lieu, comme illustré dans le tableau 1, il n'a in the same way, give good results in ELISA. Second, as illustrated in Table 1, it has
pas été possible avec le RIA de réduire les temps d'incuba- not been possible with the RIA to reduce incubation times
tion au-dessous de trois heures. Un besoin existe d'une recherche rapide, une à deux heures au total, dans les préparatifs de transfusion, et ceci n'a été possible qu'avec l'ELISA. tion within three hours. There is a need for rapid research, one to two hours in total, in transfusion preparations, and this was only possible with ELISA.
TABLEAU 1TABLE 1
Expériences à temps et température variables en RIA avec Variable time and temperature experiments in RIA with
IgG marquée par 125I.IgG labeled with 125I.
Sérums témoins Temps en heures Température_ S r m _ _on Négatif Coupure Positif Control sera Time in hours Temperature_ S r m _ _on Negative Cutoff Positive
18) 1.13 0.28 0.0818) 1.13 0.28 0.08
3)TA 0.37 0.19 0.13) TA 0.37 0.19 0.1
2) 0.30 0.18 0.092) 0.30 0.18 0.09
1) 0.34 0.15 0.11) 0.34 0.15 0.1
3) 0.43 0.15 0.113) 0.43 0.15 0.11
2)37 C 0.43 0.19 0.092) 37 C 0.43 0.19 0.09
1) 0.28 0.18 0.121) 0.28 0.18 0.12
3) 0.45 0.14 0.063) 0.45 0.14 0.06
2)450C 0.40 0.14 0.072) 450C 0.40 0.14 0.07
1) 0.27 0.13 0.051) 0.27 0.13 0.05
* % de liaison du niveau d'entrée.*% of entry level binding.
La figure 2 montre les résultats d'essais par ELISA de Figure 2 shows the ELISA test results of
56 sérums cliniques, provenant dans le cas présent d'hémo- 56 clinical sera, in this case from hemo-
philes traités par des concentrés commerciaux et non com- philes treated with commercial concentrates and not
merciaux de Facteur VIII et d'homosexuels. On peut voir dans la figure qu'une séparation claire s'est faite entre les sérums réactifs pour l'anti-CEM/CBL 1 et les sérums non réactifs. Dans cet exemple particulier, la densité optique moyenne de 16 sérums réactifs pour l'anticorps du CEM/CBL 1 était 0,085 (0,037 à 0,327) et la densité Factor VIII and homosexuals. It can be seen in the figure that a clear separation has been made between the sera reactive for anti-CEM / CBL 1 and the non-reactive sera. In this particular example, the average optical density of 16 sera reactive for the CEM / CBL 1 antibody was 0.085 (0.037 to 0.327) and the density
optique moyenne de 40 sérums non réactifs pour cet anti- average optics of 40 sera not reactive for this anti
corps était 1,16 (0,736 à 1,352). Le sérum a provenait d'un patient atteint du SIDAcondamné et était faiblement réactif aux essais par immunofluorescence et par liaison directe. Les sérums b et c étaient non réactifs lors d'un body was 1.16 (0.736 to 1.352). The serum a was obtained from an AIDS patient who was convicted and was poorly reactive to immunofluorescence and direct binding tests. Sera b and c were non-reactive during a
nouveau test.new test.
La même formule exactement a été utilisée dans une étude The exact same formula was used in one study
sur des sérums de Transfusion Sanguine au Royaume-Uni. on Blood Transfusion sera in the United Kingdom.
Jusqu'à présent plus de 12 000 sérums de donneurs ont été testés. Trois sérums ont donné des réactions aux essais To date, more than 12,000 donor sera have been tested. Three sera gave reactions to the tests
de dépistage. Toutefois, lors d'un nouvel essai, un don- screening. However, when retried, a don-
neur unique seulement a été trouvé réactif. Le sérum était réactif de façon répétée, était titrable et manifestait une forte réactivité en immunofluorescence à l'égard de only a single neur was found to be reactive. Serum was repeatedly reactive, titratable, and exhibited strong immunofluorescence reactivity towards
cellules infectées mais non de cellules non infectées. infected cells but not uninfected cells.
La réactivité aléatoire de sérums non liée à l'infection Random reactivity of sera not linked to infection
par CEM/CBL 1 était par conséquent extrêmement faible. by CEM / CBL 1 was therefore extremely low.
