FI87795B - Method for production of therapeutically useful polypeptides - Google Patents
Method for production of therapeutically useful polypeptides Download PDFInfo
- Publication number
- FI87795B FI87795B FI873632A FI873632A FI87795B FI 87795 B FI87795 B FI 87795B FI 873632 A FI873632 A FI 873632A FI 873632 A FI873632 A FI 873632A FI 87795 B FI87795 B FI 87795B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- leu
- thr
- ser
- cycle
- gly
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/585—Calcitonins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Obesity (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
Abstract
Description
1 877951 87795
Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten polypep-tidien valmistamiseksi.A method for preparing novel therapeutically useful polypeptides.
Keksintö koskee menetelmää uusien, terapeuttisesti 5 käyttökelpoisten polypeptidien valmistamiseksi, joilla on kaava (IA):The invention relates to a process for the preparation of novel therapeutically useful polypeptides of formula (IA):
Cys-Asn-A3-Leu-Ser-Thr-Cys-A8-Leu-Gly- AU~A12-A13-Gln*A15-A16_A17_LyS-A19-A20- ( IA ) 10 Thr-A22-Pro-A24-Thr-A26-A27-Gly-A29-Gly-A31-Cys-Asn-A3-Leu-Ser-Thr-Cys-A8-Leu-Gly-AU ~ A12-A13-Gln * A15-A16_A17_LyS-A19-A20- (IA) 10 Thr-A22-Pro-A24-Thr- A26-A27-Gly-A29-Gly-A31
Pro-NH2 jossa A3 = Ser, Gly tai Ala A8 = Vai tai Leu 15 An = Lys tai Thr A12 = Leu tai Tyr A13 = Ser tai Thr A15 = Glu tai Asp A16 = Leu tai Phe 20 A17 = His tai Asn A19 = Leu tai Phe . A20 = Gin tai His , A22 = Tyr tai Phe A24 = Arg tai Gin -’25 A26 = Asp, Asn tai Ala A27 = Vai, Thr tai Ile A29 = Ala, Ser tai Vai A31 = Thr, Vai tai Ala 30 tai kaava (lB): • -(CH2)5 -, CO-Asn-A'2-Leu-Ser-Thr-NHCHCO-A'7-Leu-Gly-A'io-A,u-A,i2-Gln-A'14-A'15-A'16-Lys-A'18- (IB) 35 A'19-Thr-A'21-Pro-A'23-Thr-A'25-A'26-Gly-A'28- .··. Gly-A130-Pro-NH2 2 87795 t r ,.r> i jossa A'2 = Ser, Gly tai Ala A'7 = Vai tai Leu A' 10 = Lys tai Thr A'n = Leu tai Tyr 5 A112 = Ser tai Thr A' 14 = Glu tai Asp A' 15 = Leu tai Phe A'i6 = His tai Asn A' 18 = Leu tai Phe 10 A' 19 = Gin tai His A' 21 = Tyr tai Phe A' 23 = Arg tai Gin A'25 = Asp, Asn tai Ala A'26 = Vai, Thr tai Ile 15 A' 2g = Ala, Ser tai Vai A'30 = Thr, Vai tai Ala jolloin kaavan (IB) mukaiset yhdisteet sisältävät α-amino-korkkihappoa (Asu), jossa ω -karboksyyli on liittynyt 20 Asn:n aminoryhmään.Pro-NH2 where A3 = Ser, Gly or Ala A8 = Val or Leu 15 An = Lys or Thr A12 = Leu or Tyr A13 = Ser or Thr A15 = Glu or Asp A16 = Leu or Phe 20 A17 = His or Asn A19 = Leu or Phe. A20 = Gln or His, A22 = Tyr or Phe A24 = Arg or Gln -'25 A26 = Asp, Asn or Ala A27 = Val, Thr or Ile A29 = Ala, Ser or Vai A31 = Thr, Vai or Ala 30 or formula (1B): • - (CH2) 5 -, CO-Asn-A'2-Leu-Ser-Thr-NHCHCO-A'7-Leu-Gly-A'io-A, uA, i2-Gln-A ' 14-A'15-A'16-Lys-A'18- (IB) 35 A'19-Thr-A'21-Pro-A'23-Thr-A'25-A'26-Gly-A ' 28-. ··. Gly-A130-Pro-NH2 2 87795 tr, .r> i where A'2 = Ser, Gly or Ala A'7 = Val or Leu A '10 = Lys or Thr A'n = Leu or Tyr 5 A112 = Ser or Thr A '14 = Glu or Asp A' 15 = Leu or Phe A'i6 = His or Asn A '18 = Leu or Phe 10 A' 19 = Gln or His A '21 = Tyr or Phe A' 23 = Arg or Gln A'25 = Asp, Asn or Ala A'26 = Val, Thr or Ile 15 A '2g = Ala, Ser or Val A'30 = Thr, Vai or Ala wherein the compounds of formula (IB) contain α-amino -cork acid (Asu) in which the ω -carboxyl is attached to an amino group of 20 Asn.
Kaavan (IB) mukaiset tuotteet ovat rakenteellisia analogeja · luonnon peptideille, joita K. Jost ja J. Rudinger esitti- I vät aivolisäkkeen hermolohkon tapauksessa (Collect. Czech.The products of formula (IB) are structural analogs of the natural peptides presented by K. Jost and J. Rudinger in the case of the pituitary nerve block (Collect. Czech.
; Chem. Comm., 1967, 32, 1229).; Chem. Comm., 1967, 32, 1229).
‘ 25 Kaavojen (IA) ja (IB) mukaiset tuotteet voidaan ryhmitellä uudelleen seuraavaksi kaavaksi: D-A’7-Leu-Gly-A' 10-A'n-A' 12-Gln-A ' 14-A ' 15-A ' 16-Lys-A'18-A' 19-Thr-A' 21-Pro-A' 23-Thr-A ’ 25-A' 26-GLY-A ’ 28-Gly-A' 30-Pro NH2 30 jossa symboleilla A'7, A'10, A'u< A'12, A'14, A'15, A'16 ^ 18, A 19' A 21/ A 23' ^ 25' ^ 26' ^28' 3a ^ ' 30 on edellä annettu merkitys ja D esittää: - joko radikaalia Cys-Asn-A3-Leu-Ser-Thr-Cys-, jossa symbolilla A3 on edellä annettu merkitys, ;-·f 35 - tai radikaalia: 3 87795 I-(CH2)5-1 CO-Asn-A' 2-Leu-Ser-Thr-NHCHCO- jossa symbolilla A'2 on edellä annettu merkitys.The products of formulas (IA) and (IB) may be regrouped into the following formula: D-A'7-Leu-Gly-A '10-A'n-A' 12-Gln-A '14-A' 15- A '16-Lys-A'18-A' 19-Thr-A '21-Pro-A' 23-Thr-A '25-A' 26-GLY-A '28-Gly-A' 30-Pro NH2 30 where the symbols A'7, A'10, A'u <A'12, A'14, A'15, A'16 ^ 18, A 19 'A 21 / A 23' ^ 25 '^ 26' ^ 28 '3a ^' 30 has the meaning given above and D represents: - either the radical Cys-Asn-A3-Leu-Ser-Thr-Cys-, in which the symbol A3 has the meaning given above, - · f 35 - or the radical: 3 87795 I- (CH2) 5-1 CO-Asn-A '2-Leu-Ser-Thr-NHCHCO- wherein A'2 has the meaning given above.
5 Keksinnön kohteena ovat erityisesti yhdisteet, jotka vastaavat yleisiä kaavoja (IA) ja (IB), kuten edellä määriteltiin, joissa A8 ja A'7 esittävät valii-nia.The invention relates in particular to compounds corresponding to the general formulas (IA) and (IB), as defined above, in which A8 and A'7 represent valine.
Keksinnön kohteena ovat tarkemmin yhdisteet, jot-10 ka vastaavat seuraavia yleisiä kaavoja (IA) ja (IB): - Cys - Asn - Ser - Leu - Ser5 - Thr - Cys - Vai - Leu -Gly10 - Lys - Leu - Ser - Gin - Glu15 - Leu - His -The invention more particularly relates to compounds which correspond to the following general formulas (IA) and (IB): - Cys - Asn - Ser - Leu - Ser5 - Thr - Cys - Val - Leu -Gly10 - Lys - Leu - Ser - Gln - Glu15 - Leu - His -
Lys - Leu - Gln20 - Thr - Tyr - Pro - Arg - Thr2b -1 15 Asp - Vai - Gly - Ala - Gly30 - Thr - proamidi |- (CH2 ) 5-1 - CO-Asn-Ser-Leu-Ser-Thr5-NH-CH-CO-Val-Leu-Gly-Lys10-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu15-His-Lys-Leu-Gln-Thr20-Tyr-Pro-Arg- 20 Thr-Asp25-Val -Gly-Ala-Gly-Thr30-proamidi . - Keksinnön mukaiset polypeptidit alentavat kalsemiaa h ja fosfatemiaa; ne hidastavat luiden haurastumista, kiih- ; dyttävät uusien luiden muodostumista, lisäävät kalsiumin 25 absorboitumista suolessa ja alentavat kalkkivirtsaisuutta.Lys - Leu - Gln20 - Thr - Tyr - Pro - Arg - Thr2b -1 15 Asp - Val - Gly - Ala - Gly30 - Thr - proamide | - (CH2) 5-1 - CO-Asn-Ser-Leu-Ser- Thr5-NH-CH-CO-Val-Leu-Gly-Lys10-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu15-His-Lys-Leu-Gln-Thr20-Tyr-Pro-Arg-20 Thr-Asp25-Val-Gly -Ala-Gly-Thr30-proamide. - The polypeptides of the invention reduce calcemia h and phosphatemia; they slow bone fragility, agitation; increase the formation of new bones, increase the absorption of calcium in the gut and reduce calcification.
: · Ne sitovat kalsiumia solujen sisällä. Niillä on tärkeä tu- : ·· lehduksenvastainen ja kipua lievittävä vaikutus.: · They bind calcium inside the cells. They have an important anti-inflammatory and analgesic effect.
Nämä ominaisuudet puolustavat aikaisemmin määriteltyjen kaavojen (ΙΛ) ja (IB) mukaisten polypeptidien käyt-: -.:30 töä lääkkeinä.These properties support the use of the polypeptides of formulas (ΙΛ) and (IB) as previously defined as medicaments.
•Lääkkeiden pääindikaatioita ovat Pagetin sairaus, eri syistä johtuvat osteoporoosit (tavallinen, huokosten -·_ pehmentymisestä johtuva, kortisoniperäinen, loukkaantumi sen jälkeinen, liikkumattomuudesta johtuva ja idiopaatti-·-··* 35 nen), renaalinen luun kasvuhäiriö, murtumat, hyperkalse- 4 37795 miat, luu-nivelkivut, erityisesti ne, jotka johtuvat luun metastaaseista, spasmofilia ja kalkkiaineenvaihdunnan aiheuttama häiriö normaalikalsemiassa.• The main indications for the medicines are Paget's disease, osteoporosis of various causes (common, pore softening, cortisone, post-injury, immobility and idiopathic · - ·· * 35 nen), renal bone growth failure, fractures, hypercalcemia. 37795 mias, bone-joint pain, especially those due to bone metastases, spasmophilia, and disorder of calcification metabolism in normal calcemia.
Lääkekäyttöä varten muodostetaan farmaseuttisia 5 koostumuksia, jotka sisältävät vaikuttavana perusaineena ainakin yhtä aikaisemmin määriteltyä tuotetta.For pharmaceutical use, pharmaceutical compositions are formed which contain at least one product as previously defined as active ingredient.
