FR1465393A

FR1465393A - Improvement in methods of separating serum proteins and in particular gamma globulin from human placentas or hemolyzed blood

Info

Publication number: FR1465393A
Application number: FR18572A
Authority: FR
Inventors: Robert Plan
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1965-05-26
Filing date: 1965-05-26
Publication date: 1967-01-13

Description

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Perfectionnement aux méthodes de séparation de protéines sériques et notamment de la gamma globuline à partir de placentas humains ou de sang hémolysé. Dans sa demande de brevet P.Y. n 16.820 du 12 mai 1965, la demanderesse a décrit un procédé d'élimination de l'hémoglobine en solution dans du sang humain obtenu à partir de placentas humains ou ayant subi une hémolysation. <Desc / Clms Page number 1>
Improvement in methods of separating serum proteins and in particular gamma globulin from human placentas or haemolyzed blood. In its PY patent application No. 16,820 of May 12, 1965, the Applicant described a process for removing hemoglobin in solution in human blood obtained from human placentas or having undergone hemolyzation.

Ce procédé ne permet pas toutefois de préparer de la gamma globuline absolument incolore à partir de sang hémolysé ou de sang provenant de placentas humains. However, this process does not make it possible to prepare absolutely colorless gamma globulin from hemolyzed blood or from blood originating from human placentas.

Le nouveau procédé objet de la présente invention est caractérisé notamment par le fait qu'au lieu d'éliminer l'hémoglobine avant de recourir aux méthodes de fractionnement connues en vue d'extraire des protéines sériques telle que la gamma globuline, on met en oeuvre ces méthodes de fractionnement sans éliminer préalablement l'hémoglobine, et on soumet ensuite les produits extraits par lesdites méthodes de fractionnement à un traitement de purification permettant d'absorber la totalité de l'hémoglobine et de ses dérivés, notamment les pigments colorants qui accompagnent ces produits, sur des résines échangeuses d'ions, de fa- çon à obtenir des protéines sériques, et en particulier de la gamma globuline parfaitement incolore. The new process which is the subject of the present invention is characterized in particular by the fact that instead of eliminating the hemoglobin before resorting to known fractionation methods with a view to extracting serum proteins such as gamma globulin, one implements these fractionation methods without first removing the hemoglobin, and the products extracted by said fractionation methods are then subjected to a purification treatment making it possible to absorb all of the hemoglobin and its derivatives, in particular the coloring pigments which accompany these produced, on ion exchange resins, so as to obtain serum proteins, and in particular perfectly colorless gamma globulin.

Sans revenir sur le détail des méthodes de fractionnement à l'alcool, qui ont été décrites par l'équipe de Cohn et ses successeurs de l'Université de Boston, ii y a lieu de remarquer simplement que lorsqu'on emploie du sang provenant d'autres sources que la ponction veineuse, c'est-à-dire soit du sang hémolysé soit du sang provenant de placentas humains, l'hémoglobine est entraînée dans la plupart des fractions que l'on peut isoler par l'une quelconque des méthodes connues à ce jour. Without going into the details of the alcohol fractionation methods, which were described by the team of Cohn and his successors at Boston University, it should be noted simply that when blood obtained from '' other sources than venipuncture, i.e. either hemolyzed blood or blood from human placentas, hemoglobin is entrained in most of the fractions which can be isolated by any of the methods known to date.

Or il est avantageux de pouvoir utiliser notamment du sang provenant de placentas humains, pour réaliser une économie importante de sang de donneurs. Now, it is advantageous to be able to use in particular blood originating from human placentas, in order to achieve significant savings in donor blood.