Des expériences ultérieures de titrage de sérums réactifs pour l'antiHTLV-III ont démontré que les titres étaient en gros les mêmes lors des essais par i'ELISA CEM/CBL 1 Subsequent titration experiments for antiHTLV-III reactive sera demonstrated that the titers were roughly the same in the ELISA CEM / CBL 1 assays
et les analyses directes. Ceci a été confirmé par l'exa- and direct analyzes. This was confirmed by the exa-
men ultérieur de sérums prélevés sur des patients subis- men later of sera taken from patients undergoing
sant une séroconversion aigu& à la suite d'une infection primaire par HTVL-III. Encore une fois il n'y avait en an acute seroconversion following a primary infection with HTVL-III. Again there was no
gros aucune différence dans le niveau ou le temps de réac- big no difference in level or reaction time
tivité initial entre l'analyse par liaison directe et i'ELISA compétitif. En utilisant la même méthode d'essai, initial activity between direct link analysis and competitive ELISA. Using the same test method,
des sérums de patients contenant des anticorps anti-lympho- patient sera containing anti-lympho- antibodies
cytes oligo et pan-réactifs, et des sérums de patients oligo and pan-reactive cytes, and patient sera
atteints d'une maladie auto-immunitaire, ont été non réac- with autoimmune disease, have not been reacted
tifs dans l'ELISA compétitif. Considérées ensemble ces tifs in competitive ELISA. Considered together these
données indiquent une spécificité et une sensibilité éle- data indicate specificity and high sensitivity
vées de cet ELISA compétitif pour l'anticorps du rétro- of this competitive ELISA for the antibody of the retro-
virus lié au SIDA.AIDS-related virus.
EXEMPLE 4.EXAMPLE 4.
ELISA compétitif en une étape pour l'anti-HTLV-I On a sélectionné et préparé des sérums et des réactifs de la même façon que pour l'analyse immunologique du CEM/ CBL i de l'Exemple 3, à ceci près qu'on a utilisé des Competitive one-step ELISA for anti-HTLV-I Sera and reagents were selected and prepared in the same way as for the immunological analysis of CEM / CBL i in Example 3, except that used
cellules infectées par HTLV-I pour la préparation de l'anti- cells infected with HTLV-I for the preparation of anti
gène et des sérums de patients contaminés par HTLV-I comme gene and sera from patients contaminated with HTLV-I as
source de réactifs.source of reagents.
La figure 3 montre la densité optique fournie par 32 sérums Figure 3 shows the optical density provided by 32 sera
cliniques, y compris trois témoins connus faiblement posi- clinical trials, including three known low-dose controls
tifs. Une différenciation claire s'est manifestée entre les sérums réactifs et non réactifs, la densité optique moyenne de cinq sérums réactifs pour cet anticorps étant 0,099 (0,060 à 0,129) et la densité optique moyenne de 24 sérums non réactifs pour cet anticorps étant 1,64 (1,48 à 1,83). L'essai est robuste et on peut faire varier les conditions mais en pratique on a décidé d'adopter comme optimum une incubation immune d'une heure à 45 C. Ceci correspond aux conditions adoptées pour la détection des tifs. A clear differentiation was manifested between reactive and non-reactive sera, the average optical density of five reactive sera for this antibody being 0.099 (0.060 to 0.129) and the average optical density of 24 non-reactive sera for this antibody being 1.64 (1.48 to 1.83). The test is robust and the conditions can be varied, but in practice we have decided to adopt as an optimum one hour immune incubation at 45 C. This corresponds to the conditions adopted for the detection of
anticorps de CEM/CBL 1.CEM / CBL antibody 1.
La même formule d'essai a été utilisée pour dépister plus de 1000 donneurs de sang britanniques tout-venant et aucun The same test formula was used to screen more than 1,000 non-standard British blood donors and none
sérum réactif n'a été identifié. En revanche, un dépis- reactive serum has not been identified. However, a
tage sélectif de quelques 75 donneurs d'origines afri- selective selection of some 75 donors of African origin
caine et antillaise a permis d'identifier un seul donneur caine et caribbean helped identify a single donor
séropositif donnant pour la première fois. HIV positive giving for the first time.
La procédure décrite ci-dessus a été répétée mais en uti- The procedure described above was repeated but in use
lisant des sérums de patients infectés par HTLV-II comme reading sera from patients infected with HTLV-II as
source de globuline de recouvrement et comme source d'IgG. source of recovery globulin and as source of IgG.
On a utilisé des cellules infectées par HTLV-II comme Cells infected with HTLV-II were used as
source d'antigène. Ces réactifs ont été choisis et pré- source of antigen. These reagents were chosen and pre-
parés de la même façon que précédemment décrit dans l'exem- dressed in the same way as previously described in the example
ple 2 pour le RIA de l'anti-HTLV-III. ple 2 for the anti-HTLV-III RIA.
