FI87577B - Foerfarande foer framstaellning av voert och oel med foerbaettrad filtrerbarhet och/eller laegre viskositet - Google Patents

Description

87577

Menetelmä parantuneen suodatettavuuden ja/tai alhaisemman viskositeetin omaavan vierteen ja oluen valmistamiseksi -Förfarande för framställning av vört och öl med förbättrad filtrerbarhet och/eller lägre viskositet Tämä keksintö koskee parannuksia oluen valmistuksessa, erityisesti, muttei yksinomaan, pohjahiivalla fermentoidun oluen valmistuksessa. Aivan erityisesti se koskee menetelmää vierteen tai oluen suodatettavuuden ja siten niiden saannon lisäämiseksi ja oluen kolloidisen stabiilisuuden parantamiseksi kypsymisprosessin aikana.

Oluita valmistetaan jyvistä, joissa on luonnostaan vähän käymiskelpoisia sokereita. Jyvien tärkkelys täytyy sen vuoksi sokeroida (so. hydrolysoida käymiskelpoisiksi sokereiksi, maltoosiksi ja glukoosiksi) ennen fermentoimista hiivoilla. Ohra sisältää vähän tai ei yhtään amylaasia, mutta idättämisen aikana syntyy suuria määriä amylaasia. Sen vuoksi ohra kostutetaan, sen annetaan itää ja sitten se kuivataan ja säilytetään tulevaa käyttöä varten. Tällaista kuivattua, idätettyä ohraa kutsutaan maltaaksi. Euroopassa käytetään perinteisesti ohramallasta oluen valmistuksessa. Ohran tärkkelyksen sokeroimiseksi käytetään ohramaitaan itsensä sisältämiä tärkkelystä hydrolysoivia entsyymeitä (amylaaseja).

Siten ensimmäinen vaihe oluen valmistuksessa on mallastus. Sitten mallas jauhetaan ja suspendoidaan veteen, jotta tärkkelys edelleen hydrolysoituisi ja käymiskelpoiset sokerit uuttuisivat. Uutteen fermentoitavuuden parantamiseksi voidaan suspensioon lisätä useita tärkkelystä hajottavia entsyymeitä, esimerkiksi alfa-amylaasia, beta-amylaasia, amylo-glukosidaasia ja sivuketjuja katkaisevia entsyymeitä kuten pullulanaasia. Kun sokeroituminen on saavuttanut halutun asteen, seos keitetään entsymaattisten lisämuutosten lopettamiseksi ja sitten se suodatetaan. Suodokseen lisätään huma-lauutetta, joka osittain aikaansaa oluen kitkerän flavorin, ja joka myös toimii säilöntäaineena bakteerikasvun estämiseksi. Humaloitu, suodatettu käymiskelpoisia sokereita si- 2 37577 sältävä uute, jota kutsutaan vierteeksi, on tämän jälkeen valmis fermentointia varten.

Olutkäymisissä vierre ympätään aina voimakkaasti erityisillä hiivakannoilla, jotka ovat peräisin edellisestä käymisestä. Käyminen etenee alhaisissa lämpötiloissa 5-10 päivän ajan. Useimmat oluenvalmistuksessa käytetyt hiivakannat kuuluvat Saccharomvces carlsberaensis- ja Saccharomvces cerevisiae-lajeihin. Käymisen aikana käymiskelpoiset sokerit muuttuvat etanoliksi ja syntyy luonteenomaisia flavoriyhdisteitä.

Käymisen jälkeen suurin osa hiivasta poistetaan ja nuorolut-ta säilytetään varastotankeissa vaihtelevia aikoja, jotta se kypsyisi.

Mikäli panimossa käytetään huonolaatuista mallasta tai osa maltaasta korvataan ohralla tai vehnällä, on tarpeen lisätä vierteeseen beta-glukanaasia ja joskus alfa-amylaasia ja proteaasia vierteen viskositeetin vähentämiseksi ja keitto-saannon lisäämiseksi. Beta-glukaanaasia voidaan myös lisätä olueen varastoinnin tai kylmäsäilytyksen aikana suodatetta-vuuden, oluen kirkkauden ja kolloidisen stabiilisuuden parantamiseksi, jolloin samalla vastaavasti suodatusapuaineita ei tarvita niin paljoa. Beta-glukaanit koostuvat hyvin pitkistä 1,4-beta-D-glukopyranoosiketjuista (70 % sidoksista) ja 1,3-D-glukopyranoosiketjuista (30 % sidoksista). Niiden molekyylipaino on n. 200 000. Beta-glukaanien liuokset ovat hyvin viskooseja, ja beta-glukaanit aiheuttavat sen vuoksi usein suodatusongelmia oluenpanossa. Nykyään Bacillus subti-lis-, Aspergillus niger- ja Penicillium emersonii-organis-meista peräisin olevia beta-glukanaaseja on kaupallisesti saatavana beta-glukaanien aiheuttamien suodatusongelmien ratkaisemiseksi teollisuusmittakaavassa. Ohran ja vehnän ku-miaineosassa on paitsi beta-glukaaneja myös joitakin pento-saaneja. Pentosaanit tunnetaan huonommin kuin beta-glukaanit ja niiden rakenne on monimutkaisempi, koska niissä on pitkiä 3 87577 1,4-beta-D-ksylopyranoosiketjuja ja yksittäisiä 1,2- tai 1,3-alfa-L-arabinofuranoosi-sivuketjuja (suhteessa 1 arabi-noosi kahta ksyloosiyksikköä kohti); katso liitteenä oleva kuvio 1, esittäneet H. Neukom, L. Providoli, H. Gremli ja P.O. Jui, Cereal Chem., 44, 238 (1967).

Pentosaanien ominaisuudet vaihtelevat riippuen peptidien, ferulihapon ja arabinogalaktaanin läsnäolosta tai poissaolosta. Noin 2/3 kokonaispentosaaneista on liukenemattomia suuren molekyylipainonsa johdosta, ja koska ne ovat liittyneet proteiineihin ja muihin aineosiin. Niillä on erittäin suuri vedenpidätyskyky ja niistä saadaan hyvin kuohkeita (suuren tilavuuden omaavia) suodatusjäännöksiä. Kun liukoisten pentosaanien arabinofuranoosisivuketjut hydrolysoidaan, havaitaan substituoimattomien ksylaanien yhteenkeräytyminen ja saostuminen.