Ce sang provenant de placentas humains n'est toutefois pratiquement pas utilisable pour la transfusion directe, en raison justement de l'hémoglobine qui s'y trouve et qui constitue une impureté supplémentaire, hémoglobine qui se trouve totalement mise en solution au moment où les placentas sont conservés dans des réfrigérateurs, à des températures de l'ordre de - 5 à - 30 C, et où toutes les hématies contenues dans le sang éclatent de ce fait. This blood from human placentas is however practically not usable for direct transfusion, precisely because of the hemoglobin which is there and which constitutes an additional impurity, hemoglobin which is completely dissolved when the placentas are stored in refrigerators, at temperatures of the order of -5 to -30 C, and where all the red cells contained in the blood burst as a result.

Dans le cas de sang extrait de placentas congelés, l'hémoglobine peut représenter plus de 50 % des protéines que l'on peut extraire. In the case of blood extracted from frozen placentas, hemoglobin can represent more than 50% of the proteins that can be extracted.

Pour éliminer cette hémoglobine, le procédé suivant la présente invention prévoit, qu'il s'agisse de solutions de gamma globuline ou d'autres protéines sériques, une adsorption de l'hémoglobine et de ses dérivés sur résines échangeuses d'ions du type di- éthyl-amino-éthyl avec un support de dextran ou de cellulose. To eliminate this hemoglobin, the process according to the present invention provides, whether it is solutions of gamma globulin or other serum proteins, adsorption of hemoglobin and its derivatives on ion exchange resins of the di type. - ethyl-amino-ethyl with a dextran or cellulose support.

Dans la pratique, si l'on opère à des conditions de pH convenables et avec une dilution appropriée des solutions de protéines, l'hémoglobine est fixée entièrement sur de telles résines, alors que les protéines passent presque entièrement à travers ces résines. In practice, if one operates at suitable pH conditions and with a suitable dilution of the protein solutions, hemoglobin is bound entirely on such resins, while the proteins pass almost entirely through these resins.

Dans le cas de la gamma globuline, on part d'un produit purifié par fractionnement à l'alcool par exemple, ou par toute autre méthode classique ou même d'un produit purifié après un fractionnement par relargage par les sels. In the case of gamma globulin, the starting point is a product purified by fractionation with alcohol, for example, or by any other conventional method, or even a product purified after fractionation by salting out with salts.

Les solutions de gamma globuline sont diluées de préférence jusqu'à une concentration de l'ordre de 20 g pour mille, bien qu'une telle dilution ne soit pas absolument impérative. The gamma globulin solutions are preferably diluted to a concentration of the order of 20 g per thousand, although such dilution is not absolutely imperative.

Pour que l'adsorption se fasse dans les meilleures conditions, il est toutefois nécessaire d'obtenir une force ionique faible et inférieure à 0,100, et de plus il faut opérer à un pH voisin de 8. For the adsorption to take place under the best conditions, it is however necessary to obtain a weak ionic strength less than 0.100, and moreover it is necessary to operate at a pH close to 8.

Le traitement se fait soit en bain, soit en colonne. On peut ajouter simplement la substance régénérée, mise en cycle anionique type Cl ou phosphate, directement dans la solution de gamma globuline et agiter ensuite cette solution fortement pendant plusieurs heures, 2 à 4 h par exemple, jusqu'à adsorption totale de l'hémoglobine et fixation de cette dernière sur la résine. The treatment is carried out either in a bath or in a column. One can simply add the regenerated substance, put in anionic cycle type Cl or phosphate, directly in the solution of gamma globulin and then shake this solution strongly for several hours, 2 to 4 h for example, until total adsorption of hemoglobin and fixing the latter on the resin.

Dans le cas où l'on opère en colonne, on met la résine sous forme humide dans une colonne de chromatographie, et l'on fait circuler la solution de gamma globuline, à travers cette résine, de façon à provoquer l'adsorption de l'hémoglobine au fur et à mesure de l'écoulement de cette solution. In the case where the operation is carried out in a column, the resin is placed in wet form in a chromatography column, and the gamma globulin solution is circulated, through this resin, so as to cause the adsorption of l. hemoglobin as this solution flows.

