FR2480306A1 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF L-METHIONINE BY FERMENTATION - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION A POUR OBJET UN PROCEDE DE PRODUCTION DE L-METHIONINE PAR FERMENTATION UTILISANT DES MUTANTS OBTENUS PAR TRANSFORMATION GENETIQUE. SELON L'INVENTION, ON CULTIVE DANS UN MILIEU DE CULTURE UN MICRO-ORGANISME PRODUCTEUR DE L-METHIONINE ET ON RECUEILLE LA L-METHIONINE ACCUMULEE DANS LE MILIEU DE CULTURE, LEDIT MICRO-ORGANISME ETANT OBTENU PAR INCORPORATION, DANS UNE SOUCHE RECEPTRICE DU GENRE ESCHERICHIA, D'UN PLASMIDE HYBRIDE DANS LEQUEL EST INSERE UN FRAGMENT D'ADN PORTANT L'INFORMATION GENETIQUE RELATIVE A LA PRODUCTION DE L-METHIONINE, LEDIT FRAGMENT ETANT DERIVE D'UNE SOUCHE DONNEUR DU GENRE ESCHERICHIA QUI EST RESISTANTE A L'ETHIONINE.THE OBJECT OF THE INVENTION IS A PROCESS FOR THE PRODUCTION OF L-METHIONINE BY FERMENTATION USING MUTANTS OBTAINED BY GENETIC TRANSFORMATION. ACCORDING TO THE INVENTION, A MICRO-ORGANISM PRODUCING L-METHIONINE IS CULTIVATED IN A CULTURE MEDIUM AND L-METHIONINE ACCUMULATED IN THE CULTURE MEDIUM, THIS MICRO-ORGANISM BEING OBTAINED BY INCORPORATION, IN A RECEIVING STRAIN OF THE GENUS, IS COLLECTED. ESCHERICHIA, OF A HYBRID PLASMID IN WHICH IS INSERTED A FRAGMENT OF DNA CONTAINING GENETIC INFORMATION RELATING TO THE PRODUCTION OF L-METHIONINE, THE FRAGMENT BEING DERIVED FROM A DONOR STRAIN OF THE GENUS ESCHERICHIA WHICH IS RESISTANT TO ETHIONINE.
Description
La présente invention concerne un procédé pour la production de L-The present invention relates to a process for the production of L-
méthionine par fermentation et, en particulier, un procédé pour produire la L-méthionine avec un micro-organisme methionine by fermentation and, in particular, a process for producing L-methionine with a microorganism
construit par une technique de recombinaison de gènes. constructed by a recombinant gene technique.
La plupart des souches sauvages de micro-organismes ne produisent pas de L-méthionine dans le milieu. Pour rendre une souche sauvage capable de produire la L-méthionine à partir des hydrates de carbone, il a été nécessaire d'induire des mutants artificiels à partir de la souche sauvage. Il existe de nombreux mutants artificiels producteurs de méthionine connus. Les mutants connus caractéristiques producteurs de méêtionine sont les suivants: 1) Escherichia coli résistant à l'éthionine, Candida utilis résistant 2y-3) à l'éthionine, Salmonella typhimurium résistant à l'éthionine3 3) Salmonella typhimurium résistant à l'améthylméthionine, Salmonella 3) typhimurium résistant à la norleucine, Escherichia coli résistant Most wild strains of microorganisms do not produce L-methionine in the medium. To make a wild strain capable of producing L-methionine from carbohydrates, it has been necessary to induce artificial mutants from the wild strain. There are many known methionine-producing artificial mutants. The known characteristic mutants producing metietin are: 1) Escherichia coli resistant to ethionine, Candida utilis resistant 2y-3) to ethionine, Salmonella typhimurium resistant to ethionine3 3) Salmonella typhimurium resistant to amethylmethionine, Salmonella 3) Norleucin resistant typhimurium, resistant Escherichia coli
à la norleucine 4), Corynebacterium alutamicum résistant à l'a-méthyl- norleucine 4), Corynebacterium alutamicum resistant to α-methyl-
))
méthionine, et Brevibacterium flavum résistant à l'éthionine6). methionine, and Brevibacterium flavum resistant to ethionine6).
