FR2571060A1 - Nouveaux vecteurs de clonage et d'expression dans les cellules eucaryotes utilisant le virus de la vaccine - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE UN VIRUS RECOMBINANT DE LA VACCINE UTILE COMME VECTEUR DE CLONAGE OU D'EXPRESSION D'UN EXOGENE, CARACTERISE EN CE QU'IL COMPORTE AU MOINS: -TOUT OU PARTIE DU GENOME DU VIRUS DE LA VACCINE; -TOUT OU PARTIE DU FRAGMENT DE RESTRICTION ECORI DE PPBR322 INSERE DANS LE SITE ECORI DU GENE TK DU VIRUS DE LA VACCINE (SOUCHES VPB2 ET VPB3); -TOUT OU PARTIE DU FRAGMENT DE RESTRICTION PVUII DU VIRUS HERPES (HSV) CONTENANT LE GENE THYMIDINE KINASE; -UN FRAGMENT DE RESTRICTION SAU3A OU BCLI OU UN FRAGMENT D'ADN OBTENU PAR SONICATION DU GENOME VACCINE INSERE DANS LE SITE BGLII DU FRAGMENT PVUII AYANT UNE ACTIVITE PROMOTEUR DE L'EXPRESSION DU GENE TKHSV (SOUCHES VPT). L'INVENTION CONCERNE EGALEMENT TOUT PLASMIDE DERIVE DE L'ADN GENOMIQUE DES RECOMBINANTS VACCINE VPT ET CONTENANT LE FRAGMENT D'ADN VACCINE PROMOTEUR DE L'EXPRESSION DU GENE TKHSV (PLASMIDES PT) DANS LE VIRUS DE LA VACCINE.
Description
La présente invention concerne de nouveaux vecteurs de clonage et d'expression,notamment dans les cellules eucaryotes, utilisant le virus de la vaccine.
Depuis un certain temps, le virus de la vaccine est utilisé comme vecteur d'expression d'exogène dans les cellules eucaryotes, en particulier dans les cellules de mammifères.
Ce type de vecteur présente de nombreux avantages, en particulier il s'agit d'un virus qui est utilisé depuis longtemps et dont les propriétés sont bien connues.
Dans ce qui suit, on utilisera parfois la terminologie "le virus de la vaccine" (ou W) mais il est bien entendu que cette terminologie couvre, en fait, différents virus et en particulier les mutants.
Le virus de la vaccine ou poxvirus est un virus du genre orthopoxvirus qui contient un DNA double brin.
L'insertion d'un fragment d'ADN étranger dans le génome du W nécessite la construction d'un plasmide comportant de part et d'autre du DNA 3 insérer deux séquences de DNA d'une région non essentielle du VV.
Ce plasmide est utilisé pour transfecter des cellules infectées par le virus de la vaccine, l'insertion du DNA étranger dans le génome du W intervenant par recombinaison homologue.
Afin de pouvoir sélectionner les virus ayant intégré dans leur génome 1'ADN étranger, l'insertion est effectuée dans un gène marqueur, en général le gène codant pour la thymidine kinase (TK), ce qui a pour effet de rendre les virus correspondants TK-.
La présente invention concerne de nouveaux vecteurs de clonage et d'expression de gènes hétérologues dans les cellules eucaryotes et en particulier les cellules de mammifères.
I1 s'agit d'un virus recombinant de la vaccine utile comme vecteur de clonage ou d'expression d'un exogène, caractérisé en ce qu'il comporte au moins
tout ou partie du génome du virus de la vaccine,
tout ou partie du fragment de restriction
EcoRI de pBR322 inséré dans le site EcoRI du gène TK du virus de la vaccine.
tout ou partie du génome du virus de la vaccine,
tout ou partie du fragment de restriction
EcoRI de pBR322 inséré dans le site EcoRI du gène TK du virus de la vaccine.
En particulier, il s'agit de deux recombinants
VpB2 et VpB3 du virus de la vaccine ayant le fragment
EcoRI du DNA de pBR322 inséré dans le site EcoRI du gène TK dans les deux sens possibles (figures 1 et 2).
VpB2 et VpB3 du virus de la vaccine ayant le fragment
EcoRI du DNA de pBR322 inséré dans le site EcoRI du gène TK dans les deux sens possibles (figures 1 et 2).
Ce type de recombinant permet l'insertion facile d'un gène hétérologue dans le génome du W en clonant le gène sur pBR322 et en effectuant une transfection de cellules infectées par le recombinant du VV, par recombinaison'grace aux séquences homologues de pBR322, le gène hétérologue sera inséré dans certains recombinants.
Les recombinants vaccine ayant intégré- ce
DNA exogène peuvent étre ensuite isolés par hybridation in situ des plages virales au moyen d'une sonde spécifique après avoir pris une empreinte.
DNA exogène peuvent étre ensuite isolés par hybridation in situ des plages virales au moyen d'une sonde spécifique après avoir pris une empreinte.
L'un des avantages de ce type de recombinant est que le gène ainsi cloné peut être récupéré dans E. coli.
A cette fin, le DNA génomique des recombinants est isolé puis digéré par une enzyme de restriction (HindIII,
EcoRI, BamHI, etc.) qui libère un fragment contenant l'origine de réplication et le marqueur ampicilline et/ou le marqueur tétracycline de pBR322 ainsi que l'insertion de DNA exogène. Les produits de la digestion de ce DNA génomique sont ensuite circularisés puis transfectés dans E. coli et les plasmides sélectionnés par. l'åmpicilline ou la tétracycline.
EcoRI, BamHI, etc.) qui libère un fragment contenant l'origine de réplication et le marqueur ampicilline et/ou le marqueur tétracycline de pBR322 ainsi que l'insertion de DNA exogène. Les produits de la digestion de ce DNA génomique sont ensuite circularisés puis transfectés dans E. coli et les plasmides sélectionnés par. l'åmpicilline ou la tétracycline.