Pour concentrer ensuite la solution de gamma globuline ainsi obtenue et dont la grande pureté peut être vérifiée par électrophorèse, on peut employer, soit la lyophilisation ou la dessication sous vide, soit le relargage par le sulfate d'ammonium à 200 g/litre, suivi d'une dialyse, soit encore une précipitation par l'alcool à basse température à - 5 en employant 27 Gf`o d'alcool et en opérant à pH 6,8, le précipité alcoolique obtenu étant ensuite séparé par les méthodes classiques et étant lyophilisé de façon à obtenir une poudre sèche. To then concentrate the gamma globulin solution thus obtained and whose high purity can be verified by electrophoresis, it is possible to use either lyophilization or vacuum drying, or release with ammonium sulphate at 200 g / liter, followed by dialysis, or again a precipitation by alcohol at low temperature at - 5 using 27 Gfʻo of alcohol and operating at pH 6.8, the alcoholic precipitate obtained then being separated by conventional methods and being lyophilized to obtain a dry powder.

On va donner ci-après quelques indications complémentaires sur les résines échangeuses d'ions qui peuvent être utilisées pour adsorber l'hémoglobine, ses dérivés; et les pigments contenus dans ces produits. Some additional information will be given below on the ion exchange resins which can be used to adsorb hemoglobin, its derivatives; and the pigments contained in these products.

Comme on l'a dit plus haut, l'échangeur d'anion est .du type diéthyl-amino-éthyl et cet échangeur est fixé sur une substance insoluble, qui est un polymère des sucres, tel que l'amidon ou que la cellulose et le dextran cités plus haut. As stated above, the anion exchanger is of the diethyl-amino-ethyl type and this exchanger is fixed on an insoluble substance, which is a polymer of sugars, such as starch or cellulose. and dextran mentioned above.

On sait que la cellulose est facile à préparer par la technique décrite par Peterson et Sober dans le Journal de la Société Chimique Américaine (1956-28-751). Cellulose is known to be easy to prepare by the technique described by Peterson and Sober in the Journal of the American Chemical Society (1956-28-751).

Toutefois, la cellulose, si elle est facile à préparer, présente par contre l'inconvénient de se gonfler beaucoup et de provoquer une perte de rendement par imbibition des résines. However, cellulose, if it is easy to prepare, has the disadvantage of swelling a lot and causing a loss of yield by imbibition of the resins.

C'est pourquoi on préfère en général utiliser le- diéthyl-amino-éthyl dextran dont le coefficient de gonflement est moindre et qui permet d'obtenir un rendement plus élevé, mais tous les polymères des sucres sont en principe utilisables, la manipulation de certains d'entre eux pouvant être simplement plus commode. This is why it is generally preferred to use diethyl-amino-ethyl dextran, the swelling coefficient of which is lower and which makes it possible to obtain a higher yield, but all the polymers of the sugars are in principle usable, the manipulation of certain of them may simply be more convenient.

Premier exemple. - On prend une solution de gamma globuline colorée provenant d'un fractionnement en solution concentrée entre 10 et 20 %o On la dilue jusqu'à une concentration en protéines sensiblement égale à 20 g par litre; On ajoute ensuite peu à peu sous forte agitation 2 g par litre de diéthyl-amino-étyl dextran, et on laisse la température remonter aux alentours de 25 à 28 , en maintenant l'agitation; On refroidit éventuellement si la température dépasse 300; On ajuste le pH de la solution en contrôlant la valeur à l'aide d'un pH mètre à électrode de verre et électrode de référence au Calomel, jusqu'à obtention d'un pH exactement égal à 8,0 au moyen de soude Normale; On poursuit l'agitation de la solution pendant quatre heures en corrigeant le pH si celui-ci vient à varier. First example. - A colored gamma globulin solution is taken from a fractionation in a concentrated solution between 10 and 20% o It is diluted to a protein concentration substantially equal to 20 g per liter; Then added little by little with vigorous stirring 2 g per liter of diethyl-amino-ethyl dextran, and the temperature is allowed to rise to around 25 to 28, while maintaining stirring; Optionally cooled if the temperature exceeds 300; The pH of the solution is adjusted by controlling the value using a pH meter with a glass electrode and a Calomel reference electrode, until a pH exactly equal to 8.0 is obtained by means of Normal soda. ; Stirring of the solution is continued for four hours, correcting the pH if the latter changes.