Seuraavassa on esitetty eri viljakasvien keskimääräisiä pen-tosaanipitoisuuksia (ks. Handbuch der Lebensmittelchemie, voi. 5, s. 32, 1867, Springer Verlag):

Viljakasvin jyvä Pentosaaneja (% kuivapainosta) - Ohra (kuoret mukaanlukien) 10,3

Vehnä 7,4

Ruis 10,6

Kaura (kuoret mukaanlukien) 7,5

Maissi 6,2

Riisi 2,0

Hirssi 2,0 GB-patenttijulkaisussa n:o 1,421,127 kuvataan menetelmä beta-l,4/beta-l,3-glukanaasiaktiivisuutta omaavan entsyymi-liuoksen valmistamiseksi PeniciIlium emersoniista, ja sitä suositellaan käytettäväksi oluen valmistuksessa vierteen suodatettavuuden parantamiseksi.

4 87577

Coote ja Kirsop [J. Inst Brew., 82, 34 (1976)] esittävät, että tietynlaiset samentumat, joita esiintyy high gravity-oluessa, sisältävät 88 % pentosaaneja.

GB-patenttijulkaisussa n:o 2,150,933 kuvataan pentosanaasi, joka on saatu fermentoimalla Talaromvces (so. Penicillium) emersoniita. Tämän entsyymin esitetään kykenevän katalysoimaan ksylaanin hajoamista ja olevan käyttökelpoinen käymis-kelpoisten sokerien tuoton ja uuttumisen parantamiseksi oluen valmistuksessa ja tietyntyyppisten samentumien estämiseksi ja käsittelemiseksi.

Olemme nyt yllättäen havainneet, että endoksylanaasilla, jota tuottaa sieni Disporotrichum. on erityisen arvokkaita ominaisuuksia aineena, joka parantaa vierteen tai oluen saantoa ja suodatettavuutta.

Disporotrichum. ja erityisesti Disporotrichum dimorphosporum. on kuvattu artikkelissa J.A. Stalpers, Studies in Mycology, 24, 1 (1984).

Tämän keksinnön kohteena on siten menetelmä vierteen tai oluen valmistamiseksi, joilla on parantunut suodatettavuus ja/tai alhaisempi viskositeetti, jossa menetelmässä mainittu vierre tai olut saatetaan Disporotrichum-ksvlanaasin vaikutukselle alttiiksi.

Mieluiten käytetään ksylanaasivalmistetta, joka on peräisin Disporotrichum dimorphosporumista. Hyvin tyydyttäviä tuloksia saadaan, kun käytetään ksylanaasivalmistetta, joka on peräisin Disporotrichum dimorphosporum kannasta ATCC 24562, joka on saatavissa American Type Culture Collection-talletuslaitoksesta, ja joka on identtinen kannan CBS 484.76 kanssa, joka kanta on saatavissa Centraal Bureau voor Schimmelcultures-talletuslaitoksesta (Baarn, Hollanti). Nämä kannat ovat edullisia tämän keksinnön tarkoituksiin.

5 87577

Muita ksylanaasivalmisteita, joita voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisesti, ovat sellaiset, joilla on olennaisesti samat tunnusmerkit kuin ksylanaasivalmisteella, jota saadaan Disporotrichum dimorphosporum kannasta ATCC 24562 (tai CBS 484.76). Tällaisia ovat myös valmisteet, jotka saadaan transformoidusta isäntä-mikro-organismista, joka sisältää geenin, joka koodittaa mainitun Disporotrichum kannan ATCC 24562 (tai CBS 484.76) tuottamaa ksylanaasia.

Tekniseltä kannalta katsottuna endo-tyyppinen entsyymi on yleensä suositeltavampi, koska se hydrolysoi suurimolekyyli-painoisia polysakkarideja hyvin nopeasti. Ekso-tyyppinen entsyymi vaatii enemmän aikaa ja suuremman entsyymikonsent-raation saman teknisen tuloksen saavuttamiseksi.

Yleensä pentosanaasien tai ksylanaasien aktiivisuudet mitataan kaupallisilla substraateilla, joita saadaan lehtikuusen ksylaanista tai kaurankuoriksylaanista ja joiden rakenne on täysin erilainen kuin viljakasveista peräisin olevilla ksy-laanisubstraateilla. Kun entsyymi on saanut vaikuttaa tarkoissa pH- ja lämpötilaolosuhteissa, entsyymiaktiivisuus arvioidaan määrittämällä pelkistävät sokerit. Tällä menetelmällä ei ole mahdollista saada selville onko entsyymi endo- vai ekso-tyyppiä vai niiden seos. Edelleen nykyiset kaupalliset substraatit ovat enemmän tai vähemmän puhdistus-käsittelyissä denaturoituneita.

Disporotrichum-ksylanaasikonsentraatti. joka on sopiva tämän keksinnön mukaiseen käyttöön, voidaan saada seuraavalla tavalla. Fermentointi suoritetaan steriilissä tankissa ja kasvualustassa tunnetulla tavalla. Kasvualusta sisältää selluloosaa, pektiiniä, hiivauutetta ja sopivia suoloja. Se ympätään Disporotrichum dimorphosporum-puhdasvil~ielmällä. Fermentointi suoritetaan vakiolämpötilassa välillä 20°C - 37°C, mieluiten noin 32°C:ssa, ja pH pidetään välillä 3,0 - 6,0, mieluiten välillä 4,0 - 4,5. Fermentointi voi olla joko « 37577 panos- tai jatkuvatoiminen fermentointi. Ksylanaasiaktiivi-suutta seurataan prosessin aikana. Entsyymin tuottoa ei tarvitse välttämättä indusoida lisäämällä ksylaaneja sisältäviä aineita (esim. maissintähkiä tai maissijauhoja), ja sellais-ten aineiden lisääminen yleensä aiheuttaa eksoksylanaasin tuottoa, mikä on keksinnön kannalta vähemmän hyödyllistä.

Kun tarvittava entsyymiaktiivisuus on saavutettu, massa kerätään ja konsentroidaan vakuumissa tai ultrasuodatuksella. Konsentraatti voidaan myydä joko nestepreparaattina tai spray-kuivattuna jauheena. Endoksylanaasi hydrolysoi pento-saaniketjujen 1,4-beta-ksyloosisidoksia.