EXEMPLE 5EXAMPLE 5
Production et utilisation de l'équipement d'essai. Production and use of test equipment.
1. Réactifs On a recouvert au moins la surface interne des puits d'une plaque de polystyrène multipuits contenant 96 puits d'un anticorps humain du CBL-1 purifié. L'anticorps provenait d'un sérum traité par la chaleur prélevé sur un humain contaminé par le rétrovirus du SIDA. Après recouvrement du polystyrène par l'anticorps, on a neutralisé les sites de liaison résiduels par une protéine inerte, dans le cas présent l'albumine de sérum bovin. L'antigène utilisé pour l'insolubilisation sur les plaques, de polystyrène était le CBL-1. On a d'abord traité celui-ci par la F propiolactone viricide et une suspension du CBL-1 inactivé 1. Reagents At least the internal surface of the wells was covered with a multi-well polystyrene plate containing 96 wells of a purified human antibody to CBL-1. The antibody came from a heat treated serum from a human infected with the AIDS retrovirus. After covering the polystyrene with the antibody, the residual binding sites were neutralized with an inert protein, in this case bovine serum albumin. The antigen used for insolubilization on the plates of polystyrene was CBL-1. This was first treated with F propiolactone viricide and a suspension of inactivated CBL-1
dans le tampon TRIS/BSA/Tween a été incubée avec le poly- in TRIS / BSA / Tween buffer was incubated with poly-
styrène traité pendant deux jours environ à température ambiante. De cette façon, le CBL-1 a été solubilisé par styrene treated for about two days at room temperature. In this way, the CBL-1 was dissolved by
liaison indirecte au support de polystyrène par l'inter- indirect bond to the polystyrene support via the
médiaire de l'anticorps. Ce composant est le premier compo- medium of the antibody. This component is the first component
sant de l'équipement d'essai.health testing equipment.
On a préparé le second composant de l'équipement d'essai en marquant le même anticorps humain qui a été utilisé pour recouvrir le polystyrène comme décrit ci-dessus. On a marqué l'anticorps par conjugaison avec la peroxydase The second component of the test equipment was prepared by labeling the same human antibody which was used to coat the polystyrene as described above. The antibody was labeled by conjugation with peroxidase
de raifort (HRPO) en utilisant des techniques de conjugai- horseradish (HRPO) using conjugation techniques
son classiques. On a conservé cet anticorps marqué par HRPO à l'état lyophilisé et l'a reconstitué immédiatement avant l'utilisation en utilisant une suspension dans un its classics. This HRPO-labeled antibody was kept in a lyophilized state and reconstituted immediately before use using a suspension in a
diluant aqueux.aqueous thinner.
En plus des deux composants mentionnés ci-dessus, il est In addition to the two components mentioned above, it is
souhaitable d'inclure dans l'équipement d'essai des réac- desirable to include in the test equipment
tifs auxiliaires de façon à mettre à disposition tous auxiliary devices so as to make all available
les réactifs de révélation et de contrôle nécessaires. the necessary development and control reagents.
Pour l'équipement utilisant la HRPO comme traceur, il est commode d'utiliser la 3,3',5,5 '-tétraméthylbenzidine For equipment using HRPO as a tracer, it is convenient to use 3,3 ', 5,5' -tetramethylbenzidine
257610?257610?
(TMB) comme substrat pour l'enzyme;.la TMB a été mise (TMB) as a substrate for the enzyme; the TMB has been
en oeuvre sous forme de comprimés, chaque comprimé procu- used in tablet form, each tablet provides
rant un substrat suffisant pour 96 puits. Immédiatement avant utilisation, on a dissous les comprimés de TMB dans une solution aqueuse contenant du citrate trisodique et du peroxyde d'hydrogène. Il est également souhaitable de prévoir des sérums témoins positif et négatif. Le sérum témoin négatif était du sérum humain normal non réactif pour l'anticorps du CLB-1 dans ce test. Le sérum témoin sufficient substrate for 96 wells. Immediately before use, the TMB tablets were dissolved in an aqueous solution containing trisodium citrate and hydrogen peroxide. It is also desirable to provide positive and negative control sera. The negative control serum was normal human serum not reactive for the antibody to CLB-1 in this test. The control serum
positif était un sérum humain traité par la chaleur, réac- positive was a heat treated human serum, reacted
tif pour l'anticorps du CBL-1 dans la procédure d'essai. tif for the CBL-1 antibody in the test procedure.