Au bout de ce temps, on centrifuge, ou on filtre, pour obtenir un liquide clair. L'hémoglobine est alors fixée complètement sur la résine. At the end of this time, it is centrifuged, or filtered, to obtain a clear liquid. The hemoglobin is then completely fixed on the resin.

On concentre à nouveau le liquide décoloré ainsi obtenu pour la commodité de l'emploi. The decolored liquid thus obtained is concentrated again for convenience of use.

Pour cela, on ajuste le pH à 7,0 et on refroidit à00C: On ajoute goutte à goutte de l'alcool froid pour porter la concentration alcoolique à une valeur comprise entre 25 et 30 % par exemple 40 litres d'alcool à 960 refroidi à -20 0C pour 100 litres de liquide dont la température est maintenue à 0 0C. For this, the pH is adjusted to 7.0 and cooled to 00C: Cold alcohol is added dropwise to bring the alcohol concentration to a value between 25 and 30%, for example 40 liters of cooled 960 alcohol at -20 0C for 100 liters of liquid, the temperature of which is maintained at 0 0C.

Durant l'addition d'alcool, la température de la solution tombe de 0 à - 50 en restant au voisinage de son point .de congélation. On recueille ensuite le précipité insoluble par centrifugation en centrifugeuse réfrigérée à - 50 en appliquant une force centrifuge de 20 000 g pendant 15 mn. During the addition of alcohol, the temperature of the solution drops from 0 to -50 while remaining near its freezing point. The insoluble precipitate is then collected by centrifugation in a refrigerated centrifuge at -50 by applying a centrifugal force of 20,000 g for 15 min.

La pâte recueillie peut être enfin desséchée sous vide par lyophilisation de façon à obtenir une poudre très pure de gamma globuline. The collected paste can finally be dried under vacuum by lyophilization so as to obtain a very pure powder of gamma globulin.

Il y a lieu de noter que les résines employées peuvent servir plusieurs fois à la condition de les régénérer par la technique suivante Régénération des résines 10 La résine ayant servi à une adsorption est conservée sur ClNa en -solution aqueuse saturée à + 40. It should be noted that the resins used can be used several times on condition that they are regenerated by the following technique Regeneration of the resins The resin which has been used for adsorption is stored on ClNa in saturated aqueous solution at + 40.

Pour cinq traitements consécutifs on ajoute à chaque fois de 450 à 500 g de résine dans 30 litres d'eau distillée additionnée de 10,500 kg .de chlorure de sodium. For five consecutive treatments, 450 to 500 g of resin are added each time to 30 liters of distilled water to which 10.500 kg of sodium chloride have been added.

On agite chaque fois pour faire déposer la résine et on maintient la solution à + 40. The mixture is stirred each time to deposit the resin and the solution is maintained at + 40.

20 Lorsqu'on a rassemblé sous forme de gel une quantité correspondant à 2,500 kg de résine sèche par exemple, dans la solution de chlorure de sodium saturée, on porte le volume à 180 litres en ajoutant de l'eau distillée. On agite fortement pendant 15 mn, on laisse décanter, et on rejette le surnageant. When an amount corresponding to 2,500 kg of dry resin has been collected in the form of a gel, for example, in saturated sodium chloride solution, the volume is brought to 180 liters by adding distilled water. Stirred vigorously for 15 min, allowed to settle, and discard the supernatant.