Puhdistamattoman entsyymituotteen ominaisuuksia on tutkittu viskosimetrisesti substraatilla, joka sisältää ± 1% ksylaaneja (katso liitteenä olevia kuvioita 2 ja 3). Optimi-pH on 4,7, mutta pH-välillä 3,0 - 6,0 on suhteellinen aktiivisuus yli 50%. Optimilämpötila on 55°C, mutta vielä 65°C:ssa yli puolet suhteellisesta aktiivisuudesta on jäljellä. Tämän Disporotrichum-ksvlanaasin puhdistamista ovat tutkineet Com-tat et ai. [J. Comtat, K. Ruel, J.-P. Joseleau ja F. Bar-noud, Symposium on Enzymatic Hydrolysis of Cellulose, SITRA, Helsinki, Suomi, 351 (1975); J. Comtat ja J.-P. Joseleau, Carbohydr. Res., 95 101 (1981)]:

Disporotrichum-ksylanaasia voidaan käyttää oluenpanoproses-sissa muiden lisäaineiden, esim. tavallisten sameudenestoai-neiden (chillproofing agents), esimerkiksi papaiinin, poly-vinyylipyrrolidonin ja parkkihapon kanssa, ja useiden muiden entsyymien kanssa, joita on kuvattu mm. US-patenteissa n:o 3,061,439, 3,095,358, 3,749,582 ja 3,770,454 sekä kanadalaisessa patentissa n:o 743,524. On yllättävää, että ksylanaasi on tehokasta oluenpanossa, koska beta-glukaani-pentosaani-suhde ohran kumiaineosassa (barley gum) on 4:1, mutta tämä saattaa johtua pentosaanien suuremmasta vedenpidätyskyvystä.

Papaiinia, joka on kasviproteiini, käytetään laajalti parantamaan oluen kolloidista stabiliteettia proteiinihydrolyysin 7 87577 avulla. Disporotrichuro-ksvlanaasin lisääminen papaiiniin va-rastotankissa saa aikaan täydentävän vaikutuksen kolloidisessa stabiliteetissa ja parantaa oluen suodatettavuutta. Ksylanaasin lisääminen on erityisen edullista silloin kun mäskissä käytetään vehnää tai ohraa tai kun maltaan laatu on huono.

Disporotrichum-ksylanaasi näyttää soveltuvan käytettäväksi oluen valmistuksessa paremmin kuin muut ksylanaasit. Kun verrataan esimerkiksi Trichoderma- ja Disporotrichum-ksylanaasia, niiden tehokkuudessa viskositeettikokeissa on suuri ero, jolloin Disporotrichum-ksvlanaasi on ylivoimainen.

Ksylanaasilla (pentosanaasilla), joka on kuvattu GB-patentti-julkaisussa n:o 2,150,933, esitetään olevan optiroiaktiivi-suus kauran kuoren ksylaania vastaan 87 ± 2 °C ja säilyttävän 50 % alkuperäisestä aktiivisuudestaan, kun sitä oli kuumennettu 95 °C:ssa kuusi minuuttia pH:ssa 5,0. Näin voimakasta lämpöstabiilisuutta ei toivota entsyymille, jota käytetään oluen valmistuksessa fermentointivaiheessa, koska se tarkoittaa sitä, että entsyymi ei olennaisesti denaturoidu oluen normaalin pastörointiprosessin aikana. Disporotrichum-ksylanaasi kuitenkin denaturoituu lähes täydellisesti näissä olosuhteissa.

Disporotrichum-ksvlanaasia voidaan lisätä beta-glukanaasi-entsyymiliuoksiin niiden ominaisuuksien parantamiseksi. Disporotrichum-ksylanaasin lisääminen aikaansaa parannetun vaikutuksen vierteen ja oluen viskositeettiin, uutepitoisuu-teen ja suodatettavuuteen. Pienentämällä vierteen viskositeettia ja jäännösmäskin (spent grain) vedenpidätyskykyä Disporotrichum-ksvlanaasi mahdollistaa panimon kapasiteetin lisäämisen tuottamalla vahvempia panimotuotteita.

Erityisesti kun panimossa käytetään vehnää tai ohraa (joissa pentosaanipitoisuus on suuri), Disporotrichum-ksylanaasia 8 B7577 voidaan käyttää ratkaisemaan vierteen ja oluen suodatetta-vuuteen liittyviä ongelmia.

Penicillium emersoniista peräisin olevalla ksylanaasilla (GB-patenttijulkaisu n:o 2,150,933) on samantyyppistä viskositeettia vähentävää aktiivisuutta kuin Disporotrichum-ksylanaasilla on osoitettu olevan, mutta P. emersonii-ksylanaasin aktiivisuustaso on paljon alhaisempi (tavallisesti n. 10 - n. 40 % Disporotrichum-ksvlanaasin aktiivisuudesta) . Kuitenkin tästä alhaisemmasta aktiivisuudesta johtuen Disporotrichum-ksylanaasin lisääminen P. emersonii-entsyymiliuokseen parantaa tuotteen tehokkuutta. £. emerso-nii-ksylanaasi on lämpöstabiili (optimilämpötila 85-87 °C), mutta beta-glukaanit ja pentosaanit vapautuvat vierteeseen vain noin 65 °C:ssa, kun tärkkelys gelatinoituu. Tässä lämpötilassa Disporotrichum-ksvlanaasi säilyttää yli 50 %:n jäännösaktiivisuuden, mikä on riittävä hydrolysoimaan loput pentosaanit, jotka vapautuvat tässä lämpötilassa. Lisäksi 85 °C:n lämpötilaa ei milloinkaan käytetä panimoprosessissa, jonka lämpötila ei koskaan nouse yli 76 °C:n.

Disporotrichum-ksylanaasin toiminta panimossa vaikuttaa oluen suodatettavuuteen, mutta kun Disporotrichum-ksylanaasia ei ole käytetty panimossa, on vielä mahdollista lisätä sitä varastotankkiin ilman beta-glukanaasia tai sen kanssa oluen ·. suodatettavuuden parantamiseksi ja tästä seuraavien säästö jen saavuttamiseksi (esim. työ, suodattimet, häviöt jne.). Disporotrichum-ksylanaasia voidaan tietenkin käyttää sekä . panimossa että varastotankissa. Näin valmistettu olut tarvitsee vähemmän painetta suodatuskierron aikana, on kirkkaampaa suodatuksen jälkeen, ja sillä on parantunut kolloidinen stabiilisuus. Näyttää vaikealta käyttää Penicillium emersonii-ksylanaasia varastotankissa, koska se ei inakti-voidu oluen normaalissa pastöroinnissa.