1) J. Bacteriol., 76,326 (1958), 2) Folia Microbiol., 9,374 (1964), 3) Genetics, 58,473 (1968), 4) Compt. Rend., 248,3490 (1959), ) Brevet des Etats-Unis d'Amérique n 3.729.381, 6) Publication pour opposition de la demande de brevet 1) J. Bacteriol., 76, 326 (1958), 2) Folia Microbiol., 9,374 (1964), 3) Genetics, 58,473 (1968), 4) Compt. Rend., 248,3490 (1959),) United States Patent No. 3,729,381, (6) Publication for opposition to the patent application
japonais na 6753/1976.Japanese na 6753/1976.
Le producteur de méthionine le plus efficace jusqu'à prébent, à la connaissance de la demanderesse, est Corynebacterium gEluamicium ATCC 21608 qui a produit 3,4 mg/ml de L-méthionine à The most effective methionine producer up to prebent, to the knowledge of the Applicant, is Corynebacterium gEluamicium ATCC 21608 which produced 3.4 mg / ml of L-methionine at
partir de 10 g/dl de glucose.from 10 g / dl of glucose.
Il est devenu cependant difficile d'augmenter les rendements de Lméthionine en utilisant les techniques de mutation artificielle. On a donc constamment besoin de mettre au point un nouveau procédé pour la production de L-méthionine avec des However, it has become difficult to increase the yields of L-methionine using artificial mutation techniques. There is therefore a continuing need to develop a new process for the production of L-methionine with
rendements élevés.high yields.
L'invention a donc pour objet un procédé pour la The subject of the invention is therefore a method for
production dLe L-mêthionine avec des rendements élevés. production of L-methionine with high yields.
Cet objet et d'autres objets de l'invention qui appa- This object and other objects of the invention which appear
raîtront plus facilement ci-après ont été obtenus par un procédé qui consiste: à cultiver dans un milieu de culture un micro-organisme producteur de L-méthionine qui est obtenu par incorporation, dans une souche réceptrice du-genre Escherichia, d'un plasmidehybride dans lequel est inséré un fragment d'ADN portant l'information génétique relative à la production de L-méthionine, qui provient d'une souche de donneur d'ADN du genre Escherichia qui est résistante à l'éthionine The following are more readily obtained by a method which comprises: culturing in a culture medium an L-methionine-producing microorganism which is obtained by incorporation into a recipient strain of the genus Escherichia of a hybrid plasmid in which is inserted a DNA fragment carrying the genetic information relating to the production of L-methionine, which originates from a DNA donor strain of the genus Escherichia which is resistant to ethionine
et à récupérer de la L-méthionine accumulée dans le milieu de culture. and recovering L-methionine accumulated in the culture medium.
La souche de donneur d'ADN utilisée pour construire le producteur de Lméthionine de l'invention est un mutant du genre Escherichia résistant à l'éthionine et possède l'information génétique relative à la production de L-méthionine. On utilise de préférence comme donneur d'ADN des souches ayant une productivité supérieure de L-méthionine. Le mutant résistant à l'éthionine utilisé comme donneur d'ADN peut être obtenu par des techniques classiques de mutation. L'ADN chromosomique est extrait du donneur d'ADN de manière bien connue et traité avec une endonucléase de restriction The DNA donor strain used to construct the L-methionine producer of the invention is a mutant of the genus Escherichia resistant to ethionine and has the genetic information relating to the production of L-methionine. Strains with higher productivity of L-methionine are preferably used as the DNA donor. The ethionine resistant mutant used as a DNA donor can be obtained by standard mutation techniques. The chromosomal DNA is extracted from the DNA donor in a well-known manner and treated with a restriction endonuclease
par un procédé bien connu (Biochem. Biophys. Acta 383, page 457 (1975)). by a well-known method (Biochem Biophys Acta 383, page 457 (1975)).
