FR2505048A1

FR2505048A1 - METHOD FOR THE RAPID DETERMINATION OF TOTAL AND DIRECT BILIRUBIN IN BIOLOGICAL LIQUIDS WITH SINGLE REAGENT

Info

Publication number: FR2505048A1
Application number: FR8206260A
Authority: FR
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1981-04-17
Filing date: 1982-04-09
Publication date: 1982-11-05
Also published as: FR2505048B3; DE3212795A1; IT1219781B; IT8105149A0

Abstract

The method is for rapid determination of total and direct bilirubin in biological fluids using single reagents. Used for this purpose is fast red B BF4 salt in an acid solution which contains decouplers or decoupling agents which are adapted to the aim or the object, e.g. urea or methanol.

Description

Méthode pour la détermination rapide de la bilirubine totale et directe dans les liquides biologiques auec réactif unique.Method for the rapid determination of total and direct bilirubin in biological fluids with a single reagent.

L'invention concerne une méthode pour la détermination rapide ae la bilirubine totale et directe dans les liquides biologiques avec réactif unique. The invention relates to a method for the rapid determination of total and direct bilirubin in biological fluids with a single reagent.

Depuis qu'Ehrlich a introduit en 1883 la réaction de diazotation et qu'ensuite Van den Berg a démontré les réactions directe et indirecte, on a fait de multiples tentatives pour définir une méthode rapide et simple de détermina- tion de la bilirubine dans les liquides biologiques. Since Ehrlich introduced the diazotisation reaction in 1883, and after which Van den Berg demonstrated the direct and indirect reactions, attempts have been made to establish a rapid and simple method for the determination of bilirubin in liquids. organic.

Les réactifs de décopulation proposés ont été nombreux, depuis -1 'éthanol, la caféine et le benzoate jusqu'aux surfactifs ; on a formulé diverses propositions pour définir le temps de lecture de la bilirubine directe et aussi pour établir de façon assez concordante un temps de cinq minutes on a aussi discuté du problème du choix du pH final pour conclure essentiellement à l1 adoption du milieu alcalin. The proposed decopulation reagents have been numerous, from ethanol, caffeine and benzoate to surfactants; Various proposals have been formulated for defining the reading time of the direct bilirubin and also for establishing a sufficiently concordant time of five minutes. The problem of the choice of the final pH has also been discussed in order to conclude essentially with the adoption of the alkaline medium.

En tout cas, les méthodes proposées jusqu'ici sont assez complexes, étant donné qu'elles exigent la préparation du blanc pour chaque echantillon, un traitement diversifié pour les deux types de réaction, une alcalinisation, un contrôle strict des temps aux divers passages analytiques et,enfin, l'instabilité au réactif de diazotation. In any case, the methods proposed so far are rather complex, since they require the preparation of the blank for each sample, a diversified treatment for the two types of reaction, an alkalization, a strict control of the times to the various analytical passages. and, finally, instability to the diazotization reagent.

Récemment, on a proposé une méthode (méthode DPD) utilisant un réactif unique pour le dosage de la bilirubine totale avec emploi d'un agent de diazotation stabilisé, nais, dans ce cas, il est nécessaire de préparer le blanc. Recently, a method (DPD method) using a single reagent for assaying total bilirubin using a stabilized diazotizing agent has been proposed, but in this case it is necessary to prepare the blank.

Le but de l'invention est donc d'utiliser un agent de diazotation stable, qui est le sel de ssF4 du Rast red B" (CI 37125) (avec comme synonymes : tétrafluoroborate de I-ami no-2-méthoxy-4-nitrobenzene diazoté ; "azoic diazo z5BF4tw tétrafluoroborate de 5-nitro-2-amino-anisole diazoté ; tétrafluoroborate de 5.nitro.2-aminométhoxybenzene di azoté) de formule C7H6N303. BF4, poids moléculaire 266,9, pour la détermination de la bilirubine aussi bien totale que directe, sans la préparation du blanc, même sur des sérums avec hémolyse évidente, aussi bien par utilisation manuelle qu'au moyen de systèmes automatiques de type quelconque. The object of the invention is therefore to use a stable diazotization agent, which is the salt of ssF4 of Rast red B "(CI 37125) (with as synonyms: tetrafluoroborate of I-ami no-2-methoxy-4- diazotized nitrobenzene; diazotised azoic diazo z5BF4tw 5-nitro-2-aminoanisole tetrafluoroborate; 5-nitro-2-aminomethoxybenzene di-nitrogen tetrafluoroborate) of the formula C7H6N303. BF4, molecular weight 266.9, for the determination of both total and direct bilirubin, without the preparation of the blank, even on sera with obvious hemolysis, both by manual use and by means of automatic systems of any type.