Bien que d'autres recombinants vaccine, nommEs vP7 et vP8, contenant pBR322 inséré à un autre endroit dans le génome vaccinal aient été déjà utilisés pour insérer du DNA exogène dans le virus vaccinal, les résultats prévus quant à l'expression de cette séquence n'ont pas été obtenus (PANICALI D., DAVIS S.N., WEINBERG R.L., et PAOLETTI E. (1983) Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5364-5368).
Les recombinants VpB2 et VpB3 sont différents de vP7 et vP8 par l'endroit où pBR322 est inséré dans le génome vaccinal ainsi~que par l'enzyme de restriction employée pour l'insertion (EcoRI, BamHI dans la référence précédente). Ce dernier point est important car dans les vecteurs de la présente invention on n'observe pas d'expression parasite avec au moins, lue reçombinant VpB3 par suite sans doute de la dispositin -différente de pBR322.
Ces vecteurs peuvent être utilisés pour le clonage et l'expression d'un exogène dans le virus de la vaccine. I1 convient, bien entendu, pour que l'exogène soit exprimé de disposer d'un promoteur actif dans le virus de la vaccine.
Pour qu'un recombinant vaccine (poxvirus) exprime une séquence codante exogène, il est en effet nécessaire de placer en amont une séquence vaccine ayant une activité promoteur de la transcription car les promoteurs de la polymérase II (cellules eucaryotes) ne sont pas reconnus par le système de transcription vaccinal.
Jusqu'à présent un seul fragment de DNA ayant cette activité du type précoce lorsqu'il est placé en amont d'une séquence exogène a été décrit (MACKETT M.,
SMITH G.L. et MOSS B. (1982) Vaccinia virus a selectable eukaryotic cloning andexpression vector. Proc. Natl.
SMITH G.L. et MOSS B. (1982) Vaccinia virus a selectable eukaryotic cloning andexpression vector. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 79, 7415-7419)
La présente invention concerne, en outre, une procédure pour obtenir un ensemble de fragments de DNA génomique vaccinal présentant une activité promoteur de l'expression d'un exogène (séquence codante ADN).
La présente invention concerne, en outre, une procédure pour obtenir un ensemble de fragments de DNA génomique vaccinal présentant une activité promoteur de l'expression d'un exogène (séquence codante ADN).
Ces fragments sont clonés dans le virus vaccinal (clones dénommés VpT) et dans E. coli (plasmides pT). Les fragments clonés dans E. coli peuvent être utilisés pour construire des vecteurs vaccine exprimant une séquence exogène utile.
Les recombinants vaccine VpT peuvent être également utilisés à cette fin avec la possibilité de sélectionner les recombinants TK
Pour ce faire, la présente invention propose un procédé de sélection de promoteurs de l'expression d'un exogène dans le virus de la vaccine, caractérisé en ce que
a) on construit à partir de fragments de 1'ADN génomique du virus de la vaccine une banque d'ADN
b) on insère, dans un plasmide comportant tout ou partie de 1'ADN de pBR322 et le gène TK de HVS situé dans 1'ADN de pBR322, les différents fragments de la banque préparée en a), en amont du gene TK/HVS
c) on infecte une culture cellulaire avec un virus recombinant selon l'une des revendications 1 à 4 et on transfecte lesdites cellules avec les plasmides obtenus en b) ; ;
d) on sélectionne les virus TK+, les fragments d'ADN génomiques du virus de la vaccine qu'ils comportent étant aptes à être utilisés comme promoteur de l'expression d'un exogène dans le virus de la vaccine.
Pour ce faire, la présente invention propose un procédé de sélection de promoteurs de l'expression d'un exogène dans le virus de la vaccine, caractérisé en ce que
a) on construit à partir de fragments de 1'ADN génomique du virus de la vaccine une banque d'ADN
b) on insère, dans un plasmide comportant tout ou partie de 1'ADN de pBR322 et le gène TK de HVS situé dans 1'ADN de pBR322, les différents fragments de la banque préparée en a), en amont du gene TK/HVS
c) on infecte une culture cellulaire avec un virus recombinant selon l'une des revendications 1 à 4 et on transfecte lesdites cellules avec les plasmides obtenus en b) ; ;
d) on sélectionne les virus TK+, les fragments d'ADN génomiques du virus de la vaccine qu'ils comportent étant aptes à être utilisés comme promoteur de l'expression d'un exogène dans le virus de la vaccine.
Dans un mode de mise en oeuvre de ce procédé, on construit une collection de virions recombinés vaccine ayant intégré le DNA de la séquence codante thymidine kinase du virus de l'herpès type 1 (TK/HSV) avec des petits fragments de DNA vaccine placés en amont.
L'ensemble de ces fragments (0,25 9 0,6 kb en moyenne) recouvre le génome vaccinal. Lorsqu'un de ces fragments possède une activité promoteur, la thymidine kinase est synthétisée et le virus recombinant devient TK et peut être sélectionné en milieu HAT, les cellules hôtes et le virus vaccinal d'origine étant TK
Pour pouvoir intégrer dans le virus vaccinal les constructions TK/HSV ayant en amont un petit fragment vaccine, il est nécessaire que l'ensemble de la construction à intégrer dans le virus vaccinal soit inséré dans un fragment du génome vaccinal vecteur.
Pour pouvoir intégrer dans le virus vaccinal les constructions TK/HSV ayant en amont un petit fragment vaccine, il est nécessaire que l'ensemble de la construction à intégrer dans le virus vaccinal soit inséré dans un fragment du génome vaccinal vecteur.