Le plasmide-ADN ou ADN-phage utilisé comme vecteur dans le procédé de synthèse est également traité de manière analogue par The plasmid-DNA or DNA-phage used as a vector in the synthesis method is also treated analogously by
une endonucléase de restriction. On peut utiliser divers types d'endo- a restriction endonuclease. Various types of endo-
nucléases de restriction, si la digestion de l'ADN chromosomique est effectuée partiellement. Ensuite, l'ADN chromosomique digéré et restriction nucleases, if the digestion of chromosomal DNA is partially carried out. Then, the chromosomal DNA digested and
i'ADN vecteur sont soumis à une réaction de "ligation" (fixation). the vector DNA are subjected to a "ligation" reaction (fixation).
La recombinaison de l'ADN pour préparer le plasmide recombinant peut etre effectuée par introduction,avec la transférase terminale, d'acide désoxyadénylique et d'acide désoxythymidylique ou d'acide désoxyguanylique et d'acide désoxycytidylique dans le fragment d'ADN chromosomique et l'ADN vecteur scindé, et en soumettant le fragment d'ADN chromosomique modifié et 1'ADN vecteur scindé à The recombination of the DNA to prepare the recombinant plasmid can be carried out by introducing, with the terminal transferase, deoxyadenyl acid and deoxythymidylic acid or deoxyguanyl acid and deoxycytidylic acid into the chromosomal DNA fragment and Cleaved vector DNA, and subjecting the modified chromosomal DNA fragment and the cleaved vector DNA to
une réaction d'annellation.a reaction of annellation.
Comme ADN vecteur convenable, on peut utiliser un vecteur classique tel que Col El, pSC 101, pBR 322, pACYC 177, pCR 1, As a suitable vector DNA, a conventional vector such as Col El, pSC 101, pBR 322, pACYC 177, pCR 1, can be used.
R6K ou X-phage, ou leurs dérivés.R6K or X-phage, or their derivatives.
248 30 6248 30 6
L'ADN hybride ainsi obtenu peut être incorporé dans un micro-organisme du genre Escherichia par des techniques classiques de transformation, voir J. Bacteriol., 119, page 1072 (1974) Le transformant désiré est sélectionné en utilisant un milieu sur lequel ne peut pousser qu'un clone ayant les caractéristiques de production de L-méthionine provenant du fragment d'ADN chromosomique ou celles The hybrid DNA thus obtained can be incorporated into a microorganism of the Escherichia genus by conventional transformation techniques, see J. Bacteriol., 119, page 1072 (1974). The desired transformant is selected using a medium on which no push a clone having the characteristics of L-methionine production from the chromosomal DNA fragment or those
provenant de l'ADN vecteur, ou les unes et les autres. from the vector DNA, or both.
Comme micro-organisme récepteur de l'ADN hybride, on utilise ordinairement un auxotrophe de L-méthionine puisqu'il est classique de distinguer le transformant producteur de méthionine du récepteur. Il est souhaitable, pour obtenir de meilleurs résultats, d'utiliser commle récepteur un mutant possédant déjà une productivité As hybrid micro-receptor microorganism, an L-methionine auxotroph is usually used since it is conventional to distinguish the methionine-producing transformant from the receptor. It is desirable, for best results, to use as a receptor a mutant already having a productivity
supérieure de L-snéthionine.top of L-seethionine.
Les procédés de culture des souches productrices de L-méthionine ainsi obtenues sont classiques et semblables aux procédés pour la culture des micro-organismes producteurs de L-méthionine connus. Donc, le milieu de culture utilisé est un milieu classique contenant des sources de carbone, des sources d'azote, des ions inorganiques et, si nécessaire, de plus faibles quantités d'agents nutritifs organiques, tels que vitamines ou aminoacideso Des exemples The culture methods of the L-methionine-producing strains thus obtained are conventional and similar to the methods for culturing known L-methionine-producing microorganisms. Thus, the culture medium used is a conventional medium containing carbon sources, nitrogen sources, inorganic ions and, if necessary, smaller amounts of organic nutrients, such as vitamins or amino acids.
de sources de carbone appropriées comprennent le glucose, le saccha- suitable carbon sources include glucose, saccharine
rose, le lactose, l'hydrolysat de mais et les mélasses. On peut utiliser comme sources d'azote l'ammoniac gazeusex, lammoniaque aqueuse rose, lactose, corn hydrolyzate and molasses. Gaseous ammonia, aqueous ammonia, can be used as sources of nitrogen
et les sels d'ammonium et d'autres substances azotées. and ammonium salts and other nitrogenous substances.