De plus, il est souhaitable de prévoir, comme sérum témoin de coupure, un sérum humain traité par la chaleur réactif (au niveau de coupure dans l'essai) pour l'anticorps du CBL-1 et également un fluide de lavage comprenant du sérum In addition, it is desirable to provide, as cut-off control serum, a human serum treated with reactive heat (at cut-off level in the test) for the antibody to CBL-1 and also a washing fluid comprising serum.
physiologique et du Tween 20.physiological and Tween 20.
2. Utilisation de l'équipement d'essai. 2. Use of test equipment.
L'anticorps marqué à la HRPO a été reconstitué immédiate- The HRPO-labeled antibody was reconstituted immediately-
ment avant utilisation. L'essai a été effectué en utili- before use. The test was carried out using
sant 25 microlitres d'échantillon de sérum par puits. 25 microliters of serum sample per well.
Deux puits ont reçu un sérum témoin négatif et un un sérum témoin positif, trois un sérum témoin de coupure et les échantillons à tester ont été introduits dans les puits restants. On a introduit des portions de 75 microlitres de l'anticorps marqué à la HRPO reconstitué dans chaque Two wells received a negative control serum and one a positive control serum, three a cut-off control serum and the test samples were introduced into the remaining wells. 75 microliters of the reconstituted HRPO-labeled antibody were introduced into each
puits, puis on a couvert la plaque à puits et on l'a incu- well, then we covered the well plate and incubated it
bée sur un bloc chauffant à 45 pendant une heure, ou alternativement à 20 à 25 C pendant une nuit pour une incubation d'au moins 16 heures. A la fin de la période d'incubation, on a lavé la plaque et ajouté à chaque puits open on a heating block at 45 for one hour, or alternatively at 20 to 25 ° C overnight for an incubation of at least 16 hours. At the end of the incubation period, the plate was washed and added to each well
des portions de 100 microlitres de solution de substrat. portions of 100 microliters of substrate solution.
La plaque a ensuite été incubée pendant 20 minutes entre 18 et 25 C, après quoi une couleur bleue s'est développée dans les puits contenant les échantillons négatifs. Des portions de 50 microlitres d'acide sulfurique 2M ont alors été ajoutées à chaque puits, la couleur bleue devenant The plate was then incubated for 20 minutes at 18-25 C, after which a blue color developed in the wells containing the negative samples. Portions of 50 microliters of 2M sulfuric acid were then added to each well, the blue color becoming
2576T1072576T107
alors jaune. On a ensuite lu l'absorbance de chaque puits à 450 nm, dans les 30 minutes suivant l'addition de l'acide then yellow. The absorbance of each well was then read at 450 nm, within 30 minutes of adding the acid.
sulfurique, en utilisant un lecteur de plaque à micro- sulfuric, using a micro plate reader
puits. 3. Résultats Les résultats ont été évalués de la façon suivante: on a calculé l'absorbance moyenne des trois sérums témoins well. 3. Results The results were evaluated as follows: the mean absorbance of the three control sera was calculated
de coupure. On a alors considéré comme négatif pour l'anti- cutoff. We then considered negative for the anti
corps du rétrovirus du SIDA, dans les limites du système d'essai, tout échantillon présentant une absorbance égale body of the AIDS retrovirus, within the limits of the test system, any sample with equal absorbance
ou supérieure à la valeur moyenne du témoin de coupure. or higher than the average value of the cut-off indicator.
Tout échantillon présentant une absorbance inférieure à la moyenne du témoin de coupure ou jusqu'à 10% au-dessus Any sample with an absorbance below the average of the cut-off indicator or up to 10% above
de celle-ci a été de nouveau testé. of it has been tested again.
Tout sérum apparaissant positif de façon répétée dans cet essai a été testé de nouveau aux fins de confirmation Any serum that appears repeatedly positive in this test has been retested for confirmation
en utilisant l'immunofluorescençe ou la méthode de sépa- using immunofluorescence or the separation method
ration par électrophorèse et transfert connue sous la ration by electrophoresis and transfer known as
désignation "Western Blot"."Western Blot" designation.
La procédure décrite ci-dessus a été-testée avec 1600 échantillons de routine de donneurs de banques du sang avec des résultats négatifs. Cependant, quand on a testé The procedure described above has been tested with 1600 routine samples from blood bank donors with negative results. However, when we tested
d'autres spécimens cliniques provenant de patients présen- other clinical specimens from patients with
tant un diagnostic clinique de SIDA, de para-SIDA (Aids- both a clinical diagnosis of AIDS, of para-AIDS (Aids-
relatex complex) ou d'autres maladies, on a détecté des résultats positifs qui, pratiquement dans tous les cas, ont été confirmés au test par immunofluorescence et par un autre essai immunologique avec enzyme. On a obtenu relatex complex) or other diseases, positive results have been detected which in almost all cases was confirmed by the immunofluorescence test and another enzyme immunoassay. We got
les résultats indiqués dans le tableau 2. the results shown in Table 2.