Disporotrichum-ksvlanaasi11a käsitellyn oluen kolloidinen stabiilisuus on tutkittu alkoholijäähdytyskokeella. Bacillus 9 87577 subtilis-bakteerista peräisin olevan beta-glukanaasin lisäys ylimäärän kanssa papaiinia (annos, joka ylittää määrän, joka aikaansaa maksimivaikutuksen stabiilisuuteen) varastotank-kiin ei muuta oluen kolloidista stabiilisuutta verrattuna pelkän papaiinin lisäämiseen. Kuitenkin jos Disporotrichum-ksylanaasia lisätään papaiinin ylimäärän kanssa, oluen minimi-sameusarvo vielä alittuu.

Disporotrichum-ksvlanaasin edulliset ominaisuudet ovat myös hyödyllisiä valmistettaessa vaaleata olutta pintahiivan avulla.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä. Esimerkeissä endo-ksylanaasin aktiivisuusmääritys, jota käytettiin, ellei toisin mainita, suoritettiin seuraavalla tavalla.

Endoksvlanaasin aktiivisuuden määrittäminen

Analyyttinen menetelmä on johdettu esimerkissä I esitetystä menetelmästä.

A. Periaate

Menetelmä perustuu entsyymin viskosimetrisen aktiivisuuden mittaamiseen luonnollisella rukiin pentosaanisubstraatilla.

Spesifisen viskositeetin käänteisarvon (1/nS) vaihtelu entsyymin vaikutusajan suhteen tekee mahdolliseksi määrittää näennäisen kinetiikkavakion, joka on verrannollinen entsyy-mipreparaatin spesifiseen aktiivisuuteen.

B. Välineet

- Vesihaude 42 °C ± 0,1 °C

- Kapillaariviskosimetri, jonka virtausvakio on lähellä 0,03:a - Ubbelohde-viskosimetri n° IC tai Prolabo-viskosimetri 10 37577

tyyppiä UF

- kaksi sekuntikelloa - suodatin - pH-mittari - sentrifuugi C. Reaaenssit

Cl. Pentosaanisubstraatti Tämä substraatti uutetaan ruisjauhoista (tyyppi 170, Ranskan lainsäädännön mukainen, "harmaajauholaatu").

Tämä ruisjauho valittiin, koska sillä on - suuri viskoosisten pentosaanien konsentraatio (Drewsin menetelmän mukaisesti, ks. esimerkki I) - alhainen luonnonpentosanaasiaktiivisuus

Valmistetaan liete, jossa on 300 g ruisjauhoja ja 1 litra tislattua vettä 42 °C:ssa, ja sitä sekoitetaan 30 minuuttia tässä lämpötilassa. pH säädetään arvoon 10,0 lisäämällä NaOH:a ja pidetään tässä arvossa 2 tunnin ajan tässä lämpötilassa. Tämän pH-käsittelyn tarkoituksena on inhiboida luonnollinen pentosanaasiaktiivisuus muuttamatta substraatin ominaisuuksia. Kun on pidetty 2 tuntia pH:ssa 10,0, pH säädetään arvoon 4,70 etikkahapolla. Liukenematon osa erotetaan sentrifugoimalla ja/tai suodattamalla. pH korjataan 4,70:aan mikäli tarpeen. Tätä substraattia säilytetään pakastettuna 100 ml:n erissä muovipulloissa.

C2. Entsyymi1juokset

Entsyymituote laimennetaan vedellä kunnes liuos sisältää 6-15 ksylanaasiyksikköä millilitraa kohti. Liukenemattomia aineita sisältävät liuokset suodatetaan ennen käyttöä.

11 37577 D. Mittaus

Viskosimetriä tasapainotetaan 42 °C:n vesihauteessa vähintään 30 minuuttia ennen mittausta. Putki, joka sisältää täsmälleen 20 ml substraattia, pannaan hauteeseen ja odotetaan kunnes lämpötila on vakio. 2 ml entsyymiliuosta lisätään nollapisteessä, josta lähtien otetaan aikaa ensimmäisellä sekuntikellolla, sekoitetaan ja siirretään viskosimetriin tarvittava määrä. Seoksen viskositeetti mitataan kolmen minuutin kuluttua, sitten joka kolmas minuutti noin 15 minuutin ajan.

Liuos vedetään ylempään säiliöön ja liuoksen annetaan valua alas; heti kun nesteen pinta saavuttaa ylemmän merkin, käynnistetään toinen sekuntikello ja luetaan samalla hetkellä ensimmäisen sekuntikellon lukema T.

Heti kun nesteen pinta saavuttaa alemman merkin, toinen sekuntikello pysäytetään ja merkitään muistiin aika Δt sekunneissa, mikä osoittaa ajan, jonka kuluessa neste valuu ka-pillaariputken läpi. Toinen sekuntikello käynnistetään uudelleen ja At-määritys toistetaan eri T:n arvoilla, kuten edellä esitettiin.

Kustakin määrityssarjasta määritetään minimiviskositeetti, joka vastaa entsymaattisen reaktion loppua, antamalla substraatin ja entsyymiylimäärän reagoida substraatin kanssa koeolosuhteissa (Atm).

Edelleen määritetään AtO, joka vastaa 20 ml:n substraattia ja 2 ml:n vettä viskositeettia. Tämän arvon stabiilisuus tarkistetaan kunkin analyysin kuluessa.

Sama analyysi suoritetaan standardientsyymipreparaatilla.

12 37577 E. Laskeminen

El. K-vakioiden määrittäminen

Kullekin määritykselle ja standardille lasketaan kunkin mittauksen aika (t) sekunneissa At t = T + 2

AtO - Atm kullekin t:lle lasketaan suhde I/nS = At - Atm

Koordinaatistoon merkitään peräkkäiset t:n arvot vastaan vastaavat I/nS:n arvot. Piirretään käyrä, jonka pitäisi olla suora viiva, ja määritetään tämän viivan kulmakerroin K (sekuntia-1), joka otetaan näennäiseksi kineettiseksi vakioksi.