La culture des micro-organismes recombinants est effectuée en conditions aérobies, le pH et la température du milieu étant ajustés à une valeur convenable et maintenus jusqu'à ce que The culture of the recombinant microorganisms is carried out under aerobic conditions, the pH and the temperature of the medium being adjusted to a suitable value and maintained until
la formation de L-méthionine cesse. L-methionine formation ceases.
La L-néthionine accumulée dans le milieu de culture L-nethionine accumulated in the culture medium
peut itre récupérée par des procédés classiques. can be recovered by conventional methods.
Par le procédé de la présente invention, on peut produire la L-méthionine avec des rendements plus élevés que ceux obtenus dans les procédés connus précédemment,dans lesquels on utilise des mutants artificiels d'Escherichiao Les exemples suivants illustrent l'invention sans By the method of the present invention, L-methionine can be produced in higher yields than those obtained in the previously known methods in which artificial Escherichia mutants are used. The following examples illustrate the invention without
toutefois en limiter la portée.however, limit its scope.
EXEMPLE 1EXAMPLE 1
(1) Préparation d'ADN chromosomique possédant l'information génétique relative à la production de L-méthionine Dans 1 litre de milieu L contenant 1 g/dl de peptone, 0,5 g/dl d'extrait de levure, 0,1 g/dl de glucose, 0,5 g/dl de NaCl (ajusté à pH 7,2), on cultive à 37 C, pendant 3 h en agitant, Escherichia coli EG-20 (NRLL B-12392), mutant résistant à la S-(2-aminoéthyl)-cystéine (AEC) et à l'éthionine et dérivé de K-12 (1) Preparation of chromosomal DNA having the genetic information relating to the production of L-methionine In 1 liter of L medium containing 1 g / dl of peptone, 0.5 g / dl of yeast extract, 0.1 g / dl of glucose, 0.5 g / dl of NaCl (adjusted to pH 7.2), cultured at 37 ° C. for 3 h with stirring, Escherichia coli EG-20 (NRLL B-12392), mutant resistant to S- (2-aminoethyl) -cysteine (AEC) and ethionine and K-12 derivative
(ATCC 10798) par exposition de cellules K-12 à 250 y/ml de N-méthyl- (ATCC 10798) by exposing K-12 cells to 250 μg / ml of N-methyl-
N'-nitro-N-nitrosoguanidine dans un tampon à l'acide citrique à pH 5,5 à 0 C pendant 60 min, et en séparant la colanie qui apparaît sur le milieu de gélose, et on récolte les cellules bactériennes dans la phase de croissance exponentielle. On extrait-l'ADN chromosomique N'-nitro-N-nitrosoguanidine in a citric acid buffer at pH 5.5 at 0 ° C for 60 min, and separating colania which appears on the agar medium, and the bacterial cells are harvested in the phase of exponential growth. Chromosomal DNA is extracted
par une méthode classique au phénol et on obtient 3,4 mg d'ADN purifié. by a conventional phenol method and 3.4 mg of purified DNA is obtained.