25761t0725761t07
TABLEAU 2TABLE 2
Réactivité de sérums de donneurs de sang et de patients ayant le SIDA, des états associés au SIDA et d'autres maladies. Positif pour Positif pour Nombre l'anticorps l'anticorps Groupe clinique d'échantillons avec l'équiconfirméa pement d'essai Reactivity of sera from blood donors and patients with AIDS, AIDS-related conditions and other diseases. Positive for Positive for Number Antibody Antibody Clinical sample group with test confirmation
Donneurs de sang 1600 0 -Blood donors 1600 0 -
SIDA 4 4 4AIDS 4 4 4
para-SIDA 39 39 39 Groupes à haut risque 7 7 7 Autres maladiesb Mononucléose para-AIDS 39 39 39 High-risk groups 7 7 7 Other diseasesb Mononucleosis
infectieuse 48 0 -infectious 48 0 -
Hépatite B 25 3c 2 Syphilis 117 2 2 Hepatitis B 25 3c 2 Syphilis 117 2 2
Rhumatisme articu-Rheumatoid arthritis
laire 9 O Autres infectionsd 37 Omilk 9 O Other infectionsd 37 O
aLes tests de confirmation comprennent l'immunofluores- aConfirmation tests include immunofluores-
cence et un essai immunologique alternatif avec enzyme. cence and an alternative enzyme immunoassay.
bEchantillons positifs seuls confirmés. b Only positive samples confirmed.
CUn échantillon positif à deux réalisations de l'essai sur A positive sample to two achievements of the test on
quatre, négatif à la confirmation. four, negative upon confirmation.
dInclut rubéole (18 cas), parvovirus (9), cytomégalovirus dIncludes rubella (18 cases), parvovirus (9), cytomegalovirus
(5), toxoplasmose (5).(5), toxoplasmosis (5).
Le principe de l'utilisation d'un antisérum humain pour lier un antigène viral à la phase solide donne une phase solide qui reflète elle-même le modèle d'antigènes viraux The principle of using a human antiserum to bind a viral antigen to the solid phase gives a solid phase which itself reflects the pattern of viral antigens
le mieux reconnus par les humains. Ceci peut être avanta- best recognized by humans. This may be before-
geux car il y aura alors une bonne adaptation entre le mélange d'antigènes capturés et le profil des anticorps humains. De plus, les conditions douces utilisées pour la préparation d'antigènes peut permettre la préservation d'épitopes conformationnels délicats non représentés dans gous because there will then be a good adaptation between the mixture of antigens captured and the profile of human antibodies. In addition, the mild conditions used for the preparation of antigens may allow the preservation of delicate conformational epitopes not shown in
les préparations purifiées par gradient et éclatées uti- gradient purified and exploded preparations used
lisées dans les autres essais en phase solide. Il est maintenant possible d'ajuster le mélange d'antigènes de phase solide en recouvrant la phase solide d'un anticorps monoclonal murin de spécificité définie de façon que les read in the other solid phase tests. It is now possible to adjust the mixture of solid phase antigens by covering the solid phase with a murine monoclonal antibody of defined specificity so that the
antigènes immobilisés aient une spécificité prédéter- immobilized antigens have a specific predeter-
minée. Les données fournies ici démontrent la supériorité undermined. The data provided here demonstrates the superiority
du test quand un anticorps monoclonal sélectionné réagis- of the test when a selected monoclonal antibody reacts
sant avec p25 (une protéine 25 K Dalton) est utilisé sur la phase solide. Les avantages portent sur la quantité Health with p25 (a 25 K Dalton protein) is used on the solid phase. The advantages relate to the quantity
plus faible d'antigène nécessaire pour une recherche conve- lower antigen required for proper research
nable (Tableau A) et sur la sensibilité accrue de l'essai résultant, voir le Tableau B, qui montre que les dilutions au point final de sérums individuels donnent une inhibition supérieure (c'est-à-dire une lecture d'OD inférieure) table (Table A) and on the increased sensitivity of the resulting assay, see Table B, which shows that endpoint dilutions of individual sera give greater inhibition (i.e., lower DO reading )
dans l'essai monoclonal que dans l'essai polyclonal. L'aug- in the monoclonal test than in the polyclonal test. August