E2. Aktiivisuuden laskeminen Ksylanaasistandardille saadaan - vertailuaktiivisuus As (ksylanaasiyksikköä/g) - määritetyn liuoksen entsyymikonsentraatio Cs (g/1) - näennäinen kineettinen vakio Ks

Tuntemattomalle mitattavalle ksylanaasille saadaan - määritetyn liuoksen entsyymikonsentraatio Ce (g/1) - näennäinen kineettinen vakio Ke

Lasketaan tuntematon aktiivisuus verrattuna standardiin:

Cs Ke aktiivisuus = As x Ce x Ks = ksylanaasiyksikköä/g tai ml.

13 B7 577

Esimerkki I

Disporotrichum dimorphosporum-. Trichoderma- ia Aspergillus niqer-peräisten ksvlanaasien endoksvlanaasiaktiivisuuden vertailu Drewsin menetelmällä

Endoksylanaasiaktiivisuus määritettiin Drewsin ja Weipertin esittämällä menetelmällä [Die Miillerei, 15, 369 (1970)]. Tällä tavoin määritetty aktiivisuus näytti olevan hyvin sopusoinnussa ksylanaasin teknologisten vaikutusten kanssa oluenpanossa.

Valmistettiin dispersio, jossa oli 150 g harmaita ruisjauhoja (tyyppi 170) 350 ml:ssa vesijohtovettä, 42 °C:ssa. Liete pantiin Brabender-viskosigrafin maljaan, lämpötila pidettiin 42 °C:ssa. Viskositeetin stabiloitumisen jälkeen viskosigra-fiin pantiin entsyymiliuos, joka sisälsi 60 ksylanaasiyksik-köä, mitattuna pelkistävien sokereiden avulla suoritetulla määrityksellä. Kun entsymaattinen hydrolyysi oli tapahtunut 10, 20 ja 30 minuuttia, viskositeetin alenemisen prosentuaalinen määrä mitattiin.

42 °C:ssa tärkkelys ei gelatinoitunut eikä alfa-amylaasilla ollut mitään vaikutusta. Osoitettiin myös, että amylaaseil-la, proteaaseilla ja beta-glukanaaseilla ei ollut merkittävää vaikutusta.

Viskoosina substraattina on mahdollista käyttää nestemäistä fraktiota, joka saadaan, kun ruisjauhodispersio sentrifugoi-daan. Brabender-viskosigrafin sijasta voidaan silloin käyttää Ostwald-tyyppistä viskosimetriä. Nämä kaksi menetelmää antavat samanlaiset tulokset (vrt. menetelmä, joka on kuvattu sivulta 10 alkaen).

Kuviot 4, 5 ja 6 esittävät Aspergillus-. Disporotrichum- ja Trichoderma-ksvlanaasien vaikutuksen samaan aktiivisuusyk- 14 87577 sikkömäärään, mitattuna pelkistävien sokerien avulla suoritetulla määrityksellä (tavanomainen menetelmä).

Kuvio 4 osoittaa, että Asperaillus-ksvlanaasilla ei ollut mitään vaikutusta pentosaaniviskositeettiin, joka pysyy stabiilina ajan funktiona. Tämä tuote sisältää ainoastaan ekso-ksylanaasia.

Kuvio 5 osoittaa Disporotrichum-ksvlanaasin vaikutuksen, jolle on tyypillistä jatkuva viskositeetin aleneminen ajan funktiona. Tämä käyrä on tyypillinen endoksylanaasiaktiivi-suudelle.

Kuvio 6 osoittaa Trichoderma-ksvlanaasin vaikutuksen: nopea viskositeetin aleneminen ensimmäisen 1-2 minuutin aikana, jonka jälkeen viskositeetti pysyy stabiilina loppuajan. Tämä käyrä on ominainen tällä entsyymillä esiintyvälle steerisen esteen aiheuttamalle inhibitiovaikutukselle.

Talaromvces emersonii-ksvlanaasilla on samanlainen tyypillinen käyrä kuin Disporotrichum-ksvlanaasilla. mutta ksylanaa-siaktiivisuuden taso on dramaattisesti alhaisempi Talaromvces-entsvvmin kaupallisilla tuotteilla (50-150 endo-ksylanaasiyksikköä/ml lisättynä Glaxon kaupalliseen beta-glukanaasiin).

- : Esimerkki II

Disporotrichum- ia Trichoderma-peräisten ksvlanaasien ksvla-naasiaktiivisuuksien vertailu eri substraateilla ia eri menetelmillä 15 37 577

ANALYYTTISET MENETELMÄT AKTIIVISUUSSUHDE

Trichoderma-ksylanaasi/ Disporotrichum-ksylanaasi

Reduktimetrinen aktiivisuus maissintähkän ksylaaneihin 21,8

Viskosimetrinen menetelmä

Brabender-viskosigrafilla noin 6

(Drews) - täydellinen ruis-substraatti, ks. Esim. I

Viskosimetrinen menetelmä

Ostwald-viskosimetrillä - noin 9 liukoinen ruissubstraatti, ks. menetelmä s. 10

Viskosimetrinen menetelmä

Ostwald-viskosimetrillä - 3,4 - 15 alkoholisaostuksella puhdistettu ruissubstraatti

Viskosimetrinen menetelmä

Oswald-viskosimetrillä - 31,5 etukäteen 20 min. 90 °C:ssa kuumennettu liukoinen ruissubstraatti

Ensimmäinen analyysi suoritettiin maissintähkän ksylaaneilla monosakkaridimäärityksenä reduktimetrisesti. Tässä tapauksessa mitattiin sekä ekso- että endoksylanaasiaktiivisuudet. Trichoderma-ksylanaasien aktiivisuutta on vaikea arvioida käyttäen Brabender- tai Oswald-viskosimetriä, koska tulokset olivat suuresti riippuvaisia käytetystä entsyymikonsentraa-tiosta. Tämä viittaa inhibitiovaikutukseen.

ie 87577

Etanolilla saostettujen ruisksyläänien käyttö puhdistettuna substraattina ei muuttanut tuloksia. Lisäksi osoitettiin myös, että useiden proteaasien vaikutus ei muuttanut liukoista substraattia eikä myöskään inhibitiovaikutusta Trichoderma-ksylanaasiin. Liukoisen substraatin kuumentaminen kuitenkin edisti 65 % proteiineja ja 35 % hiilihydraatteja, pääasiassa ksyloosia, arabinoosia ja glukoosia sisältävän liukenemattoman aineksen saostumista. Tällä kuumennetulla liukoisella substraatilla saavutettiin Disporotrichum-ksylanaasin aktiivisuuden paraneminen viisinkertaiseksi ja Trichoderma-ksylanaasin 20-kertaiseksi. Siten inhibitiovai-kutus on tärkeämpi jälkimmäisellä ksylanaasilla.