(2) Préparation d'ADN vecteur On prépare comme vecteur l'ADN de pBR 322 de la manière suivante On fait incuber à 370C une souche d'Escherichia coli K-12 recevant le plasmide pBR 322 dans 1 litre d'un milieu contenant 2 g de glucose, 1 g de NH4C1, 6 g de Na2HP04, 3 g de KH2P04 5 g de (2) Preparation of Vector DNA pBR 322 DNA was prepared as follows. A strain of Escherichia coli K-12 receiving plasmid pBR 322 was incubated at 370 ° C. in 1 liter of a medium containing 2 × 1 g of glucose, 1 g of NH 4 Cl, 6 g of Na 2 HPO 4, 3 g of KH 2 PO 4, 5 g of
NaCI. 0,1 g de MgSO 4,7H120 0,015 g de CaC12 2H20, 20 g de "casamino- NaCl. 0.1 g of MgSO 4.7H120 0.015 g of CaCl 2 2H 2 O, 20 g of casamino
acide" (hydrolysat de caséine), 0,05 g de thymine, 0,05 g de L-trypto- acid (casein hydrolyzate), 0.05 g of thymine, 0.05 g of L-tryptophan
phane et 100 y de chlorhydrate de thiamine par litre (ajusté à pH 7,2). phane and 100 μl of thiamine hydrochloride per liter (adjusted to pH 7.2).
Après avoir fait incuber la souche jusqu'à la fin de la phase loga- After incubating the strain until the end of the log phase
rithmique, on ajoute au milieu de culture 170 Ty/ml de chloramphénicol. rhithmic, 170 ml / ml of chloramphenicol is added to the culture medium.
Par ce procédé, l'ADN de plasmide s'est développé et accumulé abondam- By this method, the plasmid DNA has grown and accumulated abundantly.
ment dans les cellules bactériennes. in bacterial cells.
Après 16 h d'incubation, on récolte les cellules que l'on lyse par traitement par le lysozyme et le dodécylsulfate de sodium. On centrifuge le lysat à 30.000xg pendant 1 h pour obtenir la liqueur surnageante. Après concentration de la liqueur surnageante, After 16 hours of incubation, the cells are harvested and lysed by treatment with lysozyme and sodium dodecyl sulphate. The lysate is centrifuged at 30,000xg for 1 h to obtain the supernatant liquor. After concentration of the supernatant liquor,
on obtient 480 y de l'ADN de plasmidepBR 322 en utilisant la centri- 480 μ of plasmid pBR 322 DNA is obtained using the
fugation dans un gradient de densité chlorure de césium-bromure fugation in a cesium-bromide chloride density gradient
d'éthidium jusqu'à l'équilibre.from ethidium to equilibrium.
(3) Insertion du fragment d'ADN chromosomique dans le vecteur (3) Insertion of the chromosomal DNA fragment into the vector
On traite 10 y de l'ADN chromosomique avec l'endo- Chromosomal DNA is treated with the endothelium.
nucléase de restriction Hind III à 37 C pendant 5; 10, 20, 30 ou min pour scinder les chaînes d'ADN, et on chauffe à 65 C pendant 5 min, respectivement. On traite également 10 y de l'ADN vecteur avec chacune des endonucléases de restriction mentionnées ci-dessus A 37 C pendant 1 h pour scinder complètement l'ADN,- et on chauffe ensuite a 65 C pendant 5 min. On mélange la solution d'ADN chromosomique digéré et la solution d'ADN vecteur scindé et on soumet à la réaction de ligation de fragments d'ADN par une ligase de l'ADN-phage T4 en présence d'ATP et de dithiothréitol à 10 C pendant 24 h. On chauffe ensuite le mélange de réaction à 65 C pendant 5 min, et on ajoute deux fois son volume Hind III restriction nuclease at 37 ° C for 5; 10, 20, 30 or min to split the DNA chains, and heated at 65 ° C for 5 min, respectively. Vector DNA was also treated with each of the restriction endonucleases mentioned above at 37 ° C for 1 h to completely cleave the DNA, and then heated at 65 ° C for 5 min. The digested chromosomal DNA solution was mixed with the split vector DNA solution and the DNA ligation reaction was ligated with T4 phage DNA ligase in the presence of ATP and dithiothreitol. C for 24 h. The reaction mixture is then heated at 65 ° C. for 5 minutes, and its volume is twice
d'éthanol. On récupère l'ADN recombinant précipité. ethanol. The recombinant DNA precipitated is recovered.