mentation de sensibilité a rendu l'essai plus efficace dans la détection de la production précoce d'anticorps par comparaison avec de nombreux autres essais. De plus, l'utilisation d'un anticorps murin sur la phase solide évite le problème potentiel de la réticulation par des facteurs du type rhumatorde entre l'IgG humaine de la phase solide et le conjugué d'IgG humaine dans les essais homologues. Pratiquement, on a identifié un petit nombre de sérums qui manifestent de façon régulière un degré d'inhibition supérieur dans l'essai à base monoclonale par rapport à l'essai à base polyclonale. Ce phénomène est apparemment dû à la réactivité de niveau faible et de titre faible qui lie le conjugué à la phase solide d'une manière non spécifique dans les essais homologues seulement. Ce phénomène ou un phénomène similaire peut aussi expliquer une autre constatation inattendue, à savoir que la distribution de réactivité en densité optique de sérums normaux est beaucoup plus étroite dans l'essai à base monoclonale que dans un essai polyclonal réalisé simultanément. Etant donné la simplicité constatée de l'utilisation d'un anticorps monoclonal pour un produit de gène rétroviral gag, fournissant essentiellement un essai compétitif pour la réponse humaine anti-HTLV-III contre le nucléolde, il est probable que l'utilisation d'anticorps pour des produits env définis permettra le développement d'essais Mention of sensitivity made the assay more effective in detecting early production of antibodies compared to many other assays. In addition, the use of a murine antibody on the solid phase avoids the potential problem of cross-linking by rheumatoid-type factors between human IgG of the solid phase and the human IgG conjugate in homologous trials. In practice, a small number of sera have been identified which regularly exhibit a higher degree of inhibition in the monoclonal test compared to the polyclonal test. This phenomenon is apparently due to the reactivity of low level and of low titer which binds the conjugate to the solid phase in a non-specific way in the homologous tests only. This or a similar phenomenon may also explain another unexpected finding, namely that the distribution of reactivity in optical density of normal sera is much narrower in the monoclonal test than in a polyclonal test carried out simultaneously. Given the simplicity found in the use of a monoclonal antibody for a retroviral gag gene product, essentially providing a competitive assay for the human anti-HTLV-III response against the nucleus, it is likely that the use of antibodies for defined env products will allow the development of tests
analogues pour des anticorps contre des antigènes d'enve- analogs for antibodies against antigens of
loppes sélectionnés. Ceci permettra une étude beaucoup plus précise de la réponse humaine à différents antigènes selected loppes. This will allow a much more precise study of the human response to different antigens.
viraux qui peuvent avoir de l'importance en termes clini- which may be of clinical importance
ques, prognostiques et de lutte contre l'infection. ques, prognostics and infection control.
TABLEAU ATABLE A
Titration de l'antigène CEM/CBL 1 sur des phases solides Titration of the CEM / CBL 1 antigen on solid phases
polyclonales et monoclonales.polyclonal and monoclonal.
Dilution Revêtement de la phase solide de l'antigène de l'antigène Polyclonal Monoclonal * Neg.Cou- Positif Neg C pou-rePositif pure pure Dilution Coating of the solid phase of the antigen of the Polyclonal Monoclonal antigen * Neg.Cou- Positive Neg C for pure pure
1.34** 0.69 0.05 NT NT NT1.34 ** 0.69 0.05 NT NT NT
1.14 0.45 0.03 1.85 0.86 0.111.14 0.45 0.03 1.85 0.86 0.11
0.82 0.45 0.03 NT NT NT0.82 0.45 0.03 NT NT NT
NT NT NT 1.50 0.37 0.09NT NT NT 1.50 0.37 0.09
NT NT NT 1.36 0.38 0.08NT NT NT 1.36 0.38 0.08
NT NT NT 1.23 0.28 0.07NT NT NT 1.23 0.28 0.07
100 NT NT NT 1.18***0.27 0.07100 NT NT NT 1.18 *** 0.27 0.07
* Coupure - témoin faiblement positif ** OD à 450 nm dans les conditions standards de test pour l'anti-CEM-CBL-1 *** Titre "de travail" de la préparation d'antigène NT = Non testé * Cut - weak positive control ** OD at 450 nm under standard test conditions for anti-CEM-CBL-1 *** "Working" title of the antigen preparation NT = Not tested
TABLEAU BTABLE B
OD à 450 nm de dilutions de 19 sérums titrés à 50% du point final d'inhibition, testées sur des phases solides polyclo- OD at 450 nm of dilutions of 19 sera titrated at 50% of the final point of inhibition, tested on polyclo- solid phases
nales et monoclonales.nales and monoclonals.
