FR2509861A1 - Procede et appareil pour l'execution et la lecture des reactions d'immuno-agglutination du sang - Google Patents

Abstract

LE SANG ET LE REACTIF SONT PLACES DANS UNE CASE 20 D'UNE PLAQUE EN MATIERE TRANSPARENTE SUR LE TRAJET D'UN FAISCEAU LUMINEUX VENANT D'UNE SOURCE DE LUMIERE 13 EN DIRECTION D'UNE BARRETTE DE DETECTION 16 COMPRENANT 128 PHOTODIODES 17 QUI EST DEPLACEE PAS A PAS SUCCESSIVEMENT EN FACE DE 256 LIGNES PARALLELES DE SORTE QUE L'AFFAIBLISSEMENT DU FAISCEAU PAR L'AGGLUTINATION EST MESURE EN PLUS DE 3000 POINTS ET PERMET DE DETERMINER UN FACTEUR GLOBAL D'AGGLUTINATION.

Description

L'invention a pour objef un procédé et un appareil servant à la détermination objective et automatique du taux d'agglutination des globules rouges pendant les réactions d';mmuno-agglutination effectuées avec du sang.

Les réactions auxquelles on se réfère plus particulièrement ici sont celles du test de Beth-Vincent et du test de Simonin utilisées pour la détermination des groupes sanguins et du facteur rhésus. Elles sont effectuées très fréquemment et l'invention apporte à leur exécution des avantages importants au point de vue de Iiéconomie réalisée sur le volume des réactifs employés, du temps passé à leur mise en oeuvre, de la précision et de l'objectivité des résultats obtenus.Toutefois, bien que ces reactions soient une application typique et avantageuse de l'invention, il est entendu que celle-ci ntest pas limitée à la recherche des groupes sanguins. Cn peut l'employer pour toute réaction faite avec du sang et comportant l'adjonction d'un réactif susceptible de provoquer un changement de l'opacité du sang.

Quand il stagit des tests mentionnés plus haut, on les exécute actuellement selon une méthode manuelle qui consiste à ajouter à la main à une quantité de sang de l'ordre de 50 ul un volume de réactif de l'ordre de 60 ul souvent compris en réalité entre 5G et 10C ul. On laisse le tout s'étaler librement sur une plaque de verre et on observe à ltoeSl l'importane des agglutinations qui peuvent se produire ; on exprime le résultat par une notation qualitative, non numérique, qui consiste souvent à utiliser le signe - pour l'absence dragglu- tination ou pour un début incertain d'agglutination, et les signes + puis ++ et enfin +++ pour une agglutination plus forte allant jusqu'a l'agglutination totale.

Selon le procédé de Irinvention, on dépose le sang à tester sur une surface ayant un contour et une dimension déterminés, en relation avec un volume déterminé de sang augmenté du réactif, de façon à obtenir à l'intérieur du contour déterminé une épaisseur de liquide pouvant contenir à l'état libre environ 2 à 3 globules superposés. On effectue ensuite la mesure de l'affaiblissement de linten5ité lumineus d'un rayon traversant cette couche, en un nombre élevé de points voisins sur la totalité de la surface limitée par le contour.On affecte à llintensité lumineuse recueillie à chaque point une valeur dite de pondération choisie entre l'absence d'affaiblissement et l'occultation totale et on traite les valeurs de la pondération obtenues pour l'ensemble des points afin de parvenir à un facteur dragglutination. Par exemple, si on appelle Pi la valeur de la pondération d'un point quelconque où l'affaiblissement de l'intensité lumineuse indique une agglutination et Nv le nombre des points où l'absence d'affaiblissement indique une absence dragglutination, le facteur d'agglutinatZon s'exprime en pourcentage par le rapport
FA% = Pi x 100. On arrive ainsi à une appréciation numérique
Nv de l'agglutination qui est significative de son importance entre
O et 100, en pratique entre 15 et 100.

Selon un mode préféré de mise en oeuvre de l'lnventSon, la mesure de l'affaiblissement de l'intensité lumineuse du rayon traversant ntest pas absolue mais relative en chaque point, en comparaison des points voisins de ce dernier.

De préférence, on choisit un contour carré, on mesure l'affaiblissement de la transmission. lumineuse par un balayage effectué ligne par ligne le long de lignes espacées l'une de l'autre d'une distance égale énviron à une fois la dimension d'un globule rouge (lo microns) et sur un nombre de points espacés les uns des autres sur chaque ligne d'une distance égale environ au double de la dimension d'un globule rouge. Ces valeurs sont données à titre indicatif ; elles ne sont pas absolues. La seule condition imposée par l'invention est que le nombre des points où la mesure est effectuée soit au moins de 2 pour la plus petite surface agglutinée à détecter.