(4) Transformation génétique par le plasmidehybride recevant l'information génétique relative à la production de L-méthionine On induit les souches réceptrices suivantes à partir (4) Genetic transformation by the hybrid plasmid receiving the genetic information relating to the production of L-methionine The following receptor strains are induced from
d'Escherichia coli K-12 par exposition à 250 y/ml de N-méthyl-N'- of Escherichia coli K-12 by exposure to 250 μg / ml of N-methyl-N'-
nitro-N-nitrosoguanidine dans un tampon à l'acide citrique à pH 5,5 à 0 C pendant 60 min. N 2 (NRRL B-12393) (résistant à la S-(2-aminoéthyl)cystéine) No 30 (NRR B-12395) (résistant à la norleucine) N 77 (NRRL B12397) (résistant à la 2-thiazoléalanine) nitro-N-nitrosoguanidine in a citric acid buffer at pH 5.5 at 0 C for 60 min. N 2 (NRRL B-12393) (resistant to S- (2-aminoethyl) cysteine) No. 30 (NRR B-12395) (norleucine resistant) N 77 (NRRL B12397) (2-thiazolealanine resistant)
N 283 (NRRL B-12398) (résistant à la p-fluorophényl- N 283 (NRRL B-12398) (resistant to p-fluorophenyl-
alanine) On inocule chacune des souches réceptrices dans 10 ml alanine) Each of the recipient strains is inoculated into 10 ml
de milieu L et on cultive à 37 C en agitant. medium L and cultured at 37 C with stirring.
On récolte les cellules dans la phase de croissance exponentielle et on les met en suspension dans une solution de MgC12 O,lM et ensuite dans une solution de CaC12 O,1M au bain de The cells are harvested in the exponential growth phase and suspended in a solution of 0.1 M MgCl 2 and then in 0.1 M CaCl 2 solution in a water bath.
2 2'2 2 '
glace; on prépare ainsi les cellules "'compétentes" capables de fixer ice cream; the "competent" cells capable of fixing
1'ADN.1'ADN.
Dans la suspension de cellules compétentes, on ajoute l'ADN obtenu à l'étape (3) qui contient l'ADN de plasmidehybride. On maintient la suspension au bain de glace pendant 30 min, puis on chauffe à 40 C pendant 2 min, et on laisse à nouveau reposer au bain de glace pendant 30 min; les cellules dans lesquelles l'ADN de plasmidehybride est ainsi incorporé sont inoculées dans le milieu L et on agite le milieu A 37 C pendant 2 h; la réaction de transforma- tion est ainsi terminée. On récolte les cellules, on les lave et on les remet en suspension. On étale une faible portion de la suspension de cellules sur une plaque de gélose contenant 2 g de glucose, 1 g de (NH4)2S04, 7 g de K2HP04, 2 g de KH2P04, 0,1 g de MgS04,7H20, 0,5 g de citrate de sodium,2H20, 0,5 g de S-(2aminoéthyl)-cystéine, In the competent cell suspension, the DNA obtained in step (3) which contains the plasmid hybrid DNA is added. The suspension is kept in an ice bath for 30 minutes, then heated at 40 ° C. for 2 minutes and allowed to stand in an ice bath for 30 minutes; the cells in which the plasmid hybrid DNA is thus incorporated are inoculated into the medium L and the medium A 37 C is stirred for 2 hours; the transformation reaction is thus complete. The cells are harvested, washed and resuspended. A small portion of the cell suspension is spread on an agar plate containing 2 g of glucose, 1 g of (NH 4) 2 SO 4, 7 g of K 2 HPO 4, 2 g of KH 2 PO 4, 0.1 g of MgSO 4, 7H 2 O, 5 g of sodium citrate, 2H 2 O, 0.5 g of S- (2-aminoethyl) -cysteine,
y/ml d'ampicilline et 20 g de gélose par litre (ajustée à pH 7,2). y / ml of ampicillin and 20 g of agar per liter (adjusted to pH 7.2).