Nämä farmaseuttiset koostumukset voivat olla esimerkiksi kiinteitä tai nestemäisiä ja ne ovat farmaseuttisissa muodoissa, joita nykyään käytetään ihmisten lää-10 kintään, kuten esimerkiksi yksinkertaiset tai sokeripääl-lysteiset tabletit, kapselit, rakeet, liposomit, aerosolit, peräpuikot, injektoitavat valmisteet; ne valmistetaan tavallisten menetelmien mukaan. Vaikuttava aine tai aineet voidaan liittää täyteaineisiin, joita tavallisesti käyte-15 tään näissä farmaseuttisissa koostumuksissa, kuten talkki, arabikumi, laktoosi, tärkkelys, magnesiumstearaatti, kaakaovoi, vesipitoiset tai vedettömät apuaineet, eläin- tai kasvialkuperää olevat rasva-aineet, parafiinijohdannaiset, glykolit, erilaiset kostuttavat, dispergoivat tai emulgoi-20 vat aineet, ja säilöntäaineet.These pharmaceutical compositions may be, for example, solid or liquid and are in pharmaceutical forms currently used in human medicine, such as simple or sugar-coated tablets, capsules, granules, liposomes, aerosols, suppositories, injectables; they are prepared according to standard methods. The active ingredient or ingredients may be incorporated into excipients commonly used in these pharmaceutical compositions, such as talc, acacia, lactose, starch, magnesium stearate, cocoa butter, aqueous or non-aqueous excipients, fats of animal or vegetable origin, various paraffin derivatives, wetting, dispersing or emulsifying agents, and preservatives.
Erityisesti voidaan muodostaa farmaseuttisia koos-• tumuksia, kuten edellä on määritelty, jotka on tarkoitettu ... parenteraalisesti annettavaksi, oraalisesti annettavaksi liposomien muodossa, tai nenän kautta annettavaksi jauhe-'*·· 25 tussa muodossa.In particular, pharmaceutical compositions as defined above may be formulated for parenteral administration, oral administration in the form of liposomes, or nasal administration in powder form.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle uusien polypepti-dien valmistamiseksi on tunnusomaista, että tarvittavat Y.: aminohapot, peptidit tai niiden yhdistelmät kondensoidaan kaavojen (IA) ja (IB) mukaisten aminohapposekvenssien jär- - -.:30 jestyksessä, ja valmistettaessa kaavan (IB) mukaisia tuot- -'· teitä, yhdistetään kiinteäfaasimenetelmä sekvenssin 10 - 31 saamiseksi ja klassinen nestefaasimenetelmä sekvenssin 1-9 saamiseksi.The process of the invention for the preparation of novel polypeptides is characterized in that the necessary Y .: amino acids, peptides or combinations thereof are condensed in the order of the amino acid sequences of formulas (IA) and (IB), and in the preparation of products of formula (IB). The solid phase method for obtaining SEQ ID NOs: 10 to 31 and the classical liquid phase method for obtaining SEQ ID NO: 1 to 9 are combined.
Kuten aikaisemmin esitettiin, kaavan (IA) mukaisten — '35 peptidien ja kaavan (IB) mukaisten tuotteiden sekvenssin 10 5 87795 - 31 synteesit suoritetaan käyttäen kiinteätaasimenetel-mää. Tämä tuo käytettäväksi bentsyylihydryyliaminohartsin käytön (P.G. Piettä ja G.R. Marshall,, Chem. Commun., 1970, 650), jonka valmistus ja käyttö on kuvattu (P. Ri-5 vaille, A. Robinson, M. Kamen ja G. Milhaud, Helv., 1971, 54, 2772).As previously described, the syntheses of the peptides of formula (IA) -35 and the products of formula (IB) 10 5 87795-31 are performed using the solidase method. This makes available the use of a benzylhydrylamino resin (PG Pieta and GR Marshall, Chem. Commun., 1970, 650), the preparation and use of which have been described (P. Ri-5, A. Robinson, M. Kamen and G. Milhaud, Helv ., 1971, 54, 2772).
Kaavan (IÄ) mukaisten tuotteiden edullisessa valmistusmenetelmässä ryhmä Ν-α-butyylioksikarbonyyli (t-Boc) suojaa aminohappojen α-aminoryhmää. Aminohappojen la-10 teraaliset ryhmät suojataan muodossa: 1) bentsyyliesterinä asparagiinihapon ja glutamiinihapon karboksyyliketjuun, 2) bentsyylieetterinä seriinin ja treoniinin hydroksyyliin ja 2,4-diklooribentsyylieetterinä tyrosiiniin, 15 3) metoksibentsyylieetterinä kysteiinin sulfhydryyliryh- mään, 4) dinitro-2,4-fenyylinä histidiinin imidatsoliin, 5) bentsoksikarbonyyliryhmänä lysiinin ?-aminoryhmään.In a preferred process for the preparation of products of formula (IÄ), the group Ν-α-butyloxycarbonyl (t-Boc) protects the α-amino group of amino acids. The terminal groups of amino acids Ia-10 are protected in the form of: 1) as a benzyl ester to the carboxyl chain of aspartic acid and glutamic acid, 2) as a benzyl ether to the hydroxyl of serine and threonine and as a 2,4-dichlorobenzyl ether to tyrosine, 3) as a methoxybenzyl ether to diphyridine histidine to imidazole, 5) as a benzoxycarbonyl group to the? -amino group of lysine.
Eri aminohapot liitetään peptidiketjuun disyklo-20 heksyylikarbodi-imidillä (DCCI) ja hydroksibentsotriatso- lilla (HOBT) antamalla proliinin suhteen ylimäärän suojat- . tuja aminohappoja ensin reagoida peräkkäin hartsiin kiin- .1 / nitettynä. Reaktion annetaan jatkua kaksi tuntia. t-Boc- ryhmät poistetaan trifluorietikkahapolla metyleenikloridi-25 liuoksessa; metyleenikloridilla pesemisen jälkeen neutra- - lointi suoritetaan trietyyliamiinilla tai di-isopropyyli- : ·· etyyliamiinilla (DIEA) samassa liuottimessa.The various amino acids are coupled to the peptide chain with dicyclo-20-hexylcarbodiimide (DCCI) and hydroxybenzotriazole (HOBT) to provide excess protection against proline. amino acids first reacted sequentially attached to the resin. The reaction is allowed to proceed for two hours. the t-Boc groups are removed with trifluoroacetic acid in methylene chloride-25 solution; after washing with methylene chloride, the neutralization is carried out with triethylamine or diisopropyl-ethylamine (DIEA) in the same solvent.
Asparagiini ja glutamiini liitetään paranitrofenyy-liestereidensä muodossa liuoksessa dimetyyliformamidissa *·_: 30 (DMF). Jos kontrollikoe ninhydriinin kytkemiseksi Kaise- rin ja Colescottin menetelmän mukaan on positiivinen, seos käsitellään pivaliinihapolla (1 %); jos tässä kokeessa si-·· ninen väri vielä pysyy, DMF/1 % AcOH-seos kyllästetään urealla. Kuitenkin, vaikka tämä koe olisi negatiivinenkin -- ‘35 (ei siniseksi värjäytymistä), kukin kytkentä voidaan tois- 6 87795 taa kaksi kertaa systemaattisesti. Jos kytkentä ei ole totaalinen 48 tunnin reaktion jälkeen, kuten on asianlaita asemassa 20 olevan glutamiinin suhteen, reagoimaton treo-niini asetyloidaan asetyyli-imidatsolilla metyleeniklori-5 dissa tai etikkahapolla ja DCCIrllä.Asparagine and glutamine are combined in the form of their paranitrophenyl esters in a solution in dimethylformamide * · _: 30 (DMF). If the control test for coupling ninhydrin according to the method of Kaiser and Colescott is positive, the mixture is treated with pivalic acid (1%); if in this experiment the blue color still remains, the DMF / 1% AcOH mixture is saturated with urea. However, even if this experiment is negative - ‘35 (no blue staining), each coupling can be repeated twice systematically. If the coupling is not total after 48 hours of reaction, as is the case with glutamine at position 20, the unreacted threonine is acetylated with acetylimidazole in methylene chloride or acetic acid and DCCl.
Lopuksi histidiinin imidatsolia suojaava ryhmä poistetaan, kun peptidi on edelleen hartsiin kiinnittyneenä, pHrssa 8, merkaptoetanolilla DMF-liuoksessa. Peptidi erotetaan hartsista käsittelemällä nestemäisellä vetyfluo-10 ridihapolla anisolin ja metioniinin läsnäollessa. Kaikki suojaryhmät poistetaan tämän tapahtuman aikana.Finally, the imidazole protecting group of histidine is removed while the peptide is still attached to the resin, at pH 8, with mercaptoethanol in DMF solution. The peptide is separated from the resin by treatment with liquid hydrofluoric acid in the presence of anisole and methionine. All protecting groups will be removed during this event.
Peptidit puhdistetaan geelisuodatuksella. Pääpiik-kejä vastaavat fraktiot kootaan, lyofilisoidaan, siirretään jälleen puskuriin pH:ssa 8 ja hapetetaan 24 tuntia 15 ilmavirralla tarkoituksena muodostaa disulfidisilta kahden kysteiinijäännöksen väliin.The peptides are purified by gel filtration. The fractions corresponding to the main peaks are pooled, lyophilized, again transferred to buffer at pH 8 and oxidized for 24 hours with a stream of air to form a disulfide bridge between the two cysteine residues.
Fraktio, joka vastaa piikkiä, jolla on haettu biologinen aktiivisuus, puhdistetaan jälleen ioninvaihtohart-silla CMC 32 happoeluointigradientilla. Saatu peptidi on 20 homogeeninen paperielektroforeesissa ja selluloosakromato- grafiässä.The fraction corresponding to the peak with the claimed biological activity is again purified with an ion exchange resin CMC 32 with an acid elution gradient. The resulting peptide is homogeneous in paper electrophoresis and cellulose chromatography.
. - Kaavan (IB) mukaisten tuotteiden sekvenssi 10 - 31 saadaan samoissa olosuhteissa, jotka aikaisemmin esitettiin kaavan (IA) mukaisten tuotteiden valmistukselle. Se 25 mitä esitettiin glutamiinille asemassa 20 kaavan (IA) mukaisissa tuotteissa, pätee tietenkin asemaan 19 kaavan . *** (IB) mukaisissa tuotteissa.. - Sequence 10 to 31 of the products of formula (IB) is obtained under the same conditions as those previously presented for the preparation of the products of formula (IA). What was shown for glutamine at position 20 in products of formula (IA) applies, of course, to position 19 of formula. *** (IB) compliant products.
Kaavan (IB) mukaisten tuotteiden edullisessa valmistusmenetelmässä sekvenssin 1-9 synteesi suoritetaan 30 nestemäisessä väliaineessa. Fragmentti:In a preferred method of preparing the products of formula (IB), the synthesis of sequences 1-9 is performed in a liquid medium. Fragment:
(CH^L.COOR(CH L.COOR
H-Asn-Λ ’ ,-Leu-Ser-Thr -NH-CH-OOH-Asn-Λ ', -Leu-Ser-Thr -NH-CH-OO
7 S77S5 jossa symbolilla A'2 on edellä annettu merkitys ja R = esteri, kondensoidaan syklisoinnin jälkeen tripeptidin A'7-Leu-Gly kanssa. Käytetään peptidien synteeseissä yleensä käytettäviä suojaryhmiä.S77S5 in which the symbol A'2 has the meaning given above and R = ester is condensed after cyclization with the tripeptide A'7-Leu-Gly. Protecting groups commonly used in peptide syntheses are used.
5 Kaavan (IB) mukainen peptidi saadaan sitten seuraa vasti :The peptide of formula (IB) is then obtained as follows:
Edelläoleva suojattu nonapeptidi muutetaan N-hyd-roksisukkiini-imidiesteriksi, kytketään sitten fragmentin 10 - 31 kanssa hartsiin kiinnittyneenä DMF-väliaineessa 10 30 °C:ssa. Peptidi erotetaan hartsista käsittelemällä nes temäisellä vetyfluoridihapolla dimetyylisulfidin ja p-kre-solin läsnäollessa (J.P. Tam, W.H. Heathand ja R.B. Merri-field, J.A.C.S.,.1983, 105, 6442). Kaikki suojaryhmät poistetaan tämän tapahtuman aikana.The above protected nonapeptide is converted to the N-hydroxysuccinimide ester, then coupled with fragment 10-31 attached to the resin in DMF medium at 30 ° C. The peptide is separated from the resin by treatment with liquid hydrofluoric acid in the presence of dimethyl sulfide and p-cresol (J.P. Tam, W.H. Heathand and R.B. Merri-field, J.A.C.S., 1983, 105, 6442). All protecting groups will be removed during this event.
