FR2513264A1 - Procede d'agitation de cultures cellulaires et dispositif pour sa mise en oeuvre - Google Patents
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Abstract
PROCEDE D'AGITATION DE CULTURES CELLULAIRES ET DISPOSITIF POUR SA MISE EN OEUVRE. LE DISPOSITIF COMPORTE UN RECIPIENT 1 POUR CULTURE CELLULAIRE, MUNI D'UN ORIFICE D'ENTREE 2 ET D'UN ORIFICE DE SORTIE 3 ET COUPLE PAR L'INTERMEDIAIRE DESDITS ORIFICES A UN SYSTEME DE POMPE 4, 10 QUI ASSURE LA MISE EN MOUVEMENT DE LA COUCHE 7 DU DERIVE PERFLUORE, LEDIT DISPOSITIF COMPORTANT EN OUTRE DES MOYENS 5 D'INTRODUCTION DE SUBSTANCES NECESSAIRES A LA CROISSANCE DES CELLULES ET DES MOYENS 6 DE CONTROLE DES CONDITIONS DE CULTURE. APPLICATION EN BIOLOGIE ET EN MICROBIOLOGIE.
Description
La présente invention concerne un procédé d'agitation de cultures cellulaires et un dispositif pour sa mise en oeuvre.
Les cultures cellulaires en suspension directe ou sur microbilles ou toute autre condition, sont effectuées en milieu aqueux et sous agitation. L'agitation est généralement réalisée par des moyens mécaniques, par exemple à 1' aide d'un agitateur à palettes, dtun barreau aimanté ou tout autre moyen semblable.
Cependant, ces moyens d'agitation créent au sein de la culture cellulaire des forces de cisaillement importantes qui perturbent la culture et endommagent les cellules.
On a maintenant trouvé un nouveau procédé d'agitation qui permet d'éviter les inconvénients ci-dessus tout en assurant l'agiFation désirée.
Le procédé d'agitation de cultures cellulaires selon l'invention, consiste à utiliser, comme moyen d'agitation, un fluide inerte, non miscible à l'eau, ledit fluide étant mis en mouvement par un moyen approprié quelconque.
Le fluide inerte, qui, selon sa densité, sera au-dessus ou au-dessous du milieu de culture cellulaire, imprime audit milieu de culture, un mouvement lorsque luimême sera mis en mouvement par un moyen quelconque, tel qu'un agitateur, une pompe ou tout autre moyen.
Comme fluide inerte approprié aux fins de l'invention, on peut utiliser n'importe quel fluide inerte, qui est non miscible à l'eau et plus ou moins dense que l'eau.
A titre d'exemple illustratif de fluide inerte, on peut citer les dérivés perfluorés liquides, tels que par exemple le dérivé de formule c r - CH = CH - C6F 13
6, v
Par "dérivés perfluorés, on désigne des composés hydrocarbonés dont les chaînes alkyle sont partiellement ou totalement fluorées. Pour plus de détail sur les dérivés perfluorés, on pourra se référer à l'article de 3.G. RIESS et M. LE BLANC -. ANCEWANDTE CHEMIE (1978) 17 621-634.
6, v
Par "dérivés perfluorés, on désigne des composés hydrocarbonés dont les chaînes alkyle sont partiellement ou totalement fluorées. Pour plus de détail sur les dérivés perfluorés, on pourra se référer à l'article de 3.G. RIESS et M. LE BLANC -. ANCEWANDTE CHEMIE (1978) 17 621-634.
On sait que les dérivés perfluorés sont utilisés comme substituts du sang, en raison de leur très grande capacité de dissolution de l'oxygène. A cet effet, on pour-ra se référer aux brevets FR 73 39 533 - 74 03 244 - 72 16 962 75 37 587 ; aux brevets 3.778.381 et 4.105.798, ainsi qu'à l'article de 3.G. RIESS et al. dans Angew.Chem.Int.Ed. Engl.17, 621-634 (1978).
Par ailleurs, on a déjà utilisé des dérivés perfluorés dans des procédés de cultures de micro-organismes. A cet effet, on peut se référer au brevet US 4.166.006 qui concerne un procédé pour stimuler la croissance microbienne, qui consiste à utiliser un dérivé perfluoré comme transporteur d'oxygène dans le milieu de culture. Cependant, le dérivé perfluoré n'est pas utilisé comme moyen d'agitation du milieu de culture considéré. Au contraire, il est indiqué que, lorsque les cultures sont réalisées dans des boltes de Pétri, il peut être avantageux d'immobiliser les liquides. Il est donc clair que les dérivés perfluorés ne sont utilisés dans ce procédé que comme transporteurs d'oxygène.
On peut également se référer au brevet FR 73 10 317 qui concerne un procédé de culture d'un micro-organisme aérobie dans un milieu nutritif aqueux en présence d'un liquide organique inerte non miscible à l'eau, capable de dissoudre une grande quantité d'oxygène, c'est-à-dire dans des dérivés perfluorés liquides ou des huiles siliconées de faible viscosité. I1 est indiqué que ce procédé est de préférence mis en oeuvre dans des conditions d'aération, d'agitation et/ou d'agitation par secousses. Cependant, si le procédé est mis en oeuvre sans aération, agitation ni/ou agitation par secousses, une partie du liquide inerte capable de dissoudre une grande quantité d'oxygène est prélevée du milieu de culture et mise en contact avec de l'air ou de l'oxygène, avant d'être réintroduite dans le milieu de culture.