On fait incuber la plaque à 37 C pendant 3 jours. The plate is incubated at 37 ° C. for 3 days.
On prélève les colonies apparaissant sur la plaque et on obtient des souches résitantes à la fois à l'ampicilline, à The colonies appearing on the plate are removed and strains resisting to both ampicillin,
la S-(2-aminoéthyl)-cystéine et à l'éthionine. S- (2-aminoethyl) -cysteine and ethionine.
On obtient les clones hybrides produisant la L-méthio- Hybrid clones producing L-methio-
nine AJ 11539 (FERM-P 5479, NRRL B-12399), AJ 11540 (FERM-P 5480, NRRL B12400), AJ 11541 (FERM-P 5481, NRRL B-12401) et AJ 11542 (FERM-P, NRRL N12402) à partir des souches réceptrices n 2, 30, AJ 11539 (FERM-P 5479, NRRL B-12399), AJ 11540 (FERM-P 5480, NRRL B12400), AJ 11541 (FERM-P 5481, NRRL B-12401) and AJ 11542 (FERM-P, NRRL N12402 ) from the receptor strains n 2, 30,
77 et 283, respectivement.77 and 283, respectively.
(5) Production de la L-méthionine par la nouvelle souche productrice de Lméthionine Le tableau ci-après indique les résultats expérimentaux de la production par fermentation de L-méthionine en utilisant les nouvelles souches productrices de L-méthionine et la souche de (5) Production of L-methionine by the new L-methionine producing strain The following table shows the experimental results of fermentation production of L-methionine using the new L-methionine producing strains and the L-methionine strain.
donneur d'ADN EG-20.EG-20 DNA donor.
Le milieu de fermentation contient 5 g/dl de glucose, 2,5 g/dl de sulfate d'ammonium, 0,2g/dLde KH2P04, 0,1 g/dl de MgSO 4, 7H20 0,05 g/dl d'extrait de levure, 100 y/dl de chlorhydrate de thiamine, 1 mg/dl de FeSO 4,7H20, 1 mg/dl de MnSO4,4H20 et 2,5 g/dl de CaCO3 The fermentation medium contains 5 g / dl glucose, 2.5 g / dl ammonium sulfate, 0.2 g / dL KH 2 PO 4, 0.1 g / dL MgSO 4, 7H 2 O 0.05 g / dL yeast extract, 100 μl / dl of thiamine hydrochloride, 1 mg / dl of FeSO 4.7 H 2 O, 1 mg / dl of MnSO 4 · 4H 2 O and 2.5 g / dl of CaCO 3
(stérilisé séparément) et le pHli est ajusté à 7,0. (sterilized separately) and the pHli is adjusted to 7.0.
On place des lots de 20 ml de milieu de fermentation, Place lots of 20 ml of fermentation medium,
inoculés au moyen d'une boucle de platine avec l'inoculum du micro- inoculated by means of a platinum loop with the inoculum of the micro-
organisme d'essai, et on effectue la culture à 31 C pendant 72 h. La quantité de méthionine dans la liqueur surnageante test organism, and the culture is carried out at 31 C for 72 h. The amount of methionine in the supernatant liquor
du bouillon de fermentation esL déterminée par dosage microbiologique. Esl fermentation broth determined by microbiological assay.
TABL7AUTABL7AU
TABLEAUBOARD
Micro-organisme essayé EG-20Microorganism tried EG-20
AJ 11539AJ 11539
AJ 11540AJ 11540
AJ 11541AJ 11541
Ai 11542 N 2 No 30 Nl 77Ai 11542 No. 2 No. 30 No. 77
N 283N 283
L-méthionine produite (mg/dl)L-methionine produced (mg / dl)
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| WO2021060438A1 (en) | 2019-09-25 | 2021-04-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2464299A1 (en) * | 1979-08-28 | 1981-03-06 | Inst Genetiki Selektsii | Prepn. of strains producing aminoacid(s) - by genetic engineering to disturb the negative control over aminoacid synthesis |
-
1980
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Patent Citations (1)
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