15 Peptidit puhdistetaan geelisuodatuksellaPeptides are purified by gel filtration
Tuotteiden biologinen aktiivisuus määritetään käyttäen urosrottia joiden paino on 100 - 120 g ja joita on pidetty ilman ruokaa 16 tuntia. Aktiivisuus on ilmaistu MRC-yksiköissä alkaen kalsemian vähenemisestä, mitattuna 20 tunti tutkittavan peptidin suoneen injektoinnin jälkeen sopivasti 0,1N natriumasetaattipuskuriin pHrssa 6 ja 0,1 % albumiiniin laimennettuna, verrattuna sopivasti laimennetun "Research Standard B":n aktiivisuuteen. Esimerkin 1 ; peptidin biologinen aktiivisuus on suurempi kuin 4000 MRC- - 25 yksikköä mg:aa kohti ja esimerkin 2 peptidin aktiivisuus on suurempi kuin 4500 MRC-yksikköä mg:aa kohti. Tämän aktiivisuuden huomioon ottaen tavanomainen annos voi olla : esim. 1 - 100 MAC-yksikköä päivää kohti lihaksensisäisesti tai ihonalaisesti annettuna, vaihdellen käytetyn tuotteen, 30 käsiteltävän potilaan jo kyseessä olevan taudin mukaan. ·“' Esimerkin 1 mukaisen yhdisteen aktiivisuus on ver- rattu lohen kalsitoniini-aktiivisuuteen in vitro-kokeella, ··· jossa luukudoskato-aktiivisuus määritetään kvantitatiivi sesti mittaamalla 1uunäytteiden kuoppien lukumäärää ja —'35 pinta-alaa. Mitä enemmän kalsitoniini kokeessa vähentää s 87795 näiden kuoppien lukumäärää ja pinta-alaa, sitä aktiivisempi se on. Kokeen suorittamiseksi vastasyntyneiden rottien pitkät luut poistettiin, raaputettiin skalpellilla ja näytteet kerättiin puskuroituun Hepes-liuokseen. Näin saa-5 tu luukudossuspensio saatetaan välittömästi kosketukseen muiden luunäytteiden kanssa. Inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa kukin luunäyte siirretään steriiliin astiaan ja inkuboi-daan 18 h kalsitoniinin tai liuottimen läsnäollessa. Kuoppien lukumäärä ja pinta-ala määritetään pyyhkäisyelektro-10 nimikroskoopilla. Tulokset on laskettu luukudoskato-aktii-visuutena prosenttina kontrollinäytteen arvosta. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa.The biological activity of the products is determined using male rats weighing 100 to 120 g and fasted for 16 hours. Activity is expressed in MRC units from the reduction in calcemia, measured 20 hours after intravenous injection of the test peptide, suitably diluted in 0.1 N sodium acetate buffer at pH 6 and 0.1% albumin, compared to the activity of appropriately diluted "Research Standard B". Example 1; the biological activity of the peptide is greater than 4000 MRC- 25 units per mg and the activity of the peptide of Example 2 is greater than 4500 MRC units per mg. In view of this activity, the usual dose may be: e.g. 1 to 100 MAC units per day administered intramuscularly or subcutaneously, depending on the product used, depending on the disease already being treated. The activity of the compound of Example 1 has been compared to the calcitonin activity of salmon in an in vitro experiment in which bone loss activity is quantified by measuring the number of wells and the area of the samples. The more calcitonin in the experiment reduces s 87795 the number and area of these wells, the more active it is. To perform the experiment, the long bones of newborn rats were removed, scraped with a scalpel, and samples were collected in buffered Hepes solution. The bone tissue suspension thus obtained is immediately contacted with other bone samples. After incubation at 37 ° C, each bone sample is transferred to a sterile vessel and incubated for 18 h in the presence of calcitonin or solvent. The number and area of the wells are determined with a scanning electro-10 microscope. Results are calculated as bone loss activity as a percentage of control sample value. The results are shown in the following table.
' Kuoppien lukumäärä Kuoppien pinta-ala 15 luunäytteessä luunäytteessä (% kontrollista) (% kontrollista)'Number of wells Area of wells in 15 bone samples in bone sample (% of control) (% of control)
Lohen kalsito-niini 20 (0,1 pg/ml) 35 % 40 %Salmon calcitonin 20 (0.1 pg / ml) 35% 40%
Esimerkin 1 mukainen tuote (0,1 pg/ml) 26 % 21 % : 25 __,Product of Example 1 (0.1 pg / ml) 26% 21%: 25 __,
Tuloksista ilmenee, että esimerkin 1 mukainen modifioitu kanan kalsitoniini on aktiivisempi kuin lohen kalsitonii-ni. Kuoppien lukumäärän väheneminen on suurempi uuden kal-30 sitoniinin ollessa kyseessä kuin tunnetun lohen kalsitoniinin ollessa kyseessä; 26 % kontrollin kuopista ja vastaavasti 35 %. Ero on siis 35-%:inen. Pinta-alan pienenemisen suhteen vastaavat luvut ovat 21 % ja 40 %, mikä vastaa 90-%:ista eroa.The results show that the modified chicken calcitonin of Example 1 is more active than salmon calcitonin. The reduction in the number of wells is greater for new calcitonin than for known salmon calcitonin; 26% of control wells and 35%, respectively. The difference is then 35%. The corresponding figures for the reduction in surface area are 21% and 40%, which corresponds to a 90% difference.
35 Alan kirjallisuuden perusteella (Nieto, Moya and R- ··_ Candela, Biochim. Biophys. Acta, 322, 1973, 383 - 391) tiedetään, että kanan kalsitoniinilla ja lohen kalsitonii-··- nilla on hyvin samantyyppiset ominaisuudet. Tämän keksin- 9 37795 nön mukaisesti saatu yhdiste on siten aktiivisempi myös kanan kalsitoniiniin nähden.35 It is known from the literature (Nieto, Moya and R- ·· _ Candela, Biochim. Biophys. Acta, 322, 1973, 383-391) that chicken calcitonin and salmon calcitonin have very similar properties. The compound obtained according to the present invention is thus also more active against chicken calcitonin.
Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.The following examples illustrate the invention.
Esimerkki 1 5 Seuraavan kaavan (IA) mukaisen peptidin valmis taminenExample 1 Preparation of a peptide of the following formula (IA)
Cys - Asn - Ser - Leu - Ser5 - Thr - Cys - Vai - Leu -Gly10 - Lys - Leu - Ser - Gin - Glu15 - Leu - His -10 Lys - Leu - Gln20 - Thr - Tyr - Pro - Arg - Thr25 - (IA) Asp - Vai - Gly - Ala - Gly30 - Thr -proamidiCys - Asn - Ser - Leu - Ser5 - Thr - Cys - Vai - Leu -Gly10 - Lys - Leu - Ser - Gin - Glu15 - Leu - His -10 Lys - Leu - Gln20 - Thr - Tyr - Pro - Arg - Thr25 - (IA) Asp - Val - Gly - Ala - Gly30 - Thr -pramide
Lateraalisia ryhmiä sisältävät t-Boc-aminohapot tulevat BACHEMilta (Dubendorf, Sveitsi) tai valmistetaan labora-15 toriossa Schnabelin menetelmällä (E. Schnabel, Liebigs Ann. Chem. 702, 188, 1967) autotitrauslaitteessa. Niiden puhtaus määritetään polarimetrialla, sulamispisteen avulla j a ohutkerrossilikageelikromatografiällä.T-Boc amino acids containing lateral groups come from BACHEM (Dubendorf, Switzerland) or are prepared in the laboratory by the method of Schnabel (E. Schnabel, Liebigs Ann. Chem. 702, 188, 1967) in an autotitrator. Their purity is determined by polarimetry, melting point and thin layer silica gel chromatography.
Puhdistetun peptidin hydrolyysi suoritetaan sulje-20 tussa putkessa vakuumissa 6N HC1-väliaineessa (110 °C, 24 tuntia).Hydrolysis of the purified peptide is performed in a sealed tube under vacuum in 6N HCl medium (110 ° C, 24 hours).
I. Sekvenssin synteesi / a) Hartsin valmistus (P. Rivaille, A. Robinson, M. Kamen ja G. Milhaud, Helv., 1971, 54, 2772).I. Sequence synthesis / a) Preparation of resin (P. Rivaille, A. Robinson, M. Kamen and G. Milhaud, Helv., 1971, 54, 2772).
• 25 Bentsyyliketohartsi 2 litran kolmikaulapullossa, joka on varustettu sekoittajalla, annetaan 50 g:n polystyreeniä, jossa on 1 % divinyylibentseeniä Bio-rad SX2 (200 - 400) turvota 2 tuntia 350 ml:ssa nitrobentseeniä. Toisessa pullossa liuote-30 taan 66 g A1C13 300 mlraan nitrobentseeniä, johon on lisätty 80 ml bentsoyylikloridia. Seos kaadetaan ensimmäiseen pulloon hyvin sekoittaen ja pidetään 2 tuntia ympäristön lämpötilassa. Jos hartsi turpoaa liikaa, lisätään nitrobentseeniä (noin 100 ml). Seos suodatetaan, pestään diok-....:35 saanilla (3 x), etikkahapolla (3 x), metanolilla (3 x) ja • · · 10 37 795 lopuksi vuorotellen CH2Cl2:lla ja CH20H:lla tarkoituksena tehdä hartsi sellaiseksi, että se turpoaa ja supistuu kulloinkin jättäen riittävän kosketusajan. Seos kuivataan ek-sikaattorissa vakuumissa koko yön (saanto 75 g).• 25 Benzyl ketone resin In a 2 liter three-necked flask equipped with a stirrer, 50 g of polystyrene with 1% divinylbenzene Bio-rad SX2 (200-400) is allowed to swell for 2 hours in 350 ml of nitrobenzene. In another flask, 66 g of AlCl 3 are dissolved in 300 ml of nitrobenzene to which 80 ml of benzoyl chloride have been added. The mixture is poured into the first flask with good stirring and kept at ambient temperature for 2 hours. If the resin swells too much, add nitrobenzene (about 100 ml). The mixture is filtered, washed with dioxane (3x), acetic acid (3x), methanol (3x) and finally CH 2 Cl 2 and CH 2 OH alternately to make the resin that it swells and shrinks in each case, leaving sufficient contact time. The mixture is dried in a desiccator under vacuum overnight (yield 75 g).
5 Bentshydryyliamiinihartsi 1 litran pullossa, johon on kiinnitetty "Dean Stark" ja sekoittaja, kuumennetaan 500 g ammoniumformiaat-tia 120 - 130 °C:seen 1-2 tunniksi. Hartsi (50 g) lisätään kerralla ja lämpötilan annetaan nousta 160 - 165 °C:- 10 seen puolen tunnin kuluessa tehokkaasti sekoittaen, joka lämpötila sitten pidetään 6 tuntia. Seos pestään vedellä, käsitellään sitten kuten edellä bentsyyliketohartsin tapauksessa. Vakuumissa kuivattua hartsia kuumennetaan palautus jäähdyttäen ja sekoitetaan 8 tuntia 6N HCltssä. Sit-15 ten se suodatetaan ja pestään kuten edellä. Kiinnitys kapasiteetti vaihtelee, aminohapon luonteen mukaisesti, välillä 0,3 ja 0,5 mmol/g.5 Benzhydrylamine resin In a 1 liter flask fitted with a "Dean Stark" and a stirrer, 500 g of ammonium formate are heated to 120-130 ° C for 1-2 hours. The resin (50 g) is added at once and the temperature is allowed to rise to 160 - 165 ° C - 10 over a period of half an hour with efficient stirring, the temperature was then held for 6 hours. The mixture is washed with water, then treated as above in the case of benzyl ketone resin. The vacuum dried resin is heated to reflux and stirred for 8 hours in 6N HCl. Sit-15 is filtered and washed as above. The attachment capacity varies, depending on the nature of the amino acid, between 0.3 and 0.5 mmol / g.
b) Peptidin valmistus Käytetty laite mahdollistaa 25 ml: n pyrexputken 20 mekaanisen sekoittamisen, jonka keskimmäinen osa sisältää hartsia (2 g). Putken päissä olevista huokoslasisuodatti- mista on tarkoitus lisätä ja poistaa reagensseja (noin 15 V ml).b) Peptide preparation The device used allows mechanical mixing of a 25 ml pyrex tube 20, the middle part of which contains resin (2 g). Reagents (approximately 15 V ml) are to be added and removed from the porous glass filters at the ends of the tube.