On donne à chaque point un coefficient d'affaSblis- sement choisi entre O (aucun affaiblissement) et 1 (opacité maximale) et on additionne à ce coefficient celui des deux points voisins de part et d'autre sur la meme ligne et celui de chacun des trois points voisins correspondant à ces trois points sur la ligne voisine de balayage.De cette façon chaque point reçoit une valeur relative de pondération qui s'exprime par un chiffre allant deO (quand les six points considérés ont le coefficient O) à 6 (quand les six points ont le coefficient 1)
A partir de là, on considère les points par groupes minima de 6 points, et on admet que les points de chaque groupe font partie d'un agglutinat lorsque le total de leurs coefficients respectifs dépasse le nombre des points du groupe ; pour 40 points voisins les uns des autres constituant un groupe quand le total des coefficients de ces points dépasse 40, on admet que ce groupe est un agglutinat.De cette façon, de ltensemble des points de mesure on déduit le nombre des points qui sont considérés comme en dehors d'une agglutination et le nombre de ceux qui sont considérés comme inclus dans une zone d'agglutination. On calcule alors le facteur d'agglut;- nation selon la valeur donnée plus haut dans laquelle, selon ce mode préféré de mise en oeuvre du procédé, Pi est la somme des coefficients des points inclus dans des groupes d'agglutination.

Les résultats obtenus par le procédé de l'invention tel qu'on vient de ltexpliquer ont été comparés à ceux que donnent la méthode manuelle subjective classique et ont permis de tracer la courbe visi-ble-sur la figure l. En abscisses, on a porté la notation faite à l'aide des signes -, +, ++, +++, selon l'appréciation visuelle (AV) de la méthode classique.

En ordonnées, on a porté le facteur d'agglutination (FA) calculé comme dit ci-dessus. II est facile de constater que le procédé de l'invention rend possible une appréciation plus exacte et plus nuancée de l'agglut;natSon.

Un autre avantage du procédé de l'invention est qu'il ne nécessite qu'une quantité faible de sang et de réactif. Par exemple, pour le test de Beth-Vincent, selon 1'invention on utilise un volume de 2 microlitres d'une dilution à 2 % d'hématines dans du PBS (eau physiologique) auquel il suffit d'ajouter 4 microlitres d'ant;sérum. Pour le test de Simonin, on emploie un volume de 2 microlitres d'une dilution à 2 % d'hématies dans du PBS auquel on ajoute 4 microlitres de sérum. On constate que la quantité d'échantillon du sang et de réactifs employés est environ 20 fois plus faible que pour la méthode classique.

L'invention couvre aussi un appareil servant à la mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus.

Pour faire une détermination d'un groupe sanguin, il suffirait d'utiliser une plaque de matière transparente dans laquelle serait ménagée une case ayant le contour et la dimension voulus. Mais il est usuel, ainsi luron le sait, de faire la détermination d'un groupe sanguin en effectuant simultanément quatre réactions du test de Simonin, quatre réactions inverses du test de Beth-Vincent, et une -réaction supplémentaire pour le facteur Rhésus. Pour cette raison, l'invention prévoit l'emploi d'une plaque présentant neuf cases voisines identiques. De préférence, chaque case a le contour d'un carré avec des côtés de 4 mm de long chacun et une profondeur de 2 mm.

Un appareil conforme à l'invention comprend un support de la plaque mise horizontalement laissant libre le passage d'un rayon lumineux à travers chaque case perpendiculairement à son plan, une source de lumière disposée d'un côté de la plaque pour envoyer une rayon lumineux à travers le contour d'une case, un détecteur sensible à l'intensité lumineuse disposée à l'opposé de la source de lumière par rapport à la plaque, un organe moteur attelé pour provoquer un déplacement relatif pas à pas au moins dans une direction entre la plaque et le détecteur pour l'exploration d'un grand nombre de points de chaque case, des circuits électriques et électroniques transformant l'intensité lumineuse recueillie en chaque point et affichant et/ou imprimant le facteur dragglutination relatif à chaque case.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le détecteur est une barrette de photodiodes alignées de longueur égale à la longueur d'une côté d'une case. Une barrette de ce genre est disponible dans le commerce. Pour une longueur de 4 mm, elle comprend 128 diodes, ce qui permet de mesurer simultanément l'affaiblissement de la lumière à travers 128 points d'une même ligne. Dans ce cas, l'organe moteur provoque un déplacement pas à pas relatif dans une seule direction, permendiculairement à la ligne des photodiodes.