La méthode selon l'invention est caractérisée par le fait que l'on utilise le sel de 4 du "ast red b" en solution acide contenant des diazocopulants convenant à cet effet, comme, par exemple, l'urée et le méthanol, pour la détermination des bilirubines, par le fait que l'on élimine le blanc, par le fait qu'il permet la détermination simultanée de la bilirubine (totale et directe) avec le même réactif unique en ajoutant simplement au préalable de l'azoture de sodium (ou d'autres substances réductrices) à une concentration appropriée, conne inhibiteurs de la réaction de diazotation de la bilirubine indirecte, et par le fait qu'il élimine l'interférence due à l'hémoglobine (présente dans des sérums avec hémolyse) cette élimination étant obtenue grâce & l'addition d'ioduré de potassium à une concentration appropriée. The method according to the invention is characterized in that the salt of 4 of "ast red b" in acid solution containing diazocopulants suitable for this purpose, such as, for example, urea and methanol, is used for the determination of bilirubins, by the fact that the white is eliminated, in that it allows the simultaneous determination of bilirubin (total and direct) with the same single reagent by simply adding sodium azide beforehand (or other reducing substances) at an appropriate concentration, as inhibitors of the indirect bilirubin diazotization reaction, and by the fact that it eliminates hemoglobin interference (present in hemolysis sera). elimination being achieved by the addition of potassium iodide at an appropriate concentration.

Une autre caractéristique de la méthode proposée par l'invention réside dans le fait qu'elle utilise un réactif unique stable pour les deux formes de bilirubine et qu' el- le ne nécessite pas de blanc, de sorte qu'il se forme un comme posé coloré stable à coefficient d'absorption élevé, en un temps court (environ 15 minutes). Another feature of the method provided by the invention is that it uses a single stable reagent for both forms of bilirubin and that it does not require white, so that one forms like stable, high absorption coefficient, in a short time (about 15 minutes).

Selon l'invention, en présence d'urée et de metha nol, en milieu acide, les bilirubines totale et directe réagissent sur le sel de diazonium stabilisé (sel de BF4 du "Fast red B") en formant un composé azoïque coloré en vertbleu. La réaction de la bilirubine indirecte est inhibée par le pretraitement de l'échantillon au moyen d'un réducteur. La couleur engendrée, stable pendant au moins 2 heures, lue a 592 nm (580 à 610 nm), est proportionnelle â la concentration de bilirubine jusqu'à 25 mg/dl. According to the invention, in the presence of urea and methanol, in an acidic medium, the total and direct bilirubins react on the stabilized diazonium salt (BF4 salt of "Fast red B"), forming an azo compound colored in greenblue. . The reaction of indirect bilirubin is inhibited by pre-treatment of the sample with a reducing agent. The generated color, stable for at least 2 hours, read at 592 nm (580 to 610 nm), is proportional to the concentration of bilirubin up to 25 mg / dl.

Pour atteindre le but que se propose l'invention, il est nécessaire dtutiliser deux réactifs pour les deux types ae bilirubine ; ils comprennent la solution du colorant et du aécopulant en milieu acide (réactif A) et la solution du reducteur à une concentration bien définie (réactif B). To achieve the object of the invention, it is necessary to use two reagents for both types of bilirubin; they include the dye solution and acidic aecopulant (reagent A) and the reducer solution at a well-defined concentration (reagent B).

En outre, il peut être parfois utile d'utiliser un troisième réactif (réactif C) constitué par une solution d'iodure de potassium, pour éliminer les interférences dues à 1'hémoglo- bine.In addition, it may sometimes be useful to use a third reagent (reagent C) consisting of potassium iodide solution to eliminate hemoglobin-induced interference.