Revêtement de la phase solide Sérum Polyclonal Monoclonal Témoin positif 0.08 0.09 Coupure 0.76 0.55 Négatif 1.39 1.42 Hémophile -1 1.08 0.86 Coating of the solid phase Polyclonal Monoclonal Serum Positive control 0.08 0.09 Cutoff 0.76 0.55 Negative 1.39 1.42 Hemophiliac -1 1.08 0.86
2 0.95 0.772 0.95 0.77
3 1.01 0.773 1.01 0.77
4 1.04 0.744 1.04 0.74
Sida 1 0.63 0.48AIDS 1 0.63 0.48
2 0.93 0.712 0.93 0.71
3 0.85 0.523 0.85 0.52
4 0.70 0.564 0.70 0.56
PGL 1 0.84 0.62PGL 1 0.84 0.62
(lymphadénopathie 2 0.84 0.58 générale 3 0.73 0.56 persistante) 4 0.60 0. 48 Drogué 1 0.50 0.44 (lymphadenopathy 2 0.84 0.58 general 3 0.73 0.56 persistent) 4 0.60 0. 48 Drug addict 1 0.50 0.44
2 0.66 0.502 0.66 0.50
3 0.95 0.733 0.95 0.73
4 0.85 0.634 0.85 0.63
Sain 1 0.50 0.41Healthy 1 0.50 0.41
2 0.56 0.422 0.56 0.42
3 0.69 0.493 0.69 0.49
Dans les exemples ci-dessus, l'essai est conduit par une In the examples above, the test is carried out by a
détermination de traceur associé à la phase solide. Cepen- determination of tracer associated with the solid phase. However
dant, le niveau de traceur associé au sérum de départ étant dant, the level of tracer associated with the starting serum being
ou pouvant être déterminé, il est aussi possible de surveil- or can be determined, it is also possible to monitor
ler la réduction de comptage radioactif ou de niveau d'enzyme associé à la phase liquide après que les sérums marqués connus et les sérums testés ont été mis en contact avec l'antigène en phase solide, et la réduction de niveau de traceur de The reduction in radioactive count or level of enzyme associated with the liquid phase after the known labeled sera and the tested sera have been brought into contact with the solid phase antigen, and the reduction in tracer level.
la phase liquide utilisée comme mesure de la teneur en anti- the liquid phase used as a measure of the anti-
corps des sérums testés.body of sera tested.
Les avantages de l'essai compétitif simultané peuvent être The advantages of concurrent competitive testing can be
résumés sous les titres suivants.summarized under the following headings.
Préparation de l'antigène.Antigen preparation.
Bien que l'exemple 2 décrive l'utilisation de virus HTLV-III purifiés, la fixation accrue résultant de l'utilisation d'un anticorps immobilisé permet d'utiliser pour le recouvrement une préparation de lysat de cellules brutes quand un tel Although Example 2 describes the use of purified HTLV-III viruses, the increased binding resulting from the use of an immobilized antibody makes it possible to use for recovery a preparation of crude cell lysate when such a
antigène n'est pas susceptible par lui-même de se lier direc- antigen is not by itself capable of direct binding
tement de façon utile à une phase solide. Cette mesure sup- usefully in a solid phase. This measure sup-
prime la contrainte constituée par la nécessité d'un anti- takes precedence over the constraint constituted by the need for an anti
gène hautement purifié pour la production de tests de diag- highly purified gene for the production of diag-
nostic et rend leur fabrication plus facile. Cet avantage n'est pas applicable aux recherches directes dans lesquelles un revêtement de globuline humaine entière donnerait un signal nostic and makes their manufacture easier. This advantage is not applicable to direct research in which a coating of whole human globulin would give a signal
inévitable avec le traceur de globuline anti-humaine final. inevitable with the ultimate anti-human globulin tracer.
Formule d'essai.Test formula.
L'utilisation d'un volume de sérum non dilué offre un avan- Using an undiluted volume of serum offers an advantage
tage considérable aux centres de transfusion sanguine o la nécessité de procéder à une dilution initiale accroîtrait la charge de travail. Le rapport entre les volumes de sérum et de traceur enzyme peut varier de 1:1 à 1:10 avec une faible altération seulement de l'efficacité du test. L'optimum est 1:3 avec 25 /1l de sérum et 75 /1 de traceur enzyme, ce qui considerable tage at blood centers where the need for an initial dilution would increase the workload. The ratio between the volumes of serum and enzyme tracer can vary from 1: 1 to 1:10 with only a slight deterioration in the efficiency of the test. The optimum is 1: 3 with 25 / 1l of serum and 75/1 of enzyme tracer, which
fournit une bonne différenciation entre les sérums posi- provides good differentiation between positive sera
tifs et négatifs. Les durées d'essai peuvent être réduites tives and negatives. Test times can be reduced
à une heure ou moins en utilisant une technique ELISA. an hour or less using an ELISA technique.
