FI99115B - Peptides which react with antibodies directed against an antigen which is bound at T4 receptors, and the diagnostic use thereof - Google Patents
Peptides which react with antibodies directed against an antigen which is bound at T4 receptors, and the diagnostic use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- FI99115B FI99115B FI943795A FI943795A FI99115B FI 99115 B FI99115 B FI 99115B FI 943795 A FI943795 A FI 943795A FI 943795 A FI943795 A FI 943795A FI 99115 B FI99115 B FI 99115B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- thr
- ser
- peptide
- tyr
- asn
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
99115 T-4 reseptoreihin sitoutuvaa antigeeniä kohtaan suunnattujen vaata-aineiden kanssa reagoivia peptidejä ja niiden diagnostinen käyttö 5 Jakamalla erotettu hakemuksesta FI 885630.99115 Peptides Reactive with Tactors Targeting T-4 Receptor Binding Antigen and Their Diagnostic Use 5 Divided by application from FI 885630.
Keksinnön lyhyt kuvaus Tämä keksintö liittyy synteettisesti tuotettuihin lyhyisiin peptidijaksoihin, jotka aiheuttavat HTLV-III/ 10 LAV:n eli HIV-viruksen vaippaproteiiniin kohdistuvien vasta-aineiden tuotannon. Tästä johtuen näitä peptideitä ja niitä vastaan valmistettuja monoklonaalisia vasta-aineita voitaisiin käyttää diagnostisina aineina HIV-viruksen tunnistamiseksi. Tämän vuoksi peptideillä ja peptidejä vas-15 taan suunnatuilla vasta-aineilla voisi olla käyttöä valmistettaessa koepakkauksia HIV-viruksen kantajien tai AIDS:a potevien henkilöiden tunnistamiseksi.Brief Description of the Invention This invention relates to synthetically produced short peptide sequences that induce the production of antibodies to HTLV-III / 10 LAV, or HIV envelope protein. Consequently, these peptides and monoclonal antibodies raised against them could be used as diagnostic agents for the identification of the HIV virus. Therefore, peptides and antibodies directed against the peptides could have use in the preparation of test kits for the identification of HIV carriers or individuals with AIDS.
Keksinnön taustaBackground of the invention
Useat tutkijat ovat raportoineet AIDS (HIV) -viruk- 20 sen täydellisen nukleiinihappojärjestyksen. (Katso LeeSeveral researchers have reported the complete nucleic acid sequence of the AIDS (HIV) virus. (See Lee
Ratner ja muut, Nature 313, s. 277, tammikuu 1985; Muesing ja muut, Nature 313, s. 450, helmikuu 1985; ja Wain-Habson . ja muut Cell 40, sivut 9-17, tammikuu 1985.) Vaippageeniä ;.· on erityisesti liitetty antigeeni syy teen ja tartuntaky- » * 25 kyyn. Vaipan alueen tiedetään myös sisältävän alueita, jotka ovat hyvin vaihtelevia. HIV-viruksen vaipan glyko-proteiinin on osoitettu liittyvän kovalenttisella sidok-'·' sella ihmisen, rotan ja apinan aivojen kalvoihin ja immuu- nijärjestelmän soluihin.Ratner et al., Nature 313, p. 277, January 1985; Muesing et al., Nature 313, p. 450, February 1985; and Wain-Habson. and others Cell 40, pp. 9-17, January 1985.) The envelope bed is specifically associated with antigenic cause and infectivity. The envelope region is also known to include regions that are highly variable. The HIV viral envelope glycoprotein has been shown to be covalently bound to human, rat and monkey brain membranes and immune system cells.
30 Sen ymmärtäminen, että virukset voivat osoittaa va- likoivuutta soluja ja kudoksia kohtaan kiinnittymällä so- ;·. lukalvon pinnan reseptorien erittäin spesifisiin aluei- • · siin, on rohkaissut tutkijoita etsimään aineita, jotka : voisivat sitoutua solukalvojen virusreseptorikohtiin ja 35 näin ehkäistä tietyn viruksen sitoutuminen näihin solui- • · · * • · · « * • » • · • · 2 99115 hin. Aikaisemmin on osoitettu (Epstein ja muut Nature 318, sivut 663-667), että vaccinia-viruksen erityisten reseptorien välittämä tartuntakyky voidaan osoittaa tulevan tehottomaksi synteettisten peptidien avulla.30 Understanding that viruses can show selectivity for cells and tissues by attaching to cells; highly specific regions of membrane surface receptors, has encouraged researchers to look for agents that: could bind to viral receptor sites on cell membranes and thus prevent a particular virus from binding to these cell membranes. Hin. It has previously been shown (Epstein et al., Nature 318, pp. 663-667) that infectivity mediated by specific receptors of the vaccinia virus can be shown to be ineffective with synthetic peptides.
5 HIV-viruksen on osoitettu sitoutuvan pintamolekyy- liin, Joka tunnetaan CD4- tai T4-alueena, mikä esiintyy monissa eri HIV-tartunnalle alttiissa soluissa, mukaanlukien T-lymfosyytit ja raakrofagit. (Katso Shaw et ai. [Science 226, sivut 1165-1171], missä on tarkasteltu HTLV-10 lii:n valikoivuutta).The HIV virus has been shown to bind to a surface molecule known as the CD4 or T4 region, which is present in many different cells susceptible to HIV infection, including T lymphocytes and crude phage. (See Shaw et al. [Science 226, pp. 1165-1171] for a review of the selectivity of HTLV-10 lii).
Immunopuutoksesta aiheutuvien oireiden lisäksi AlDS-potilaat osoittavat hermopsykologisia vaurioita. Keskushermostolla ja immuunijärjestelmällä on suuri määrä yhteisiä spesifisiä solupinnan tunnistusmolekyylejä, jotka 15 toimivat hermopeptidien välittämän solujen välisen yhteydenpidon reseptoreina. Hermopeptidit ja niiden reseptorit ovat osoittautuneet huomattavan pysyviksi kehityksen kuluessa ja ovat säilyneet lähes muuttumattomassa muodossa yksisoluisissa eliöissä sekä korkeammissa eläimissä. Li-20 säksi keskushermostossa ja immuunijärjestelmässä havaitaan yhteiset DC4 (T4) solupinnan tunnistusmolekyylit, jotka toimivat HIV:n vaipan glykoproteiinin (gp 120) reseptoreina. Koska samat suuressa määrin säilyneet hermopeptideistä koostuvat tietoa kuljettavat aineet yhdistävät immuuni- ja • · 25 aivotoiminnan reseptoreilla, jotka ovat huomattavassa mää- ' rin samankaltaisia HIV:n reseptoreiden kanssa, on väitet- ty, että se hyvin samanlainen aminohappojärjestys, joka ]·* HIV: n glykoproteiini 120:11a on erään lyhyen peptidin kanssa, joka tunnistettiin aiemmin muussa yhteydessä Ep- 30 stein-Barr -viruksen vaippa-alueelta, saattaa merkitä sel- . laisen ydinpeptidin olemassaoloa, joka on oleellinen vi- ;·. rusreseptoriin sitoutumiselle. Esitettiin, että tällaiset « · reseptorikohtiin sitoutuvat peptidit aiheuttaisivat pepti-: dijaksoja kohtaan suunnattujen vasta-aineiden tuotannon, » · · ,..’35 ja että näitä peptidejä voitaisiin käyttää tarjoamaan im-··. munologinen perusta AIDS:n diagnosoimiseksi.In addition to the symptoms of immunodeficiency, AlDS patients show neuropsychological damage. The central nervous system and immune system share a large number of specific cell surface recognition molecules that act as receptors for intercellular communication mediated by neuropeptides. Neuropeptides and their receptors have been shown to be remarkably stable during development and have remained in almost unchanged form in unicellular organisms as well as in higher animals. In addition to Li-20, common DC4 (T4) cell surface recognition molecules that act as receptors for the HIV envelope glycoprotein (gp120) are detected in the central nervous system and immune system. Because the same largely conserved neuropeptide transporters combine immune and • · 25 brain function with receptors that are substantially similar to HIV receptors, it has been argued that the very similar amino acid sequence that] · * HIV glycoprotein 120: 11a with a short peptide previously identified elsewhere in the envelope region of Ep-Stein-Barr virus may indicate. the existence of a nuclear nucleus peptide that is essential; rus receptor binding. It was suggested that such peptides that bind to receptor sites would result in the production of antibodies directed against peptide sequences, and that these peptides could be used to provide imaging. an immunological basis for diagnosing AIDS.
»M»M
« · • · 3 99115«· • · 3 99115
Tarkoitus Tämän keksinnön kohde oli saada diagnostisia keinoja HIV:a tai HIV:n vaippaproteiinia kohtaan kehittyneiden vasta-aineiden toteamiseksi.Object of the present invention was to provide diagnostic means for detecting antibodies to HIV or HIV envelope protein.
5 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus5 Detailed description of the invention
Tunnistettiin oktapeptidi HIV:n vaipan glykopro-teiinissa (gp 120) tietokoneavusteista analyysia käyttäen. Tämän peptidin, joka nimettiin "peptidi T”:ksi korkean treoniinisisältönsä perusteella, on osoitettu estävän gp 10 120:n sitoutumisen aivon kalvoihin. Peptidin aminohappo- järjestys on Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr. Myöhempi analyysi paljasti samantyyppisiä pentapeptidejä, joilla on samanlaiset sitoutumisominaisuudet.The octapeptide in the HIV envelope glycoprotein (gp120) was identified using computer-assisted analysis. This peptide, designated “peptide T” because of its high threonine content, has been shown to inhibit the binding of gp 10 120 to brain membranes.The amino acid sequence of the peptide is Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr. Subsequent Analysis revealed similar types of pentapeptides with similar binding properties.
Tämän keksinnön mukaiselle peptidille on tunnus-15 omaista, että sillä on kaava I: X-R1-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Rb-X (I) jossa kaavassa 20 R1 on aminopään pääteryhmä Ala- tai D-Ala-,The peptide of the present invention is characterized in that it has the formula I: X-R1-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Rb-X (I) in which R1 is an amino-terminal end group A- or D- Area-,
Rb on karboksipään pääteryhmä -Thr tai -Thr-amidi,Rb is the carboxy-terminal end group -Thr or -Thr-amide,
Ja X on Cys tai toinen tai molemmat X:t puuttuvat, tai sillä on kaava II: 1 25 « X-Rl-R2-R3-R4-R1-X (II) • 9 9 *:1 jossa kaavassa :T: R1 on aminopään pääteryhmä Thr-, Ser-, Asn-, Leu-, 30 Ile-, Arg- tai Glu-, R2 on Thr, Ser tai Asp, • · · R3 on Thr, Ser, Asn, Arg, Gin, Lys tai Trp, « · R4 on Tyr, ja • 1 : R5 on karboksipään pääteaminohapporyhmä, vastaava * · · ·...1 35 D-aminohappo, vastaava amidi johdannainen tai R5 puuttuu, ja • · 9 • · • · * · · · • » · , 99115 X on Cys tai toinen tai molemmat X:t puuttuvat, edellyttäen kuitenkin ettei peptidi ole Ser-Thr-Asn-Tyr-Thr, tai niiden fysiologisesti hyväksyttäviä suoloja.And X is Cys or one or both Xs are absent, or have the formula II: 1 25 «X-R1-R2-R3-R4-R1-X (II) • 99 *: 1 wherein: T: R1 is an amino-terminal end group Thr, Ser, Asn, Leu, Ile, Arg or Glu, R2 is Thr, Ser or Asp, • · · R3 is Thr, Ser, Asn, Arg, Gln, Lys or Trp, «· R4 is Tyr, and • 1: R5 is the terminal amino acid group of the carboxy terminus, the corresponding * · · · ... 1 35 D-amino acid, the corresponding amide derivative or R5 is absent, and • · 9 • · • · * · · • »·, 99115 X is Cys or one or both Xs are absent, provided, however, that the peptide is not Ser-Thr-Asn-Tyr-Thr, or physiologically acceptable salts thereof.
5 R5 on mieluimmin karboksipään pääteryhmä -Thr, Arg tai Gly tai näiden johdannainen. Peptidi, joka päättyy R4:ään (tyrosiiniin) säilyttää tässä käsitellyn ryhmän si-toutumisominaisuudet. Tämän keksinnön aktiiviset yhdisteet voivat esiintyä peptidien fysiologisesti hyväksyttävinä 10 suoloina.R5 is preferably a carboxy-terminal end group -Thr, Arg or Gly or a derivative thereof. A peptide terminating in R4 (tyrosine) retains the binding properties of the group discussed herein. The active compounds of this invention may exist as physiologically acceptable salts of the peptides.
Tämän ryhmän peptidien on havaittu sitoutuvan T4-virusreseptoreihin.Peptides in this group have been found to bind to T4 viral receptors.
Kaikkein ensisijaisimmat peptidit, sekä ylläkuvattu peptidi T, ovat seuraavanlaisia kaavan (I) mukaisia okta-15 peptidejä: D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr ja D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr-amidi ja seuraavanlaisia kaavan (II) mukaisia pentapeptidejä:The most preferred peptides, as well as the peptide T described above, are the following octa-15 peptides of formula (I): D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr and D-Ala-Ser-Thr-Thr-Thr -Asn-Tyr-Thr-amide and the following pentapeptides of formula (II):
Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr 20 Thr-Thr-Ser-Tyr-ThrThr-Asp-Asn-Tyr-Thr 20 Thr-Thr-Ser-Tyr-Thr
Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr ja niiden analogeja, joilla aminopään pääteryhmänä on D-Thr ja/tai karboksipään pääteryhmänä amidiJohdannainen.Thr-Thr-Asn-Tyr-Thr and analogs thereof having an amino-terminal D-Thr and / or a carboxy-terminal amide derivative.
.' Tässä esitettyjä peptidejä voi myös modifioida ava- 25 ruusrakenteeltaan rajoitetuiksi pysyvyyden parantamiseksi.. ' The peptides disclosed herein may also be modified to be spatially limited to improve stability.
Jäljempänä käytetään seuraavia lyhenteitä: .’ Aminohappo Kolmikirjaiminen Yksikirjaiminen ··· koodi koodi »·The following abbreviations are used:. ’Amino acid Three-letter One-letter ··· code code» ·
30 arginiini arg R30 arginine arg R
asparagiini asn Nasparagine asn N
asparagiinihappo asp Daspartic acid asp D
• · kystelini cys C• · kystelini cys C
.·. glysiini gly G. ·. glycine Gly G
35 seriini ser S35 serine ser S
**
Γ treoniinl thr TΓ threonine thr T
tyrosiini tyr Ytyrosine tyr Y
5 991155 99115
Ellei muuten ole osoitettu, ovat aminohapot tietenkin luonnollisissa L-stereoisomeerisissa muodoissa.Unless otherwise indicated, the amino acids are, of course, in their natural L-stereoisomeric forms.
Kahdentoista pentapeptidin aminohappojärjestysten vertailu on esitetty taulukossa 1. Vaikka historiallisesti 5 aluksi suorittamamme tiotokonehaku paljasti peptidi T:n (ARV-eristyksen sisältämä peptidi) olevan asianomainen jakso, uusien virusperäisten aminohappojaksojen tultua saataville kävi selväksi, että asianomainen bioaktiivinen jakso voisi olla lyhempi pentapeptidi, joka nimellisesti 10 koostuu peptidistä T (4-8), tai jakso TTNYT. Vertaamissamme eristyksissä (taulukko 1) huomattavaa homologiaa havaittiin vain tällä lyhyemmällä alueella. Suurin osa muutoksista on seriinin (S) ja treonlinin (T), kahden toisiaan läheisesti muistuttavan aminohapon, vaihtuminen kes-15 kenään. Peptidi T:n asemassa 7 oleva tyrosiini on kaikkien näiden muotojen muuttumattomana säilyvä piirre, mikä viittaa siihen, että se voi olla bioaktiivisuudelle välttämätön. Asemassa 5 esiintyvät korvaustapahtumat käsittävät T:n, Gtn, R:n ja S:n. Asemat 4 ja 6 rajattiin ensir käoit-20 tämään (yhtä poikkeusta lukuunottamatta) S:n, T:n ja N:n, jotka kaikki ovat aminohappoja, joilla on varauksettomat polaariset, avaruusrakenteeltaan läheisesti samanlaiset . ryhmät. Viiden eri AIDS-virus eristysvalmisteen kesken • · suoritettu jaksojen yhtäläisen yhdenmukaisuuden määrittä- * · ’ ‘ 25 minen paljastaa, että alue, joka sijaitsee peptidi T-jak- ’ son vieressä ja johon tämä itse kuuluu, on hyvin muuntele- V vaa. Tällainen muuntelevuus voi viitata alakantojen kehit- tymiseen sellaisen voimakkaan toiminnan (toimintojen) mo- nimuotoisuuden lisääntymisen välityksellä, joka on alttii- 30 na valintatapahtumille, ja joka sijoittuu tälle alueelle.A comparison of the amino acid sequences of the twelve pentapeptides is shown in Table 1. Although historically, our initial computer search revealed peptide T (a peptide contained in ARV isolation) to be the relevant sequence, as new viral amino acid sequences became available, the bioactive sequence could be shorter. 10 consists of peptide T (4-8), or the sequence TTNYT. In the isolations we compared (Table 1), significant homology was observed only in this shorter range. Most of the changes are the exchange of serine (S) and threonine (T), two closely resembling amino acids, in one to 15 years. Tyrosine at position 7 of peptide T is an unchanged feature of all these forms, suggesting that it may be necessary for bioactivity. The substitution events occurring at position 5 include T, Gtn, R, and S. Positions 4 and 6 were first limited to (except for one exception) S, T, and N, all of which are amino acids with uncharged polar, closely related in space structure. element. The determination of the uniformity of the sequences between the five different AIDS virus isolation preparations reveals that the region adjacent to the peptide T sequence, to which it itself belongs, is highly variable. Such variability may indicate the development of sub-strains through an increase in the diversity of a strong activity (s) that is susceptible to selection events and located in this region.
*.^ Opiaattipeptidien tavoin nämä peptidi T:n analogit näyt- *:*. tävät esiintyvän monissa muodoissa, muistuttaen met- ja % · leu-enkefaliineja. Nämä pentapeptidijaksot, jotka esiin- • · .: : tyvät näissä useissa eri AIDS-viruseristysvalmisteissa, · « ...: 35 ovat biologisesti aktiivisia ja kykenevät vuorovaikutuk- m • · « m m ·« · 1 · * f · · « · 6 99115Like opiate peptides, these peptide T analogs show *: *. occur in many forms, resembling met and% · Leu encephalins. These pentapeptide sequences, which are present in these various AIDS virus isolation preparations, are biologically active and capable of interacting with • · · · mm · «· 1 · * f · ·« · 6 99115
Been CD4 reseptorin - aiemmin laajemmalti tunnettu T-aut-tajasolujen pinta"raarkkeeri" ominaisuudestaan - vastavai-kuttajana.Been CD4 receptor - formerly more widely known as a T-helper cell surface "rougher" property - as an antagonist.
Taulukko 1. ENV-jakson vertailu useista AIDS viruseristys^ 5 valmisteistaTable 1. Comparison of the ENV sequence from several AIDS virus isolation ^ 5 preparations
Eristysvalmlste Jakso Viite peptidi T ASTTTNYT Pert, C.B., ja muut PNAS (painossa) 10 *ARV (195-199) TTNYT Willey, R.L. ja muut LAV TTSYT PNAS 83, s.5083, 1986Isolation Section Section Peptide T TESTED Pert, C.B., and others PNAS (w / w) 10 * VALUE (195-199) Tested Willey, R.L. and others LAV TTSYT PNAS 83, p.5083, 1986
Z3 SSTYRZ3 SSTYR
NY5 NTSYTNY5 NTSYT
15 BIO(HTLV-III) TTSYT Starcich, B.R., ja muut WMJ-1 SSTYR Cell, 45, s. 637, 198615 BIO (HTLV-III) TTSYT Starcich, B.R., and others WMJ-1 SSTYR Cell, 45, p. 637, 1986
HAT-3 NTSYGHAT-3 NTSYG
Peräkkäiset eris-tysvalmisteet STNYRSuccessive insulation products STNYR
20 WMJ-1 SSTYR Hahn, B.L. ja muut WMJ-2 SSRYR Science 232 s. 1548, WMJ-3 SSTYR 198620 WMJ-1 SSTYR Hahn, B.L. and others WMJ-2 SSRYR Science 232 p. 1548, WMJ-3 SSTYR 1986
·’: TTSYS· ': TTSYS
: : 25 1 Numerot viittaavat aminohappojen suhteellisiin paikkoihin ARV env -jaksossa (9).:: 25 1 The numbers refer to the relative positions of the amino acids in the ARV env sequence (9).
Seitsemästä aminohaposta koostunut peptidi CYS-THR- .:. THR-ASN-TYR-THR-CYS on myös aktiivinen. Kysteiinien lisäys ··. ydin jaksoon ei merkittävästi heikennä aktiivisuutta. Pep- • · 30 tidit syntetoitiin Peninsula Laboratories -yhtiön toimittamana palveluna keksinnön tekijöiden ja valmistajan välisen luottamuksellisuussopimuksen alaisuudessa. Käytettiin ’ Merrifieldin kiinteän faasin peptidisynteesiä. (Katso US- patentti nro 35311258, mikä liitetään tähän hakemukseen • · · ***; 35 viittaamalla.) Syntetoidut peptidit ovat ensisijaisessa • · · m ··· * ··· • · • · ·· • · 7 99115 asemassa. Vaikkakin peptidi T ja tähän osana kuuluva pen-tapeptidi voitaisiin eristää viruksesta, Merrifieldin mukaan syntetoidut peptidit eivät sisällä jäämiä soluista tai viruksista. Tämän johdosta kontaminaatioita kohtaan 5 syntyneitä reaktioita ei tapahdu, kun käytetään syntetoi-tuja peptidejä.The seven amino acid peptide CYS-THR-.:. THR-ASN-TYR-THR-CYS is also active. Addition of cysteines ··. the core cycle does not significantly impair activity. Pep- • · 30 tids were synthesized as a service provided by Peninsula Laboratories under a confidentiality agreement between the inventors and the manufacturer. ‘Merrifield solid phase peptide synthesis was used. (See U.S. Patent No. 3,531,1258, which is incorporated herein by reference.) The peptides synthesized are in the primary position of • 7 · m ··· * ··· • · • · ···. Although peptide T and the pentapeptide included in it could be isolated from a virus, the peptides synthesized according to Merrifield do not contain residues from cells or viruses. As a result, reactions to site 5 contamination do not occur when synthesized peptides are used.
Tämän keksinnön peptidejä voidaan tuottaa tavanomaisilla peptidisynteesimenetelmillä. Sekä kiinteän että nestemäisen faasin menetelmiä voidaan käyttää. Olemme ha-10 vainneet Merrifieldin kiinteän faasin olevan erityisen käyttökelpoinen. Tässä menetelmässä peptidi syntetoidaan vaiheittain ketjun karboksipään ollessa kovalenttisesti liitetty liukenemattomaan kantajaan. Synteesin välivaiheiden aikana peptidi pysyy kiinteässä faasissa ja on siten 15 helposti käsiteltävissä. Kiinteä kantajafaasi on klorome-tyloitu styreeni-divinyylibentseeni -kopolymeeri.The peptides of this invention can be produced by conventional peptide synthesis methods. Both solid and liquid phase methods can be used. We have ha-10 assumed the solid phase of Merrifield to be particularly useful. In this method, the peptide is synthesized stepwise with the carboxy terminus of the chain covalently attached to an insoluble support. During the intermediate steps of the synthesis, the peptide remains in the solid phase and is thus easily handled. The solid support phase is a chloromethylated styrene-divinylbenzene copolymer.
Karboksipään pääteaminohapon N-suojatun muodon, esim. t-butoksikarbonyyli (Boc-) -suojatun aminohapon, annetaan reagoida klorometyloidun styreeni-divinyylibentsee-20 ni-kopolymeerihartsin klorometyyliryhmän kanssa, jolloin syntyy hartsin suojattu aminoasyylijohdannainen, missä aminohappo on liittynyt hartsiin bentsyyliesterinä. Tämän suojaus poistetaan ja sen annetaan reagoida seuraavan aminohapon suojatun muodon kanssa, mistä syntyy hartsiin lii-25 ttynyt suojattu dipeptidi. Aminohappoa käytetään tavallisesti aktivoidussa muodossaan, esim. käyttämällä karbodi-imidiä tai aktiivista esteriä. Nämä vaiheet toistetaan ja peptidlketju kasvaa ryhmä kerrallaan kondensoitumalla ami-: nopäästään haluttujen N-suojattujen aminohappojen kanssa 30 kunnes haluttu peptidi on koottu kantajaan. Peptidihartsi käsitellään sitten vedettömällä fluorivetyhapolla, mikä . katkaisee koottua peptidiä kantajaan yhdistävän esterisi- doksen halutun peptidin vapauttamiseksi. Samalla voidaan • tavanomaisin menetelmin vapauttaa aminohappojen sivuketju- .· 35 jen funktionaaliset ryhmät, jotka on täytynyt suojata syn- m • · 8 99115 teesivaiheiden ajaksi. Amidiryhmän karboksi-päässään sisältävän peptidin synteesi voidaan suorittaa tavanomaisesti 4-metyylibentshydrylamiinihartsia käyttäen.The N-protected form of the terminal amino acid of the carboxy terminus, e.g., the t-butoxycarbonyl (Boc-) -protected amino acid, is reacted with the chloromethyl group of the chloromethylated styrene-divinylbenzene-20-copolymer resin as a bimethyl ester to give the protected aminoacyl. This is deprotected and reacted with the next protected form of the amino acid to give the protected dipeptide attached to the resin. The amino acid is usually used in its activated form, e.g. using a carbodiimide or an active ester. These steps are repeated and the peptide chain grows group by group by condensation at its amino terminus with the desired N-protected amino acids 30 until the desired peptide is assembled on a support. The peptide resin is then treated with anhydrous hydrofluoric acid, which. cleaves the ester bond connecting the assembled peptide to the carrier to release the desired peptide. At the same time, the functional groups of the amino acid side chains which have had to be protected during the synthesis steps can be liberated by conventional methods. The synthesis of a peptide containing an amide group at its carboxy terminus can be carried out conventionally using 4-methylbenzhydrylamine resin.
Vielä yksi tämän keksinnön kohde liittyy AIDS-vi-5 rusten havaitsemiseksi käytettäviin koepakkauksiin, joiden antigeenilähde sisältää tämän keksinnön mukaisen peptidin. Keksinnön mukaiselle koepakkaukselle sellaista antigeeniä kohtaan suunnattujen vasta-aineiden määrittämiseksi, joka sitoutuu T4 reseptoriin, on tunnusomaista, että se sisäl-10 tää huokoiseen pintaan tai kiinteälle alustalle sidotun keksinnön mukaisen peptidin. Esimerkiksi tämän keksinnön mukaista peptidiä voidaan käyttää koepakkaukessa havaitsemaan AIDS-infektio ja AIDS ja esi-AIDS -tilojen diagnoosiin käyttämällä sitä testireagenssina entsyymiin kytke-15 tyssä immunosorbenttimääritystestissä (ELISA) tai entsyy-mi-immunotäplämääritystestissä. Tällaiset koepakkaukset voivat sisältää liukenemattoman huokoisen pinnan tai kiinteän alustan, johon antigeeninen peptidi on etukäteen adsorboitu tai liitetty kovalenttisesti, tällaisen pinnan 20 tai alustan ensisijaisesti mikrotiitterilevyn tai kuoppien muodossa; testiseerumit; toisperäiset antiseerumit, jotka sitoutuvat spesifisesti pintaan tai kantajaan adsorboituun antigeeniin tai vasta-aineeseen ja kyllästävät tämän; useita eri laimentimia ja puskuriliuoksia; leimattuja kon-25 jugaatteja spesifisesti liittyneiden vasta-aineiden ha vaitsemiseksi ja multa signaalia aiheuttavia reagensseja, ' kuten entsyymin substraatteja, kofaktoreita ja kromogeene- jä.Another object of the present invention relates to test kits for detecting AIDS viruses, the antigen source of which comprises a peptide of the present invention. The assay kit of the invention for determining antibodies to an antigen that binds to the T4 receptor is characterized in that it comprises a peptide of the invention bound to a porous surface or solid support. For example, a peptide of this invention can be used in a test kit to detect AIDS infection and the diagnosis of AIDS and pre-AIDS conditions by using it as a test reagent in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or enzyme-linked immunostaining assay. Such assay kits may include an insoluble porous surface or solid support to which the antigenic peptide has been pre-adsorbed or covalently attached, such surface or support being primarily in the form of a microtiter plate or wells; test sera; secondary antisera that specifically bind to and saturate the antigen or antibody adsorbed on the surface or carrier; several different diluents and buffer solutions; labeled conjugates to detect specifically associated antibodies; and mold signaling reagents such as enzyme substrates, cofactors, and chromogens.
: Esillä olevan keksinnön kohteena on edelleen kek- 30 slnnön mukaisen peptidin käyttö diagnostisessa menetelmäs- .. sä ihmisen immuunikatovirus (HIV)-infektion havaitsemisek- *. si kehonesteestä tai kudoksesta, joka menetelmä on käyttö kelpoinen hankitun immuunikato-oireryhmän (AIDS) tai sen • esiasteen diagnosoimiseen, jolloin 9 99115 a) näyte saatetaan reagoimaan mainitun antigeenisen peptidin kanssa, b) muodostetaan antigeeni-vasta-ainekompleksi, ja c) havaitaan muodostunut antigeeni-vasta-ainekom- 5 pieksi.: The present invention further relates to the use of a peptide of the invention in a diagnostic method for detecting human immunodeficiency virus (HIV) infection. a body fluid or tissue useful for diagnosing acquired immune deficiency syndrome (AIDS) or a precursor thereof, wherein 9 99115 a) reacting a sample with said antigenic peptide, b) forming an antigen-antibody complex, and c) detecting the formation of an antigen-antibody complex; antigen-antibody complex.
Tämän keksinnön mukaista peptidiä voidaan myös käyttää tavanomaisiin menetelmin immunogeenlnä aiheuttamaan sellaisten monoklonaalisten vasta-aineiden tuottoa, jotka spesifisesti sitoutuvat asianmukaisiin alueisiin 10 AIDS-viruksen vaipan jaksossa.The peptide of this invention can also be used as an immunogen by conventional methods to induce the production of monoclonal antibodies that specifically bind to appropriate regions in the envelope region of the AIDS virus.
Kokeelliset menetelmät ja koetuloksetExperimental methods and test results
Gp 120:n leimaus radioaktiivisella merkkiaineella, kalvojen valmistus aivoista, gp 120:n sitoutuminen ja ris-tiinsitominen reseptoriin, ja T4-antigeenin immunosaostus 15 HIV:n HTLV-IIIb kantaa lisättiin H9 soluissa ja gp 120 eristettiin immuuniaffiniteettikromatografiaa ja pre-paratiivista NaDodS04/PAGE:a käyttämällä. Puhdistettu gp 120 leimattiin 125I:lla kloramiini-T -menetelmällä.Radiolabeling of gp120, preparation of membranes from the brain, binding and cross-linking of gp120 to the receptor, and immunoprecipitation of T4 antigen 15 strains of HIV HTLV-IIIb were added in H9 cells and gp120 was isolated by immunoaffinity chromatography and pre-preparative NaD Using PAGE. Purified gp120 was labeled with 125 I by the chloramine-T method.
Tuoreet ihmisen, apinan ja rotan pikkuaivot homoge- 20 noitiin nopeasti (Polytron, Brinkmann Instruments) 100 ti lavuudessa jääkylmää Hepes (pH 7,4)-puskuria. Sentrifugoi-malla (15000 x g) kerätyt kalvot pestiin alkuperäisen puskuriliuoksen tilavuudessa ja käytettiin tuoreeltaan tai • · I.1 varastoitiin -70 °C:ssa. Aivojen kalvot ja pitkälle puhdis- 25 tetut T-solut (viite 16; lahjoitus Larry Wahl'ilta) esi-inkuboitiin ennen käyttöä 15-30 min fosfaatilla puskuroi- • · ·’ dussa suolaliuoksessa (PBS). 20 mg:n erä (märkäpaino alus- sa) aivoista peräisin olevia kalvoja (noin 100 pg proteii- * · · / : nia) inkuboitiin 28000 cpm:n erän kanssa 125l-gp 120:a 1 30 tunnin ajan 37 °C:ssa 200 plrssa (lopullinen tilavuus) 50 mM Hepes-puskuriliuosta, joka sisälsi 0,1 % naudan seeru- :1; min albumiinia ja peptidaasi-inhibiittoreita basitrasiini (0,005 %), aprotiniini (0,005 %), leupeptiini (0,001 %) ja ·· · kymostatiini (0,001 %). Inkubointiseokset suodatettiin no- ..." 35 peasti tyhjiön avulla ja radioaktiivisuus laskettiin re- • · · * • » · · - · · • · • · 10 99115 septorlin kiinnittyneen materiaalin määrän määrittämiseksi.Fresh human, monkey, and rat cerebellum were rapidly homogenized (Polytron, Brinkmann Instruments) in 100 volumes of ice-cold Hepes (pH 7.4) buffer. The membranes collected by centrifugation (15,000 x g) were washed in a volume of the original buffer solution and used fresh or stored at -70 ° C. Brain membranes and highly purified T cells (Ref. 16; donation from Larry Wahl) were preincubated for 15-30 min in phosphate buffered saline (PBS) before use. A 20 mg aliquot (wet weight at the beginning) of brain-derived membranes (approximately 100 pg protein *) was incubated with a 28,000 cpm aliquot of 125 I-gp 120 for 30 hours at 37 ° C. 200 μl (final volume) of 50 mM Hepes buffer containing 0.1% bovine serum: 1; min albumin and the peptidase inhibitors bacitracin (0.005%), aprotinin (0.005%), leupeptin (0.001%) and ·· · chymostatin (0.001%). The incubation mixtures were quickly filtered under vacuum and the radioactivity was counted to determine the amount of material attached to the receptor.
ImmuunisaostusLymphocyte Activation
Immuunisaostumat valmistettiin inkuboimalla (yön 5 yli 4 °C:ssa) 0,5 % Triton-X-100/PBS -liuoksella liukoiseksi tehtyjä, laktoperoksidaasi/glukoosioksidaasi/125I jodat-tuja aivojen kalvoja tai ehjiä T-soluja ilmoitettujen mo-noklonaalisten vasta-aineiden kanssa, joita käytettiin 10 yg reaktiota kohti. Kiinteän faasin immunoadsorbenttia 10 (Immunobeads, Bio-Rad) käytettiin immu’'nikompleksien saos- tamiseen ennen niiden erottelua NaDod.'.O,/PAGE: 11a. Verrokki -inkuboinnit eivät sisältäneet primäärisiä monoklonaali-sia vasta-aineita tai sisälsivät alaryhmän verrokkina olevan monoklonaalisen vasta-aineen (ΟΚΤβ).Immunoprecipitates were prepared by incubating (overnight at 4 ° C) with 0.5% Triton-X-100 / PBS solubilized lactoperoxidase / glucose oxidase / 125 I iodinated brain membranes or intact T cells against the indicated monoclonal antibodies. with the substances used at 10 μg per reaction. Solid phase immunoadsorbent 10 (Immunobeads, Bio-Rad) was used to precipitate immune complexes before separation with NaDod. Control incubations did not contain primary monoclonal antibodies or contained a subset of control monoclonal antibody (ΟΚΤβ).
15 Kemiallinen hermoanatomia ja tietokoneavusteinen tiheysmittaus 25 ym kryostaattileikkeet tuoreena pakastetuista ihmisen, apinan ja rotan aivoista kiinnitettiin sulattamalla ja kuivattiin gelatiinilla päällystetyille objekti-20 laseille, ja reseptorit saatettiin havaittaviksi viitteessä (18) kuvatulla tavalla. Inkuboinnit ilman T4, T4A, T8 ja Tll vastaan suunnattuja vasta-aineita (10 yg/ml) tai . näiden kanssa suoritettiin yön yli 0 °C:ssa RPMI-liuokses sa, sidottiin ristiin antigeeneihinsä ja saatettiin ha-25 väittäviksi 125I:lla leimatulla vuohen hiirtä vastaan suun- * natulla vasta-aineella. Objektilasille kiinnitettyjen ku- .· dosleikkeiden inkuboinnit antigeenireseptorln leimaamiseksi' si 12SI-gp 120:11a suoritettiin 5 ml:n objektilasisäiliöissä leimaamattoman gp 120:n kanssa (1 yM) tai ilman tätä tai 30 0KT4A monoklonaalisen vasta-aineen kanssa (10 yg/ml) (Ort- . ho Diagnostics) tai ilman tätä.15 Chemical Nerve Anatomy and Computer-Aided Density Measurement 25 μm cryostat sections from fresh frozen human, monkey, and rat brains were thawed and dried on gelatin-coated slides, and receptors were detected as described in reference (18). Incubations without antibodies to T4, T4A, T8 and T11 (10 μg / ml) or. these were performed overnight at 0 ° C in RPMI solution, cross-linked to their antigens and challenged with 125 I-labeled goat mouse antibody. Incubations of slide sections attached to slides to label antigen receptor 12SI-gp120 were performed in 5 ml slide wells with or without unlabeled gp120 (1 μM) or with 30 0KT4A monoclonal antibody (10 μg / ml). ) (Ort-. Ho Diagnostics) or without this.
;·. T-lymfosyyttien alaryhmien erottaminen • T-solujen alaryhmät saatiin käsittelemällä Percoll- : tineysgradientissa puhdistettuja ääreisverenkierron T-so- 35 luja spesifisillä monoklonaalisilla vasta-aineilla (T4 tai » · · • · 1 m · • ψ • · 11 99115 T8), joiden pitoisuus oli 10 pg/ml. Käsiteltyjä soluja seisotettiin 30 min 4 °C:ssa muovisella petrimaljalla, jonka pintaan oli kiinnitetty vuohen [F(ab')2] hiirtä vastaan kohdistettua immunoglobuliinia (Sero Lab, Eastbury, MA).; ·. Separation of T lymphocyte subgroups • T cell subgroups were obtained by treating peripheral circulating T cells purified in a Percoll density gradient with specific monoclonal antibodies (T4 or »· · • · 1 m · • ψ • · 11 99115 T8) with the concentration was 10 pg / ml. The treated cells were allowed to stand for 30 min at 4 ° C in a plastic petri dish fixed with immunoglobulin against goat [F (ab ') 2] mouse (Sero Lab, Eastbury, MA).
5 Tämän jälkeen poistettiin vapaaksi jääneet solut, ja ne pestiin ja niiden reaktiivisuus tutkittiin virtaussytomet-rilla. Erotetuissa T4 ja T8 solupopulaatioissa on muita T-solujen alaryhmiä < 5 % kontaminaatiotasolla. Solut viljeltiin sitten fytoheraagglutiniinin (1 pg/ml) läsnäollessa 10 Ja altistettiin HIV:lie kuten jäljempänä kuvataan. HIV:tä sitoutuneiden solujen ilmiasun luonne selvitettiin, kun solujen toksisuusmääritykset tehtiin.The remaining cells were then removed and washed and examined for reactivity with a flow cytometer. Separated T4 and T8 cell populations have other T cell subsets at <5% contamination level. The cells were then cultured in the presence of phytoheragglutinin (1 pg / ml) and exposed to HIV as described below. The nature of the appearance of HIV-bound cells was elucidated when cell toxicity assays were performed.
VIruss1toutuminenVIruss1toutuminen
Sitoutumiseen käytetty HTLV-virus eristettiin in-15 terleukiinia 2 (IL-2)-vaativasta viljellystä T-solulinjas-ta, joka oli eristetty tuoreesta AIDS-potilaan materiaalista ja siirrostettu HuT 78:aan, permissiiviseen solulin-jaan, joka on riippumaton IL-2:sta.The HTLV virus used for binding was isolated from a cultured T cell line requiring in-15 terleukin 2 (IL-2) isolated from fresh AIDS patient material and inoculated into HuT 78, a permissive cell line that is independent of IL-2. 2.
Piirrosten kuvaus 20 Kuva IA osoittaa 125I-gp 120:n ristiinsitoutumisen aivon kalvoihin ja T-soluihin. (a) yksinomaan 125l-gp 120; (b) apina; (c) rotta; (d) ihmisen aivot; ja (e) ihmisen T-solut.Description of the Drawings Figure IA shows the cross-linking of 125 I-gp120 to brain membranes and T cells. (a) 125 I-gp 120 alone; (b) monkeys; (c) rat; (d) the human brain; and (e) human T cells.
Kuvat IB Ja 1C osoittavat 125I-leimattujen apinan 25 aivojen kalvojen ja vastaavasti ihmisen T-solujen immuuni -’ saostuksen; (f,i) verrokki ilman primääristä vasta-ainet ta; (g,j) monoklonaalinen vasta-aine 0KT4; (h,k) 0KT8 mo-noklonaalinen vasta-aine.Figures IB and 1C show the immunoprecipitation of 125 I-labeled monkey brain membranes and human T cells, respectively; (f, i) a control without primary antibodies; (g, j) monoclonal antibody 0KT4; (h, k) 0KT8 monoclonal antibody.
: Kuvassa 2A nähdään tuoreisiin rotan pikkuaivojen 30 kalvoihin kohdistuneen spesifisen 125I-gp 120:n sitoutumisen syrjäytyminen. Kukin määritys tehtiin kolmesti; tulokset . yhdestä kolme kertaa samanlaiset tulokset antaneesta ko- keesta on esitetty. Sellaisen spesifisen sitoutumisen as- : te, joka oli syrjäytettävissä 10 pg/ml 0KT4:a ja 4A:a, 35 vaihteli 27 ja 85 % välillä kokonaissitoutumisesta, joka \ esitetyssä kokeessa oli 2201 ± 74 cpm.: Figure 2A shows the displacement of specific 125 I-gp120 binding to fresh rat cerebellar membranes. Each assay was performed in triplicate; results. one experiment giving similar results three times is shown. The degree of specific binding that was displaceable by 10 pg / ml 0KT4 and 4A ranged from 27 to 85% of the total binding, which in the experiment shown was 2201 ± 74 cpm.
* 1 · * 12 99115* 1 · * 12 99115
Kuva 2B osoittaa, että peptidi T ja sen synteetri-set analogit tekevät viruksen sitoutumisen tehottomaksi. Kukin määritys tehtiin kahdella rlnnakkaiskokeella. Tulokset edustavat yhtä koetta, joka toistettiin kolmasti sa-5 manlaisin tuloksin.Figure 2B shows that peptide T and its synthetic analogs render viral binding ineffective. Each assay was performed in two parallel experiments. The results represent one experiment repeated three times with similar results.
Esimerkki 1 125I-gp 120:n sitoutuessa spesifisesti pääkalloapi-nan, rotan tai ihminen aivojen kalvoihin saadaan yksi ra-dioaktiivisesti leimautunut, noin 180 Kd:n ristiinsitoutu-10 mistuote, jota ei voida erottaa vastaavasta ihmisen T-soluihin sitoutuneesta tuotteesta (kuva IA). Tämä tulos osoittaa, että gp 120 voidaan kytkeä noin 60 Kd:n proteiiniin; reagoimaton I25I-gp 120 kulkeutuu ilman kalvoja ajetun verrokin vieressä (kanava a).Example 1 Binding of 125 I-gp120 specifically to skull monkey, rat or human brain membranes yields one radiolabeled, approximately 180 Kd cross-linked 10 product that is indistinguishable from the corresponding product bound to human T cells (Figure 1A). ). This result indicates that gp120 can be coupled to a protein of about 60 Kd; the unresponsive I25I-gp 120 travels next to the membrane-free control (channel a).
15 Radioaktiivisella jodilla leimattujen ihmisen aivo jen kalvojen immuunisaostus 0KT4:lla ja 0KT8:lla (10 pg/ ml)(kuva IB) osoittaa, että aivojen kalvot sisältävät T4-antigeenin, joka on kooltaan noin 60 Kd, eikä sitä voi erottaa ihmisen T-lymfosyyteistä tunnistetusta vastaavasta 20 antigeenistä (kuva 1C); tätä vastoin 0KT8:lla suoritetussa immunosaostuksessa saostuu T-lymfosyyteistä (kuva 1C) pienen (noin 30 Kd) molekyylipainon omaava proteiini, jota ei esiinny aivojen kalvoissa (kuva IB), mikä viittaa siihen, • · ··' ; että aivojen T4 ei ole peräisin näihin paikallistuvista • »* * 25 lymfosyyteistä. Samanlaisia tuloksia (tuloksia ei esitet ty) on saatu apinan ja rotan pikkuaivojen kalvoja käyttä-: *,! mällä. Nämä tulokset osoittavat, että T4-antigeeni toimii ||* virusreseptorina ja se on hyvin säilynyt 60 Kd:n molekyy- li, joka on yhteinen immuunijärjestelmälle ja keskusher- i 30 mostolle.Immunoprecipitation of radiolabeled human brain membranes with 0KT4 and 0KT8 (10 pg / ml) (Figure IB) shows that the brain membranes contain T4 antigen of approximately 60 Kd in size and cannot be distinguished from human T-antigen. the corresponding 20 antigens identified from lymphocytes (Figure 1C); in contrast, immunoprecipitation with 0KT8 precipitates a low molecular weight (approximately 30 Kd) protein from T lymphocytes (Fig. 1C) that is not present in brain membranes (Fig. IB), suggesting that • · ·· '; that brain T4 is not derived from these localized • »* * 25 lymphocytes. Similar results (data not shown) were obtained using monkey and rat cerebellar membranes- * ,! by. These results indicate that the T4 antigen acts as a || * viral receptor and is a well-conserved 60 Kd molecule common to the immune system and central sensory 30.
y. Sen seikan toteaminen, että Epstein-Barr ja HTLV- » « · m-ym III/LAV omaavat lähes identtiset oktapeptidijaksot, johti • · t "peptidi T"n synteesiin ja tutkimiseen. Kuva 2 osoittaa, • · ; että 125I-gp 120:n sitoutuminen vastavalmistettuihin rotan 35 aivojen kalvoihin tapahtuu suurella affiniteetilla (0,1 » · • % * · 13 99115 nM:n alue) ja että tämä on kyllästyvää. Spesifisyyden (kuva 2B) osoittaa estyminen 0KT4:lla ja 0KT4A:lla, mutta ei 0KT3:lla (0,1 pg/ml). Peptidi T ja kaksi sen synteettistä analogia estivät merkittävästi 125I-gp 120:n sitoutu-5 misen 0,1 nM:n alueella (kuva 2C) (mutta tähän yhteyteen kuulumaton oktapeptidi aine P (1-8) ei tätä tehnyt). Asemaan 8 tehty D-threoniiniamidikorvaus aiheutti ainakin 100-kertaisen reseptoriin kohdistuvan sitoutumisaktllvisuuden katoamisen. Klassinen (L-ala):n korvaus (D-ala):lla 10 johti pysyvästi vaikutuskykyisempään, nähtävästi enemmän peptidaasla kohtaan resistenttiin analogiin kuin peptidi T; C-pään päätetreoniini tuottaa pysyvästi jonkinverran lisääntyneen vaikutuskyvyn (kuva 3).y. The finding that Epstein-Barr and HTLV- »« · m-ym III / LAV have nearly identical octapeptide sequences led to the synthesis and study of "peptide T". Figure 2 shows, • ·; that the binding of 125 I-gp 120 to freshly prepared rat 35 brain membranes occurs with high affinity (0.1 »· •% * · 13 99115 nM range) and that this is saturable. Specificity (Figure 2B) is indicated by inhibition by 0KT4 and 0KT4A, but not by 0KT3 (0.1 pg / ml). Peptide T and two of its synthetic analogs significantly inhibited 125 I-gp120 binding in the 0.1 nM range (Figure 2C) (but this was not done by the non-associated octapeptide substance P (1-8)). D-threoninamide substitution at position 8 resulted in at least a 100-fold loss of receptor binding activity. The substitution of classical (L-domain) by (D-domain) 10 resulted in a permanently more potent, apparently more peptidase-resistant analog than peptide T; The C-terminal terminal threonine produces a permanently somewhat increased potency (Figure 3).
Kun testattiin synteettisten peptidien kykyä eh-15 käistä reseptoriin sitoutumista ihmisen T-soluissa, kokeiden suorittajat eivät tienneet sitoutumiskokeiden tuloksia. Tasolla 10‘7 kolme sitoutumismäärityksessä aktiivista peptidiä vähentävät havaittavaa käänteistranskriptaasita-soa lähes 9-kertaisesti. Vähemmän aktiivinen sitoutumisen 20 syrjäyttäjä (D-thre)-peptidi T osoittautui niinikään sitoutumisen estoltaan suuresti heikentyneeksi, ja merkittävän eston aikaansaamiseksi sitä tarvittiin 100 kertaa suu-·. rempi pitoisuus. Näin ollen ei ainoastaan neljän peptidin luokkien välinen järjestys ((D-( Alah-peptidi T-amidi > (D-25 (Ala ^-peptidi T > peptidi T > (D-(Thr)8-peptidi T-amidi), . vaan myös näiden reseptoriin sitoutumisen esto korreloi läheisesti toisiaan (kuva 3).When the ability of synthetic peptides to prevent receptor binding in human T cells was tested, the experimenter was unaware of the results of the binding experiments. At level 10’7, the three peptides active in the binding assay reduce the detectable level of reverse transcriptase by almost 9-fold. The less active binding displacement (D-thre) peptide T also proved to be greatly impaired in inhibition of binding and was required 100-fold to achieve significant inhibition. higher concentration. Thus, not only the order between the classes of the four peptides ((D- (Alah peptide T-amide> (D-25 (Ala ^ peptide T> peptide T> (D- (Thr) 8-peptide T-amide),. but also the inhibition of their binding to the receptor is closely correlated with each other (Fig. 3).
Esimerkki 2 * Noin 60 Kd:n proteiini, joka on samanlainen ellei 30 Identtinen ihmisen T-solujen T4-antigeenin kanssa, esiin- ·· tyi ilmeisen säilyneessä molekulaarisessa muodossa ihmisen *: aivoista valmistetuissa kalvoissa; lisäksi radioaktiivi- sesti merkitty HIVrn vaipan glykoproteiini (125I-gp 120) voidaan ristiinsitoa kovalenttisesti kolmen nisäkkään ai- ;· 35 vojen molekyyliin, jota kokonsa ja in muni-saostusominai- • · •« • · * « 14 99115 suuksiensa puolesta el voida erottaa T4-antlgeenista. Käyttämällä menetelmää, jolla aivojen leikkeistä havaitaan vasta-ainetta sitoneet reseptorit, esitettiin aivojen T4:n hermoanatornisen jakautuman muodostama hahmo, joka on ti-5 hein kuorikerroksen henr.osyiden pääteverkossa ja joka on järjestynyt analogisesti kaikilla kolmella nisäkkäällä.Example 2 * A protein of about 60 Kd, similar if not identical to the T4 antigen of human T cells, was apparently present in preserved molecular form in membranes prepared from human *: brain; in addition, the radiolabeled HIV envelope glycoprotein (125I-gp120) can be covalently cross-linked to three mammalian molecules that can be distinguished by their size and in vitro precipitation properties. T4 antlgeenista. Using a method of detecting antibody-binding receptors in brain sections, a pattern formed by the neural anatomical distribution of brain T4 in the end network of the henr.coat of the ti-5 hay bark and presented analogously in all three mammals was presented.
Myös radioaktiivisesti leimattu HIV-viruksen vaipan glyko-proteiinin sitoutuminen tuotti vastaavanlaisen hahmon peräkkäisissä leikkeissä, mikä viittaa siihen, että T4 oli 10 HIV-reseptori.Radiolabeled HIV envelope glycoprotein binding also produced a similar character in successive sections, suggesting that T4 was the 10 HIV receptor.
Esimerkki 3Example 3
Kemiallinen hermoanatomia, tietokoneavusteinen ti-heysmittausChemical nerve anatomy, computer-assisted ti-density measurement
Tuoreena jäädytettyjen ihmisen, apinan ja rotan 15 aivojen 25 mikronin kryostaattileikkeet kiinnitettiin sulattamalla Ja kuivattiin geelipäällysteisille objektila-seille ja reseptorit saatettiin havaittaviksi julkaisussa Herkenham ja Pert, J. Neurosci., 2, sivut 1129-1149 (1982) kuvatulla tavalla. Inkuboinnit T4:a, T4A:a, T8:a ja 20 Tll:a kohtaan suunnattujen vasta-aineiden kanssa (10 pg/ ml) ja ilman näitä suoritettiin yön yli 0 °C:ssa RPMl:ssa, ristiinsidottiin antigeeneihinsa ja saatettiin havaitta- ·. viksi IJ5I-vuohen hiirtä vastaan suunnatulla vasta-aineella.25 micron cryostat sections of fresh frozen human, monkey, and rat brains were thawed and dried on gel-coated slides, and the receptors were detected as described in Herkenham and Pert, J. Neurosci., 2, pp. 1129-1149 (1982). Incubations with and without antibodies to T4, T4A, T8, and 20 T11 (10 pg / ml) were performed overnight at 0 ° C in RPM1, cross-linked to their antigens, and detected. ·. with an antibody directed against the IJ5I goat mouse.
« / 1J5I-gp 120:11a tapahtuvaa antigeenin/reseptorin leimaamista 25 varten suoritetut objektilasille kiinnitettyjen kudosleik-keiden inkuboinnit suoritettiin 5 ml:n objektilasisäi-·' liöissä käyttäen (10'6 leimaamatonta gp 120:a tai OKT4A (10 v : pg/ml) monoklonaalista vasta-ainetta tai jättäen nämä * : pois, kuten yllä on kuvattu kalvojen käytön yhteydessä.Incubations of slide sections attached to the slide for antigen / receptor labeling with 1J5I-gp120 were performed in 5 ml slide vials using 10'6 unlabeled gp120 or OKT4A (10 μg / ml). ml) monoclonal antibody or omitting these *: as described above for the use of membranes.
30 Suoritettiin tietokoneavusteinen autoradiografia- filmin muunnos kvantitatiivisiksi värikuviksi. Apinan ai-vojen leikkeiden kanssa rinnan suoritettu valotus tunnetun radioaktiivisuuslisäyksen sisältäviä standardeja käyttä-;/ mällä antoi tulokseksi lineaarisen kuvaajan (4 => 0,99) ··* 35 log OD:n ja cpm:n suhteen, josta radioaktiivisuuden suh- » · • · 15 99115 teellinen pitoisuus voidaan mielekkäästi ekstrapoloida. Alvolelkkelden solujen värjäys tlonllnllla suoritettiin klassisilla menetelmillä Ja reseptorit saatettiin havaittaviksi värjätyssä kudoksessa.30 A computer-aided conversion of autoradiographic film to quantitative color images was performed. Exposure in parallel with monkey brain sections using standards with known radioactivity enhancement resulted in a linear plot (4 => 0.99) of ·· * 35 log OD and cpm, of which the radioactivity ratio • · 15 99115 can be meaningfully extrapolated. Staining of alvolelkelt cells was performed by classical methods and the receptors were detected in the stained tissue.
5 Esimerkki 45 Example 4
On suoritettu kokeita T4-antigeenin jakautuman määrittämiseksi pääkalloapinan aivojen etuosasta takaosaan ulottuvassa sarjassa tai pitkin vaakatasoa tehdyissä leikkeissä. Nämä kokeet osoittavat, että T4 monoklonaalisen 10 vasta-aineen sitoutumista aivorungon (esim. substantia nigraan) soluarkkitehtuurlin nähden mielekkäille alueille tapahtuu havaittavan suurissa määrissä, mutta silmiinpistävä kuorikerrokseen rikastuva esiintymishahmo näkyy her-mostoakselin jokaisella tasolla. 0KT8, T-lymfosyyttiä koh-15 taan suunnattu monoklonaalinen vasta-aine samasta alaryhmästä kuin 0KT4, ei muodosta minkäänlaista tunnistettavaa hahmoa. Aivojen kuorikerroksen kaikkein ylimmät pintakerrokset sisältävät yleensä T4-antigeenin tiheimmän pitoisuuden; isojen aivojen kuorikerroksen otsalohko ja limbis-20 tä järjestelmää ympäröivä kuorikerroksen osa mantelitumakkeen yläpuolella sisältävät erityisen paljon reseptoreita, jotka paikallistuvat kaikkialle sisäisiin kerroksiin. Reseptorien tihein pitoisuus kohdistuu aivotursoalueelle apinan, rotan ja ihmisen aivoissa. Filminkehitysliuokseen 25 kastettujen pääkalloapinan leikkeiden pimeäkenttämlkrosko-pointi paljasti, että reseptorien tiheimmän leimautumisen vyöhyke sijaitsee hammaspoimun molekulaarlsessa kerroksessa ja itse aivotursossa (joka sisältää hyvin vähän neuroneja). Reseptorit siis näyttävät sijoittuvan juuri sopi-30 vasti kattamaan hermosyiden pääteverkkoaluetta (hermopäätteiden ja viejähaarakkeiden hermojatkoksia) tai sijoittu-. vat johonkin erityiseen värjäytymättömään tähtitukikudok- sen solujen alaryhmään.Experiments have been performed to determine the distribution of T4 antigen in a series extending from the anterior to posterior part of the skull monkey brain or in horizontal sections. These experiments show that the binding of T4 monoclonal antibody to areas relevant to the cellular architecture of the brainstem (e.g., substantia nigra) occurs at detectably high levels, but a striking cortex-enriching presence is evident at each level of the germ axis. 0KT8, a monoclonal antibody directed against T-lymphocyte from the same subgroup as 0KT4, does not form any recognizable character. The uppermost surface layers of the cerebral cortex generally contain the densest concentration of T4 antigen; the frontal lobe of the cerebral cortex and the portion of the cortical layer surrounding the limbis-20 system above the tonsil nucleus contain a particularly large number of receptors that are localized throughout the inner layers. The densest concentration of receptors targets the area of edema in the monkey, rat, and human brains. Dark field microscopy of skull monkey sections dipped in film development solution 25 revealed that the zone of densest labeling of receptors is located in the molecular layer of the tooth fold and in the cortex itself (which contains very few neurons). Thus, the receptors appear to be precisely located to cover the terminal network of neural causes (nerve extensions of nerve terminals and exporting branches) or to locate. to a specific subset of unstained star scaffold cells.
: On tehty määrityksiä, joista ilmenee näyttöä kemi- ' 35 allisen hermoanatomian spesifisyydelle ja joista saadut * 16 99115 tulokset osoittavat, että T4 ja viruksen vaipan proteiinin tunnistava molekyyli eivät poikkea toisistaan. Rotan aivojen vaakatason suuntaisissa leikkeissä paljastui hahmoltaan hyvin samanlainen isojen aivojen kuorlkerrokseen/ai-5 votursoon keskittyvä reseptorijakautuma riippumatta siitä, käytettiinkö havaittavaksi saattamiseen 0KT4 tai 12SI-gp 120. Lisäksi tällaista hahmoa ei havaittu, kun lnkubointi tapahtui leimaamattoman gp 120:n (1 μΜ), 0KT4A:n (10 pg/ ml) tai 0KT4:n (10 pg/ml) läsnäollessa. Mitään tunnistet-10 tavaa hahmoa ei saatu rotan aivoista muilla toisia ihmisen T-solujen antigeenejä kohtaan suunnatuilla hiiren monoklo-naalisilla vasta-aineilla, 0KT8 ja 0KT11 mukaanlukien, kun havaittavaksi saattaminen suoritettiin 1J5I-vuohen anti-hiiri XgG sekundaarisella vasta-aineella, samoin kuin pelkkää 15 sekundaarista vasta-ainetta käyttämällä ei löytynyt tois-tettavasti havaittavaa antigeeniä/reseptoria.: Assays have been performed that demonstrate the specificity of the chemical neural anatomy and the results obtained * * 9999115 show that T4 and the viral envelope protein recognition molecule do not differ. Horizontal sections of rat brain revealed a very similar receptor distribution focused on the cerebral cortex / α1-5 of the large brain, regardless of whether 0KT4 or 12SI-gp120 was used for detection. In the presence of 0KT4A (10 pg / ml) or 0KT4 (10 pg / ml). No identifiable figure was obtained from rat brain with other murine monoclonal antibodies directed against other human T cell antigens, including 0KT8 and 0KT11, when detected with 1J5I goat anti-mouse XgG secondary antibody, as well as no reproducibly detectable antigen / receptor was found using the 15 secondary antibody alone.
• · • · • · 9· 9 9 9 9 9 9 • · • · 9 • 999 9 9 99 ··· • · • · * • · ··· • · · » · · I · • · · • · · t · · · • · · • · • · 9 9 9 9 999 9 · 9 * 999 9 9 9 9 9 9 99 9 ·• · • · • · 9 · 9 9 9 9 9 9 • · • · 9 • 999 9 9 99 ··· • · • * * · · ··· • · · · · I · • · · · · T · · · • · · • · • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
Claims (10)
Applications Claiming Priority (10)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US86991986A | 1986-06-03 | 1986-06-03 | |
US86991986 | 1986-06-03 | ||
US87858686A | 1986-06-26 | 1986-06-26 | |
US87858686 | 1986-06-26 | ||
US4814887A | 1987-05-11 | 1987-05-11 | |
US4814887 | 1987-05-11 | ||
US8701270 | 1987-05-27 | ||
PCT/US1987/001270 WO1987007613A1 (en) | 1986-06-03 | 1987-05-27 | Small peptides which inhibit binding to t-4 receptors and act as immunogens |
FI885630 | 1988-12-02 | ||
FI885630A FI94352C (en) | 1986-06-03 | 1988-12-02 | A method for preparing peptides that inhibit binding to T-4 receptors and act as immunogens |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI943795A FI943795A (en) | 1994-08-18 |
FI943795A0 FI943795A0 (en) | 1994-08-18 |
FI99115B true FI99115B (en) | 1997-06-30 |
FI99115C FI99115C (en) | 1997-10-10 |
Family
ID=27444153
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI943795A FI99115C (en) | 1986-06-03 | 1994-08-18 | Peptides reactive with antibodies to antigen binding to T-4 receptors and their diagnostic use |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
FI (1) | FI99115C (en) |
-
1994
- 1994-08-18 FI FI943795A patent/FI99115C/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI943795A (en) | 1994-08-18 |
FI943795A0 (en) | 1994-08-18 |
FI99115C (en) | 1997-10-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Pert et al. | Octapeptides deduced from the neuropeptide receptor-like pattern of antigen T4 in brain potently inhibit human immunodeficiency virus receptor binding and T-cell infectivity. | |
US5863718A (en) | Small peptides which inhibit to T-4 receptors and act as immunogens | |
Wahren et al. | HIV-1 peptides induce a proliferative response in lymphocytes from infected persons | |
DE3750339T2 (en) | HTLV-III enveloping peptides. | |
DE69535601T2 (en) | NUCLEOTIDE SEQUENCES FROM RETROVIRUS ANTIGENIC HIV-I GROUP (OR SUB-GROUP) O | |
Oldstone et al. | Mapping the anatomy of the immunodominant domain of the human immunodeficiency virus gp41 transmembrane protein: peptide conformation analysis using monoclonal antibodies and proton nuclear magnetic resonance spectroscopy | |
EP0710295A1 (en) | Htlv-ii nra? compositions and assays for detecting htlv infection | |
EP0249390A2 (en) | Synthetic peptides related to the HIV glycoprotein gp 120 | |
EP0247557B1 (en) | HTLV-III(LAV) Envelope peptides | |
EP0344006A2 (en) | Peptides that block the binding of hiv-1 to th CD4 receptor protein | |
US5241047A (en) | Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies | |
KR0151860B1 (en) | Peptides and antibodies derived therefrom for the diagnosis of, therapy for and vaccination against htlv-1 infection | |
EP0740792A1 (en) | Peptomers with enhanced immunogenicity | |
JPS6327498A (en) | Htlv-iii/lav virus related peptide | |
EP0249394B1 (en) | Small peptides which inhibit binding to T-4 receptors and act as immunogens | |
FI99115B (en) | Peptides which react with antibodies directed against an antigen which is bound at T4 receptors, and the diagnostic use thereof | |
KR930008448B1 (en) | Small peptides which inhibit binding to t-4 receptors and act as immunogens | |
US5567805A (en) | The cellular receptor for the CS3 peptide of human immunodeficiency virus | |
AP96A (en) | Small peptides which inhibit binding to T-4 receptors and act as immunogens. | |
NO880446L (en) | SMALL PEPTIDES INHIBITING BINDING TO T-4 RECEPTORS. | |
NO329149B1 (en) | Synthetic peptides, mixtures, immunoassay method and diagnostic kit | |
US6210874B1 (en) | Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies | |
US6218102B1 (en) | Synthetic peptides and mixtures thereof for detecting HIV antibodies | |
CA2676762C (en) | Peptides for the detection of hiv-1 group o | |
TWI249407B (en) | Hybridoma cell line for producing monoclonal antibody against porcine endogenous retrovirus envelope protein and the produced monoclonal antibody and their use |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BB | Publication of examined application | ||
MA | Patent expired |