En effet, après transfection de ce fragment dans les cellules infectées par le virus vaccinal, l'intégration est réalisée par recombinaison dans les régions communes au DNA transfecté et au virus vaccinal et donc situées de-part et d'autre de la partie exogène.
Le recombinant VpB3 contient le DNA du plasmide pBR322 inséré dans la partie codante (site EcoRI) du gène TK vaccine et est donc TK (fig. 2). Les constructions constituées par un petit fragment vaccine placé en amont de la séquence TK/HSV déjà intégrée dans pBR322 ont été réaiisées en insérant au site BglII du plasmide PAGO (COLBERE-GARAPIN F., CHOUSTERMAN S.,
HORODNICEANU F., KOURILSKY P. et GARAPIN A.C. (1979).
HORODNICEANU F., KOURILSKY P. et GARAPIN A.C. (1979).
Cloning of the active thymidine kinase gene of herpes simplex virus type 1 in Escherichia coli K12. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 76, 3755-3759) des fragments de DNA vaccine (DNA soniqué de taille moyenne 0,6 kbp, DNA traité par Sau3A qui coupe statistiquement toutes les 256 bases et DNA traité par BclI) qui se trouvent insérés ainsi à 57 bp en amont de la séquence codante TK/HSV (fig. 3).
Par transfection du DNA total des plasmides non clonés de ces trois banques vaccine dans les cellules CliD (TK-) infectées par le recombinant vaccine VpB3 (TR on a obtenu des virions TK après sélection en milieu
HAT, formés après recombinaison par homologie pBR322 (fig. 4). Chacun de ces recombinants vaccine sélectionné doit contenir une insertion vaccine ayant une activité promoteur et placée en amont de la séquence codante
TK/HSV, l'ensemble étant inséré dans la partie pBR322 de VpB3 (fig. 4).
HAT, formés après recombinaison par homologie pBR322 (fig. 4). Chacun de ces recombinants vaccine sélectionné doit contenir une insertion vaccine ayant une activité promoteur et placée en amont de la séquence codante
TK/HSV, l'ensemble étant inséré dans la partie pBR322 de VpB3 (fig. 4).
On obtient de cette façon des promoteurs qui peuvent être utilisés dans différentes constructions mettant en jeu des recombinants de la-vaccine.
En effet, l'insertion vaccine ayant une activité promoteur peut Etre isolée de chaque plasmide pT puis utilisée pour exprimer une séquence exogène intégrée dans le virus vaccinal. Plusieurs promoteurs différents étant disponibles, il est possible de construire un recombinant vaccine exprimant plusieurs séquences exogènes. Le protocole décrit permet de choisir les promoteurs les plus adaptés (forte expression à l'époque tardive, etc) parmi la collection disponible et de pouvoir isoler facilement les fragments de DNA correspondants car déjà clones dans un plasmide.
Mais, les vecteurs TK+ obtenus sont également utilisables tels quels en remplaçant la séquence TK/HSV par une autre séquence exogène qui code pour une protéine d'intérêt pratique.
Après transfection par un fragment de DNA convenable, la sélection des recombinants utiles peut être effectuée en milieu BUdR (MACKETT M., SMITH G.L., et MOSS B. (1982). Vaccinia virus a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-7419).
Ces vecteurs offrent l'avantage d'avoir déjà un promoteur vaccine que l'on peut choisir selon ses caractéristiques, de ne pas impliquer nécessairement la présence d'un polylinker qui peut réduire l'expression et de pouvoir utiliser l'homologie pBR322 présente dans les recombinants. De plus, il s'agit ici de sélection de recombinants n'exprimant plus la TK/HSV alors que la référence ci-dessus concerne la TK vaccine endogène.
Ces vecteurs offrent l'avantage d'avoir déjà un promoteur vaccine que l'on peut choisir selon ses caractéristiques, de ne pas impliquer nécessairement la présence d'un polylinker qui peut réduire l'expression et de pouvoir utiliser l'homologie pBR322 présente dans les recombinants. De plus, il s'agit ici de sélection de recombinants n'exprimant plus la TK/HSV alors que la référence ci-dessus concerne la TK vaccine endogène.
De façon générale, les vecteurs recombinants selon l'invention comporteront de préférence dans le fragment EcoRI de pBR322, en particulier pour VpB2 et VpB3, au moins un promoteur de l'expression d'un exogène par le virus de la vaccine et un exogène codant pour une protéine déterminée situé en aval et placé sous la dépendance dudit promoteur.
L'invention concerne, en outre, les cellules eucaryotes, en particulier les cellules de mammifères, comportant les vecteurs de l'invention.
Par culture de ces cellules incorporant les vecteurs comportant un exogène codant pour une protéine déterminée, on pourra isoler du milieu de culture ladite protéine.
La nature des cellules transfectées dépendra évidemment de la protéine à préparer, de même les milieux de culture seront fonction des cellules à utiliser.
Les exemples ci-aprbs sont destinés à illustrer la présente invention mais ne la limitent aucunement.
EXEMPLE 1
Construction de VpB2 et VpB3
Le plasmide pBR-J comporte un fragment HindIII du genome du virus de la vaccine qui porte le gène TK, ce fragment est dénommé J/HindIII. La préparation de ce plasmide est décrite notamment dans WEIR J.P., BAJSZAR G., et MOSS B. (1982) Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell free translation of selected mRNA, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79, 1210-1214
HRUBY D.E. et BALL L.A. (1982) Mapping and identification of the vaccinia virus thymidine kinase gene, J. Virol.
Construction de VpB2 et VpB3
Le plasmide pBR-J comporte un fragment HindIII du genome du virus de la vaccine qui porte le gène TK, ce fragment est dénommé J/HindIII. La préparation de ce plasmide est décrite notamment dans WEIR J.P., BAJSZAR G., et MOSS B. (1982) Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell free translation of selected mRNA, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79, 1210-1214
HRUBY D.E. et BALL L.A. (1982) Mapping and identification of the vaccinia virus thymidine kinase gene, J. Virol.