De préférence, la source de lumière et la barrette de détection sont montées sur une chariot auquel est attelé l'organe moteur et le support de la plaque est fixe. Le chariot est déplaçable le long d'une course qui permet de dégager entièrement le support de la plaque. L'appareil a une face frontale pourvue d'un verre dépoli situé en regard de l'emplacement de la plaque sur le support de plaque ; de plus, une source supplémentaire de lumière est placée en-dessous de ltemplacement de la plaque à un niveau inférieur au niveau de la barrette de détection montée sur le chariot tandis qu'un miroir incliné est monté au-dessus du passage du chariot pour renvoyer sur le verre dépoli le faisceau lumineux venant de la source supplémentaire de lumière.De cette façon, quand le chariot est à une extrémité de sa course, le contenu des cases de la plaque est éclairé par la source supplémentaire de lumière et il apparat sur le verre dépoli.

On donnera maintenant, uniquement à titre d'exemple, une description drun exemple de réalisation d'un appareil conforme à l'invention. On se reportera aux dessins annexés dans lesquelles
- la figure 1 est un graphique de comparaison entre le facteur d'agglutination FA calculé selon le procédé de l'invention et l'appréciation visuelle (AV) faite selon la méthode manuelle classique,
- la figure 2 est une vue de côté en coupe par un plan transversal d'un appareil conforme à l'invention,
- la figure 3 est un graphique montrant partiellement la tension fournie par la barrette de détection aux différents points successifs d'une ligne de balayage,
- la figure 4 est un dessin agrandi de plusieurs points explorés servant à expliquer la manière d'établir leur coefficient de pondération,
Un appareil selon l'invention comprend une enveloppe générale 1 avec une paroi frontale 2 ayant une ouverture centrale 3 munie à sa partie supérieure drune bande de verre dépoli 4. A l'intérieur de cette enveloppe 1, un chariot 5 est guidé par une glissière horizontale 6 fixée à la paroi arrière 7 opposée à la paroi frontale 2. Ce chariot 5 ne repose pas sur le fond 8 de l'enveloppe 1 ; il comprend une paroi verticale 9 ayant une face arrière 9 A tournée vers le fond 7 et une face avant 9 B tournée vers l'ouverture 3. La face arrière 9 A est pourvue des éléments nécessaires à son montage-et à son coulissement sur la glissière horizontale 6.

En plus ces éléments comprennent un écrou 8 immobilisé en rotation à travers lequel se visse une vis il à billes allongée parallèlement à la glissière 6 et accouplée à une extrémité à un moteur (non représenté). Ce dernier est supporté par une paroi latérale de l'enveloppe 1 et il est du type pas à pas.

II est capable de déplacer le chariot 5 soit de façon continue et constante, soit par une succession de pas nombreux de faible valeur. La face avant 9 B de la paroi 9 est pourvue de trois plateaux étagés 12 A, 12 B, 12 C, en porte à faux.

Le plateau supérieur 12 A supporte une source de lumière ou, de préférence, l'embout terminal 13 d'un câble optique (non représenté) provenant d'une source de lumière disposée dans l'enveloppe- 1 ( non visible sur la figure 2).

Le plateau supérieur 12 A est assez éloigné de la paroi supé-rieure 14 de l'enveloppe 1 pour laisser la place nécessaire au montage au-dessus de lui d'un miroir 15 incliné à 450 en face du verre dépoli 4 et en direction de ce dernier.

Le plateau intermédiaire 12 B est destiné à supporter une lentille ou tout moyen optique équivalent apte à donner un faisceau de lumière convenable pour l'éclairage uniforme de chacune des cases d'une plaque conforme à l'invention.

Le plateau inférieur 12 C est destiné à supporter un détecteur constitué dans cet exemple par une barrette de détection 16 composée de 128 photodiodes alignées 17.

Cette barrette 16 est incorporée à un circuit imprimé 16 A dessiné partiellement en trait mixte. Le plateau inférieur 12 C est situé à un niveau assez élevé au-dessus du fond 8 pour laisser la place à une source supplémentaire de lumière 15 A disposée en-dessous du miroir incliné 15 et tournée vers lui.