Une préparation typique est la suivante
Réactif A : sel de BF4 du "Fast red B", 0,4 mmol/l, carbami@ 4 mol/l, méthanol 1 mol/l ; pH 2
Réactif B : azoture de sodium 0,15 mol/l
Réactif C : KI 0,6 mol/l
EXEMPLE :

A typical preparation is as follows
Reagent A: BF4 salt of "Fast red B", 0.4 mmol / l, carbamate @ 4 mol / l, methanol 1 mol / l; pH 2
Reagent B: 0.15 mol / l sodium azide
Reagent C: KI 0.6 mol / l
EXAMPLE:

<tb> Introduire <SEP> à <SEP> Blanc <SEP> Echantillon <SEP> Echantillon
<tb> la <SEP> pipette <SEP> pour <SEP> pour
<tb> dans <SEP> l'é- <SEP> Bilirubine <SEP> bilirubine
<tb> prouvette <SEP> totale <SEP> directe
<tb> H2O <SEP> 0,2 <SEP> ml <SEP> - <SEP>
<tb> Sérum <SEP> - <SEP> 0,2 <SEP> ml <SEP> 0,2 <SEP> ml
<tb> Réactif <SEP> B <SEP> - <SEP> .<SEP> 20
<tb> Réactif <SEP> A <SEP> 2,0 <SEP> ml <SEP> 2,0 <SEP> ml <SEP> 2,0 <SEP> ml
<tb>
Mélanger ; attendre au moins 15 minutes ; lire à 592 (580 à 610) nm le pouvoir d'absorption des divers échantillons en prenant le blanc comme zéro.<tb> Introduce <SEP> to <SEP> White <SEP> Sample <SEP> Sample
<tb> the <SEP> pipette <SEP> for <SEP> for
<tb> in <SEP> Bilirubin <SEP> Bilirubin
<tb> direct <SEP> total <SEP> direct
<tb> H2O <SEP> 0.2 <SEP> ml <SEP> - <SEP>
<tb> Serum <SEP> - <SEP> 0.2 <SEP> ml <SEP> 0.2 <SEP> ml
<tb> Reagent <SEP> B <SEP> - <SEP>. <SEP> 20
<tb> Reagent <SEP> A <SEP> 2.0 <SEP> ml <SEP> 2.0 <SEP> ml <SEP> 2.0 <SEP> ml
<Tb>
Mix; wait at least 15 minutes; read at 592 (580 to 610) nm the absorption power of the various samples by taking white as zero.

CALCUL
Bilirubine (totale ou directe) mg/dl = A x 10
Sr-bilirubines (totales) ou (esters) Conc. mol/l = A x 171
INTERVALLES DE REFERENCE
Bilirubine totale : 1 ng/dl
Sr-bilirubines (totales) Conc. = 4 à 17 mol/l Bilirubine directe : < 0,35 mg/dl
Sr bilirubines (esters) Conc. < 6 pmol/l
Le procédé permettant dsatteindre le but de l'in vention peut être récapitulé par les points suivants 1) utiliser du sérum frais et éviter la lumière directe sur
l'échantillon ; 2) l'analyse peut s'effectuer par des microméthodes, en uti
lisant le même facteur de calcul et en diminuant propor-
tionnellement les volumes 3) pour traiter les échantillons avec hémolyse, on ajoute
directement au sérum 10 l de réactif C/0,2 ml de sérum,
en éliminant ainsi les interférences dues à l'hémoglobine
jusqu'à 400 sg/dl 4) pour le contrôle de qualité, utiliser des sérums contenant
de la bilirubine à l'état natif, sans addition de conser
vateurs etc. (sérum normal marque Roche, Clinocontrol N
Sclavo, Seronorm Bracco etc.) ou comparer parfois les don
nées obtenues en utilisant la méthode classique.CALCULATION
Bilirubin (total or direct) mg / dl = A x 10
Sr-bilirubins (total) or (esters) Conc. mol / l = A x 171
REFERENCE INTERVALS
Total bilirubin: 1 ng / dl
Sr-bilirubins (total) Conc. = 4 to 17 mol / l Direct bilirubin: <0.35 mg / dl
Sr bilirubins (esters) Conc. <6 pmol / l
The method of attaining the purpose of the invention can be summarized by the following points: 1) use fresh serum and avoid direct light on
the sample; 2) the analysis can be carried out by micromethods, using
reading the same calculation factor and decreasing
volumes 3) to treat samples with hemolysis, add
directly to the serum 10 l of reagent C / 0.2 ml of serum,
eliminating the interference caused by hemoglobin
up to 400 sg / dl 4) for quality control, use sera containing
of bilirubin in the native state, without the addition of
vateurs etc. (normal serum brand Roche, Clinocontrol N
Sclavo, Seronorm Bracco etc.) or compare donations
obtained using the classical method.

