FI82265C - Alstring av aromatiska foereningar i bakterier. - Google Patents

Description

1 82265

Aromaattisten yhdisteiden muuttaminen bakteereissa Tämä keksintö kohdistuu indigo-väriainetta tuottavaa proteiini-systeemiä koodaavaan DNA-sekvenssiin sekä menetelmään, jolla saadaan aikaan aromaattisten yhdisteiden, kuten indolin ja naftalee-nin derivatisointi bakteerisolussa.

Indigo on yksi yleisimmin tunnetuista väriaineista, jota esiintyy luonnossa useissa kasvilajeissa. Aikaisemmin indigoa saatiin kasveista uuttamalla, mutta nykyään synteettinen indigo on suurelta osin korvannut kasviperäisen tuotteen. Paitsi synteettisesti, indigoa voidaan tuottaa nykyään myös mikrobiologisesti. US-paten-tissa 4 520 103 on kuvattu indigo-väriaineen mikrobiologinen synteesi indolia sisältämättömällä alustalla viljelemällä nafta-leenidioksygenaasigeenin sisältävällä DNA-ilmentämisvektori1la transformoitua Escherichia col ia sopivissa olosuhteissa, ja eristämällä muodostunut indigo mikro-organismista tai kasvualustasta.

PCT-patenttihakemuksessa WO 84/01154 on kuvattu mm. plasmidi pE317, joka sisältää Pseudomonas putidasta peräisin olevan DNA-sekvenssin, joka koodaa naftaleenin oksidatiiviseen hajotukseen salisylaatiksi osallistuvien entsyymien ilmentymistä E. colissa. Näihin plasmidin pE317 koodaamiin entsyymeihin kuuluu naftaleeni-dioksygenaasientsyymi, joka katalysoi naftaleenin muuttumista cis-1,2-naf taleenidihydrodioliksi.

Pseudomonas-lajien kyvyn käyttää naftaleenia ainoana hiili- ja energialähteenä määräävät useat naftaleenia metaboloivat plasmi-dit, joista lähimmin on tutkittu P. putidan NAH7-plasmidia. Naftaleenin hapettumisen aikaansaavat geenit ovat järjestäytyneet kahteen erilliseen operoniin NAH7:ssä. Ensimmäinen operoni <nah-ABCDEF) koodaa entsyymejä naftaleenin hapettamiseksi salisylaa-tiksi ja toinen operoni (nahGHIJK) salisylaatin konvergoimisekei pyruvaatiksi ja asetaldehydiksi. Vaikka näiden operonien organi- 2 82265 säätiötä ja säätelyä on tutkittu yksityiskohtaisesti, paljoakaan ei tiedetä yksittäisten geenien rakenteesta. Ainoastaan näiden operonien nahH-geeni ja promootttorlalueet on analysoitu nukleo-tidieekvenesien suhteen.

Naftaleenidioksygenaasi kykenee myöskin muuttamaan indolin indigoksi, ja on havaittu indolin hapetuksen olevan kaikkien bakteeriperäisten diokeygenaaslen ominaisuus, jotka muodostavat dihyd-rodioleja aromaattisista hiilivedyistä. Indigoa valmistettaessa transformoituja mikro-organismeja kasvatetaan sellaisissa olosuhteissa, jotka sallivat indolin dioksygenaaslentsyymin katalysoivan oksidatiivisen transformaation, jolloin reaktiotuotteena saadaan cis-indoli-2,3-dihydrodio1 ia. Tämä tuote uudelleenjärjestyy in-doksyyliksi, joka muuttuu indigoksi ilman vaikutuksesta. Tähän hapetusreaktioon ottaa osaa entsyymisysteemi, joka koostuu kolmesta proteiinista. Näiden proteiinien rakennetta ei kuitenkaan ole aikaisemmin selvitetty.