43, 403-409; VASSEF A., BEN-HAMIDA F. et BEAUD G. (1983)
Mapping of a mutation site in the thymidine kinase gene of vaccinia virus by marker rescue, Ann. Virol. (Inst.
Mapping of a mutation site in the thymidine kinase gene of vaccinia virus by marker rescue, Ann. Virol. (Inst.
Pasteur) 143E, 375-385 ; DUBBS D.R., OTSUKA H., QAVI H.
et KIT S. (1983) Mapping thymidine kinase-deficient mutants of vaccinia virus by marker rescue with hybrid plasmid DNAs containing portions of the HindIII-J fragment of virus DNA, Virology 126, 408-411.
Ce fragment J/HindIII est isolé par restriction
HindIII et électrophorèse puis recircularisé par la ligase T4.
HindIII et électrophorèse puis recircularisé par la ligase T4.
Ce fragment recircularisé et le plasmide pBR322 sont traités par EcoRI et les fragments traités par la ligase T4 ; on obtient ainsi des plasmides dérivés de pBR322 comportant au site EcoRI une insertion comportant le gène TK. Suivant l'orientation du gène TK, on obtient deux plasmides dénommés pAV2 et pAV3.
EXEMPLE 2
Caractérisation des recombinants vaccine
VpB2 et VpB3
L'augmentation de 10X du nombre des recombinants vaccine TK formés après la transfection par les DNA pAV2 et-pAV3 suggère fortement que les clones TK VpB2 et VpB3 contiennent bien l'insertion pBR322. Afin de confirmer ce fait on a pu montrer que les plages virales formées sur une monocouche de cellules révèlent une hybridation
32 avec le DNA de pBR322 marqué au 32p, après la prise d'une réplique sur une membrane de nitrate de cellulose.
Caractérisation des recombinants vaccine
VpB2 et VpB3
L'augmentation de 10X du nombre des recombinants vaccine TK formés après la transfection par les DNA pAV2 et-pAV3 suggère fortement que les clones TK VpB2 et VpB3 contiennent bien l'insertion pBR322. Afin de confirmer ce fait on a pu montrer que les plages virales formées sur une monocouche de cellules révèlent une hybridation
32 avec le DNA de pBR322 marqué au 32p, après la prise d'une réplique sur une membrane de nitrate de cellulose.
La plupart des plages formées en milieu BUdR ont cette propriété alors que ces expériences sont négatives avec des plages formées par des virions TK ou le virus vaccinal d'origine TK+.
Ceci démontre la présence de séquences pBR322 dans le DNA de VpB2 et'VpB3.
Le DNA génomique de VpB2 et VpB3 a été ensuite isolé et les fragments obtenus, après digestion par
HindIII, ont été analysés par électrophorèse en comparant leur migration à celle des fragments du virus d'origine.
HindIII, ont été analysés par électrophorèse en comparant leur migration à celle des fragments du virus d'origine.
Dans le cas de VpB2 et VpB3, le fragment J/HindIII est absent et deux fragments supplémentaires sont observés (pour VpB2: 0,8 et 8,5 kbp ; pour VpB3: 4,1 et 5,2 kbp).
Ces résultats sont ceux prévus. De plus, les fragments supplémentaires devant contenir tout ou partie de pBR322 32 s'hybrident bien au DNA de pBR322 (sonde32P).
L'ensemble de ces résultats indique que la totalité du DNA de pBR322 a bien été intégrée dans la vaccine. Une preuve supplémentaire que les gènes de pBR322 intégré dans le virus vaccinal sont restés fonctionnels est apportée par les expériences qui suivent.
EXEMPLE 3
Sauvetage du plasmide pBR322 intégré dans
le virus vaccinal
Le DNA génomique de VpB2 et VpB3 a été isolé à partir de virions purifiés. I1 a été digéré par HindIII ou EcoRI puis circularisé par la ligase T4. Les produits de cette ligation ont été transfectés dans E. coli HB101 en présence d'ampicilline. Les plasmides obtenus sont également résistants à la tétracycline et ont les tailles prévues (pour HindIII : 5,2 kbp avec VpB3 et 8,5 avec
VpB2 ; pour EcoRI : identique à celle de pBR322 dans les deux cas). Les plasmides récupérés après traitement des
DNA génomiques de VpB2 et VpB3 par BamHI et XhoI ont également la taille prévue.
Sauvetage du plasmide pBR322 intégré dans
le virus vaccinal
Le DNA génomique de VpB2 et VpB3 a été isolé à partir de virions purifiés. I1 a été digéré par HindIII ou EcoRI puis circularisé par la ligase T4. Les produits de cette ligation ont été transfectés dans E. coli HB101 en présence d'ampicilline. Les plasmides obtenus sont également résistants à la tétracycline et ont les tailles prévues (pour HindIII : 5,2 kbp avec VpB3 et 8,5 avec
VpB2 ; pour EcoRI : identique à celle de pBR322 dans les deux cas). Les plasmides récupérés après traitement des
DNA génomiques de VpB2 et VpB3 par BamHI et XhoI ont également la taille prévue.
EXEMPLE 4
Construction des banques vaccine dans pAGO
Le DNA génomique a été isolé de virus purifié en gradient de saccharose. Le DNA de la souche vaccine IHD a été digéré par Sau3A ou BclI.
Construction des banques vaccine dans pAGO
Le DNA génomique a été isolé de virus purifié en gradient de saccharose. Le DNA de la souche vaccine IHD a été digéré par Sau3A ou BclI.
Le DNA du plasmide pAGO (COLBERE-GARAPIN F. et al.