30 On remet en suspension dans 180 litres de 30 Resuspend in 180 liters of

solution de C1Na 50 g/litre, on laisse décanter à + 4 pendant une nuit, et on rejette le surnageant. 50 g / liter C1Na solution, the mixture is allowed to settle at + 4 overnight, and the supernatant is discarded.

4 On recommence l'opération au moins six fois en laissant décanter à chaque fois. 4 The operation is repeated at least six times, allowing to settle each time.

5 Traitement à Pacide acétique Après avoir décanté le surnageant on le remplace par 150 litres d'eau distillée puis on ajoute de l'acide acétique de manière à obtenir un pH de 5,5 à 6,0 (soit 600 ml environ d'acide acétique pur) et on laisse en contact pendant une nuit à +4o. 5 Treatment with acetic acid After having decanted the supernatant, it is replaced with 150 liters of distilled water and then acetic acid is added so as to obtain a pH of 5.5 to 6.0 (i.e. approximately 600 ml of acid. pure acetic) and left in contact overnight at + 4o.

6 Le lendemain on décante le surnageant, et on le remplace par 150 litres d'eau distillée qu'on laisse en contact pendant une nuit à + 4 . 6 The next day, the supernatant is decanted and replaced with 150 liters of distilled water which is left in contact overnight at + 4.

7 Traitement à l'acide chlorhydrique Cette opération doit être faite obligatoirement .dans la journée, sinon il y a destruction de la résine. 7 Treatment with hydrochloric acid This operation must be carried out during the day, otherwise the resin will be destroyed.

Le matin, on décante le surnageant de l'opération de lavage 6 et on le remplace par 150 litres d'HC1 0,5 N, en employant un mélange préparé séparément de 6 600 ml de HCl pur et de la quantité d'eau permutée nécessaire pour obtenir 150 litres. In the morning, the supernatant from washing operation 6 is decanted and replaced with 150 liters of 0.5 N HCl, using a separately prepared mixture of 6600 ml of pure HCl and the amount of deionized water. necessary to obtain 150 liters.

On agite fortement à l'agitateur mécanique pendant une heure, on laisse décanter jusqu'à l'après- midi. It is stirred vigorously with a mechanical stirrer for one hour, and the mixture is allowed to settle until the afternoon.

8 On rejette alors le surnageant que l'on remplace par 150 litres d'eau permutée. On agite pendant 5 à 10 mn, et on laisse décanter pendant une nuit à + 4 C. 8 The supernatant is then discarded and replaced with 150 liters of deionized water. Stirred for 5 to 10 min, and allowed to settle overnight at + 4 ° C.

9 On renouvelle l'opération précitée de lavage à l'eau permutée au moins trois fois, en éliminant à chaque fois le surnageant par décantation ou essorage. 9 The aforementioned operation of washing with deionized water is repeated at least three times, each time removing the supernatant by decantation or draining.

10 Après avoir éliminé le surnageant on ajoute ensuite 50 litres d'alcool dénaturé. On agite fortement et on laisse en contact pendant une nuit. After removing the supernatant, 50 liters of denatured alcohol are then added. Stir vigorously and leave in contact overnight.

11 Après essorage on procède à un deuxième lavage à l'alcool sous agitation, et on récupère la résine par essorage. 11 After draining, a second washing with alcohol is carried out with stirring, and the resin is recovered by draining.

12 On étend ensuite la résine essorée sur papier filtre et on la sèche pendant une nuit à 50 C. The drained resin is then spread over filter paper and dried overnight at 50 ° C.

N.B. Il est nécessaire d'opérer constamment au-dessous de 80 C, pour ne pas risquer de détruire la résine. N.B. It is necessary to operate constantly below 80 C, so as not to risk destroying the resin.