Aminohappojen kytkentä käsittää seuraavat vaiheet: '25 Sykli 32The coupling of amino acids comprises the following steps: '25 Cycle 32
Kytkentä: 2 g hartsia (kiinnityskapasiteetti 0,5 mmol/g) sekoitetaan (10 min) CH2C12, (CH3)2NCH0 (DMF)-väliaineessa (1:1, v/v) Boc-L-proliinin läsnäollessa (2 mM, 0,43 g).Coupling: 2 g of resin (binding capacity 0.5 mmol / g) are stirred (10 min) in CH 2 Cl 2, (CH 3) 2 NHCH (DMF) medium (1: 1, v / v) in the presence of Boc-L-proline (2 mM, 0 .43 g).
30 DCCI (4 mmol) ja 1-hydroksibentsotr iät solia (HOBT) (4 mmol) lisätään ja sekoittamista jatketaan 2 tuntia. Hartsi pestään peräkkäin CH2Cl2:lla (1 x,2 min), CH30H:lla, abs. (3 x,2 min), ja CH2Cl2:lla (3 x, 2 min). Ninhydriinireak-tio suoritetaan hartsinäytteelle: se on negatiivinen.DCCI (4 mmol) and 1-hydroxybenzotriaxol sol (HOBT) (4 mmol) are added and stirring is continued for 2 hours. The resin is washed successively with CH 2 Cl 2 (1x, 2 min), CH 3 OH, abs. (3x, 2 min), and with CH 2 Cl 2 (3x, 2 min). The ninhydrin reaction is performed on a resin sample: it is negative.
Μ 07795Μ 07795
Aininoryhmän vapautus:Ainino group exemption:
Hartsi käsitellään seoksella CF3COOH-CH2Cl2 (1:1, v/v) 1 min; seos suodatetaan ja suoritus toistetaan antaen kosketuksen kestää 15 min. Hartsi pestään CH2Cl2:lla (3 x.The resin is treated with CF 3 COOH-CH 2 Cl 2 (1: 1, v / v) for 1 min; the mixture is filtered and the run is repeated, allowing contact to take 15 min. The resin is washed with CH 2 Cl 2 (3 x.
5 1 min). CF3COOH poistetaan käsittelemällä hartsi kahdesti5 1 min). CF3COOH is removed by treating the resin twice
Et3N/CH2Cl2-seoksella (12,5:87,5 v/v) (kosketusaika 1 min, sitten 5 min). Se pestään CH2Cl2:lla (8 x, 1 min). L-pro-liinihartsi titrataan: se sisältää 0,5 mmol/g proliinia.Et3N / CH2Cl2 (12.5: 87.5 v / v) (contact time 1 min, then 5 min). It is washed with CH 2 Cl 2 (8 x, 1 min). The L-proline resin is titrated: it contains 0.5 mmol / g proline.
Sykli 31 10 Kytkentä: L-prolyylihartsia (1 mmol) sekoitetaan (10 min) 4 mmol:n kanssa Boc-O-bentsyyli-L-treoniinia (1,23 g) CH2-C12-DMF:ssä (1:1, v/v) (10 ml). DCCI (4 mmol) ja HOBT (4 mmol) lisätään ja sekoitusta jatketaan (2 h). Hartsi pes- 15 tään peräkkäin: CH2C12 (1 x, 2 min), CH30H abs. (3 x, 2 min), CH2C12 (3 x, 2 min). Ninhydriinireaktio on negatiivinen.Cycle 31 Coupling: L-prolyl resin (1 mmol) is mixed (10 min) with 4 mmol of Boc-O-benzyl-L-threonine (1.23 g) in CH 2 -C12-DMF (1: 1, v / v) (10 ml). DCCI (4 mmol) and HOBT (4 mmol) are added and stirring is continued (2 h). The resin is washed successively with CH 2 Cl 2 (1x, 2 min), CH 3 OH abs. (3x, 2 min), CH 2 Cl 2 (3x, 2 min). The ninhydrin reaction is negative.
Aminoryhmän vapautus - katso sykli 32Amino group release - see Cycle 32
Syklit 30 - 25 20 Käytetään edellä olevia kytkentä- ja vapautusmene- telmiä seuraaviin reaktioihin: ' . Sykli 30 4 mmol Boc-glysiiniä (0,71 g) . Sykli 29 4 mmol Boc-L-ala (0,76 g) . Sykli 28 4 mmol Boc-glysiiniä (0,71 g) ' :25 . Sykli 27 4 mmol Boc-L-valiinia (0,87 g) : .. . Sykli 26 4 mmol Boc-L-asparagiim hapon B-bentsyy- liesteriä (1,29 g)Cycles 30 to 25 The above coupling and release methods are used for the following reactions: '. Cycle 30 4 mmol Boc-glycine (0.71 g). Cycle 29 4 mmol Boc-L-ala (0.76 g). Cycle 28 4 mmol Boc-glycine (0.71 g) ': 25. Cycle 27 4 mmol Boc-L-valine (0.87 g): ... Cycle 26 4 mmol Boc-L-aspartic acid B-benzyl ester (1.29 g)
Sykli 25 4 mmol Boc-O-bentsyyli-L-treoniinia : (1,24 g) .'./30 Sykli 24Cycle 25 4 mmol Boc-O-benzyl-L-threonine: (1.24 g). '/ 30 Cycle 24
Kytkentä:Coupling:
Syklin 25 hartsipeptidiä, joka aikaisemmin pestiin —: DMFrllä (2 x), sekoitetaan (10 min) 4 mmol:n kanssa Boc- N- Y-tosyyli-L-arginiinia (1,41 g) DMF-liuoksessa ja sen ... 35 jälkeen prosessi on sama, joka kuvattiin syklille 31.The resin peptide of cycle 25, previously washed with -: DMF (2x), is mixed (10 min) with 4 mmol of Boc-N-Y-tosyl-L-arginine (1.41 g) in DMF solution and its ... After 35, the process is the same as described for cycle 31.
i2 3 7795i2 3 7795
Sykli 23 Kytkentä:Cycle 23 Wiring:
Syklin 24 peptidihartsia sekoitetaan (10 min) 4 mmol:n kanssa Boc-L-proliinia (0,88 g CH2Cl2-väliaineessa) 5 (10 ml). DCCI/HOBT-seosta lisätään, kuten syklille 32 ku vattiin. Reaktio jakson lopussa ninhydriinireaktio on negatiivinen.The peptide resin from cycle 24 is mixed (10 min) with 4 mmol of Boc-L-proline (0.88 g in CH 2 Cl 2) 5 (10 mL). The DCCI / HOBT mixture is added as described for cycle 32. At the end of the reaction period, the ninhydrin reaction is negative.
Vapautus - katso sykli 32 Syklit 22 - 21 10 Syklissä 23 käytettyjä kytkentä- ja vapautusproses- seja käytetään seuraaviin reaktioihin: . Sykli 22 4 mmol Boc-O-bentsyyli-L-tyrosiinia (1,49 g) . Sykli 21 4 mmol Boc-O-bentsyyli-L-reoniinia (1,24 g). Sykli 20 15 Kytkentä:Release - see Cycle 32 Cycles 22 to 21 10 The coupling and release processes used in Cycle 23 are used for the following reactions:. Cycle 22 4 mmol Boc-O-benzyl-L-tyrosine (1.49 g). Cycle 21 4 mmol Boc-O-benzyl-L-reonine (1.24 g). Cycle 20 15 Wiring:
Syklin 21 hartsipeptidiä, joka aikaisemmin pestiin DMF:llä (2 x), sekoitetaan 4 mmol:n kanssa Boc-L-glutamii-ni-p-nitrofenyyliesteriä (1,5 g) ja 10 ml:n kanssa DMF, johon on lisätty 1 % etikkahappoa. DCCI (4 mmol) ja HOBT 20 (4 mmol) lisätään ja seosta sekoitetaan 48 tuntia. Hartsi pestään DMF:llä, CH2Cl2:lla, CH30H:lla, CH2Cl2:lla (2 x). Vapautus - katso sykli 32 Syklit 19 - 15 Käytetään prosessia syklille 31 seuraaviin reakti- : 25 oihin: "· . Sykli 19 4 mmol Boc-L-leusiini (1,0 g)The resin peptide from Cycle 21, previously washed with DMF (2x), is mixed with 4 mmol of Boc-L-glutamine-p-nitrophenyl ester (1.5 g) and 10 ml of DMF to which 1 % acetic acid. DCCI (4 mmol) and HOBT 20 (4 mmol) are added and the mixture is stirred for 48 hours. The resin is washed with DMF, CH 2 Cl 2, CH 3 OH, CH 2 Cl 2 (2x). Release - see cycle 32 Cycles 19 to 15 The process for cycle 31 is used for the following reactions: "·. Cycle 19 4 mmol Boc-L-leucine (1.0 g)
Sykli 18 4 mmol Boc- -karbobentsyylioksi-L-lysiini d,52g) . Sykli 17 4 mmol Boc-dinitro-2,4-fenyyli(im)L-histidiini .. 30 (1,23 g) . Sykli 16 4 mmol Boc-L-leusiini (1,0 g) . Sykli 15 4 mmol Boc-L-glutamiinihapon -bentsyyliesteri (1,3 g)Cycle 18 4 mmol Boc-carbobenzyloxy-L-lysine d, 52g). Cycle 17 4 mmol Boc-dinitro-2,4-phenyl (im) L-histidine .. 30 (1.23 g). Cycle 16 4 mmol Boc-L-leucine (1.0 g). Cycle 15 4 mmol Boc-L-glutamic acid benzyl ester (1.3 g)
Sykli 14 35 Prosessi on sama kuin syklille 20 i3 87795Cycle 14 35 The process is the same as for Cycle 20 i3 87795
Sykli 13Cycle 13
Prosessi on kuin syklille 31, käyttäen 4 mmol Boc- O-bentsyyli-L-seriiniä (1,0 g).The process is as for cycle 31, using 4 mmol Boc-O-benzyl-L-serine (1.0 g).
Syklit 12-9 5 Prosessi on sama kuin syklille 31 seuraaviin reak tioihin: . Sykli 12: syklissä 19 käytetty johdannainen.Cycles 12-9 5 The process is the same as for Cycle 31 for the following reactions:. Cycle 12: Derivative used in Cycle 19.
. Sykli 11: syklissä 18 käytetty johdannainen.. Cycle 11: Derivative used in Cycle 18.
. Sykli 10: syklissä 30 käytetty johdannainen.. Cycle 10: Derivative used in Cycle 30.
10 . Sykli 9: syklissä 19 käytetty johdannainen.10. Cycle 9: Derivative used in Cycle 19.
. Sykli 8: syklissä 27 käytetty johdannainen.. Cycle 8: Derivative used in Cycle 27.
Sykli 7 Käytetään syklin 31 menetelmää saattamaan 4 mmol Boc-L-kysteiinin S-p-metoksibentsyylieetteriä (1,13 g) 15 reagoimaan.Cycle 7 The procedure of Cycle 31 is used to react 4 mmol of S-p-methoxybenzyl ether (1.13 g) of Boc-L-cysteine.
Syklit 6-3 . Sykli 6: identtinen syklin 31 kanssa.Cycles 6-3. Cycle 6: identical to Cycle 31.
. Sykli 5: identtinen syklin 13 kanssa.. Cycle 5: identical to Cycle 13.
. Sykli 4: identtinen syklin 19 kanssa.. Cycle 4: identical to Cycle 19.
20 . Sykli 3: identtinen syklin 13 kanssa.20. Cycle 3: identical to Cycle 13.
Sykli 2 '· Kytkentä: : ." Peptidihartsia syklistä 3, joka aikaisemmin on pes- ty DMF:llä (2 x), sekoitetaan (48 h) 4 mmol:n kanssa Boc-: ' ·25 L-asparagiinin p-nitrofenyyliesteriä (1,45 g) DMF-väliai- neessa HOBT:n läsnäollessa (4 mmol). Hartsi pestään peräk-käin DMF:llä, CH2Cl2:llä, CH30H:lla, CH2Cl2:lla. Ninhydrii-nireaktio on negatiivinen.Cycle 2 '· Coupling::. "The peptide resin from Cycle 3, previously washed with DMF (2x), is mixed (48 h) with 4 mmol of Boc-: · 25 L-asparagine p-nitrophenyl ester ( 1.45 g) in DMF medium in the presence of HOBT (4 mmol) The resin is washed successively with DMF, CH 2 Cl 2, CH 3 OH, CH 2 Cl 2 The ninhydrin reaction is negative.
; Vapautus 30 Prosessi on sama kuin kuvattiin syklille 32.; Release 30 The process is the same as described for cycle 32.
- Sykli 1 3 mmol Boc-L-kysteiinin S-p-metoksibentsyylieette-riä (1,13 g) saatetaan reagoimaan syklin 31 olosuhteissa.- Cycle 1 3 mmol of S-p-methoxybenzyl ether of Boc-L-cysteine (1.13 g) are reacted under the conditions of Cycle 31.
: II - Histidiinin dinitrofenyyliryhmän eliminointi ... 35 2 ml merkaptoetanolia lisätään 15 ml: aan dimetyy- i4 37795 liformamidia (DMF), ja pH säädetään arvoon 8 trietyyli-amiinilla. Tämä reagenssi viedään laitteeseen ja seosta sekoitetaan 14 tuntia. Hartsi suodatetaan ja pestään vuorotellen metyleenikloridilla (3 x) ja metanolilla (3 x).: II - Elimination of the dinitrophenyl group of histidine ... 35 2 ml of mercaptoethanol are added to 15 ml of dimethyl4,77795 liformamide (DMF), and the pH is adjusted to 8 with triethylamine. This reagent is introduced into the apparatus and the mixture is stirred for 14 hours. The resin is filtered and washed alternately with methylene chloride (3x) and methanol (3x).
5 Vakuumissa kuivatuksen jälkeen hartsin paino on 2,85 g.5 After drying in vacuo, the weight of the resin is 2.85 g.
III. Peptidin irrotus hartsista ja suojaryhmien eliminointi 15 ml vetyfluoridihappoa tiputetaan seokseen, jossa on 1,5 g hartsipeptidiä ja 1,5 ml anisolia. Seosta sekoili) tetaan 1 h °C:ssa ja 30 min ympäristön lämpötilassa. Happo erotetaan vakuumissa ja jäännös siirretään jälleen 3 kertaa 5 ml:aan etikkahappoa ja seostetaan etyylieetterillä vapaaksi peroksidista. Sakka sentrifugoidaan kylmänä, pestään useita kertoja eetterillä, ja kuivataan vakuumissa. 15 Sakka siirretään jälleen vedellä ja liukenematon jäännös poistetaan sentrifugoimalla. Lyofilisoitu liuos antaa 800 mg tuotetta.III. Removal of the peptide from the resin and removal of the protecting groups 15 ml of hydrofluoric acid are added dropwise to a mixture of 1.5 g of the resin peptide and 1.5 ml of anisole. The mixture is stirred for 1 h at 30 ° C and for 30 min at ambient temperature. The acid is separated off in vacuo and the residue is taken up again 3 times in 5 ml of acetic acid and mixed with ethyl ether to free the peroxide. The precipitate is centrifuged cold, washed several times with ether, and dried in vacuo. The precipitate is again transferred to water and the insoluble residue is removed by centrifugation. The lyophilized solution gives 800 mg of product.
IV - Peptidin puhdistus 200 mg epäpuhdasta peptidiä pannaan Biogel P6-pyl-20 vään yläpäähän (halkaisija 2,5 cm, pituus 90 cm) (50 - 100 meshiä), ja eluoidaan 0,1 M etikkahapolla ja kerätään 12 ’· ml:n fraktioita seuraamalla eluointia 280 nm:n rekiste- röintilaitteella. Puhdistettu peptidi kerätään fraktioista 23 - 28.IV - Peptide Purification 200 mg of crude peptide is placed on the top of a Biogel P6-20 column (diameter 2.5 cm, length 90 cm) (50-100 mesh) and eluted with 0.1 M acetic acid and collected in a 12 '· ml fractions by elution with a 280 nm recorder. The purified peptide is collected from fractions 23-28.
• 25 V- Syklisointi• 25 V- Cyclization
Puhdistettua peptidiä sisältävät fraktiot lyofili-soidaan ja jäännös siirretään jälleen 500 ml:aan IM ammo-niumvetykarbonaattipuskuria, pH 8, ja siihen kohdistetaan . : ilmaporeilu huokoisen levyn läpi 24 tunniksi. Liuos lyofi- : 30 lisoidaan ja jäännös puhdistetaan CMC 52 Whatman-pylväällä ammoniumasetaattigradientilla 0,6 mho-7 mho, pH 4, LKB Ultrograd 11300-laitteella. Happohydrolyysin jälkeen ami-nohappokoostumus on seuraava, viitaten proliiniin = 2 (teoreettiset numerot suluissa): 15 87795Fractions containing purified peptide are lyophilized and the residue is again transferred to 500 ml of 1M ammonium bicarbonate buffer, pH 8, and subjected to. : air bubbling through a porous plate for 24 hours. The solution is lyophilized and the residue is purified on a CMC 52 Whatman column with an ammonium acetate gradient from 0.6 mho to 7 mho, pH 4, on an LKB Ultrograd 11300. After acid hydrolysis, the amino acid composition is as follows, referring to proline = 2 (theoretical numbers in parentheses): 15 87795
Ala (1) 1,05; Arg (1) 0,83; Asp (2) 2,10; Cys (2) 1,80; Glu (3) 3,10; Gly (3) 3,30; His (1) 0,80; Leu (5) 5,2; Lys (2) 1,90; Pro (2) 2,0; Ser (3) 3,10; Thr (4) 4,15;Ala (1) 1.05; Arg (1) 0.83; Asp (2) 2.10; Cys (2) 1.80; Glu (3) 3.10; Gly (3) 3.30; His (1) 0.80; Leu (5) 5.2; Lys (2) 1.90; Pro (2) 2.0; Ser (3) 3.10; Thr (4) 4.15;
Tyr (1) 0,85; Vai (2) 2,1.Tyr (1) 0.85; Or (2) 2.1.
55
Esimerkki 2Example 2
Seuraavan kaavan (IB) mukaisen peptidin saaminen: (CH2)5 10 CO-Asn-Ser-Leu-Ser-Thr5-NH-CH-CO-Val-Leu-Gly-Lys10-Leu-Preparation of a peptide of the following formula (IB): (CH2) 5 10 CO-Asn-Ser-Leu-Ser-Thr5-NH-CH-CO-Val-Leu-Gly-Lys10-Leu
Ser-Gln-Glu-Leu15-His-Lys-Leu-Gln-Thr20-Tyr-Pro-Arg- (IB) Thr-Asp25-Val-Gly-Ala-Thr30-proamidi t-Boc-aminohapot, joissa on lateraalisia ryhmiä, 15 saadaan kuten esimerkissä 1 on esitetty.Ser-Gln-Glu-Leu15-His-Lys-Leu-Gln-Thr20-Tyr-Pro-Arg- (IB) Thr-Asp25-Val-Gly-Ala-Thr30-proamide t-Boc amino acids with lateral groups , 15 is obtained as shown in Example 1.
Samalla tavalla suoritetaan puhdistetun peptidin hydrolyysi suljetussa putkessa vakuumissa 6N HCl-väliai-neessa (110 °C, 24 tuntia).In a similar manner, hydrolysis of the purified peptide is performed in a sealed tube under vacuum in 6N HCl medium (110 ° C, 24 hours).
Peptidin sekvenssin 10 - 31 synteesi 20 la) Hartsin valmistus (P. Rivaille, A. Robinson, M. Kamen ja G. Milhaud, Helv., 1971, 54, 2772) .Synthesis of peptide sequence 10-31 20a) Preparation of resin (P. Rivaille, A. Robinson, M. Kamen and G. Milhaud, Helv., 1971, 54, 2772).
Bentsyyliketohartsi 2 l:n kolmikaulapullossa, joka on varustettu sekoittajalla, annetaan 50 g:n polystyreeniä, jossa on mu-: 25 kana 1 % divinyylibentseeniä Bio-rad SXx (200 - 400 meshiä), turvota 350 ml:ssa nitrobentseeniä. Toisessa pullossa liuotetaan 66 g AlCl3;a 300 ml:aan nitrobentseeniä, johon on lisätty 80 ml bentsoyylikloridia. Seos kaadetaan ; ensimmäiseen pulloon hyvin sekoittaen ja pidetään kaksi I.. 30 tuntia ympäristön lämpötilassa. Jos hartsi turpoaa liikaa, lisätään nitrobentseeniä (noin 100 ml). Seos suodatetaan, pestään dioksaanilla (3 x), etikkahapolla (3 x), metano-*:*: lilla (3 x) ja lopuksi vuorotellen CH2Cl2:lla ja CH30H:lla tarkoituksena saada hartsi turpoamaan ja supistumaan kul-35 loinkin jättäen kosketusajan riittäväksi. Seos kuivataan oka i kaa l.tor I aua vakuuiuiaaa koko yön (saanto 75 g).Benzyl ketone resin In a 2 l three-necked flask equipped with a stirrer, 50 g of polystyrene containing 1% divinylbenzene Bio-rad SXx (200-400 mesh) are swollen in 350 ml of nitrobenzene. In another flask, 66 g of AlCl3 are dissolved in 300 ml of nitrobenzene to which 80 ml of benzoyl chloride have been added. The mixture is poured; to the first flask with good stirring and keep for two I .. 30 hours at ambient temperature. If the resin swells too much, add nitrobenzene (about 100 ml). The mixture is filtered, washed with dioxane (3x), acetic acid (3x), methanol - *: * (3x) and finally alternately with CH 2 Cl 2 and CH 3 OH to cause the resin to swell and shrink in each case, leaving sufficient contact time. . The mixture is dried overnight. The mixture is dried overnight (yield 75 g).
i6 87795i6 87795
Bentshydryyliamiinihartsi 1 litran pullossa, joka on varustettu "Dean Star-killa" ja sekoittajalla, kuumennetaan 500 g ammoniumformi-aattia lämpötilaan 120 - 130 °C 1 - 2 tunniksi. Hartsi (50 5 g) lisätään kerrallaan ja lämpötilan annetaan nousta 160 -165 °C:seen puoleksi tunniksi tehokkaasti sekoittaen, ja annetaan olla 6 tuntia. Seos suodatetaan, pestään vedellä, sitten käsitellään kuin edellä bentsyyliketohartsin tapauksessa. Vakuumissa kuivattua hartsia kuumennetaan pa-10 lautusjäähdyttäen 8 tuntia 6N HCl:ssä. Sitten se suodatetaan ja pestään kuten aikaisemmin. Kiinnityskapasiteetti vaihtelee aminohapon luonteen mukaisesti välillä 0,3 ja 0,5 mmol/g.Benzhydrylamine resin In a 1 liter flask equipped with a "Dean Star" and a stirrer, 500 g of ammonium formate are heated to 120-130 ° C for 1-2 hours. The resin (50 5 g) is added at a time and the temperature is allowed to rise to 160-165 ° C for half an hour with vigorous stirring, and allowed to stand for 6 hours. The mixture is filtered, washed with water, then treated as above in the case of benzyl ketone resin. The vacuum dried resin is heated to reflux for 8 hours in 6N HCl. It is then filtered and washed as before. The attachment capacity varies between 0.3 and 0.5 mmol / g depending on the nature of the amino acid.
Ib) Peptidin sekvenssin 10 - 31 valmistus 15 Käytetyssä laitteessa on mahdollista sekoittaa mekaanisesti 25 ml:n pyrexputkea, jonka keskiosa sisältää hartsia (2 g). Putken päissä olevista 2 huokoslasisuodattimes-ta on tarkoitus lisätä ja sitten poistaa reagenssit (noin 15 ml).Ib) Preparation of Peptide Sequence 10-31 In the apparatus used, it is possible to mechanically mix a 25 ml pyrex tube with a resin (2 g) in the middle. From the 2 porous glass filters at the ends of the tube, the reagents (about 15 ml) are to be added and then removed.