(1979)) a été traité par BglII qui libère des extensions identiques à celles de Sau3A et BclI, puis par la phosphatase alcaline de veau.
La ligation du DNA vaccine fragmenté a été effectuée ensuite en ajoutant un excès de 2 à 3 fois de
DNA vaccine par rapport à pAGC (figure 3).
DNA vaccine par rapport à pAGC (figure 3).
Après transfection de E. coli HB101 par le produit de la ligation retraité par BglII pour éliminer pAGO recircularisé sans insertion, environ 3 300 colonies ont été récupérées, soit l'équivalent théorique de 4,6 génomes.
ta banque BclI a été obtenue de façon similaire et représente une collection de 335 colonies, soit l'équivalent théorique de 7 génomes vaccine.
La banque de DNA sonique a été constituée à partir du DNA de la souche vaccine Copenhagen, réduit à une taille moyenne de 600 bp par sonication. Ce DNA a été réparé par la DNA polymérase de T4 en présence des 4 dXTP et la ligation à bout franc effectuée ensuite avec le plasmide pAGO traité successivement par BglII, la DNA polymérase de T4 en présence des 4 dXTP puis la phosphatase alcaline, selon un protocole déjà décrit (DEININGER P.L. (1983) Random Subcloning of sonicated
DNA : application to shotgun DNA sequence analysis.
DNA : application to shotgun DNA sequence analysis.
Anal. Biochem. 129, 216-223). Cette banque est constituée par 1700 clones, soit l'equivalent théorique de 5,7 génomes.
L'analyse du DNA total isolé de ces 3 banques révèle une faible proportion de DNA de PAGO intact(sans insertion vaccine) dans la banque de DNA soniqué et dans celle des fragments BclI ; le DNA de pAGO intact est indétectable dans la banque Sau3A. Par ailleurs, l'analyse du produit de digestion du DNA de ces 3 banques par Sau3A révèle que les 2 sites Sau3A qui doivent limiter l'insertion vaccine dans PAGO sont bien présents car les 2 fragments adjacents prévisibles (1,1 et 1,6 kb) ont été observés dans le produit de dLgestion totale en quantité approximativement molaire.
EXEMPLE 5
Transfection des cellules CliD (TK ) infectées
par le recombinant vaccine VpB3 par le DNA des
3 banques Sau3A, BclI et DNA soniqué (fig. 3 et 5)
Les transfections ont été effectuées par fusion de protoplastes bactériens -en adaptant au système vaccinal une technique décrite (SCHAFNER W. (1980) Direct transfer of cloned genes from bacteria to mammalian cells, Proc.
Transfection des cellules CliD (TK ) infectées
par le recombinant vaccine VpB3 par le DNA des
3 banques Sau3A, BclI et DNA soniqué (fig. 3 et 5)
Les transfections ont été effectuées par fusion de protoplastes bactériens -en adaptant au système vaccinal une technique décrite (SCHAFNER W. (1980) Direct transfer of cloned genes from bacteria to mammalian cells, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77, 2163-2167 ; SANDRI-GOLDIN R.M.,
GOLDIN A.L., LEVINE M. et GLORIOSO J.C. (1981) High
Frequency trans fer of cloned herpes simplex virus type 1 sequences to mammalian cells by protoplast fusion, Mol.
GOLDIN A.L., LEVINE M. et GLORIOSO J.C. (1981) High
Frequency trans fer of cloned herpes simplex virus type 1 sequences to mammalian cells by protoplast fusion, Mol.
Cell. Biol. 1, 743-752 ; RASSOULZADEGAN M., BINETRUY B.
et CUZIN F. (1982) High-frequency of gene transfer after fusion between bacteria and eukaryotic cells, Nature 295 257-259). Les bactéries des banques ont été cultivées en milieu liquide, les plasmides amplifiés en présence de chloramphénicol et les protoplastes préparés par la méthode au lysozyme.
Une culture contrôle de bactéries avec le plasmide PAGO sans insertion vaccine est également préparée.
Les cellules ClîD (4 x 106 cellules en boite de Pétri 35 mm) sont infectées par VpB3 à une multiplicité de 0,3 PFU/cellule durant 2 heures. Le milieu est ensuite aspiré, la suspension de protoplastes (220 bactéries/cellule) est déposée sur la monocouche et l'ensemble est centrifugé à 3 000 rpm durant 10 minutes. Le surnageant est aspiré et environ 0,3 ml d'une solution à 48 t (p/p) de polyéthylène glycol 1 000 est déposé goutte à goutte et 1 minute plus tard 2,5 ml de tris-salin sont ajoutés doucement et la monocouche est lavée 4 fois par du tris-salin. Les cellules sont ensuite incubées en milieu HAT supplémenté en kanamycine 30 mg/l et le lendemain le milieu est changé.Deux jours après la transfection, la monocouche est congelée pour titrer les virions TK ou alternativement des cellules indicatrices (1,4 x 106) sont ajoutées toujours en milieu
HAT pour révéler les centres infectieux et le virus est récupéré ensuite par 3 congélations-décongélations.
HAT pour révéler les centres infectieux et le virus est récupéré ensuite par 3 congélations-décongélations.
EXEMPLE 6
Isolement des re-combinants vaccine TK+
Après addition des cellules indicatrices des plages virales ont été observées au microscope dans les boutes correspondant aux transfections par le DNA des 3 banques. Par contre, la boite contrôle (PAGO sans insertion vaccine) n'a pas révélé de plages Le titrage des virions TK+ (en milieu HAT) a confirmé cette conclusion puisque le nombre de virions TK+ obtenus -par boite était respectivement de 15 400, 11 000, 9 200 et 0 pour les transfections par les banques Sau3A, BclI,
DNA soniqué et PAGO contrôle. Une quarantaine de clones vaccine VpT ont été directement isolés pour caractérisation.