Esimerkki III

Ksylanaasien vaikutus vierteeseen laboratoriomittakaavassa Olosuhteet Käytetään huonolaatuista mallasta, so. mallasta, jolla saadaan matala uutepitoisuus ja huono suodatettavuus panimo-.. teollisuudessa, koska siinä on paljon ei-hajonneita beta- glukaaneita ja hemiselluloosia.

Mallas jauhetaan EBC MIAG-myllyllä "lauter tun"-suodatuksen standardivaatimusten mukaisesti.

Standardi panimoprosessi:

Yksi osa mallasta kostutetaan kolmella osalla vettä 50 °C:ssa (huomioitava kunkin kokeen lähtöpaino). Tätä lämpötilaa ylläpidetään 20 minuutin ajan.

Kuumennetaan 63 °C:seen 1 °C/min. Tätä lämpötilaa ylläpidetään 30 minuutin ajan.

it 87577

Kuumennetaan 72 °C:seen 1 °C/min. Tätä lämpötilaa ylläpidetään 20 minuutin ajan täydellisen sokeroitumisen saavuttamiseksi (keltainen väri jodikokeessa).

Kuumennetaan 76 °C:seen. Tätä lämpötilaa ylläpidetään 5 minuuttia .

Kunkin kokeen paino tarkistetaan ja lisätään vettä lähtöpai-non saavuttamiseksi (veden haihtuminen). Maski kaadetaan suodatusta varten suppiloon, jossa on Schleicher-Schiillin suodatinpaperi (EBC). Suodatetun vierteen tilavuus ajan funktiona mitataan. Tämän arvon avulla voidaan laskea uute-pitoisuus ja saanto.

Vierteen viskositeetti mitataan kapillaariviskosimetrillä 20 °C:ssa. Suurimolekyylipainoiset beta-glukaanit määritetään 30 %:isella ammoniumsulfaatilla saostamisen jälkeen. Sakka pestään alkoholilla ennen happohydrolyysiä ja glukoosimääritystä orsinolireagenssilla.

Jäljempänä olevissa taulukoissa esitetty ksylanaasiaktiivi-suus on mitattu viskosimetrisellä menetelmällä, joka on kuvattu alkaen sivulta 10.

a) Disporotrichum- ja Trichoderma-ksylanaasien vertailu

Tulokset on esitetty taulukossa 1. Nämä kokeet osoittavat selvästi Disporotrichum-ksylanaasin paremman tehokkuuden verrattuna Trichoderma-ksylanaasiin. Katso myös selitykset esimerkeissä I ja II.

ie 87577 \ ω

• fO

Cfi I—I ό y h O' m . >ifO ft t" co oo r» Γ' ,n E co in VO r- o IS 1C I · « to £ g1 Π3 -1 g n ___ (0

H I

>1 \ ω m ft 'J3 _ I λ; <-t O' co (0 (Ö ft co o O' i" r- r- E e cortvovor- o

P O G . <N

II ΙΛ Olli ft

Ό (N ,* 4J

0 -------

Ä I

0 \ (0 •H · (0 *· in ft 00

E"1 ,y ft O' (N

>, in Oinvovoco r- CO

g ro in vo Γ" O ·

in . <N

<N σι c3 ft

,- r-i X +J

0 -Fl----- M ω M (0 (0

3 <0 P

ft G \ Ul 3 (0 · (0 fO ft (Λ ft VD ft tn >, ,Y ft m O' CO co vo O in m >, (0 ^ Λ ® O H CO ·

ME ft ft o <N

1 o E O CJ1 Ή

3 tn M

A____

O

• ·Η I

M \ ω P * (0 0 ω ft 00 r> g ,γ ft ^ σI o o O' in 0 >i<0 m m ό oo O' r~ .

ft E o <n o o H 0 01¾ Ή Q ft ,υρ _ " (0

rH

•Η Ή

P P

H p

p 3 G G G G C <U

G p ft ft ft ft ft I <1) -—- G ft ,ρ EEEEE ω Ρω <U O 0) G ft ft \ ω ω +j cM^iocootDnJO to <o p >1 3 ft <D G G Oft p’-i ό ω ^ ,γ -η ·η ,γ £ 0(0 o 3 ft ft £(0 ω^ •H G 3 3 E :(0 Ο ft ·Η >3 (/!>'-' τι > 19 87577 b) Vierteen suodatettavuutta lisäävien erilaisten beta-glukanaasia sisältävien kaupallisten tuotteiden vertailu, Disporotrichum-lcsylanaaseja joko lisätty tai ei

Kolmen kaupallisen, beta-glukanaasia sisältävän tuotteen vaikutusta vierteen suodatettavuuteen verrattiin sellaisen preparaatin vaikutukseen, jossa oli yhtä näistä ja lisäksi Disporotrichum-ksylanaasia. Tulokset on esitetty taulukossa 2.

Nämä kokeet vahvistavat Disporotrichum-ksylanaasin paremman vaikutuksen vierteen viskositeettiin, uutepitoisuuteen ja suodatettavuuteen. Glaxon beta-glukanaasivalmisteella saadut suhteellisen hyvät tulokset johtuvat siinä olevasta ksyla-naasiaktiivisuudesta (165 u/g).