A la partie inférieur de l'ouverture 3 s'étend à l'intérieur de l'enveloppe 1 à un niveau inférieur à celui du plateau intermédiaire 12 B un support de plaque 18. La source de lumière 13, les moyens optiques portés par le plateau intermédiaire 12 B et la barrette de détection 16 sont en alignement vertical et sont déplacés ensemble avec le chariot 5.

Une plaque 19, en matière transparente, conforme à l'invention, comprend de préférence, pour les raisons données plus haut, neuf cases successives 20, à contour carré, ayant des côtés de 4 mm et une profondeur de 2 mm. Des moyens de support et de repérage précis 20, 21 sont prévus sur le support de plaque 18. De préférence, la plaque t9 a un prolongement latéral 22 grace auquel elle est mise en place et retenue à sa position grace à des moyens de fixagion non représentés de façon que les cases 20 alignées se trouvent en porte à faux sur l'alignement de la source de lumière 13 et de la barrette de détection 16.Plus exactement, la largeur du chariot 5 en sens perpendiculaire au plan de la figure 2 est limitée à la valeur strictement nécessaire mais son déplacement dans cette direction se fait sur une course assez grande pour que le chariot se dégage totalement de ltespace contenu entre la source supplémentaire de lumière 15 A et le miroir incliné 15. Dans ce cas, la plaque 19 mise en place se trouve de la lumière entre la source 15 A et le miroir 15 et son image est renvoyée par ce dernier sur le verre dépoli 4. Des moyens optiques d'agrandissement 23 sont interposés, Si on le juge utile, entre le verre dépoli 4 et le miroir 15. On peut donc observer visuellement le contenu des cases 20, sur le verre 4, avant ou après l'opération de mesure que l'on décrira maintenant.

Chaque case 20 est balayée ligne par ligne, par Xle déplacement pas à pas du chariot 5, chaque ligne étant égale à la largeur d'un côté du contour carré. Sur chaque ligne il y a 128 points de mesure correspondant chacun respectivement à l'une des 128-photodiodes de la barrette de détection 16 et on effectue la mesure sur 256 lignes parallèles, à chacun des 256 pas du chariot 5.

A chaque ligne chacune des 128 photodiodes reçoit un éclairement plus ou moins affaibli en fonction de Itexis- tence ou non d'un agglomérat sur le trajet du rayon qui la frappe. La tension émise par chaque diode dépend de l'affaiblissement de la lumière, comme le montre la figure 3.

En abcisses on a porté un certain nombre des différents points successifs (Pts) d'une ligne et en ordonnées la tension fournie (en mV) par la diode correspondante. Quand la tension est à valeur maximale, on considère qu'il n'y a aucune agglomération au point considéré et on attribue à ce dernier la valeur de pondération 0. Quand la tension est nulle, on admet qu'il y a une occultation totale, donc une agglutination importante, et on attribue au point la valeur de pondération 1. A tout point où la tension est réduite au quart, ou moins, de la valeur maximale, c'est à dire à point où la-valeur de pondération serait comprise entre 0,60 et 1, on donne en réalité la valeur 1. On donne la valeur O à tous les autres points.On a donc uniquement des points de valeur 0, qui sont représentés par un point blanc sur la figure 4, et des points de valeur 1, qui sont représentés par un point noir sur cette même figure 4.

On attribue ensuite à chaque point un coefficient en tenant compte de la valeur de pondération des points voisins.

Par exemple, (figure 4) sur une ligne LI trois points successifs ont chacun la valeur 1, sur la ligne suivante L 2 les trois points voisins correspondants ont respectivement la valeur 1, 1, 0 ; sur la ligne suivante L 3, les points suivants
Pg, Ph, Pi ont les valeurs 0, O, 1 ; sur la ligne suivante L4, les points suivants Pj, Pk, PI ont les valeurs 1, 1, 1 ; sur la ligne suivante L 5, les points suivants ont les valeurs 0,0 1 etc.

On obtient le coefficient du point Fb de la ligne
L I en ajoutant à sa valeur celle des deux points voisins Pa,
Pc de la même ligne et celle des trois points Pf, Pe, Pd
correspondants de la ligne suivante, soit 1 + 1 + I + 1 + 1
+ O = 5. On a de même pour Pe = 1 + 1 + O + O + 0 + 1 (de Pd à Pi) = 3; pour Ph : O + O + 1 + 1 + 1 + 1 = 4.