Isolement des re-combinants vaccine TK+
Après addition des cellules indicatrices des plages virales ont été observées au microscope dans les boutes correspondant aux transfections par le DNA des 3 banques. Par contre, la boite contrôle (PAGO sans insertion vaccine) n'a pas révélé de plages Le titrage des virions TK+ (en milieu HAT) a confirmé cette conclusion puisque le nombre de virions TK+ obtenus -par boite était respectivement de 15 400, 11 000, 9 200 et 0 pour les transfections par les banques Sau3A, BclI,
DNA soniqué et PAGO contrôle. Une quarantaine de clones vaccine VpT ont été directement isolés pour caractérisation.
Par ailleurs environ 4 000 PFU TK ont été amplifiés en bloc par un passage en milieu non sélectif. Le DNA du virus produit a été isolé puis les constructions insérées ont été récupérées par la technique du sauvetage du plasmide et donc clonés dans E. coli.
Chacun de ces clones a été de nouveau transfecté isolément dans VpB3 pour obtenir le recombinant vaccine correspondant.
Par ces deux méthodes, on a isolé 22 recombinants vaccine
VpT avec chaque plasmide pT correspondant, et il reste une cinquantaine de clones à étudier.
VpT avec chaque plasmide pT correspondant, et il reste une cinquantaine de clones à étudier.
EXEMPLE 7
Caractérisation de la thymidine kinase
exprimée par ces recombinants VpT
Afin de caractériser la thymidine kinase exprimée par ces recombinants VpT, on utilise l'iodo déoxycytidine IdC qui est un substrat spécifique de la TK/HSV qui la transforme en IdC monophosphate alors que la TK vaccine ne peut réaliser cette transformation.
Caractérisation de la thymidine kinase
exprimée par ces recombinants VpT
Afin de caractériser la thymidine kinase exprimée par ces recombinants VpT, on utilise l'iodo déoxycytidine IdC qui est un substrat spécifique de la TK/HSV qui la transforme en IdC monophosphate alors que la TK vaccine ne peut réaliser cette transformation.
On infecte les cellules ClîD (TK-) par une vingtaine de clones obtenus a.l'exemple précédent et on prépare des extraits cytoplasmiques. On prépare également des extraits de cellules ClîD infectées par le virus vaccinal souche IHD ou non infectées comme contrôle.
L'iododéoxycytidine (IdC) est un substrat spécifique de la TK/HSV (SUMMERS W.C. et SUMMERS W.P. (1977) (1251) deoxycytidine used in a rapid, sensitive and specific assay for Herpes simplex virus type 1 thymidine kinase,
J. Virol. 24, 314-318) et il n'y a pas de formation d'IdC monophosphate (IdCMP) dans les extraits dérivés de cellules ClîD infectées par le virus vaccinal (TK+) ou non infectées par chromatographie en couche mince du produit de la réaction enzymatique avec l'IdC marquée par l'iode 125 comme substrat (solvant nO 3) (SUMMERS W.C.
J. Virol. 24, 314-318) et il n'y a pas de formation d'IdC monophosphate (IdCMP) dans les extraits dérivés de cellules ClîD infectées par le virus vaccinal (TK+) ou non infectées par chromatographie en couche mince du produit de la réaction enzymatique avec l'IdC marquée par l'iode 125 comme substrat (solvant nO 3) (SUMMERS W.C.
et SUMMERS W.P. (1977)). La thymidine kinase des extraits dérivés de cellules infectées par chacun des 22 clones TK+ phosphoryle l'IdC puisqu'une tache très forte d'IdCMP radioactive est formée. Les cellules ClîD contiennent une déaminase qui convertit l'IdC en IdU, qui est un substrat reconnu à la fois par la TK/HSV et la TK vaccine.
Malgré cette conversion la formation d'IdCMP est facilement mise en évidence dans le cas des 22 clones analysés car l'IdUMP migre de façon différente de celle de l'IdCMP. On a vérifié que l'addition de tétrahydrouridine (50 pg/ml) bloque la formation d'IdU et d'IdUMP dans les extraits incubés en présence de 1251dC (SUMMERS W.C.
et SUMMERS W.P. (1977)) et n'affecte pas la formation d'IdCMP radioactive par la thymidine kinase induite par les VpT. Ces expériences montrent directement que la thymidine kinase conférant le caractère TK+ aux clones
VpT étudiés est bien le résultat de l'expression de la TK du type herpétique exogène. Ces résultats ont été confirmés par un test autoradiographique qui permet détection de l'incorporation de 125IdC au niveau des plages qui est plus rapide mais indirect (MACKETT M., SMITH G.L. et
MOSS B. (1982) Vaccinia virus : a selectable eukaryotic cloning and expression vector, Proc. Natl. Acad. Sci.
VpT étudiés est bien le résultat de l'expression de la TK du type herpétique exogène. Ces résultats ont été confirmés par un test autoradiographique qui permet détection de l'incorporation de 125IdC au niveau des plages qui est plus rapide mais indirect (MACKETT M., SMITH G.L. et
MOSS B. (1982) Vaccinia virus : a selectable eukaryotic cloning and expression vector, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 79, 7415-7419 ; PANICALI D. et PAOLETTI E. (1982)
Construction of poxviruses as cloning vectors : insertion of the thymidine kinase gene from Herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus, Proc. Natl.
Construction of poxviruses as cloning vectors : insertion of the thymidine kinase gene from Herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 79, 4927-4931).
EXEMPLE 8
Etude préliminaire des propriétés de ces clones VpT
ExEression du type précoce ou tardif de la
TKZHSV des clones VST
Les extraits dérivés de cellules ClîD infectées de façon synchrone durant 5 heures en présence ou en absence de cytosine arabinoside (araC) à 25 vg/ml pour inhiber la réplication du DNA viral et l'expression des fonctions tardives ont été préparés pour une vingtaine de clones TK+.