20 97577

E

' 3 § « <0

ίν N. ·γΗ I

P Ui ·Η 0^ *"{ W

J rj ui n) O n ΐ m m 3 O (Λ <ji in r-~ ιο io r» G iti Pc ncoocMHt ^33^^3 *-4 <-i ι-t O cm

* -n o a M <N

rH 3 .H VO oi >, • -h -h "dm 0 en m + Q λ; > 3 '

(0 -h - P

P w gS 0) 0) M « no

β) (ti -vl 3 ·Η -H a) CM

Ρ^.Η'-Ι'-'ΟΌ cm r- o o Oi e m h τί (fl (N n m no vo o n <#> (¾ m -h -p o <n λ G o ä o -· 3 ij « 3 3 • m rH cQ tn aa O (J1 -H ·—' _ <4-1_______ 1 « r^

3 (ti 3 -P

p -h e h o Φ « >i Ή <|) ί ιί N Ή ·Ρ 'Vt <n (tiiocr^do von <#> 3 Ό 3 3 Ό <n vo (M . n

O 3 C il) 4) e cm n in \0 O

Λ3 rH A! -H Λ 0> -rl cm n λ: . 3 k· n -h 3

3 O rH O < e O

i—I tji -— 3 ------_ . . 3

Eh I E Λ

«O 3 - O

O' 3 -rl -H X

0) *H rH Ή dj

£ in rH e rH

3-300 vo CO

<#>3o« m r- oo <r> r- . oo 3-3 3 IN t}* in VO O ·

rH (ti e Φ CM CN

• -* Φ E

O 3 0u (D

* · (—I -*—-·

Cn i i

rH i—I

>1 O VO

in Sh ^ oo P P m in ffi <f ®i .in 3 3 rH <n cm n n o · <D O cm n ... Ai 3

•H -H *rH

0) e rH

(ti

i—I

I -h m -h - ' 3 -p 3 4-*

3 3 -P

rt 2 cccfiC “ o» rt P -3 -3 -rl -rH -h Jjj d j*} e -h -p esEee^Oo p QJ+J CU eKCCC0)4->o H10 CU 3 -P CM it VO CO O'* P rH “ \ P H 3 ,-,Ή Oi ^ O (0 30 Ό 3 ;:d <D «I * cl 0) in 03_j (—i P tn e} -rl >i 33p 3 -H w > rH en > e, 3 > 2i 87577 c) Erilaisten vierteen suodatettavuutta parantavien valmisteiden välinen vertailu: Bacillus subtilis-beta-glukanaasin ja Disporotrichum-ksylanaasin seos, Penicillium emersonii-beta-glukanaasi ja Penicillium emersonii-betaqlukanaasin ja Disporotrichum-ksylanaasin seos 1) Vierteessä on 100 % Menuet 81-mallasta Stella Artois-panimosta. Tulokset on esitetty taulukossa 3.

2) Vierteessä on 100 % mallasta "Enfants de Gayant"-panimosta. Tulokset on esitetty taulukossa 4.

Yhdistelmillä Penicillium emersonii-beta-glukanaasi + Dispo-rotrichum-ksylanaasi ja Bacillus subtilis-beta-glukanaasi + Disporotrichum-ksylanaasi saadaan suunnilleen samanlaiset tulokset.

3) Vierteessä on 60 % Menuet 81-mallasta (Stella Artois-panimo) + 40 % Menuet 82-ohraa. Tulokset on esitetty taulukossa 5 .

Jos taulukon 5 tuloksia verrataan taulukoiden 3 ja 4 tuloksiin, käy selvästi ilmi, että mäskissä käytetystä ohrasta johtuva suurempi viskositeetti pienenee kaikkein tehokkaimmin, kun käytetään Disporotrichum-ksylanaasia.

22 87577 ε

·Η M S

•η ^ en ο £ « > ΐ ·Η

Ο £ 3 Ρ UJ

® ra ^ £ ra 00 CO rf m P .V ° O rö ^ ro r-( 00 VO o 0) ^ m μ c <—I (N M 00 (M M 00 · . . 00

E H h O d · Ό (Tl -H 't VO o O m (N (N

Φ (j, A O 1—li—I «—I · (NOO

. . + “ £

^IdL- ° -V

p 'H

5 (0 3 ra •H ·Η (0 Ή -H e <#> r—I 00 I— h e πτ -—- <-h (N <f N co Φ n O o r~ o •HOAiO · ie ffi o m in 00 · . ·νο

O O 3 X O r-t rH rH O OrocNVO

•H M rH (0 · (N 00

C ft) ΪΤ1 rH rH

® E I O

a- 0) I "

•H

tn P , <K> if tn 1—1 ΟΟΟΟ’Ί·^· ro 3 0¾ · o ^ ^ o ^ n 1-1 00 Ό (n P t ra o ie 00 h vf in 00 . . . r-i

0 OO C H rl rl O O n (N (N

x o a g 13 · (n co

Λ0 ^ « 3 rH

3 -H jc S1

rH Q U M

3 tn

ra O + I

H 0) ® .

tn -H yj «H (U c#> •h j3 in m -p 5 o (n m 00 vo \ X) jy . O <* CN v* (N n O rH «O o 333 o vo 00 >-h n un co · · . vo

®rH rH rH rH O OCOtNCN

o en · (N 00

0-1 rH

en ffl|<£^r

I I

>1 rH

>1 O η- un vo ·<* un

WP (N Φ VO rH O

-p -p (NonuncNOO

cc <N un vo r- 00 o <n w ro

O · <H 00 rH

X (0 rH

•H ·Η *H

o e h

|0—N

L en m r-'

^ \ rH

3 o ~ ^ 3 ^ o op a en ^ O υ rH -r E £ 3 e e e e e 3 o en <o K * -C -H -H -H -H -H _ 5 (N W ’ a m m e e e e e£ g· ^ * $ e a) 0) (Λ CJ +J ia -P (N vf iD 00 O® H · O -H (Ö Ό rH·* (0 o -P w 4s

Ticn^ ^ e γη n e 9 fL

2 2 ή ^ « 1 si3 e e g -r-ι g 3 ra -r+iH 1 ^ W >*_ o D UI >+J oa --- 11 i 23 37577

λ I I i I i I

p <o P m + o g

*H Qi R

•h to ί o m oo vo

C -H ft1 <#> CO CO 0C N « ^ ON <H VO O

O-hQÄ iH h h in CO O' CD · · · 'O’ n W I · I—IfHrHrHO O CM ON O'

^ 2 ¢1 E o · CM CO

® g a ή

E 3 3 ,C

ο> μ υ d Ο ·Η • m μ

Οι I I I—I +J

_CO__________

E

•H -rl m

rl -rl (Ö <#P 00 Ό r-l 00 O

·—I C — IH ^ 00 'ί <N OO O' O' 00 P~ •H o S O · in p* o cm oo 00 · · · in

CJOlSXO H H H O O' O CM

•rl ll 3 β · <—I 00 <—I

C φ Ή r-1 γΗ β) g Τ' ϋ * <u ck~________ TCt •H 5 tji M M <#> CN P' CO P- "v. .p >, i—i o oo m oo vo cm n vo m ^ äo ö>h . oo h m p σι co · · .σ' ρ o p—i ή .n i-ι o o m m m o O o · cm ω ΐ o o E >-1 x 'tms ,2 -Hi