I1 s'agit là de culture d'un micro-organisme et non pas de cultures cellulaires, qui doivent être soumises à une agitation douce pour éviter toute perturbation de la culture.
Le procédé d'agitation selon l'invention peut aussi bien être utilisé pour des cultures cellulaires à petite échelle, par exemple au laboratoire pour des essais, que pour des cultures cellulaires à l'échelle industrielle, c'est-àdire dans des fermenteurs.
En effet, au laboratoire, les cultures cellulaires peuvent être réalisées par exemple dans des flacons. Une forme de mise en oeuvre du procédé de l'invention consiste alors à utiliser une couche d'un fluide inerte et à le mettre en mouvement par un moyen quelconque. Par exemple, si le fluide est plus dense que l'eau, il sera alors au fond du flacon et pourra etre mis enmouvement par exemple par un moyen magnétique ou par un agitateur à palettes dont l'axe traversera ou non le milieu de culture ; la rotation de l'axe des palettes le cas échéant, ne créera dans le milieu de culture que de faibles perturbations beaucoup moins importantes que celles créées par le système de palettes lui-meme.
De même à l'échelle industrielle, le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre dans les fermenteurs classiques, munis d'agitateurs de dimensions adéquates pour créer une agitation au- sein de fluide inerte.
Selon une variante de mise en oeuvre, on peut coupler le fermenteur avec un système de pompe, agencé de façon à ce que le fluide inerte soit continuellement soutiré du fermenteur par un orifice de sortie et réintroduit dans celui-ci par un orifice d'entrée.
La masse de fluide en mouvement, qui est située selon la densité du fluide en dessus ou en dessous du milieu de culture, crée, par entrasnement en masse, une agitation douce au sein du milieu de culture, qui est suffisante pour brasser la culture dans de bonnes conditions. Ainsi, le fluide inerte est utilisé comme un intermédialre d'agitation entre le moyen mécanique d'agitation et le milieu de culture.
Selon une variante de mise en oeuvre préférée du procédé de l'invention on pourra utiliser le fluide inerte comme transporteur d'oxygène et/ou d'autres substances nécessaires à la croissance des cellules, ou à la régulation des conditions de culture par exemple régulation du pH.
Ainsi, selon cette variante de mise en oeuvre, on évite la formation de bulles d'oxygène, occasionnée par l'injection d'oxygène ou d'air au sein du milieu de culture, l'oxygénation se faisant par diffusion, ce qui, en raison du brassage, lui confère une grande homogénéité. On pourra également assurer une régulation continue des conditions de culture, par exemple du pH. Cette régulation et cette aération en continu, seront assurées par exemple lorsque le fluide inerte sera mis en mouvement par l'intermédiaire d'un système de pompe adapté au fermenteur.
Ainsi, la présente invention concerne également un dispositif de culture cellulaire adapté pour la mise en oeuvre du procédé d'agitation selon l'invention. Le dispositif selon l'invention, représenté de façon schématique sur la figure unique, comprend un récipient pour culture cellulaire (1) muni d'un orifice d'entrée (2) et d'un orifice de sortie (3) et couplé par l'intermédiaire de ces orifices (2) et (3) à un système de pompe comportant une pompe (4) et des canalisations (10) reliant la pompe aux orifices de sortie et d'entrée (2) et (3), ledit système assurant la circulation ou mise en mouvement de la couche (7) du dérivé perfluoré utilisé comme intermédiaire d'agitation.Le dispositif selon l'invention peut comporter également des moyens (5) pour introduire, dans le dérivé perfluoré, de l'oxygène et du C02 par exemple, ou toute autre substance nécessaire à la croissance des cellules ou à la régulation des conditions de culture. I1 comporte également des moyens (6) de contrôle et de régulation des conditions de culture. Ces moyens (6) sont par exemple constitués d'une électrode de contrôle du pH régulant l'introduction de C02.
Le dispositif selon l'invention comporte en outre au moins un autre orifice (8) pour l'introduction du milieu de culture et des cellules, cet orifice étant éventuellement muni d'un bouchon obturateur (9). Le récipient (1) du dispositif selon l'invention peut être un flacon d'une capacité adéquate pour des cultures cellulaires de laboratoire ou à l'échelle industrielle ou tout autre récipient adapté pour de telles cultures tel qu'un fermenteur.Sur la figure unique annexée on a représenté un dispositif de culture cellulaire adapté pour une agitation selon l'invention avec un dérivé perfluoré plus dense que la culture cellulaire.L'invention n'est pas limitée à ce type de dispositif et concerne également les dispositifs de cultures cellulaires adaptés pour une agita tion selon l'invention avec un dérivé perfluoré plus léger que le milieu de culture, auquel cas les orifices d'entrée et de sortie (2) et (3) sont situés dans la partie supérieure du récipient (1) au lieu d'être dans la partie inférieure de celui-ci.
L'invention va être maintenant décrite plus en détail par l'exemple illustratif ci-après.
EXEMPLE
On a réalisé la culture de cellules lymphoblastoides humaines (souche Namalwa) dans un flacon de laboratoire de 2 litres,muni à son fond de deux orifices, et complètement rempli. Ce flacon a été couplé à une pompe pour mettre en circulation le dérivé perfluoré, à savoir : C6F13 - CH = CH - C6F13 mis dans le fond du flacon. Le milieu de culture a été introduit au-dessus dudit fluide. Lorsque la pompe fonctionne, le fluide inerte en circulation entraine en masse, le milieu de culture, et lui communique l'agitation nécessaire.
On a réalisé la culture de cellules lymphoblastoides humaines (souche Namalwa) dans un flacon de laboratoire de 2 litres,muni à son fond de deux orifices, et complètement rempli. Ce flacon a été couplé à une pompe pour mettre en circulation le dérivé perfluoré, à savoir : C6F13 - CH = CH - C6F13 mis dans le fond du flacon. Le milieu de culture a été introduit au-dessus dudit fluide. Lorsque la pompe fonctionne, le fluide inerte en circulation entraine en masse, le milieu de culture, et lui communique l'agitation nécessaire.
En plus de la pompe, on a introduit dans le système des moyens pour introduire dans le fluide en circulation, de l'oxygène et du C02 ; le débit du C02 était contrôlé par une électrode de pH plongée dans le milieu de culture.
Les résultats obtenus sont les suivants
Le milieu de culture étant ensemencé avec 5 cellules/ml en quatre jours environ, la densité atteint 2,3.106 cellules/ ml > le pH du milieu variant de + 0,1 unité à pH 7,1.
Le milieu de culture étant ensemencé avec 5 cellules/ml en quatre jours environ, la densité atteint 2,3.106 cellules/ ml > le pH du milieu variant de + 0,1 unité à pH 7,1.
A titre de comparaison, on a effectué la culture des mêmes cellules dans le même fermenteur sans l'utilisation de dérivés perfluorés comme intermédiaire d'agitation.
L'agitation était assurée par un barreau aimanté et l'aération par une poche d'air d'un litre environ et bullage d'oxygène.
Les résultats obtenus sont les suivants inoculum : 2.l0 cellules/ml
6
rendement de la culture à 106 cellules/ml.
6
rendement de la culture à 106 cellules/ml.
Claims (7)
1. Procédé d'agitation de cultures cellulaires, caractérisé en ce qu'il consiste à utiliser, comme moyen d'agitation, un fluide inerte, non miscible à l'eau, ledit fluide étant mis en mouvement par un moyen approprié quelconque.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fluide inerte est plus dense que l'eau.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fluide inerte est plus léger que l'eau.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le fluide inerte est un dérivé perfluoré liquide.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le fluide inerte est mis en mouvement par un moyen magnétique ou physique.
6.Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le fluide inerte est mis en mouvement au moyen d'un barreau aimanté, d'un agitateur à palettes ou d'un système de pompe.
7. Dispositif de culture cellulaire adapté pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comporte un récipient (1) pour culture cellulaire, muni d'un orifice d'entrée (2) et d'un orifice de sortie (3) et couplé par l'intermédiaire desdits orifices à un système de pompe (4) (10) qui assure la mise en mouvement de la couche (7) du dérivé perfluore, ledit dispositif comportant en outre des moyens (5) d'introduction de substances nécessaires à la croissance des cellules et des moyens (6) de contrôle des conditions de culture.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8117857A FR2513264A1 (fr) | 1981-09-22 | 1981-09-22 | Procede d'agitation de cultures cellulaires et dispositif pour sa mise en oeuvre |
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|---|---|
| FR2513264A1 true FR2513264A1 (fr) | 1983-03-25 |
| FR2513264B1 FR2513264B1 (fr) | 1985-03-22 |
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| EP0164813A2 (fr) * | 1984-06-14 | 1985-12-18 | Teijin Limited | Procédé de culture de cellules animales ou végétales |
| EP0229289A2 (fr) * | 1985-12-06 | 1987-07-22 | Teijin Limited | Méthode de culture de cellules animales |
| EP0356724A2 (fr) * | 1988-07-29 | 1990-03-07 | Biochem Technology Inc. | Méthode pour augmenter la quantité du produit produit par des cellules fragiles et cultures de tissus |
| EP0387065A2 (fr) * | 1989-03-08 | 1990-09-12 | Mitsui Petrochemical Industries, Ltd. | Procédé et appareil pour la culture de tissue de plantes, procédé de préparation de métabolites |
| US5250432A (en) * | 1985-12-06 | 1993-10-05 | Teijin Limited | Method of culturing animal cells |
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|---|---|---|---|---|
| FR2177051A1 (fr) * | 1972-03-23 | 1973-11-02 | Tanabe Seiyaku Co |
-
1981
- 1981-09-22 FR FR8117857A patent/FR2513264A1/fr active Granted
Patent Citations (1)
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| FR2513264B1 (fr) | 1985-03-22 |
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