Etude préliminaire des propriétés de ces clones VpT
ExEression du type précoce ou tardif de la
TKZHSV des clones VST
Les extraits dérivés de cellules ClîD infectées de façon synchrone durant 5 heures en présence ou en absence de cytosine arabinoside (araC) à 25 vg/ml pour inhiber la réplication du DNA viral et l'expression des fonctions tardives ont été préparés pour une vingtaine de clones TK+.
Le niveau de TK induite a été mesuré dans ces extraits par la cinétique de phosphorylation de la thymidine trifide ou de celle de l'1251dC. Pour la plupart des clones, le niveau de thymidine kinase induite est identique avec ou sans araC : le promoteur vaccine correspondant est donc du type précoce. Par contre, pour plusieurs clones, une réduction du niveau de TK de 60 à 70 % est observée lorsque la réplication de 1'ADN viral est inhibée. Ces derniers clones expriment donc la TK plus fortement à l'étape tardive.
Structure~du gdnome des recombinants VST
L'ADN génomique de 6 clones VpT a été isolé et les fragments obtenus après traitement par HindIII et
BamHI analysés par électrophorèse. Les fragments supplémentaires attendus dans l'hypothèse de l'insertion de la séquence codante TK/HSV par les recombinants VpT ont été observés et contiennent bien la séquence TK/HSV car ils
32 s'hybrident à une sonde spécifique P. Dans ces 6 cas, la taille des plasmides obtenus par sauvetage correspondait à celle attendue d'après l'analyse du gel de 1'ADN génomique.
L'ADN génomique de 6 clones VpT a été isolé et les fragments obtenus après traitement par HindIII et
BamHI analysés par électrophorèse. Les fragments supplémentaires attendus dans l'hypothèse de l'insertion de la séquence codante TK/HSV par les recombinants VpT ont été observés et contiennent bien la séquence TK/HSV car ils
32 s'hybrident à une sonde spécifique P. Dans ces 6 cas, la taille des plasmides obtenus par sauvetage correspondait à celle attendue d'après l'analyse du gel de 1'ADN génomique.
EXEMPLE 9
Récupération du fra ent d'ADN vaccine ayant
une activité promoteur (sauvetage du plasmide)
L'ADN génomique de plusieurs recombinants vaccine VpT isolés selon l'exemple 6 est purifié et le plasmide pBR322 contenant l'insertion vaccine adjacente à la séquence codante HSV-TK est récupéré selon l'exemple 3, après digestion par HindIII ou BamHI.
Récupération du fra ent d'ADN vaccine ayant
une activité promoteur (sauvetage du plasmide)
L'ADN génomique de plusieurs recombinants vaccine VpT isolés selon l'exemple 6 est purifié et le plasmide pBR322 contenant l'insertion vaccine adjacente à la séquence codante HSV-TK est récupéré selon l'exemple 3, après digestion par HindIII ou BamHI.
Lorsque l'insertion vaccine ne présente pas de site de restriction HindIII ou BamHI, la taille des plasmides obtenus était voisine de 7,1 kb (HindIII) ou 7,6 kb (BamHI) ; dans le cas contraire, on récupère des plasmides de taille d'environ 4,8 kb (HindIII) ou 5,6 kb (BamHI).
Une évaluation plus précise de la taille de l'insertion vaccine a été obtenue par électrophorèse du produit de digestion des plasmides pT récupdrds des recombinants vaccine par MluI, qui coupe de part et d'autre du site
BglII du plasmide pAGO et libère ainsi deux fragments la taille du petit fragment est la somme de 150 bp (partie HSV) et de l'insertion vaccine. En effet, le site BglII ne peut généralement pas être utilisé car il n'est pas reconstitué dans les recombinants VpT.
BglII du plasmide pAGO et libère ainsi deux fragments la taille du petit fragment est la somme de 150 bp (partie HSV) et de l'insertion vaccine. En effet, le site BglII ne peut généralement pas être utilisé car il n'est pas reconstitué dans les recombinants VpT.
On a ainsi montré que les recombinants VpT ont les insertions vaccine dont ,les tailles (en kbp) sont les suivantes : VpT 15 (0,18), VpT 20 (0,166), VpT 22 (0,230),
VpT 35 (0,168), VpT 38 (0,380), VpT 56 (0,28), VpT 58 (1,07), VpT 63 (0,97), VpT 64 (0,30).
VpT 35 (0,168), VpT 38 (0,380), VpT 56 (0,28), VpT 58 (1,07), VpT 63 (0,97), VpT 64 (0,30).
Légende des figures 1 à 4
Sites d'enzymes de restriction
A : AvaI ; B : BamHI ; E : EcoRI
H : HindIII ; K : KpnI ; P : PstI (figures 1 et 2) et
PvuII (figures 3 et 4)
S : SalI ; X ou Xb : XbaI ; Xh : XhoI.
Sites d'enzymes de restriction
A : AvaI ; B : BamHI ; E : EcoRI
H : HindIII ; K : KpnI ; P : PstI (figures 1 et 2) et
PvuII (figures 3 et 4)
S : SalI ; X ou Xb : XbaI ; Xh : XhoI.
Abréviations
A r gène de pBR322 pour la résistance à l'ampicilline
T r gène de pBR322 pour la résistance à la tétracycline
Ori : origine de réplication de pBR322.
A r gène de pBR322 pour la résistance à l'ampicilline
T r gène de pBR322 pour la résistance à la tétracycline
Ori : origine de réplication de pBR322.