Sensibilité Une mesure de la sensibilité d'un essai quelconque pour la recherche d'anticorps du SIDA est donnée par la proportion de sérums prélevés sur des malades du SIDA condamnés qui demeurent positifs. Avec les essais directs, il semble qu'un Sensitivity A measure of the sensitivity of any test for the detection of AIDS antibodies is given by the proportion of sera collected from condemned AIDS patients which remain positive. With direct testing, it seems that a
nombre variable de patients perdent la réactivité pour l'anti- variable number of patients lose responsiveness for anti
corps. Ceci ne se produit pas avec l'essai compétitif, ce qui suggère que la sensibilité de l'essai compétitif est body. This does not happen with competitive testing, which suggests that the sensitivity of competitive testing is
aussi bonne ou meilleure que celle des autres essais couram- as good or better than other popular tests
ment utilisés.ment used.
Spécificité Il n'y a pas lieu de s'attendre à ce qu'un essai compétitif Specificity There is no reason to expect a competitive test
présente le problème majeur de réactivité faussement positi- presents the major problem of falsely positive reactivity
ve. L'inclusion d'antigènes de membranes de lymphocytes dans l'enveloppe de virions HTLV conduit certainement à une fausse Fri The inclusion of lymphocyte membrane antigens in the envelope of HTLV virions certainly leads to a false
réactivité, de même que la présence d'aggrégats d'IgG adhé- reactivity, as well as the presence of IgG aggregates adhered
rant de façon non spécifique à la phase solide. Un tel phéno- rant non-specifically to the solid phase. Such a pheno-
mène ne donne pas lieu à une réactivité dans l'essai compé- leads does not give rise to a reactivity in the comprehensive test
titif. Des effets non spécifiques d'une concentration en protéine variable peuvent être minimisés par le choix d'un rapport sérum/traceur approprié (1:3, voir ci-dessus) et par l'utilisation d'une valeur de coupure supérieure à 50% de l'inhibition. Les sérums qui produisent une inhibition de la liaison au traceur égale ou supérieure à celle fournie par un sérum témoin interne sont considérés comme positifs à l'essai de dépistage mais l'essai doit être répété. Compte tenu du faible niveau de fausse réactivité, prévu à moins touchy. Non-specific effects of a variable protein concentration can be minimized by choosing an appropriate serum / tracer ratio (1: 3, see above) and by using a cutoff value greater than 50%. inhibition. Sera which produce an inhibition of tracer binding equal to or greater than that provided by an internal control serum are considered positive for the screening test but the test must be repeated. Given the low level of false reactivity, expected unless
d'l pour 5 000, il est peu probable que les réactions faus- of l per 5,000, it is unlikely that false reactions
sement positives dans l'ELISA compétitif créeront un problème numériquement aussi grand qu'elles semblent le faire dans les essais directs. Il en est particulièrement ainsi quand les essais directs sont exécutés sans antigène témoin. On positive in competitive ELISA will create a problem numerically as big as they seem to do in direct testing. This is particularly so when direct tests are performed without a control antigen. We
s'attend à ce que ce soit le cas dans les centres de trans- expects this to be the case in transit centers
fusion du fait que l'utilisation d'un antigène témoin double- fusion of the fact that the use of a double-
rait les quantités de réactif nécessaires dans les essais directs. the amounts of reagent required in the direct tests.
En résumé, la combinaison d'une formule simple, d'une sensi- In summary, the combination of a simple formula, a sensi-
bilité élevée et d'une spécificité élevée rend l'essai com- high bility and high specificity makes the test com-
pétitif idéal pour le dépistage des dons de sang et l'usage diagnostique. De plus, quand les centres utilisent un essai direct pour la recherche d'anti-HTLV-III, il peut se révéler préférable de confirmer la réactivité du sérum par un nouveau test à l'essai compétitif plutôt qu'en soumettant les sérums au "Western Blot", plus laborieux et moins sensible, qui peut être recommandé par la Food ideal petitive for screening blood donations and diagnostic use. In addition, when the centers use a direct test for anti-HTLV-III, it may be preferable to confirm the reactivity of the serum by a new test in the competitive test rather than by submitting the sera to the " Western Blot ", more laborious and less sensitive, which can be recommended by Food
and Drug Administration aux Etats-Unis. and Drug Administration in the United States.
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