20 Sykli 3120 Cycle 31
Kytkentä: 2 g:aa hartsia (kiinnityskapasiteetti 0,5 mmol/g) sekoitetaan (10 min) väliaineessa CH2C12' (CH3)2NCHO (DMF) (1:1, v/v) Boc-L-pro] iinin läsnäollessa ( ?. mmol, 0,43 g).Coupling: 2 g of resin (binding capacity 0.5 mmol / g) are stirred (10 min) in CH 2 Cl 2 '(CH 3) 2 NCHO (DMF) (1: 1, v / v) in the presence of Boc-L-pro] (? mmol, 0.43 g).
.25 DCCl (4 mmol) ja 1 hydroksiben t soti i a tso.L ia (HOBT) (4 ; ·.. mmol) lisätään ja sekoitusta jatketaan 2 tuntia. Hartsi pestään peräkkäin CH30H:lla (1 x, 2 min), CH30H:lla, abs. (3 x, 2 min), CH2Cl2:lla (3 x, 2 min). Ninhydriinireaktio .·. : suoritetaan hartsinäytteelle: se on negatiivinen..25 DCCl (4 mmol) and 1 hydroxybenzotieto a tso.L ia (HOBT) (4; · .. mmol) are added and stirring is continued for 2 hours. The resin is washed successively with CH 3 OH (1x, 2 min), CH 3 OH, abs. (3x, 2 min), with CH 2 Cl 2 (3x, 2 min). Ninhydrin reaction. : performed on a resin sample: it is negative.
-.30 Aminoryhmän vapautus:-.30 Amino group exemption:
Hartsi käsitellään seoksella CF3COOH-CH2Cl2 (1:1, ..." v/v) 1 min; seos suodatetaan ja tapahtuma toistetaan anta en kosketuksen kestää 15 min. Hartsi pestään CH2Cl2:lla (3 ...: x, 1 min). CF3C00H poistetaan käsittelemällä hartsia kah- ... 35 desti Et3N/CH2Cl2 seoksella (12,5:87,5 v/v) (kosketusaika i7 87795 1 min, sitten 5 min). Seos pestään CH2Cl2:lla (8 x, 1 min). Hartsi-L-proliini titrataan: se sisältää 0,5 mmol/g pro-liinia.The resin is treated with CF 3 COOH-CH 2 Cl 2 (1: 1, ... "v / v) for 1 min; the mixture is filtered and the procedure is repeated to allow contact for 15 min. The resin is washed with CH 2 Cl 2 (3 ...: x, 1 min) CF3C00H is removed by treating the resin twice with Et3N / CH2Cl2 (12.5: 87.5 v / v) (contact time i7 87795 1 min, then 5 min) The mixture is washed with CH2Cl2 (8 x, 1 The resin L-proline is titrated: it contains 0.5 mmol / g of proline.
Sykli 30 5 Kytkentä:Cycle 30 5 Wiring:
Hartsi-L-prolyyliä (1 mmol) sekoitetaan 4 mmol:n kanssa Boc-O-bentsyyli-L-treoniinia (1,23 g) CH2C12-DMF: ssä (1:1 v/v) (10 ml). DCCI (4 mmol) ja HOBT (4 mmol) lisätään ja sekoittamista jatketaan (2 h). Hartsi pestään 10 peräkkäin: CH2C12 ( 1 x, 2 min), CU ,0H abs. (3 x, 2 min), CH2C12 (3 x, 2 min). Ninhydriinireaktio on negatiivinen.Resin L-prolyl (1 mmol) is mixed with 4 mmol of Boc-O-benzyl-L-threonine (1.23 g) in CH 2 Cl 2 -DFF (1: 1 v / v) (10 mL). DCCI (4 mmol) and HOBT (4 mmol) are added and stirring is continued (2 h). The resin is washed 10 times in succession: CH 2 Cl 2 (1 x, 2 min), CU, 0H abs. (3x, 2 min), CH 2 Cl 2 (3x, 2 min). The ninhydrin reaction is negative.
Aminoryhmän vapautus - katso sykli 31Amino group release - see Cycle 31
Syklit 29 - 24 Käytetään ylläolevia kytkentä- ja vapautusprosesse-15 ja seuraavien aineiden reagoimiseen: . Sykli 29 4 mmol Boc-glysiiniä (0,71 g) . Sykli 28 4 mmol Boc-L-ala (0,76 g) . Sykli 27 4 mmol Boc-glysiiniä (0,71 g) . Sykli 26 4 mmol Boc-L-valiinia (0,87 g) 20 . Sykli 25 4 mmol Boc-L-asparagiinihapon B-bentsyylieste- . . riä (1,29 g) • . Sykli 24 4 mmol Boc-O-bentsyyli-L-treoniinia (1,24 g).Cycles 29 to 24 Use the above coupling and release processes-15 and to react with the following substances:. Cycle 29 4 mmol Boc-glycine (0.71 g). Cycle 28 4 mmol Boc-L-ala (0.76 g). Cycle 27 4 mmol Boc-glycine (0.71 g). Cycle 26 4 mmol Boc-L-valine (0.87 g) 20. Cycle 25 4 mmol Boc-L-aspartic acid B-benzyl ester-. . (1.29 g) •. Cycle 24 4 mmol Boc-O-benzyl-L-threonine (1.24 g).
Sykli 23Cycle 23
Kytkentä: ‘ : 25 Syklin 24 hartsipeptidiä, joka aikaisemmin on pesty DMFrllä (2 x), sekoitetaan (10 min) 4 mmol: n kanssa Boc-N- γ -tosyyli-L-arginiinia (1,41 g) DMF-liuoksessa ja seu-raava prosessi on sama kuin syklille 30 kuvattiin.Coupling: The resin peptide of cycle 24, previously washed with DMF (2x), is mixed (10 min) with 4 mmol of Boc-N-γ-tosyl-L-arginine (1.41 g) in DMF solution and the following process is the same as described for cycle 30.
· Sykli 22 ... 30 Kytkentä:· Cycle 22 ... 30 Wiring:
Syklin 23 hartsipeptidiä sekoitetaan (10 min) 4 ..." mmolrn kanssa Boc-L-proliinia (0,88 g) väliaineessa CH2C12 (10 ml). DCCI/HOBT lisätään kuten syklille 31 kuvattiin. Reaktiojakson lopussa ninhydriinireaktio oli negatiivinen. ... 35 Vapautus - katso sykli 31 is f 37795 .: 4;' \ .. -The resin peptide of cycle 23 is mixed (10 min) with 4 ... "mmol of Boc-L-proline (0.88 g) in CH 2 Cl 2 (10 mL). DCCI / HOBT is added as described for cycle 31. At the end of the reaction period, the ninhydrin reaction was negative. 35 Exemption - see Cycle 31 is f 37795.: 4; ' \ .. -
Syklit 21 - 20 Käytetään syklissä 22 käytettyjä kytkentä- ja va-pautusprosesseja seuraavien aineiden reagoimiseen: . Sykli 21 4 mmol Boc-O-bentsyyli-L-tyrosiinia (1,49 g) 5 . Sykli 20 4 mmol Boc-O-bentsyyli-L-treoniinia (1,24 g)Cycles 21 to 20 The coupling and release processes used in Cycle 22 are used to react the following substances:. Cycle 21 4 mmol Boc-O-benzyl-L-tyrosine (1.49 g) 5. Cycle 20 4 mmol Boc-O-benzyl-L-threonine (1.24 g)
Sykli 19 Kytkentä:Cycle 19 Wiring:
Syklin 20 hartsipeptidiä, joka aikaisemmin on pesty DMF:llä (2 x), sekoitetaan (10 min) 4 mmol:n kanssa Boc-10 L-glutamiini-p-nitrofenyyliesteriä (1,5 g) ja 10 ml:n kanssa DMF; johon on lisätty 1 % etikkahappoa. DCCI (4-mmol) ja HOBT (4 mmol) lisätään ja seosta sekoitetaan 48 tuntia. Hartsi pestään DMF:llä, CH2Cl2:lla, CH30H:lla, CH2C12:11a (2 x).The resin peptide from cycle 20, previously washed with DMF (2x), is mixed (10 min) with 4 mmol of Boc-10 L-glutamine-p-nitrophenyl ester (1.5 g) and 10 mL of DMF; to which 1% acetic acid has been added. DCCI (4 mmol) and HOBT (4 mmol) are added and the mixture is stirred for 48 hours. The resin is washed with DMF, CH 2 Cl 2, CH 3 OH, CH 2 Cl 2 (2x).
15 Vapautus - katso sykli 3115 Release - see Cycle 31
Sykljt 18_-_14Cycle 18 _-_ 14
Sykliin 30 käytettyä prosessia käytetään seuraavien aineiden reagoimiseen: . Sykli 18 4 mmol Boc-L-leusiinia (1,0 g) 20 . Sykli 17 4 mmol Boc- t--karbobentsyylioksi-L-lysiiniä (1,52 g) . Sykli 16 4 mmol Boc-dinitro-2,4-fenyyli(im)L-histidii-niä (1,23 g) . Sykli 15 4 mmol Boc-L-leusiinia (1,0 g) 25 . Sykli 14 4 mmol Boc-L-glutamiinihapon γ-bentsyylieste- riä (1,3 g)The process used for cycle 30 is used to react the following substances:. Cycle 18 4 mmol Boc-L-leucine (1.0 g) 20. Cycle 17 4 mmol Boc-t-carbobenzyloxy-L-lysine (1.52 g). Cycle 16 4 mmol Boc-dinitro-2,4-phenyl (im) L-histidine (1.23 g). Cycle 15 4 mmol Boc-L-leucine (1.0 g) 25. Cycle 14 4 mmol γ-benzyl ester of Boc-L-glutamic acid (1.3 g)
Sykli 13Cycle 13
Prosessi on sama kuin syklille 19.The process is the same as for cycle 19.
Sykli 12 30 Prosessi on sama kuin syklille 30 käyttäen 4 mmolCycle 12 30 The process is the same as for Cycle 30 using 4 mmol
Boc-O-bentsyyli-L-seriiniä (1,0 g).Boc-O-benzyl-L-serine (1.0 g).
Syklit 11 ja 10Cycles 11 and 10
Prosessi on sama kuin syklille 30 seuraavien ai-. .· neiden reagoimiseksi: 35 . Sykli 11: syklissä 18 käytetty johdannainen.The process is the same as for cycle 30 of the following ai-. · To respond to them:. Cycle 11: Derivative used in Cycle 18.
. Sykli 10: syklissä 17 käytetty johdannainen.. Cycle 10: Derivative used in Cycle 17.
19 87795 2. Peptidin sekvenssin 1-9 synteesi 2a) Osittainen sekvenssi Boc-L-Thr (Bzl)-Asu OMe (A) Z-Asu OMe (11,2 g) viedään seokseen MeOH-H20 (2:1, v/v) ja seosta hydrataan palladiumhiilen läsnäollessa (14 h).19 87795 2. Synthesis of Peptide Sequence 1-9 2a) Partial Sequence Boc-L-Thr (Bzl) -Asu OMe (A) Z-Asu OMe (11.2 g) is taken up in a mixture of MeOH-H 2 O (2: 1, v / v). v) and the mixture is hydrogenated in the presence of palladium on carbon (14 h).