Si la ligne L 5 est la dernière avant le bord d'une case, le
coefficient de Pn est O + O + 1 (Pm + Pn + Po) = 1. Les
coefficients vont donc de O à 6. C'est à partir de ces
coefficents que l'on calcule comme indiqué plus haut le
facteur d'agglutination du sang soumis à réaction dans la
case observée. Le circuit imprimé 16 A porte les moyens
nécessaires à l'exécution de ces calculs. En particulier, chaque
fois qu'un groupe de 40 points a fait l'objet du calcul du
coefficient, ces coefficients sont additionnés et le groupe
est considéré comme faisant partie ou non d'un agglutinat
comme expliqué plus haut, après quoi, pour chaque case le
le facteur d'agglutination est calculé. L'appareil contient
aussi une imprimante (non représentée) qui émet un ticket
donnant le facteur d'agglutination exprimé par un chiffre,
entre O et 100, en rapport avec chaque case 20. Les circuits
d'exécution de ces calculs sont connus en soi ; il ntest
donc pas nécessaire de les décrire.

Claims (11)

REVENDI CA TIONS

1) Procédé de détermination objective et numérique de l'agglutination des hématies du sang au cours d'une réaction, selon lequel on mélange à une quantité déterminée de sang une quantité déterminée de réactif, caractérisé en ce qu'on dépose le sang et le réactif sur une surface ayant un contour et une dimension déterminés de façon à obtenir à l'intérieur de ce contour une épaisseur de liquide pouvant contenir à l'étant libre environ 2 à 3 globules rouges superposés, on fait traverser cette couche en un nombre élevé de points par un rayon de lumière dont on mesure l'affaiblissement en chaque point sur la totalité de la surface limitée par le contour, on affecte à chaque point une valeur dite de pondération choisie entre l'affaiblissement nul et l'affaiblissement total, on traite les valeurs ainsi obtenues pour parvenir à un facteur dragglutination global du sang sous l'effet du réactif.

2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on distingue les points dont la valeur de pondération

Pi indique une agglutination et les points dont la valeur indique une absence d'agglutination, on compte le nombre Nv de ces derniers points et on adopte comme facteur d'agglutination global le rapport FA % = Pi x 100

Nv

3) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on mesure l'affaiblissement de l'intensité lumineuse du rayon en chaque point d'une manière relative en tenant compte de l'affaiblissement provoqué aux points voisins du point considéré.

4) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on choisit un contour carré et on mesure l'affaSblisse- ment par un balayage effectué ligne par ligne, ces lignes étant espacées d'une distance égale à environ une fois la dimension d'un globule rouge et les points de mesure sur chaque ligne étant espacés d'une distance égale environ au double de la dimension d'un globule rouge.

5) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'on donne à chaque point un coefficient d'affaSblis- sement choisi entre O (aucun affaiblissement) et 1 (affaiblissement total), les points où l'affaiblissement est supérieur à 0,75 étant affectés du coefficient 1 et les autres points du coefficient 0.

6) Procédé selon revendication 4 caractérisé en ce que le' contour carré a des côtés de 4 mm de longueur et une profondeur de 2 mm.

7) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce luron utilise pour chaque réaction d'agglutination une quantité de 2 microlitres d'une dilution à 2 % d'hématies dans du PBS, et une dose de 4 microlitres de réactif (sérum ou antisérum).

8) Plaque en matière transparente pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce qu'elle présente dans sa surface au moins une case et de préférence neuf cases successives alignées ayant chacune un contour carré de 4 mm de côté et 2 mm de profondeur.

9) Appareil pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 à (taie d'une plaque selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend par la mesure de l'affaiblissement de la lumière une barrette de détection (16) composée de 128 photodiodes alignées (17).

10) Appareil selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'une source de lumière (13) et la barrette de détection (16) sont portés par un chariot (5) déplaçable pas à pas pour l'exploration de 256 lignes parallèles d'une case de 4 mm de côté, un support de plaque (18) étant disposé pour tenir une plaque (19) avec au moins une case (20) située sur l'alignement source de lumière (13) barrette de détection (16) pendant le déplacement pas à pas du chariot (5).

11) Appareil selon la revendication 10 caractérisé en ce que la course du chariot(5) est supérieure à la course de balayage de la ou des cases (20) de la plaque (19), une source supplémentaire (15A) de lumière, et un miroir incliné (15) sont montés en regard l'un de l'autre respectivement en-dessous et au-dessus du chariot (5) en alignement avec l'emplacement de la plaque (19) un verre dépoli (4) étant placé en face du miroir (15) pour recevoir l'image de la ou des cases (20).