Les expériences concernant la méthode selon l'in ventis ont été conduites sur des sérums de patients hyperbili rubinéniques, en comparant les données obtenues par la méthode de Jendrassik. Experiments on the in ventis method were conducted on sera of rubinenic hyperbiliin patients, comparing the data obtained by the Jendrassik method.

La réaction de dia:otation est inhibée par des substances réductrices, ce qui fait que les sérums de patients en traitement massif par l'acide ascorbique etc. peuvent donner des valeurs faussement buses. The dialysis reaction is inhibited by reducing substances, so that the sera of patients in massive treatment with ascorbic acid and so on. can give wrongly nozzle values.

RESULTATS OBTENUS
Linéarité s on a utilisé un sérum hyperbilirubinémique ayant une concentration de bilirubine totale de 30 mg/dl, ditersi- née par la méthode de Jendrassik, en suivant les indications de Schellong et Wende. Lorsquton utilise les volumes indiqués, la méthode apparut linéaire au moins jusqu'à 20 mg/dl. Des étalons de bilirubine commerciale (par exemple les bilirubines étalons Behring) ne sont pas apparus appropriés, si ce n'est à des dilutions très élevées.RESULTS OBTAINED
Linearity was used hyperbilirubinemic serum with a total bilirubin concentration of 30 mg / dl, said by the method of Jendrassik, following the indications of Schellong and Wende. When using the indicated volumes, the method appears linear at least up to 20 mg / dl. Commercial bilirubin standards (eg, Behring standard bilirubins) did not appear appropriate, except at very high dilutions.

Reproductibilité: l'analyse (n = 40) d'un sérum normal (bi bilirubine : 0,7 mg/dl) présente un coefficient de variation en pourcentage de 2,5.Reproducibility: the analysis (n = 40) of a normal serum (bi bilirubin: 0.7 mg / dl) has a coefficient of variation in percent of 2.5.

Corrélation : des dosages en parallèle de la bilirubine totale et directe ont été exécutés sur 70 sérums normaux et pathologiques par la présente méthode et la méthode de Jendrassik. Correlation: Parallel determinations of total and direct bilirubin were performed on 70 normal and pathological sera by this method and Jendrassik's method.

La corrélation est excellente pour les deux formes de bilirubine (bilirubine directe : n = 70 ; r = 0,9974 a = -7,067 ; b = 0,9480 ; bilirubine totale : n = 70;
r = 0,9886 t a = 0,7358 s b = 0,8828).The correlation is excellent for both forms of bilirubin (direct bilirubin: n = 70, r = 0.9974 a = -7.067, b = 0.9480, total bilirubin: n = 70;
r = 0.9886 ta = 0.7358 sb = 0.8828).

- Développement de la couleur et effet des substances réductrices : le développement de la couleur du mélange de réaction, méme si l'on utilise des échantillons à haute concentration de bilirubine, s'effectue en 2 à 3 minutes et atteint en tout cas l'intensité maximale dans les 15 minutes. Toutefois, lorsqu'on utilise des sérums de patients en traitement par des substances réductrices (acide ascorbique etc.), la couleur se développe plus lentement ou même partiellement, en fonction de la concentration de la substance réductrice.- Color development and effect of reducing substances: the development of the color of the reaction mixture, even if samples with a high concentration of bilirubin are used, takes place in 2 to 3 minutes and in any case reaches maximum intensity within 15 minutes. However, when using sera from patients treated with reducing substances (ascorbic acid, etc.), the color develops more slowly or even partially, depending on the concentration of the reducing substance.