5 Katalyytin poistamisen jälkeen seos konsentroidaan vakuu-missa. Dioksaania (40 ml) lisätään, sitten lisätään tri-etyyliamiinia (4,2 ml), samalla jäähdyttäen, sitten lisätään Boc-L-Thr (Bzl) OSu (16 g). Sekoittamisen (72 h) jälkeen sekoitetaan joukkoon N,N-dimetyyliamino-1,3-propani-10 didiamiinia, ja seosta sekoitetaan (4 h) ja konsentroidaan sitten kolmasosaan tilavuudestaan. Se uutetaan etyyliasetaatilla (AcOEt), sitten AcOEt pestään HClrllä (IN), sitten H20:lla; sitten tislataan vakuumissa. Öljyinen jäännös siirretään.eetteriin, uutetaan NaHC03:lla (5 %), uutetaan 15 uudelleen AcOEtrllä ja pestään peräkkäin H20:lla, HClillä (IN),·, H20:lla. Uutteet kuivataan vedettömällä natriumsul-faatilla ja AcOEt erotetaan. A saadaan öljymäisen tuotteen muodossa (10 g).After removal of the catalyst, the mixture is concentrated in vacuo. Dioxane (40 ml) is added, then triethylamine (4.2 ml) is added while cooling, then Boc-L-Thr (Bzl) OSu (16 g) is added. After stirring (72 h), N, N-dimethylamino-1,3-propane-10 didiamine is stirred, and the mixture is stirred (4 h) and then concentrated to one third of its volume. It is extracted with ethyl acetate (AcOEt), then the AcOEt is washed with HCl (IN), then with H 2 O; then distilled in vacuo. The oily residue is taken up in ether, extracted with NaHCO3 (5%), re-extracted with AcOEt and washed successively with H2O, HCl (IN), H2O. The extracts are dried over anhydrous sodium sulfate and the AcOEt is separated. A is obtained in the form of an oily product (10 g).
2b) Osittainen sekvenssi Boc-L-Ser-(Bzl)-L-Thr-(Bzl) Asu όμθ.οηα (b).2b) Partial sequence Boc-L-Ser- (Bzl) -L-Thr- (Bzl) Asu όμθ.οηα (b).
Tuote A (5 g) liuotetaan jäähdyttäen TFA:han (15 ml). Ympäristön lämpötilassa TFA erotetaan vakuumissa ja jäännös kuivataan vakuumissa, liuotetaan sitten DMF:ään (10 ;.il) ja pH asetetaan arvoon 6 trietyyliamiinilla (4 ml) 25 äähdyttäen. Sitten lisätään HOBT (5 g) ja Boc-L-Ser (Bzl) OSu sekoittaen (3 päivää) ympäristön lämpötilassa ja pH:-Lsa 6. Lisätään N,N-dimetyyliamino-1,3-propaanidiamiinis sekoittaen (1 h), lisätään H20, ja uutetaan sen jälkeen.Product A (5 g) is dissolved in TFA (15 ml) under cooling. At ambient temperature, the TFA is removed in vacuo and the residue is dried in vacuo, then dissolved in DMF (10 μl) and the pH is adjusted to 6 with triethylamine (4 ml) under cooling. HOBT (5 g) and Boc-L-Ser (Bzl) OSu are then added with stirring (3 days) at ambient temperature and pH 6. Add N, N-dimethylamino-1,3-propanediamine with stirring (1 h), add H 2 O, and then extracted.
: AcOEt:llä kuten edellä kuvattiin. Sykloheksyyliamiinia 30 (CHA) lisätään kuivaan AcOEt:hen ja tislataan alipaineessa. Saadaan öljymäinen tuote B (4 g).: With AcOEt as described above. Cyclohexylamine 30 (CHA) is added to dry AcOEt and distilled under reduced pressure. Obtained as an oily product B (4 g).
2c) Osittainen sekvenssi Boc-L-Asn-Ser( Bzl) ‘-L-Leu-NH-Ni-'!2 (C).2c) Partial sequence Boc-L-Asn-Ser (Bzl) '-L-Leu-NH-Ni -'! 2 (C).
... · 3 g Boc-L-Asn-L-Ser-(Bzl)-L-Leu OEt:tä liuotetaan 20 ial.: .· ·. 35 aan C-.20h, lisätään 10 ml 80 % NH2NH2H20, ja seos jätetään 20 37 79 5 14 tunniksi ympäristön lämpötilaan. Sitten se seostetaan etyylieetterillä, sakka pestään etyylieetterillä ja uudelleenko teytetään seoksesta CH3OH-AcOEt-etyylieetteri. Saadaan 2,5 g odotettua tuotetta (C).Dissolve 3 g of Boc - L - Asn - L - Ser - (Bzl) - L - Leu OEt in 20. To 35 ° C-20 h, 10 ml of 80% NH 2 NH 2 H 2 O are added and the mixture is left for 20 37 79 5 14 hours at ambient temperature. It is then mixed with ethyl ether, the precipitate is washed with ethyl ether and recharged with CH3OH-AcOEt-ethyl ether. 2.5 g of the expected product (C) are obtained.
5 2d) Osittainen sekvenssi Boc-L-Asn-L-Ser (Bzl)-L-Leu-L-5 2d) Partial sequence Boc-L-Asn-L-Ser (Bzl) -L-Leu-L-
Ser (Bzl)-L-Thr (Bzl)-Asu OMe (D).Ser (Bzl) -L-Thr (Bzl) -Asu OMe (D).
Tuote B (2 g) lisätään AcOEt:hen HCl:n (IN) läsnäollessa; seos kuivataan vedettömällä natriumsulfaatilla ja konsentroidaan vakuumissa. TFA (6 ml) lisätään kylmänä se-10 koittaen ympäristön lämpötilassa (0,5 h), sitten TFA poistetaan vakuumissa ja jäännös kuivataan vakuumissa. Jäännös liuotetaan DMFrään (2 ml) ja trietyyliamiinilla neutraloinnin jälkeen lisätään hitaasti -40 °C:ssa liuokseen, jossa on C:tä Boc-L-Asn-L-Ser(Bzl)-L-Leu-NH-NH2 (1,7 g) 15 DMF:ssä (6 ml), johon on aikaisemmin lisätty dioksaania-(2,8 ml), HCl:n (IN) ja isoamyylinitriitin (0,6 ml) läsnäollessa. pH säädetään arvoon 7 trietyyliamiinilla, ja reaktio tapahtuu 5 °C:ssa (72 h) .Product B (2 g) is added to AcOEt in the presence of HCl (IN); the mixture is dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated in vacuo. TFA (6 mL) is added cold with stirring at ambient temperature (0.5 h), then the TFA is removed in vacuo and the residue is dried in vacuo. The residue is dissolved in DMF (2 ml) and, after neutralization with triethylamine, is slowly added at -40 ° C to a solution of C Boc-L-Asn-L-Ser (Bzl) -L-Leu-NH-NH 2 (1.7 g) in DMF (6 ml) previously treated with dioxane (2.8 ml), HCl (1N) and isoamyl nitrite (0.6 ml). The pH is adjusted to 7 with triethylamine and the reaction takes place at 5 ° C (72 h).
Reaktioseos viedään hitaasti -5 °C:ssa 0,5N HClrään 20 (60 ml). Sakka pestään H20:lla. Uuttaminen suoritetaan . . CHCl3:lla (100 ml), ja uutteet pestään peräkkäin HCltn ve siliuoksella (IN), NaCl:llä. CHC13 poistetaan.The reaction mixture is slowly introduced at -5 ° C into 0.5N HCl (60 mL). The precipitate is washed with H 2 O. Extraction is performed. . CHCl 3 (100 mL), and the extracts are washed sequentially with aqueous HCl (1N), NaCl. CHCl3 is removed.
Tuote D seostetaan seoksella CHCl3-n-heksaani (2 g). (2e) -L-Asn-L-Ser (Bzl)-L-Leu-L-Ser (Bzl)-L-Thr (Bzl) Asu^-NH-’25 NH2: n (E) syklisointiProduct D is mixed with CHCl 3 -n-hexane (2 g). Cyclization of (2e) -L-Asn-L-Ser (Bzl) -L-Leu-L-Ser (Bzl) -L-Thr (Bzl) Asu ^ -NH-'25 NH2 (E)
Tuote D (1,6 g) liuotetaan vedettömään pyridiiniin (15 ml). Lisätään TFA-ONP (2,5 g), sekoittaen 45 °C:ssa (3 h), konsentroidaan sen jälkeen vakuumissa, saostetaan etyyli-eetterillä, käsitellään TFA:11a kuten edellä, ja sitten ..'f. 30 syklisoidaan vedettömässä pyridiinissä 50 °C:ssa 5 tuntia.Product D (1.6 g) is dissolved in anhydrous pyridine (15 ml). TFA-ONP (2.5 g) is added, with stirring at 45 ° C (3 h), then concentrated in vacuo, precipitated with ethyl ether, treated with TFA as above, and then. 30 is cyclized in anhydrous pyridine at 50 ° C for 5 hours.
Uuttaminen suoritetaan CHCl,:lla ja uutteet pestään kuten edellä, konsentroidaan vakuumissa, ja saostetaan n-heksaa-nilla.The extraction is performed with CHCl 3 and the extracts are washed as above, concentrated in vacuo, and precipitated with n-hexane.
Sakka (2 g) liuotetaan DMF:ään (5 ml) ja CH30H: ,*··. 35 hon (25 ml). 15 ml hydratsiinia (80 %) lisätään, seosta 21 87795 sekoitetaan ympäristön lämpötilassa (14 h) ja lisätään H20. Sakka suodatetaan ja pestään H20:lla. CH3OH (50 ml) lisätään ja seos kuumennetaan palautusjäähdyttäen; tuote E saostuu (0,8 g).The precipitate (2 g) is dissolved in DMF (5 ml) and CH 3 OH. 35 hon (25 mL). 15 ml of hydrazine (80%) are added, the mixture 21 87795 is stirred at ambient temperature (14 h) and H 2 O is added. The precipitate is filtered and washed with H 2 O. CH 3 OH (50 mL) is added and the mixture is heated to reflux; product E precipitates (0.8 g).
5 2f) Sekvenssin 1-9 valmistus: -L-Asn-L-Ser (Bzl)-L-Leu- L-Ser-(Bzl)-L-Thr (Bzl )-Asul,7-L-Val-L-Leu-Gly OH (F)2 2f) Preparation of SEQ ID NO: 1-9: -L-Asn-L-Ser (Bzl) -L-Leu- L-Ser- (Bzl) -L-Thr (Bzl) -Asul, 7-L-Val-L- Leu-Gly OH (F)
Tuote E (1 g) suspendoidaan DMF:ään (4 ml), lisätään dioksaania ja 4N HC1 (1,7 ml) -5 °C:ssa. Isoamyyli-nitriittiä (0,3 ml) lisätään -10 °C:ssa sekoittaen. L-H-10 Val-L-Leu-Gly (0,9 g) lisätään -5 eC:ssa pH:n ollessa säädetty arvoon 7 trietyyliamiinilla. Seosta sekoitetaan jäähauteessa (48 h, sitten tuote F (1 g) seostetaan 0,5N HClillä (150 ml).Product E (1 g) is suspended in DMF (4 mL), dioxane and 4N HCl (1.7 mL) are added at -5 ° C. Isoamyl nitrite (0.3 ml) is added at -10 ° C with stirring. L-H-10 Val-L-Leu-Gly (0.9 g) is added at -5 ° C with pH adjusted to 7 with triethylamine. The mixture is stirred in an ice bath (48 h), then product F (1 g) is mixed with 0.5N HCl (150 mL).
3. Peptidin valmistus3. Peptide preparation
15 3a) HOBT (111 mg) ja DCCL (150 mg) lisätään tuotteeseen F3a) HOBT (111 mg) and DCCL (150 mg) are added to product F
(500 mg) liuotettuna DMFiään (2 ml). Sekoitetaan 72 tuntia peptidyylihartsin 10 - 31 (300 mg) läsnäollessa Lys10:n t-Boc:n poistamisen jälkeen.(500 mg) dissolved in DMF (2 ml). Stir for 72 hours in the presence of peptidyl resin 10-31 (300 mg) after removal of Lys10 t-Boc.
3b) Peptidin lohkaisu Tam et ai.:n mukaan JACS (1983), 20 105, 6442.3b) Peptide cleavage according to Tam et al., JACS (1983), 20 105, 6442.
Määrät viittaavat 1 g:aan peptidyylihartsia.The amounts refer to 1 g of peptidyl resin.