^ Ω U

to ω EH O o. gj αι Ύ .2 w * '53 * •rl a m ''t o CN O' σι +» ro O 00 O CM Tf CM ro iH in Ό o n ä c · vo o m in p* oo « · · ^ 3 3 d o i—i »h e-1 i—i o o >h cm ro n -S · cm 00 O nH >“· O · ijl co m, i oa_____________

I I

>1Γ-Η m2 m O' VO o o

rJ2 cm o ro ro cm co^tCMO

ti t; n m vo p oo oo ...in m n O O' O en 3d ‘ - 00 "

. . *H *H -H

® EH

* " 5 d 'J O r-. « ^ o O <#P 0. O' ^ n o rH ^ e ε o c c c c c .5 o o» · 5 a> E E E E Ec in i $ d " « * 00 ” *0 Λ d o «-h | ö in _ λ: d S Cu d -P o -P -¾

Q3 . ή c iJ, din c ^i-p R

d d £ ciö *h -ph nj ω a> tn in > ** -n E d o d -ri o» | _ O |d -P | tn >p | m , 24 87577

o S

+ u 2 0 5 •H Λ ,Η d H -H * S I» n ΜΉ g nJ Q D*Otn „ » nj I in ^ O 00 h c D1 E O^fnmo <d £ d o o n oo oo co · · . σ'

E V 3 ,C Ή O' ·νί P- O' O O O' <N CS CD

0> >] U · rH rH r-H CN . rH CD

r—I O ·Η O Ή rH

·, &.«Λ ^ cu I ^ <-η -P

-H - 1 ——— - —-----—

K CO

3 OS

•H -rl (fl

Ή·<Ηβ OOOO'O'O

rHCtO'-' «N» O O O 00 Ό CO O' CO VO O

-rl O ,y O Ή CO N ΙΟ νβ N P~ · . . 00 υ ω 3 x · ^H^Hr-irHo co σ' m

•H U rH (0 O · rH Γ- (S

C «I U.H I—(

0) E L O

(O φ

1 I

•rl (0-H

O' Sh i—i en de vo pivoin X +J >,nj rH CN VO O O 't O *t rt tf) a\ 1/1 3 O imi) · » ^ 00 o n 00 · · »m

_ U M C O H H N N o O' (N CM VO

; O O O I · rH CO

; · ^ O a E M

q Ί· o) 3 ·*:·. ,3 -h ,c ... f-] Q n 3 tn w u

<0 O

· · H Q) j. m -h co T *3 en •:- £ ns & •h JS m p- vO vO f" O' +> 3 O 00 00 O 10 vD O' (N n VO o - e -n. β . p» rH m ρ~ oi p~ . · . τ*

3 D -q O rHrHrHrHO O'lHCNOO

." · . m 75 · rH CO

° n, "< O · ? m «I ck__

I I

° cm vO p~ o

VO -If O CO rH

S 7 H 00 P 10 O pr ...O' t! q n vf m io p o co co ro §o : -4 ^ ^ .·.·. Dc: ns ^ r . . «H ·Γ*ί ·Η OS grH__________ • - - /*s 1 O' ω

• *3 ^ rH

·.. · ^ O r-. (0 \ T: n ~ o «*p Cu en 9 U rH -r g e : : ^ 5 · ^ w ^

2 CCGCfiTjoO'™ I

·:-· S E e ett ~ « 1 flJJS

0)EEtEEco>-icn^-H £ (N vf vO CO O t* UV ° O+J § 33~ S S M g « i 0 3° “ US £ 25 37577

Esimerkki IV

Oluen kolloidisen stabiilisuuden parantaminen Disporotrichum-ksylanaasilla

Suodatetun, käsittelemättömän oluen kolloidinen stabiilisuus määritettiin laboratoriomittakaavassa samoissa olosuhteissa käyttäen alkoholijäähdytyskoetta, jonka ovat esittäneet M. Moll, V. That, A. Smith ja M. Parisot, J. Amer. Soc. Brew. Chem., 3A, 187 (1976): tietty määrä taulukossa 6 spesifioitua entsyymiä pantiin pienessä tilavuudessa pulloihin. Ent-syymiliuos kiinteytettiin,jotta vältettäisiin laimentuminen olutta lisättäessä. Pullot suljettiin heti oluen lisäämisen jälkeen hapettumisen estämiseksi. Pulloja varastoitiin viikon ajan huoneenlämmössä ja entsyymikäsittelyn tehokkuus alkoholi jäähdytyskokeessa mitattiin. Mitä alhaisempi EBC-sameusarvo, sitä tehokkaampi entsyymituote. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 6.

26 87577

Taulukko 6

Papaiini- Sameusarvo (sameusmittari) konsentraatio E.B.C.-yksikköä NF-yks./Hl ____ pelkkä. papaiini + papaiini + papaiini + papaiini 1500 u/Hl 1200 u/Hl 3000 u/Hl B.subtilis Disporo- Disporo- β-gluka- trichum trichum naasi ksylanaasi ksylanaasi 6100 10,5 10,4 9,8 7,8 9200 3,6 3,7 3,9 2,3 12200 2,1 3,1 0,6 0,8 18400 1,9 2,5 0,4 0,6 (u = units = yksikköä)

Pienin sameusarvo, joka saatiin ylimääräannoksella papaii-nia, pieneni vielä, kun Disporotrichum-ksylanaasia käytettiin papaiinin lisäksi.

Claims (5)

27 87577

1. Menetelmä parantuneen suodatettavuuden ja/tai alhaisemman viskositeetin omaavan vierteen ja oluen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että mainittu vierre tai olut saatetaan alttiiksi Disporotrichum dimorphosporum -ksylanaasin vaikutukselle.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että mainittu ksylanaasi on peräisin Disporotrichum dimorphosporum ATCC 24562:sta.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitulla ksylanaasilla on olennaisesti samanlaiset ominaisuudet kuin ksylanaasilla, jota saadaan Disporotrichum dimorphosporum ATCC 24562:sta.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vierteeseen tai olueen lisätään myös papaiinia.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mallastamatonta vehnää tai ohraa käytetään vierteen tai oluen valmistuksessa. 28 87577