Claims (15)
1) Virus recombinant de la vaccine utile comme vecteur de clonage ou d'expression d'un exogène, caractérisé en ce qu'il comporte au moins
tout ou partie du génome du virus de la vaccine,
toutou partie du fragment de restriction
EcoRI de pBR322 inséré dans le site EcoRI du gène TK du virus de la vaccine.
2) Virus selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte le fragment de restriction EcoRI complet de pBR322.
3) Virus selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il s'agit du virus VpB2.
4) Virus selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il s'agit du virus VpB3.
5) Virus selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, dans le fragment EcoRI de pBR322 au moins un promoteur de l'expression d'un exogène par le virus de la vaccine.
6) Virus selon la revendication 5, caractérisé en ce que, en outre, en aval dudit promoteur et sous sa dépendance, se trouve placé un gène codant pour une protéine déterminée.
7) Cellule eucaryote comportant un virus recombinant selon l'une des revendications 1 à 6.
8) Cellule eucaryote comportant un virus recombinant selon la revendication 6.
9) Cellule eucaryote selon l'une des revendications 7 et 8, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule de mammifères.
10) Procédé de préparation d'une protéine déterminée, caractérisé en ce qu'on cultive des cellules eucaryotes selon la revendication 8 dans un milieu de culture et en ce qu'on isole après culture la protéine obtenue de la culture cellulaire.
11) Procédé de sélection de promoteurs de l'expression d'un exogène dans le virus de la vaccine, caractérisé en ce que
a) on construit à partir de fragments de 1'ADN génbmique du virus de la vaccine une banque d'ADN
b) on insère dans un plasmide comportant tout ou partie de 1'ADN de pBR322 et le gène TK de HSV situé dans 1'ADN de pBR322 les différents fragments de la banque préparée en a), en amont du gène TK/HSV
c) on infecte une culture cellulaire avec un virus recombinant selon l'une des revendications 1 à6 et on transfecte lesdites cellules avec les plasmides obtenus en b) ;
d) on sélectionne les virus TK+, les fragments d'ADN génomique du virus de la vaccine qu'ils comportent
étant aptes a être utilisés comme promoteur de l'expression d'un exogène dans le virus de la vaccine.
12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que les fragments d'ADN génomique sont des fragments de sonication de 1'ADN total, des fragments de restriction
Sau3A ou des fragments de restriction BclI.
13) Procédé selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce que la banque est insérée dans le plasmide pAGO.
14) Procédé selon la revendication 13, caractérisé
en ce que la banque est insérée au site BglII du plasmide
pAGO.
15) Procédé selon l'une des revendications 11 à 14, caractérisé en ce que l'on récupère le fragment d'ADN génomique par sauvetage du plasmide pBR322 et que l'on utilise tout ou partie de ce fragment comme promoteur de l'expression d'un exogène dans le virus de la vaccine.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8415159A FR2571060B1 (fr) | 1984-10-03 | 1984-10-03 | Nouveaux vecteurs de clonage et d'expression dans les cellules eucaryotes utilisant le virus de la vaccine |
Applications Claiming Priority (1)
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| FR8415159A FR2571060B1 (fr) | 1984-10-03 | 1984-10-03 | Nouveaux vecteurs de clonage et d'expression dans les cellules eucaryotes utilisant le virus de la vaccine |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2571060A1 true FR2571060A1 (fr) | 1986-04-04 |
| FR2571060B1 FR2571060B1 (fr) | 1987-01-09 |
Family
ID=9308300
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8415159A Expired FR2571060B1 (fr) | 1984-10-03 | 1984-10-03 | Nouveaux vecteurs de clonage et d'expression dans les cellules eucaryotes utilisant le virus de la vaccine |
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| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2571060B1 (fr) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0284416A1 (fr) * | 1987-03-27 | 1988-09-28 | Nippon Zeon Co., Ltd. | Avipoxvirus recombinant |
| US5387519A (en) * | 1987-03-27 | 1995-02-07 | Nippon Zeon Co., Ltd. | Recombinant avipoxvirus |
| WO2003078640A2 (fr) * | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Baxter International Inc. | Poxvirus modifies, incluant un vaccin issu du virus modifie de la variole derivant d'un virus de recombinaison pharmacosensible de la vaccine, et nouvelles techniques de selection |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0083286A2 (fr) * | 1981-12-24 | 1983-07-06 | Health Research, Incorporated | Virus de la vaccine modifié et méthodes de préparation et d'utilisation de celui-ci |
-
1984
- 1984-10-03 FR FR8415159A patent/FR2571060B1/fr not_active Expired
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0083286A2 (fr) * | 1981-12-24 | 1983-07-06 | Health Research, Incorporated | Virus de la vaccine modifié et méthodes de préparation et d'utilisation de celui-ci |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 49, no. 3, mars 1984, pages 857-864, American Society for Microbiology; M. MACKETT et al.: "General method for production and selection of infectious vaccinia virus recombinants expressing foreign genes" * |
| PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE USA, vol. 80, no. 17, Septembre 1983, Washington, US; D PANICALI et al.: "Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: Biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin" * |
Cited By (4)
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| EP0284416A1 (fr) * | 1987-03-27 | 1988-09-28 | Nippon Zeon Co., Ltd. | Avipoxvirus recombinant |
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| WO2003078640A2 (fr) * | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Baxter International Inc. | Poxvirus modifies, incluant un vaccin issu du virus modifie de la variole derivant d'un virus de recombinaison pharmacosensible de la vaccine, et nouvelles techniques de selection |
| WO2003078640A3 (fr) * | 2002-03-15 | 2003-12-18 | Baxter Int | Poxvirus modifies, incluant un vaccin issu du virus modifie de la variole derivant d'un virus de recombinaison pharmacosensible de la vaccine, et nouvelles techniques de selection |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2571060B1 (fr) | 1987-01-09 |
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|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |