FI97152B - Fluorogeenisia tryptofanaasisubstraatteja - Google Patents

Fluorogeenisia tryptofanaasisubstraatteja Download PDF

Info

Publication number
FI97152B
FI97152B FI913460A FI913460A FI97152B FI 97152 B FI97152 B FI 97152B FI 913460 A FI913460 A FI 913460A FI 913460 A FI913460 A FI 913460A FI 97152 B FI97152 B FI 97152B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
substrate
tryptophanase
organism
substrates
amc
Prior art date
Application number
FI913460A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI913460A0 (fi
FI913460L (fi
FI97152C (fi
Inventor
Patrick D Mize
Original Assignee
Becton Dickinson Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Becton Dickinson Co filed Critical Becton Dickinson Co
Publication of FI913460A0 publication Critical patent/FI913460A0/fi
Publication of FI913460L publication Critical patent/FI913460L/fi
Publication of FI97152B publication Critical patent/FI97152B/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI97152C publication Critical patent/FI97152C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/527—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving lyase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/20—Coumarin derivatives
    • C12Q2337/22—7-Amino-4-methylcoumarin, i.e. AMC, MCA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Ceramic Products (AREA)
  • Lock And Its Accessories (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)

Description

97152
Fluorogeenisia tryptofanaasisubstraattoja Fluorogeni ska tryptofanassubstrat 5 Tämä keksintö koskee mikro-organismien tunnistusta ja tarkemmin sanottuna se koskee entsyymisubstraattia, jota voidaan käyttää jonkin organismin identifioimiseen sen entsyymi sisältöä analysoimalla.
10 Monet tautitilat johtuvat bakteerien pääsemisestä kehon kudoksiin tai nesteisiin, kuten vereen, virtsaan, aivoselkäydinnesteeseen tai nivelnesteeseen. Tällaisten infektioiden menestyksekäs hoito vaatii varhaista diagnoosia ja asianmukaista hoitoa ei voida aloittaa ennen kuin patogeeni 15 on saatu tarkasti tunnistetuksi. Tämä saattaa olla vaikeaa infektion varhaisvaiheissa, koska patogeenin konsentraatio on vähäinen.
Useat menettelytavat, joita yleensä käytetään sairaaloiden 20 mikrobiologian laboratorioissa bakteerien tunnistamiseksi, ovat niiden kasvattamiseen perustuvia menetelmiä, jotka yleensä vaativat tunnistamiseen 18-24 tuntia tai pitempäänkin organismin eristämisestä. Joissakin tilanteissa näin pitkä tunnistusaika saattaa vaarantaa potilaan hengen.
25
Patogeenin tunnistamista määrittämällä, mitä entsyymejä se sisältää, on tutkittu. Tämä menetelmä perustuu fluorogeenis- ·· · • ten tai kromogeenisten substraattien hydrolysoimiseen or-ganismin ekspressoimi 1 la entsyymeillä ja se suoritetaan :***: 30 yleensä ymppäämällä organismi alustapaneel i in ja vertaamalla saatua fluorogeenista tai kromogeenista profiilia profiilei- ,,,,· hin, jotka on saatu esiin samalla paneelilla tunnetuista • # organismeista. Tätä menettelytapaa edustaa patenttijulkaisun US-4603108 sisältö.
: : : 35
Godsey ym. julkaisussa Journal of Clinical Microbiology, 13, , 483 (1981) kuvaavat menetelmää ja laitetta Enterobacteria- • ceae-heimoon kuuluvien kantojen ekspressoimien entsyymien 97152 2 profiloimiseksi käyttämällä fluorogeenisia substraatteja, jotka on saatu β-metyyliumbel1iferonista, β-naftyyliamiinistä ja 7-amino-4-metyylikumariinistä (AMC).
5 Tryptofanaasi on entsyymi, jota esiintyy tietyissä bakteereissa ja joka katalysoi tryptofaanin konversion indoliksi, palorypälehapoksi ja ammoniakiksi. Erästä substraattia, S-(2-nitrofenyy1i)kysteiiniä, jonka tämä entsyymi pilkkoo kro-mofori-2-nitrotiofenoliksi, kuvaavat Suelter ym. julkaisussa 10 Methods in Enzymology, 82, 561 (1979).
Tryptofanaasia varten tarvittaisiin fluorogeeninen substraatti, joka voitaisiin sisällyttää entsyymin profilointi-paneeleihin, joita käytetään bakteerien tunnistamiseen. Täl-15 lainen substraatti parantaisi kovasti tällä menettelytavalla tapahtuvaa bakteerien tunnistuksen tarkkuutta erityisesti kun kysymyksessä ovat Enterobacteriaceae-lajit. Tämä keksintö tähtää juuri tämän tarpeen tyydyttämiseen.
20 Tryptofanaasia varten tarkoitettu f 1uorogeeninen substraatti sisältää fluoresoivan väriosan ja jonkin aminohappo-osan, jolloin värissä oleva nukleofii1inen ryhmä sitoutuu aminohapon nukleofii1iseen ryhmään, joka on muu kuin e-aminoryhmä, karbonyyli- tai tiokarbonyyliryhmän välityksellä. Suositel-25 tavissa substraateissa aminohappo on treeniini, kysteiini . .·. tai kaikkein suositeltavimmin seriini ja fluoresoiva väriosa • · · • · · on fluoreseiini, rodamiini, β-naftyyliamiini tai suositelta-vimmin jokin kumariinijohdos. Kaikkein suositeltavin väri on : \ AMC.
30 • · · • · · *·* * Keksinnön mukaan suositeltavin substraatti ei ole itsessään fluoresoiva, mutta tryptofanaasi pilkkoo sen aminohapoksi ja * AMC:ksi. Sitä voidaan käyttää määrittämään, sisältääkö jokin : : : tuntematon mikro-organismi tryptofanaasia, ja se voidaan 35 sisällyttää laitteeseen, jossa tuntematon mikro-organismi tunnistetaan sen entsyymisisällön perusteella.
ti 3 97152
Jonkin tuntemattoman mikro-organismin tunnistus määrittämällä sen entsyymisisällön profiili ja vertaamalla sitä tunnettujen organismien profiileihin, on yleensä tarkka useimpien organismien kohdalla. Tekniikka on kuitenkin vähemmän tarkka 5 Enterobacteriaceae-heimon bakteerien kohdalla yleisesti käytössä olevilla substraateilla. Koska jotkut Enterobacte-riaceae-lajit ekspressoivat tryptofanaasin ja jotkut taas eivät, keksinnön mukaisen substraatin sisällyttäminen profilointi laitteeseen parantaa mikro-organismien tämän ryhmän 10 tunnistamisen tarkkuutta.
Vaikka tämä keksintö voidaan toteuttaa monilla eri tavoilla, tässä kuvataan yksityiskohtaisesti keksinnön suositeltavimpia toteutusmuotoja, jolloin on selvää, että tämä selitys on 15 katsottava esimerkiksi keksinnön periaatteista eikä sen tarkoituksena ole rajoittaa keksintöä tässä kuvattuihin toteutusmuotoihin. Keksinnön suoja-alan määrittävät liitteenä olevat patenttivaatimukset ja niitä vastaavat.
20 Tryptofanaasi katalysoi tryptofaanin konversion indoliksi, palorypälehapoksi ja ammoniakiksi ja mikro-organismeja, jotka sisältävät tätä entsyymiä, nimitetään usein indoliposi-tiivisiksi. Esimerkkejä indolipositiivisista mikro-organismeista ovat Escherichia coli, Citrobacter diversus, Proteus 25 vulgaris, Morganella morganii ja Klebsiella oxytoca. Edusta- . via indol inegat i i vis i a organismeja ovat Klebsiella pneumo- • · · • · · niae, Citrobacter freundii ja Proteus mirabilis.
• · · · 0 · · • · · • ·
Sen määrittämistä, onko jokin tuntematon mikro-organismi 30 indolipositiivinen tai indolinegatiivinen, voidaan käyttää • · · *·* ' tuntemattoman tunnistamisessa. Erityisesti Enterobacteria- ceae-lajien oikea tunnistaminen helpottuu määrittämällä or-*·**· ganismin indol i luokitus. 1 Tämän keksinnön mukaista substraattia voidaan käyttää mää-• rittämään mikro-organismin indoliluokitus jostakin kliini sestä näytteestä, kuten virtsasta, ulosteesta, haavasta, : nielusta, genitaalinäytteistä tai tavallisesti steriileistä 4 97152 kehon nesteistä, kuten verestä, aivoselkäydinnesteestä tai nivelnesteestä. Tässä keksinnössä termin mikro-organismit katsotaan tarkoittavan mitä tahansa pientä organismia, joka tuottaa entsyymejä, kuten homeita, hiivoja ja suositeltavim-5 min bakteereita.
Tämän keksinnön mukaisella £luorogeenisella tryptofanaasi-substraatilla voi olla kaavan I rakenne: 10 NHo
I Z
A-X-C-Y-CHt- (CH=CH) n-CH I.
| L "I
Z COOH
Rakenteessa I A voi olla jokin fluoresoiva väriaineosa, X, Y 15 ja Z voivat toisistaan riippumatta olla O, S tai NH ja n voi olla 0-3. Esimerkkejä sopivista fluoresoivista väriaineosista ovat: (1) AMC, jossa X on NH; 20 (2) 7-hydroksi-4-metyy1ikumariini, jossa X on 0; (3) fluoreseiini, jossa X on O; (4) rodamiini, jossa X on NH; (5) β-naftyy1iamiini, jossa X on NH.
25 Suositeltavia keksinnön mukaisia substraatteja ovat fluo-·,·.ί reseiinin seriini-, kysteiini- ja treoni ini johdokset ja AMC, seuraavan rakenteen II mukaisesti: • Ml • · · • · · • · nh5 • . | i
30 A-NH-C-Y-R-i-CH II
*.* Il 1 I
Z COOH
jossa A voi olla f luoresei ini tai AMC, R-j voi olla CH2 tai • 1 » ’·' ' CH£H=CH ja Y ja Z voivat olla O tai S. Kaikkein suositelta- : 35 vimmassa substraatissa A on 4-metyylikumariini, Y ja Z ovat O ja R| on CH2.
n 5 97152
Keksinnön mukaiset substraatit voidaan syntetisoida kaupallisesti saatavissa olevista fluoresoivista väriaineista tunnetuilla synteesitavoi1 la. Erään suositeltavan menettelytavan mukaan jokin väriaine, joka on substituoitu jollakin 5 aminoryhmällä, voidaan muuttaa vastaavaksi isosyano- tai isotiosyanojohdokseksi ja antaa sen reagoida jonkin sopivasti suojatun aminohapon kanssa, jolla on rakenne III: H\ /R3
10 N
Y-CH2-(CH*CH)n-CH III
o or2 15 jossa Y voi olla OH, SH tai NH2, n voi olla 0-3 ja R2 ja Rj ovat konventionaalisia aminohappoja suojaavia ryhmiä, kuten karbobentsyy1ioksi-, bentsyyli-, litium- ja trimetyylisilyy- 1ietoksikarbonyyliryhmiä (Teoc). Suositeltavimpia suojaryh- miä ovat litium R2:na ja Teoc R3:na (kuten esimerkissä 1 ku- 20 vataan). On selvää, että tämä synteesimenettely johtaa suo-
jaryhmien poistamisen jälkeen rakenteeseen I, jossa X on NH
ja Z on 0, isosyanoryhmällä substituoidusta väriaineesta lähdettäessä ja rakenteeseen I, jossa X on NH ja Z on S, isotiosyanoryhmällä substituoidusta väriaineesta lähdettäes- 25 sä. Näin esimerkiksi substraatti, jossa A on rodamiini, X on . .·. NH, Z on S, Y on O ja R-i on metyleeni , saadaan antamalla • · · * • · « rodami ini-isot iosyanaatin ja kaksoissuojatun sen inin rea- ΙΓΓ goidä keskenään.
• « · • · · · « 30 Eräs sopiva menettelytapa substraatin IV, jossa X on O, syn- • · · • · · V ' tetisoimiseksi on esitetty seuraavassa yhtälössä: :·*: ch3 ch3 ch3 1
XjQ, ~~
O 0 OH O^ o O-C-Cl 0 0 O-C-O-CHr-CH
: : Il II z I
O O COOH
6 97152 Tämä yhtälö esittää fluorofori-7-hydroksi-4-metyy1ikumarii-nin konversiota kloori formyylijohdokseksi ja tämän välituotteen reaktiota kaksoissuojatun seriinin kanssa, jolloin suo-jaryhmien poistamisen jälkeen saadaan tryptofanaasisub-5 straatti IV.
Muut menettelytavat keksinnön mukaisten tryptofanaasisub-straattien syntetisoimiseksi ovat itsestään selviä alaan perehtyneille ja eräs yksityiskohtainen kokeellinen menettely-10 tapa suositeltavimman substraatin syntetisoimiseksi annetaan esimerkissä 1.
CHj
15 /jQ
O O ^^NH-C-O-CH-r-CH V
Il L I 0 COOH
Kun keksinnön mukaista substraattia inkuboidaan jonkin tryp-20 tofanaasia ekspressoivan organismin kanssa, entsyymi pilkkoo fluorogeenisen substraatin, joka ei itsessään ole fluoro-geeninen, alla esitetyn mukaisesti, jolloin saadaan palory-pälehappoa, AMCra, C02:a ja ammoniakkia.
25 CH3 CH3 "I* XJOI ( [ l 2 1> Entsyymi 30 h(ii ( i 2) -oo2 x \ i : .· }o > cooh o o
V AMC
• · · • · i 35 Fluoresenssin detektio identifioi organismin indolipositii-viseksi . Fluoresenssin puuttuminen osoittaa, että organismi on indol inegati ivinen.
Keksinnön mukainen substraatti voidaan sisällyttää jonkin ·,,,· 40 tuntemattoman organismin tunnistamiseen käytettävään lait teeseen. Erästä suositeltavaa laitetta, jossa keksinnön mu-
II
7 97152 kaista substraattia voidaan käyttää, kuvataan hakijan patenttihakemuksessa US-209677, jonka sisältö liitetään tähän vi itejulkaisuna.
5 Kun keksinnön mukaista substraattia käytetään patenttihakemuksen US-209677 mukaisessa laitteessa, se voidaan yhdistää patenttihakemuksen US-209677 mukaiseen alustaan. Substraatti voidaan saattaa kosketukseen nestenäytteen kanssa, jonka epäillään sisältävän tuntematonta organismia, mieluiten sen 10 jälkeen kun organismi on käsitelty solukalvon läpäisevällä reagenssi1 la, kuten jollakin pinta-aktiivisella aineella, jotta solunsisäiset entsyymit pääsevät helpommin nestenäyt-teeseen. Jos tuntematon organismi on indolipositiivinen, nestenäytteessä läsnä oleva tryptofanaasi reagoi substraatin 15 kanssa vapauttaen fluorogeenin. Fluoresenssin puuttuminen alustasta, joka sisältää keksinnön mukaisen sub-straatin, identifioi tuntemattoman organismin indolinegatiiviseksi. Määrittämällä nopeus, jolla fluoresenssi kehittyy, saadaan tietoa substraatin hydrolysoitumisnopeudesta ja siten tryp-20 tofanaasin konsentraatiosta organismissa. Tällä tavoin määritetyn tuntemattoman organismin indolireaktio voidaan sisällyttää osaksi tuntemattoman organismin entsyymiprofii1 ia, joka saadaan esiin käyttämällä useita muita entsyymisub-straatteja, jotka on asetettu laitteessa oleville muille 25 alustoille. Profiilia voidaan sitten verrata tunnettujen mikro-organismien profiileihin, jotka on saatu esiin ··· olennaisesti samanlaisissa koeolosuhteissa, ja tuntematon m • •m organismi voidaan tunnistaa tunnetun mikro-organismin pro- » fiililla, joka on lähinnä tuntemattoman organismin profii- • · · t 4 1 2 3 4 5 6 1 ia.
2 • « · 3 0 0 0 4 • · L • 5
Keksinnön mukaista tryptofanaasisubstraattia voidaan käyttää myös patenttihakemuksen US-209677 mukaisen laitteen yhtey-dessä tuntemattoman organismin identifioimiseen määrittämäl- 6 lä sen herkkyysprofii1i sarjalle antibiootteja. Kukin patenttihakemuksen US-209677 mukaisista alustoista voi sisältää keksinnön mukaisen substraatin ja eri antibiootin. Alustoihin ympätään tuntematon organismi nestemäisessä kasvatus- 8 97152 väliaineessa ja inkuboidaan. Jos antibiootti tehoaa tuntemattomaan organismiin, sen kasvu estyy, entsyymiä ei muodostu, substraatti ei hydrolysoidu ja fluoresenssia ei tule esiin. Jos antibiootti on tehoton, tuntematon organismi kas-5 vaa ja ekspressoi entsyymin, joka hydrolysoi substraatin ja aikaansaa fluoresenssin. Kuten edellä kuvattiin, tieto, joka saadaan käyttämällä keksinnön mukaista tryptofanaasisubstraattia, voidaan yhdistää tietoon, joka saadaan käyttämällä muita entsyymejä varten tarkoitettuja substraatteja tun-10 temattoman organismin reaktiivisuusprofii1 in eri antibiootteja kohtaan saamiseksi esiin. Tuntemattoman organismin herkkyysprofii1 ia voidaan verrata tunnettujen organismien profiileihin tunnistamista varten.
15 Keksinnön mukaista substraattia voidaan käyttää myös patenttihakemuksen US-209677 mukaisen laitteen yhteydessä eri antibioottien pienimmän bakteerien kasvun estävän konsentraa-tion (MIC) määrittämiseksi tuntemattomalle organismille.
Tätä sovellusta varten alustalevy sisältää sarjan antibioot-20 tien eri väkevyyksiä ja keksinnön mukaisen substraatin. Ymp-päämisen ja inkuboinnin jälkeen kullakin alustalla olevan antibioottikonsentraation tehon osoittaa fluoresenssitaso. Alustoista, joissa on ymppäämättömästä alustasta saadun vertailuarvon yläpuolella oleva minimifluoresenssitaso, saadaan 25 antibiootin MIC tuntematonta organismia vastaan.
* · · • · ·
Seuraavat esimerkit esitetään keksinnön valaisemiseksi edel- 1 · · *]'* leen, mutta niiden ei tule katsoa rajoittavan keksinnön suo- • · « t i * *t japi iriä.
* · * · I
‘ 1 30 • · · * * · V ' Rutiinianalyysitekniikat
Analyyttinen TCL suoritettiin 0,25 mm, 5 cm x 20 cm alumii-*f*i nipohjaisi1 la si 1ikageelilevyi1lä (luettelonumero 5534), :* jotka saatiin EM Science'Itä (Cherry Hill, New Jersey).
35 Analyyttinen käänteisfaasi-HPLC suoritettiin Waters 850 kaksi pumppusysteemi 1 lä ja valodiodirividetektori1 la (200-600 nm) käyttäen Waters Delta Pak C-18 100 A, 4,6 x 220 mm ko-: : lonnia (SN-338B31162); käytetyt olosuhteet olivat: aluksi 9 97152 pidettiin 60 minuuttia 0,2 % trifluorietikkahapon vesiliuoksessa, mitä seurasi lineaarinen gradientti 0,2 %:iseen tri-fluorietikkahappoon THF:ssa 1 tunnin ajan. Sulamispisteet saatiin Thomas-Hoover-kapi1laarisulamispisteen määrityslait-5 teella (Philadelphia, Pennsylvania) eikä niitä korjattu.
Fluoresenssi-spektri rekisteröitiin Perkin-Elmer LS-5 fluo-rometrillä. NMR-spektri rekisteröitiin IBM/Brucker WP-200SY:llä (200 mHz) (Billerica, Massachusetts). Kemialliset siirtymät ilmoitetaan käyttäen referenssinä tetrametyy1i-10 silaania. Korkean erotuskyvyn massaspektrografiät suoritti D.S. Millington, Mass Spectrometry Facility, P.O. Box 3028, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina 27710.
15 Esimerkki 1
Seriini-AMC-karbamaatin (V) synteesi A. 4-Metyy1i-7-isosyanokumariinin synteesi
Pyöreäpohjaiseen 200 ml:n kolmikaulakolviin, joka oli varustettu kuivajääjäähdyttimellä ja magneettisekoittimella, pan-20 ti in 2,0 ml 20 % fosgeeni/tolueeni1iuosta ja 80 ml kuivaa dioksaania. Tähän seokseen lisättiin 2,0 g (0,0114 moolia) kiinteää AMC:a ja seosta refluksoitiin yön yli. Seos muuttui keltaisesta saostuneeksi valkoiseksi kiinteäksi aineeksi. Siihen lisättiin vielä 7,0 ml 20 % fosgeeni/tolueeni1iuosta 25 ja seosta refluksoitiin edelleen vielä 5 tuntia, jossa ajassa liuos kirkastui. Kolviin lisättiin argonkaasun syöttöput- « · · “I ki ja argonia kuplitettiin liuoksen läpi fosgeeniy1imäärän • « · « ja HCl-jäämien poistamiseksi. Samea seos suodatettiin rea- f · t • · goimattoman AMC:n poistamiseksi ja seos väkevöitiin, jolloin ’ * 30 saatiin 2,0 g, saanto 87 %, valkoista kiinteää ainetta, joka • ·· V · oli haluttu tuote. NMR (CDCI3): ppm: 2,43 (s, 3H), 7,02 (s, 1H) , 7,39 (dd, 3H) . IR: voimakas absorbanssi 2250 cm‘':n koh- *:·*: dalla; ei absorbanssia 3800-3500 cm'^:n kohdalla.
* * «
I I I
4 · I
35 B. N-(trimetyy1isilyy1ietyy1ioksikarbonyy1i-o-karbonyy1iami-no-7-(4-metyylikumarinyy1i)-L-seriinin litiumsuolan synteesi 1 1
Pyöreäpohjaiseen 100 ml:n vetoiseen kolmikaulakolviin, joka 1 varustettu magneettisekoittimel1 a, pantiin 1,16 g 97152 10 (4,16 mmoolia) N-trimetyylisilyylietyy1ioksikarbonyy1i-L-se-riinin litiumsuolaa (Shute ym., Synthesis 1987, 346) ja 20 ml asetonitrii1iä. Tähän seokseen lisättiin 0,84 g (4,18 mmoolia) 4-metyyli-7-isosyanokumariinia (kohdan A tuo-5 te) liuotettuna 15 ml:aan THF:a. Tätä seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 48 tuntia. Sitten seos suodatettiin, jolloin saatiin 1,32 g vihertävän valkoista kiinteää ainetta. Kiinteä aine lietettiin kyllästettyyn natriumvetysul-faatti1 luokseen ja sitä sekoitettiin 1 tunnin ajan. Sitten 10 suspensio suodatettiin ja saatiin 0,84 g (1,83 mmoolia) 44 %:n saannolla. Nopea atomipommitus(FAB)-massaspektrometrian tulokseksi saatiin 479 =» [MH+Na]+. NMR(DMSO-dg) : ppm: 0,0 (bs, 9H), 0,90 (m, 2H), 2,38 (s, 3H), 4,01 (m, 4H), 4,30 (m, 2H), 7,09 (m, 4H), 10,26 (s, 1H). HPLC-retentioaika 15 98 minuuttia.
C. Seriini-AMC-karbamaatin (V) synteesi 10 ml:n vetoiseen kolviin pantiin 2,0 ml trifluorietikka-happoanhydridiä (TFA) ja se jäähdytettiin 0t:een argonkehäs-20 sä. Jäähdytettyyn TFA:han lisättiin 0,24 g (0,525 mmoolia) kohdassa B saatua tuotetta. Tätä liuosta sekoitettiin 4 tuntia 0¾ :ssa, se väkevöitiin pyöröhaihduttimessa alipaineessa. Jäännös liuotettiin metanoliin, eetteriä lisättiin ja valkoinen kiinteä aine saostui. Tämä valkoinen kiinteä aine 25 suodatettiin ja saatiin 0,178 g (80,9 %). Sulamispiste • j. 185-186¾ (hajoaminen). NMR (CDClj + CFjCOOH) : ppm: 2,54 (s, ·.·!·. 3H) , 4,85 (m, 3H) , 6,44 (s, 1H), 7,66 (4H). HPLC-retent io- • « aika 74 minuuttia. Korkean erotuskyvyn massaspektrografia ... [MH+] : C14Hl5N206. Laskettu 307,0848. Todettu 307,0937.
30
Esimerkki 2 * ’ Seriini-AMC-karbamaatin reaktio tryptofanaasin kanssa • · · ·.· 1 100 mm:iin kai iumfosfaatt ipuskur ia liuotettuna seriini-AMC- karbamaatin 1,19 x 10"® M liuokseen, pH 8,2, lisättiin 100 |ll 35 5,0 mg/ml tryptofanaasi1iuosta. Fluoresenssin lisääntyminen mitattiin 440 nm:n kohdalla aktivoimisen tapahtuessa : : 365 nm:n kohdalla. Seri ini-AMC-karbamaatti1iuoksen lähtö- : fluoresenssi oli 26 suhteellista yksikköä. Entsyymin lisäyk-
It 11 97152 sen jälkeen fluoresenssi voimistui 440 nm:n kohdalla nopeudella 97 yksikköä/minuutti. Tämä tulos osoitti, että entsyymi katalysoi seriini-AMC-karbamaatin konversion 7-amino-4-metyy1ikumariiniksi. Fluoresenssin lisääntyminen entsyymin 5 puuttuessa oli merkityksetöntä.
Esimerkki 3
Mikro-organismien indolireaktion määritys 20 Mikrolitran alikvootteja esimerkin 1 mukaisen substraatin 10 0,5 % liuoksesta liuotettuna dimetyy1isulfoksidiin lisättiin seiluloosakiekoi1 le (luettelonumero 740-E, Schleicher ja Schuell, Inc. Keene, New Hampshire). DMSO poistettiin tyh-jiökuivaamalla. Kuivatut kiekot asetettiin mustan polysty-reeniä olevan mikrosyvennyslevyn syvennyksiin. Neljään kie-15 koista ympättiin kuhunkin 25 mikrolitraa suspensiota, joka
Q
sisälsi ml:aa kohti 3x10 kolonian muodostavia yksikköjä tunnettuja indolipositiivisia mikro-organismeja Escherichia coli ja Citrobacter diversus ja tunnettuja indolinegatiivi- siä mikro-organismeja Klebsiella pneumoniae ja Citrobacter
20 freundii. Suspensiot tehtiin fosfaattipuskuriin, jonka pH
oli 8,4 ja joka sisälsi tolueenia konsentraationa 2 tippaa/5 ml puskuria bakteerien tekemiseksi läpäiseviksi. Neljään kiekkoon ympättiin pelkästään puskuria verrokeiksi. Kiekkoja aktivoitiin 365 nm:n kohdalla ksenonlampui la ja fluoresenssi 25 mitattiin 1 minuutin välein 10 minuutin ajan 440 nm:n aal- ·. lonpituudella käyttäen Fluoroskan II-lukijaa (Flow Laborato- • · · · ries, McLean, Virginia 22102). Neljästä putkesta kutakin • · • · organismia saaduista tuloksista laskettiin keskiarvot ja ne on esitetty alla olevassa taulukossa nanogrammoina vapaata ' 30 AMC:a/minuutti. 1 · · • · · 12 97152
Taulukko 5 Organismi Kanta Fluoresenssin lisääntyminen (ng AMC/min) E- coli 1W9901N1 1,53 E. coli 2W0803N1 1,85 10 E. coli 4H8162N1 1,6 E. coli 7W0563N1 1,7 C. diversus 404 5,35 C. diversus 2075 4,4 K. pneumoniae 6N3696N1 0,5 15 C. freundii 2027 0,8 C. freundii 2058 0,45
Verrokki 0,43
Taulukosta näkyy, että indolinegatiivisi1 la organismeilla 20 K. pneumoniae ja C. freundii on suunnilleen sama fluoresenssin lisäys kuin verrokilla, kun taas indolipositiivisi1la organismeilla E. coli ja C. diversus on paljon suurempi fluoresenssin lisäys, mikä johtuu vapaan AMC:n vapautumisesta.
• • · · · * < · • · • · • · m « • t · • · • · • · · • · a
III

Claims (11)

97152
1. Fluorogeeninen tryptofanaasisubstraatti, tunnettu siitä, että sillä on rakenne
5 NH2 A-X-C-Y-CH,- (CH=CH) CH l 1 Z COOH jossa A on jokin fluoresoiva väriaineosa, X, Y ja Z on 10 toisistaan riippumatta valittu ryhmästä, jonka muodostavat 0, S ja NH ja n on kokonaisluku 0-3.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen substraatti, tunnettu siitä, että A on jokin fluoresoiva väriaineosa, Y on va- 15 littu ryhmästä, jonka muodostavat O ja S, X on valittu ryhmästä, jonka muodostavat O ja NH, ja n on kokonaisluku 0-1.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen substraatti, tunnettu 20 siitä, että A on 4-metyylikumariiniosa.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen substraatti, tunnettu siitä, että A - X on 7-amino-4-metyylikumariiniosa.
5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen substraatti, tunnettu j siitä, että A - X on 7-hydroksi-4-metyylikumariiniosa. • « « • · • ·
6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen substraatti, tunnettu • · t V · siitä, että A on fluoreseiiniosa. 30 : 7. Patenttivaatimuksen 2 mukainen substraatti, tunnettu siitä, että A on rodamiiniosa. • · · : ' 8. Patenttivaatimuksen 2 mukainen substraatti, tunnettu '...· 35 siitä, että A on 0-naftyyliamiiniosa. : 9. Patenttivaatimuksen 4 mukainen substraatti, tunnettu siitä, että sillä on rakenne 97152 CH3 Γ I 1 ^2 0^0^^NH-C.0.CH CH n I
5. COOH
FI913460A 1990-07-19 1991-07-18 Fluorogeenisia tryptofanaasisubstraatteja FI97152C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/554,506 US5055594A (en) 1990-07-19 1990-07-19 Fluorogenic trypotophanase substrates
US55450690 1990-07-19

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI913460A0 FI913460A0 (fi) 1991-07-18
FI913460L FI913460L (fi) 1992-01-20
FI97152B true FI97152B (fi) 1996-07-15
FI97152C FI97152C (fi) 1996-10-25

Family

ID=24213622

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI913460A FI97152C (fi) 1990-07-19 1991-07-18 Fluorogeenisia tryptofanaasisubstraatteja

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5055594A (fi)
EP (1) EP0467318B1 (fi)
JP (1) JPH0671438B2 (fi)
AT (1) ATE121791T1 (fi)
AU (1) AU631102B2 (fi)
CA (1) CA2043124C (fi)
DE (1) DE69109197T2 (fi)
FI (1) FI97152C (fi)
IE (1) IE67645B1 (fi)
MY (1) MY107196A (fi)
NO (1) NO302243B1 (fi)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2036770C (en) * 1990-02-26 2003-09-09 Jeffrey P. Whitten Inhibitors of nitric oxide biosynthesis
ES2106040T3 (es) * 1990-05-16 1997-11-01 Abbott Lab Ensayo para barbituratos, trazadores, inmunogenos, anticuerpos y kit.
FR2677023B1 (fr) * 1991-05-30 1994-02-25 Eurobio Laboratoires Derives de coumarine hydrosolubles, leur preparation et leur utilisation comme substrat d'enzyme.
GB9609024D0 (en) * 1996-05-01 1996-07-03 Idg Uk Ltd Compounds
US5888760A (en) * 1997-04-10 1999-03-30 Dade Microscan Inc. Universal test systems and methods of use thereof for identifying multiple families of microorganisms
FR2785620B1 (fr) * 1998-11-05 2003-02-07 Bio Merieux Detection de tous micro-organismes dans un echantillon
WO2000067037A2 (en) * 1999-04-29 2000-11-09 Dade Microscan Inc. A combined rapid anti-microbial susceptibility assay and microorganism identification system
CN108570032B (zh) * 2017-03-09 2021-04-02 华东理工大学 新型罗丹明染料及其在抗致病菌中的应用
CN108727326B (zh) * 2018-07-06 2021-12-21 南宁师范大学 识别半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光探针及制备方法与应用
WO2023219152A1 (ja) * 2022-05-13 2023-11-16 中外製薬株式会社 リチウム塩の析出工程を含む、アミノ酸の塩若しくはペプチド化合物の塩又はこれらの溶媒和物の製造方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1229212B (de) * 1961-03-07 1966-11-24 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von Farbstoffen
US3880934A (en) * 1972-02-10 1975-04-29 Syntex Inc Nitrophenyloxy-butanediols
JPS6026793B2 (ja) * 1977-01-05 1985-06-25 味の素株式会社 ７−ロイシルアミノ−４−メチルクマリン及びその製造方法
JPS53108974A (en) * 1977-03-03 1978-09-22 Ajinomoto Co Inc 7-arginylamino-4-methylcoumarin
US4215047A (en) * 1977-06-06 1980-07-29 Ajinomoto Company Incorporated 7-(Arginylamino)-4-methylcoumarins
US4318980A (en) * 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
JPS5524147A (en) * 1978-08-10 1980-02-21 Ajinomoto Co Inc Peptide derivative
JPH0321160B2 (fi) * 1979-05-02 1991-03-22 Nat Res Dev
US4259233A (en) * 1979-10-23 1981-03-31 Miles Laboratories, Inc. β-Galactosyl-umbelliferone-labeled protein and polypeptide conjugates
US4476229A (en) * 1982-11-08 1984-10-09 Abbott Laboratories Substituted carboxyfluoresceins
US4476228A (en) * 1982-11-08 1984-10-09 Abbott Laboratories Determination of unsaturated thyroxine binding protein sites using fluorescence polarization techniques
US4557862A (en) * 1983-10-28 1985-12-10 University Patents, Inc. Rhodamine derivatives as fluorogenic substrates for proteinases
DE3614647A1 (de) * 1986-04-30 1987-11-05 Euratom 7-phenylessigsaeure-4-alkyl-coumarinylamide, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung in verfahren zur fluorometrischen bestimmung der aktivitaet von hydrolasen, insbesondere von penicillin-g-acylase

Also Published As

Publication number Publication date
NO912413L (no) 1992-01-20
US5055594A (en) 1991-10-08
ATE121791T1 (de) 1995-05-15
DE69109197T2 (de) 1995-09-28
FI913460A0 (fi) 1991-07-18
FI913460L (fi) 1992-01-20
CA2043124A1 (en) 1992-01-20
JPH0671438B2 (ja) 1994-09-14
AU7802691A (en) 1992-01-23
EP0467318B1 (en) 1995-04-26
IE67645B1 (en) 1996-04-17
EP0467318A1 (en) 1992-01-22
NO302243B1 (no) 1998-02-09
JPH04229199A (ja) 1992-08-18
CA2043124C (en) 1995-12-12
FI97152C (fi) 1996-10-25
MY107196A (en) 1995-09-30
DE69109197D1 (de) 1995-06-01
AU631102B2 (en) 1992-11-12
IE911759A1 (en) 1992-01-29
NO912413D0 (no) 1991-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI97152B (fi) Fluorogeenisia tryptofanaasisubstraatteja
US7932050B2 (en) Enzymatic substrates derived from phenoxazinone and their use as developers in detection of microorganisms with peptidase activity
EP2942352A1 (en) ASYMMETRICAL Si RHODAMINE AND RHODOL SYNTHESIS
US8178669B2 (en) Fluorescent probe for peroxynitrite
CN108191818A (zh) 一种基于芘的比率型荧光探针及其制备方法和生物应用
US4812406A (en) Process for preparing optically active hydantoins
CA1161431A (en) Tripeptide derivatives
US20050123478A1 (en) Agent for measurement of singlet oxygen
US4576745A (en) Method for the fluorimetric determination of endotoxins, new peptides carrying a fluorophorous substance usable in said method and method for its preparation
US4777269A (en) 7-Phenylacetic acid-4-alkyl-coumarinyl amides useful in fluorometric determination of the activity of hydrolases
ES2312207T3 (es) 7-alcoxicoumarinas como sustratos de la citocromo p450.
CN113637048A (zh) 一种γ-谷氨酰转肽酶的双光子荧光探针及其制备方法和应用
US7052863B2 (en) Alizarin-based chromogenic substrates, their uses and composition containing same
ES2295061T3 (es) Substrato enzimatico, procedimiento de sintesis y empleos.
JP3581958B2 (ja) 新規な潜在的蛍光原性化合物
CN114032087A (zh) 一种酶激活型聚集诱导发光荧光探针、制备方法及其应用
US7223865B2 (en) Chromogenic compounds, and use thereof as enzyme substrates
AU785019B2 (en) Trypsin substrate and diagnostic device, and method of using same
US6733986B1 (en) Method and agent for determining a deaminase enzymatic activity
Ishiyama et al. Notes Benzothiazole-containing tetrazolium salts that produce water-soluble formazan dyes absorbing at a Long wavelength upon NADH reduction
US5128069A (en) Luciferin derivatives
RU2098417C1 (ru) Способ получения n-(8-метокси-5-хинолинсульфонил)-азиридина
Linn et al. Synthesis of serine-AMC-carbamate: a fluorogenic tryptophanase substrate
Westwood et al. Studies on the reactivity of azetidin-2-ones in phosphate buffer
EP0297607A1 (en) Gamma-L-glutamyl-4-nitroanilide derivatives and process for determining gamma-GTP activity using the same

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application