Deuxième exemple. - Traitement en colonne On prend 10 litres de solution aqueuse de gamma buline à 20 g/litre contenant au maximum ffl 0 0,50 g/litre de chlorure de sodium; On ajuste le pH à 8.0; On prend par ailleurs 20 g de diéthyl-amino- éthyi, dextran, que l'on met en suspension dans 20 litres d'eau distillée, en agitant le mélange; Après avoir ajusté le pH à 8,0 au moyen de soude N, on centrifuge la suspension et l'on remet le gel sédimenté en suspension dans 10 litres d'eau distillée; On verse ensuite la suspension dans une colonne de chromatographie et on laisse écouler l'eau excédentaire; On fait alors passer progressivement la solution aqueuse de gamma globuline à travers la colonne, et on recueille après adsorption et passage sur la colonne, un liquide complètement décoloré, qui ne renferme que la gamma globuline, la solution ayant laissé dans la colonne la totalité de l'hémoglobine qu'elle contenait. Second example. - Column treatment 10 liters of aqueous solution of gamma buline at 20 g / liter are taken, containing at most ffl 0 0.50 g / liter of sodium chloride; The pH is adjusted to 8.0; 20 g of diethyl-amino-ethyl, dextran are also taken, which are suspended in 20 liters of distilled water, while stirring the mixture; After adjusting the pH to 8.0 using N sodium hydroxide, the suspension is centrifuged and the sedimented gel is resuspended in 10 liters of distilled water; The suspension is then poured into a chromatography column and the excess water is allowed to flow; The aqueous solution of gamma globulin is then gradually passed through the column, and after adsorption and passage through the column, a completely decolorized liquid is collected, which contains only the gamma globulin, the solution having left in the column all of the liquid. the hemoglobin it contained.

Le liquide est ensuite concentré à nouveau dans les mêmes conditions qu'au premier exemple. The liquid is then concentrated again under the same conditions as in the first example.

Il est bien entendu que l'on peut apporter aux modes de mise en aeuvre du procédé de séparation de protéines sériques objet de l'invention, divers changements, perfectionnements ou additions, ou remplacer certains corps par des corps équivalents sans altérer pour cela l'économie générale de l'invention.It is understood that it is possible to make various changes, improvements or additions to the modes of implementation of the process for separating serum proteins which are the subject of the invention, or to replace certain bodies with equivalent bodies without thereby altering the general economy of the invention.

Claims

SUMMARY The present invention relates to an improved process for the separation of serum proteins and in particular gamma globulin from possibly frozen human placentas or from hemolyzed blood, said method making it possible to obtain from said placentas or from said hemolyzed blood absolutely serum proteins. colorless and in particular of gamma globulin, this process being further characterized in that after having obtained, by a conventional fractionation method, a colored solution of serum protein and in particular of gamma globulin, said optionally diluted solution is subjected to the 'action of ion-exchange resins of the diethyl-amino-ethyl type fixed on an insoluble polymer of sugars, so as to adsorb all of the hemoglobin and the derivatives contained in said solution by said ion exchange resins , said method possibly further comprising the following characteristics considered individually or in combination a. Said colored solution is diluted beforehand to a protein concentration substantially equal to 20 g per liter; b. The adsorption is carried out at a pH close to 8; vs. The serum protein solutions are diluted until an ionic strength of less than 0.100 is obtained; d. The adsorption is carried out in a bath with vigorous stirring for several hours; e. The resin is placed in an anionic cycle of the Cl or phosphate type; f. The ion exchange resin is placed in wet form in a chromatography column at

the interior of which is circulated: serum protein solution; - g. The decolorized gamma globulin solution is concentrated by lyophilization; h. The decolorized gamma globulin solution is concentrated by vacuum drying; i. The decolorized gamma globulin solution is concentrated by salting out with ammonium sulfate to 200 g per liter followed by dialysis; j. The solution of gamma globulin decolorized by precipitation with alcohol at low temperature, of the order of -5, is concentrated, using 27% of alcohol and operating at pH 6.8 and the alcoholic precipitate obtained is then subjected to lyophilization; k. As carrier, iedextran ion exchange resin is used.