- Utilisation de l'azoture de sodium dans la détermination de la bilirubine directe : on tire parti du phénomène de l'in
hibition de la réaction de diazotation par des réducteurs, dans la présente méthode, en utilisant l'azoture de sodium dans la détermination de la bilirubine directe. En effet, en utilisant 100 pg de NaN3/l,l ml de mélange de réaction, on obtient des valeurs de bilirubine directe qui sont en corrélation parfaite avec celles que l'on obtient par la méthode de
Jendrassik ( = 0,9986).- Use of sodium azide in the determination of direct bilirubin: we take advantage of the phenomenon of the
hibition of the diazotization reaction by reducing agents, in the present method, using sodium azide in the determination of direct bilirubin. In fact, using 100 μg of NaN 3 / l, 1 ml of reaction mixture, direct bilirubin values are obtained which are in perfect correlation with those obtained by the method of
Jendrassik (= 0.9986).

- Caractéristiques du réactif chromogène : le réactif chromogéne de couleur jaune plie est stable à 4 OC pendant au moins 6 mois. Le complexe coloré a un pouvoir absorbant molaire d'environ 80 x 103l.mol-1.cm-1 à 592 nm, stable pendant plusieurs heures. Il présente un spectre d'absorption ayant un maximum entre 590 et 600 nm.- Characteristics of the chromogenic reagent: the yellow chromogenic reagent plie is stable at 4 OC for at least 6 months. The colored complex has a molar absorbency of about 80 x 103 μmol-1 cm-1 at 592 nm, stable for several hours. It has an absorption spectrum having a maximum between 590 and 600 nm.

L'azoture de sodium et l'iodure de potassium aux concentrations utilisées dans la présente méthode altèrent graduellement le réactif, mais,aussitôt ajoutés, ils ne modifient pas le spectre d'absorption. Sodium azide and potassium iodide at the concentrations used in this method gradually alter the reagent but, as soon as added, do not alter the absorption spectrum.

~ Interférences et effet de l'iodure de potassium: la méthode est sensible non seulement aux substances réductrices mais à l'hémoglobine, méme à de faibles concentrations. L'addition d'ioduré de potassium au sérum à la concentration finale de 0,5 à 5,0 g/l permet un aosage correct, méme en présence d'hémolyse, jusqu'à 400 mg/dl d'hémoglobine. Les sérums hyperli sémiques ne donnent pas d'interférences appréciables, - Précision : on a analysé divers serums témoins du commerce (Tableau 1); certains présentent des valeurs nettement inférieures à la valeur préétablie, probablement à cause du type de conservateur ajouté. ~ Interferences and effect of potassium iodide: the method is sensitive not only to reducing substances but to hemoglobin, even at low concentrations. The addition of potassium iodide to the serum at the final concentration of 0.5 to 5.0 g / l allows a correct aose, even in the presence of hemolysis, up to 400 mg / dl of hemoglobin. Hyperimmune sera do not give appreciable interference, Precision: various commercial control sera were analyzed (Table 1); some have values well below the pre-established value, probably because of the type of preservative added.

- Intervalle de référence : la recherche concernant les deux formes de bilirubine a été conduite aussi bien sur des sujets normaux ambulants que sur des donneurs de sang. Il faut noter que les aonneurs de sang présentent, par tendance, des valeurs plus élevées. - Reference Interval: Research on both forms of bilirubin was conducted on normal traveling subjects as well as on blood donors. It should be noted that blood donors have, by trend, higher values.

TABLEAU I
Résultats de l'analyse des sérums témoins :

TABLE I
Results of the analysis of the control sera:

Sérums <SEP> témoins <SEP> Firme <SEP> Valeur <SEP> Valeur <SEP> %
<tb> expérimentale <SEP> théorique
<tb> Serum <SEP> control <SEP> N <SEP> Roche <SEP> 1,30 <SEP> 1,25 <SEP> 104
<tb> " <SEP> " <SEP> A <SEP> " <SEP> 2,70 <SEP> 3,2 <SEP> 84
<tb> Kontrollogen <SEP> L <SEP> Ist,Behring <SEP> 1,37 <SEP> 1,30 <SEP> 105
<tb> Seronorm <SEP> Nyegaard <SEP> 1,72 <SEP> 1,77 <SEP> 97
<tb> S <SEP> V <SEP> R <SEP> S <SEP> Wellcome <SEP> 3,50 <SEP> 3.78 <SEP> 92
<tb> Clinicontrol <SEP> N <SEP> Sclavo <SEP> 1,15 <SEP> 1,20 <SEP> 96
<tb> Precinorm <SEP> U <SEP> Biochemia <SEP> 1,05 <SEP> 1,61 <SEP> 65
<tb> TABLEAU 2
Intervalles de références de la bilirubine totale et directe, dosées par les deux méthodes (mg/dl)

Serums <SEP> witnesses <SEP> Company <SEP> Value <SEP> Value <SEP>%
<tb> experimental <SEP> theoretical
<tb> Serum <SEP> control <SEP> N <SEP> Roche <SEP> 1.30 <SEP> 1.25 <SEP> 104
<tb>"<SEP>"<SEP> A <SEP>"<SEP> 2.70 <SEP> 3.2 <SEP> 84
<tb> Kontrollogen <SEP> L <SEP> Ist, Behring <SE> 1.37 <SE> 1.30 <SE> 105
<tb> Seronorm <SEP> Nyegaard <SEP> 1.72 <SE> 1.77 <SEP> 97
<tb> S <SEP> V <SEP> R <SE> S <SEP> Wellcome <SEP> 3.50 <SE> 3.78 <SEP> 92
<tb> Clinic Control <SEP> N <SEP> Sclavo <SEP> 1.15 <SEP> 1.20 <SEP> 96
<tb> Precinorm <SEP> U <SEP> Biochemia <SEP> 1.05 <SEP> 1.61 <SEP> 65
<tb> TABLE 2
Reference ranges of total and direct bilirubin, assayed by both methods (mg / dl)

Bilirubines <SEP> totales <SEP> Bilirubines <SEP> directes
<tb> méthode <SEP> selon <SEP> méthode <SEP> méthode <SEP> selon <SEP> méthode
<tb> l'invention <SEP> Jendras. <SEP> l'invention <SEP> Jendras.
<tb>Bilirubins <SEP> total <SEP> Bilirubins <SEP> direct
<tb> method <SEP> according to <SEP> method <SEP> method <SEP> according to <SEP> method
<tb> the invention <SEP> Jendras. <SEP> the invention <SEP> Jendras.
<Tb>

Sujets <SEP> normaux <SEP> 0,69 <SEP> # <SEP> 0,25 <SEP> 0,68 <SEP> # <SEP> 0,26 <SEP> 0,21 <SEP> # <SEP> 0,12 <SEP> 0,18 <SEP> # <SEP> 0,11
<tb> Donneurs <SEP> de <SEP> sang <SEP> 0,83 <SEP> # <SEP> 0,22 <SEP> - <SEP> 0,25 <SEP> # <SEP> 0,09 <SEP> Normal <SEP> Subjects <SEP> 0.69 <SEP>#<SEP> 0.25 <SEP> 0.68 <SEP>#<SEP> 0.26 <SEP> 0.21 <SEP>#<SEP> 0.12 <SEP> 0.18 <SEP>#<SEP> 0.11
<tb> Donors <SEP> of <SEP> blood <SEP> 0.83 <SEP>#<SEP> 0.22 <SEP> - <SEP> 0.25 <SEP>#<SEP> 0.09 <SEP >

Claims

1 - Method for the rapid determination of total and direct bilirubin in biological fluids with a single reagent characterized by the fact that the ssF4 salt of "Fast red B" in acidic solution containing decouplers suitable for this purpose is used effect, such as, for example, urea and methanol.

2 - Method according to claim 1, characterized in that the white is eliminated.

3 - Method according to one of claims 1 and 2, characterized in that it allows the determination of bilirubins, total and direct, with the same single reagent, simply with a prior addition of sodium azide or other reducing substances, at an appropriate concentration, as an inhibitor of the indirect bilirubin diazotization reaction.

4 - Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that eliminates, by addition of potassium iodide at an appropriate concentration, the interference due to haemoglobin present in sera with hemolysis.