1) HF (2,5 ml) tiputetaan hartsipeptidin (1 g), dimetyy-lisulfidin (6,5 ml) ja p-kresolin (250 mg) seokseen, sekoittaen (1 h) 0 °C:ssa. Happo ja dimetyylisulfidi erote- .25 taan vakuumissa ja jäännös siirretään 3 kertaa 5 ml:11a ; AsOEt.1) HF (2.5 ml) is added dropwise to a mixture of resin peptide (1 g), dimethyl sulfide (6.5 ml) and p-cresol (250 mg) with stirring (1 h) at 0 ° C. The acid and dimethyl sulfide are separated in vacuo and the residue is taken up 3 times in 5 ml; AsOEt.
2) Kuivattu peptidyylihartsi suspendoituna dimetyylisulfi-diin (1 ml) käsitellään nestemäisellä HF:llä (10 ml) 0 °C- ;’· ssa (1 h). HF:n ja dimetyylisulfidin vakuumissa tapahtu- . 30 neen poistamisen jälkeen hartsi pestään eetterillä (3 ker taa 10 ml); peptidi siirretään etikkahappoon, saostetaan etyylieetterillä, sentrifugoidaan kylmänä, pestään useita - kertoja eetterillä, ja kuivataan vakuumissa. Sakka siir- —: retään jälleen veteen ja liukenematon jäännös poistetaan 35 sentrifugoimalla. Lyofilisoimalla liuoksesta saadaan 500 mg tuotetta.2) The dried peptidyl resin suspended in dimethyl sulfide (1 mL) is treated with liquid HF (10 mL) at 0 ° C (1 h). HF and dimethyl sulfide in vacuo. After removal, the resin is washed with ether (3 times 10 ml); the peptide is taken up in acetic acid, precipitated with ethyl ether, centrifuged cold, washed several times with ether, and dried in vacuo. The precipitate is transferred again to water and the insoluble residue is removed by centrifugation. Lyophilization of the solution gives 500 mg of product.
22 87795 3c) Peptidin puhdistus 200 g epäpuhdasta peptidiä pannaan 50 - 100 meshin Biogel P6-pylvään (halkaisija 2,5 cm, pituus 90 cm) yläpäähän. Se eluoidaan 0,1M etikkahapolla ja kerätään 12 ml: n fraktioi-5 ta seuraten eluoitumista 280 nm:n rekisteröintilaitteella. Puhdistettu peptidi kerätään fraktioissa 23 - 28. Nämä fraktiot lyofilisoidaan ja jäännös puhdistetaan Whatman CMC 32 pylväällä ammoniumasetaattigradientilla 0,6 mho - 7 mho, pH 4, LKB Ultrograd 11300-laitteella.22 87795 3c) Peptide purification 200 g of crude peptide are applied to the top of a 50-100 mesh Biogel P6 column (diameter 2.5 cm, length 90 cm). It is eluted with 0.1M acetic acid and collected in a 12 ml fraction following elution with a 280 nm recorder. The purified peptide is collected in fractions 23 to 28. These fractions are lyophilized and the residue is purified on a Whatman CMC 32 column with an ammonium acetate gradient from 0.6 mho to 7 mho, pH 4, on an LKB Ultrograd 11300.
10 Happohydrolyysin jälkeen aminohappokoostumus on seuraava, viitaten proliiniin = 2 (teoreettiset numerot suluissa):10 After acid hydrolysis, the amino acid composition is as follows, referring to proline = 2 (theoretical numbers in parentheses):
Ala (1) 1,15; Arg (1) 0,85; Asp (2) 2,15; Glu (3) 3,10; Gly (3) 2,9; His (1) 0,83; Leu (5) 5,3; Lys (2) 1,95; 15 Pro (2) 2,0; Ser (3) 3,20; Thr (4) 4,10; Tyr (1) 0,80;Ala (1) 1.15; Arg (1) 0.85; Asp (2) 2.15; Glu (3) 3.10; Gly (3) 2.9; His (1) 0.83; Leu (5) 5.3; Lys (2) 1.95; 15 Pro (2) 2.0; Ser (3) 3.20; Thr (4) 4.10; Tyr (1) 0.80;
Vai (2) 2,1; Asu (1) 0,93.Or (2) 2.1; Asu (1) 0.93.
Lyhenteet:abbreviations:
AcOEt = etyyliasetaattiAcOEt = ethyl acetate
Asu = a-aminokorkkihappo 20 Bzl = bentsyyli CHA = sykloheksyyliamiini DCHA = disykloheksyyliamiini • ONP = p-nitrofenyyliesteri ·- OSu = N-hydroksisukkiini-imidiesteri '25 Z = bentsyylioksikarbonyyliAsu = α-amino-cork acid 20 Bzl = benzyl CHA = cyclohexylamine DCHA = dicyclohexylamine • ONP = p-nitrophenyl ester · - OSu = N-hydroxysuccinimide ester '25 Z = benzyloxycarbonyl
Claims (5)
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8519113A FR2592049B1 (en) | 1985-12-24 | 1985-12-24 | NOVEL ANALOGS OF HYPOCALCEMIC POLYPEPTIDE COMPOUNDS SPARING THE CALCIUM OF THE ORGANISM, THEIR PREPARATION AND THE MEDICAMENTS CONTAINING THESE ACTIVE INGREDIENTS |
FR8519113 | 1985-12-24 | ||
PCT/FR1986/000440 WO1987003884A1 (en) | 1985-12-24 | 1986-12-19 | New analogues of hypocalcemic polypeptidic compounds saving the calcium of the organism, preparation thereof, application thereof as medicaments and compositions containing them |
FR8600440 | 1986-12-19 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI873632A FI873632A (en) | 1987-08-21 |
FI873632A0 FI873632A0 (en) | 1987-08-21 |
FI87795B true FI87795B (en) | 1992-11-13 |
FI87795C FI87795C (en) | 1993-02-25 |
Family
ID=9326119
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI873632A FI87795C (en) | 1985-12-24 | 1987-08-21 | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF THERAPEUTIC POLICEPTIDERS |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0232650B1 (en) |
JP (1) | JPH0813838B2 (en) |
AT (1) | ATE48616T1 (en) |
CA (1) | CA1273750A (en) |
DE (1) | DE3667472D1 (en) |
DK (1) | DK436187A (en) |
ES (1) | ES2012456B3 (en) |
FI (1) | FI87795C (en) |
FR (1) | FR2592049B1 (en) |
GR (1) | GR3000279T3 (en) |
IE (1) | IE59489B1 (en) |
PT (1) | PT84011B (en) |
WO (1) | WO1987003884A1 (en) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR920701248A (en) * | 1989-11-08 | 1992-08-11 | 고지마 아끼로 | Peptides, and Methods of Making Cyclic Peptides |
US5364840A (en) * | 1989-12-05 | 1994-11-15 | Vical, Inc. | Synthetic calcitonin peptides |
ES2055665B1 (en) * | 1993-02-03 | 1995-03-01 | Lipotec Sa | PROCEDURE FOR THE OBTAINING OF CARBOCALCITONINE. |
US5962270A (en) | 1996-02-06 | 1999-10-05 | Bionebraska, Inc. | Recombinant preparation of calcitonin fragments and use thereof in the preparation of calcitonin and related analogs |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS51128993A (en) * | 1975-05-01 | 1976-11-10 | Tanpakushitsu Kenkyu Shiyoureikai | Process for preparing new polypeptides |
US4401593A (en) * | 1982-02-12 | 1983-08-30 | Armour Pharmaceutical Company | Glycine - 8 calcitonin |
US4537716A (en) * | 1983-12-05 | 1985-08-27 | Armour Pharmaceutical Co. | Des-serine2 or des-glycine2 -leucine22 calcitonin |
JPS60123500A (en) * | 1983-12-08 | 1985-07-02 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | Novel calcitonin and its collection method |
US4528132A (en) * | 1984-01-13 | 1985-07-09 | Armour Pharmaceutical Company | [16-Alanine]calcitonin |
JPS61112099A (en) * | 1984-11-06 | 1986-05-30 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | Novel polypeptide and preparation thereof |
-
1985
- 1985-12-24 FR FR8519113A patent/FR2592049B1/en not_active Expired
-
1986
- 1986-12-19 ES ES86402871T patent/ES2012456B3/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-19 DE DE8686402871T patent/DE3667472D1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-19 EP EP86402871A patent/EP0232650B1/en not_active Expired
- 1986-12-19 AT AT86402871T patent/ATE48616T1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-12-19 WO PCT/FR1986/000440 patent/WO1987003884A1/en active IP Right Grant
- 1986-12-19 JP JP62500164A patent/JPH0813838B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-23 IE IE338686A patent/IE59489B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-12-23 PT PT84011A patent/PT84011B/en not_active IP Right Cessation
- 1986-12-24 CA CA000526299A patent/CA1273750A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-08-21 FI FI873632A patent/FI87795C/en not_active IP Right Cessation
- 1987-08-21 DK DK436187A patent/DK436187A/en not_active Application Discontinuation
-
1990
- 1990-01-19 GR GR89400311T patent/GR3000279T3/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1987003884A1 (en) | 1987-07-02 |
DK436187D0 (en) | 1987-08-21 |
PT84011A (en) | 1987-01-01 |
FI873632A (en) | 1987-08-21 |
FR2592049A1 (en) | 1987-06-26 |
IE863386L (en) | 1987-06-24 |
PT84011B (en) | 1989-07-31 |
GR3000279T3 (en) | 1991-03-15 |
DK436187A (en) | 1987-10-23 |
FI873632A0 (en) | 1987-08-21 |
FR2592049B1 (en) | 1988-02-12 |
CA1273750A (en) | 1990-09-04 |
FI87795C (en) | 1993-02-25 |
JPH0813838B2 (en) | 1996-02-14 |
JPS63502343A (en) | 1988-09-08 |
EP0232650B1 (en) | 1989-12-13 |
IE59489B1 (en) | 1994-03-09 |
ATE48616T1 (en) | 1989-12-15 |
ES2012456B3 (en) | 1990-04-01 |
DE3667472D1 (en) | 1990-01-18 |
EP0232650A1 (en) | 1987-08-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4606856A (en) | [Des-1-amino, 8-glycine]calcitonin | |
US4537716A (en) | Des-serine2 or des-glycine2 -leucine22 calcitonin | |
FI81589B (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV TERAPEUTISKT ANVAENDBARA GRF-PEPTIDANALOGER. | |
FI87795B (en) | Method for production of therapeutically useful polypeptides | |
US4622386A (en) | [1,7-di-alanine]calcitonin | |
EP0315687B1 (en) | (n-alpha-acyl, 8-glycine, des-19-leucine)-calcitonin | |
EP0606816B1 (en) | Procedure for preparing salmon calcitonin | |
US4659804A (en) | (Bis-1,7-S-acetamidomethyl-L-cysteine)salmon calcitonin | |
US4528132A (en) | [16-Alanine]calcitonin | |
US4632978A (en) | 6-serine, des-19-leucine calcitonin | |
US4639510A (en) | (1-S-acetamidomethyl cysteine, 7-alanine)calcitonin | |
EP0053029A1 (en) | Non enkephalin-like peptides, their production, compositions containing them, and their medical and veterinary use | |
US4820804A (en) | Analogs of [1,7-di-alanine, des-19-leucine]calcitonin | |
US4764590A (en) | Des-19-leucine, 20-glutamine, 21-threonine-calcitonin | |
US4451395A (en) | Des-serine2 -des-tyrosine22 calcitonin | |
US5656723A (en) | Analogues of hypocalcemiant polypeptide compounds sparing the calcium of the organism, their preparation, their use as medicaments and the compositions containing them | |
US4764591A (en) | Des-19-leucine, 20-glutamine, 21-threonine, 22-tyrosine-calcitonin | |
EP0204788B1 (en) | New hypocalcemic polypeptides, preparation thereof and drugs containing these active principles | |
US4639509A (en) | [16,19-Di-alanine] calcitonin | |
US4605515A (en) | Calcitonin-(1-23)-peptide amide | |
US4497732A (en) | 1A-Endo-glycine-calcitonin | |
EP0343577A2 (en) | Des-17-histidine calcitonin | |
US4604236A (en) | Calcitonin analogs | |
US4604237A (en) | Des-21-threonine-calcitonin | |
EP0297159A1 (en) | [N-Acyl, 1,7-Di-Aline] calcitonins, method for their preparation, pharmaceutical compositions and use |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM | Patent lapsed |
Owner name: MILHAUD, GERARD |