Esillä oleva keksintö kohdistuu DNA-sekvenssiin, joka koodaa näitä kolmea proteiinia. Lisäksi esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään, jossa jokin bakteerisolu transformoidaan tällä DNA-sekvenssillä (dox-geenit>, jolloin voidaan saada bakteereja, jotka hajottavat aromaattisia yhdisteitä. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Dioksygenaasientsyymi käyttää substraattinaan mdolia, jonka se muuttaa siniseksi indigoksi, joten mikäli bakteerit tuottavat itse riittävästi indolia, ei sitä tarvitse lisätä kasvualustaan.

Seuraavassa keksintöä kuvataan lähemmin esimerkkien avulla.

Esimerkki 1

Naftaleenidioksygenaasigeenien (dox-geenit) funktionaalisen alueen määrittäminen ja kloonaus Pseudomonas putidan plasmidista 3 82265

Pseudomonas putida -kantaa NCIB 9816, jossa on naftaleenia hajot- o tava megaplasmidi, kasvatettiin 28 C:sea suoloja sisältävällä M9-alustalla (Miller 1972) naftaleenin ollessa ainoana hiili-ja energialähteenä. Peeudomonaksen koko DNA eristettiin nafta-leenilla kasvaneista soluista Dhaesen et ai. (Nucl. Acids Res., 7, 1979, s.1837-1849) kuvaamalla menetelmällä.

Naftaleenidioksygenaasiaktiivisuudesta vastaavat geenit kloonattiin mainitusta kannasta perustuen niiden kykyyn hapettaa indolia indigoksi E. colissa (Ensley et ai., J. Bact., 149, 1982, s. 948- 954), jolloin lisättäessä indolia kasvatusalustaan tätä aktiivisuutta sisältävät pesäkkeet muuttuivat sinisiksi. Kokonainen Pseudomonas putidan DNA hajotettiin osittain Sau3A:lla, 10-20 kb:n fragmentit ligatoitiin BamHl:llä digestoituun plasmidiin pBR322 ja kirjasto transformoitiin E. coliin HB101. Ampisilliiniresistentit pesäkkeet valikoitiin sinisen värin tuoton suhteen indolia sisältävällä alustalla, jolloin löydettiin rekombinanttiplasmidi pSKH300, joka sisälsi noin 14 kb:n sekvenssin (kuva la). pSKH300-klooni kartoitettiin ja naftaleenidioksygenaasiaktiivisuudelle spesifinen alue subkloonattiin 4,2 kb:n PvuI I-ClaI-fragmenttina plasmidin pSKH301 saamiseksi.

Tälle plasmidille konstruoitiin yksityiskohtaisempi restriktio-kartta (kuva la), ja restriktiofragmentit kloonattiin plasmideihin pUC18 ja pUC19. Näin määritettiin funktionaalinen alue 2,7 kb:n EcoRl-fragmentti in (plasmidi pSKH302, kuva Ib). Naftaleenidioksy-genaasigeenien ekspressio subkloonatussa fragmentissa pSKH302 oli riippuvainen vektoriplasmidin lac-promoottorista, jolloin fragmentti tuotti aktiivisuuden ainoastaan kuvassa Ib esitetyssä suunnassa. Digestoimalla endonukleaasi 111:11a naftaleenidioksy-genaasiaktiivisuutta koodaavasta alueeesta voitiin vielä deletoida 100 bp sen vasemmasta päästä ja 200 bp sen oikeasta päästä (kuva Ib). Kasvatettaessa plasmidin pSKH302 sisältävää E. coli -puhdas-viljelmää indolia sisältävällä alustalla, saatiin sinisiä ja valkoisia pesäkkeitä.

4 82265

Esimerkki 2

Naftaleenidioksygenaasigeenien sekvensointi

Naftaleenidioksygenaaeigeenien täsmällisen rakenteen tutkimiseksi 2515 bp:n pituinen alue plasmidisea pSKH302 sisältäen nämä geenit sekvensoitiin. Sekvensointistrategia on esitetty kuvassa Ib. Nukleotidisekvenssin perusteella voitiin identifioida kolme peräkkäistä avointa lukujaksoa nl, n2 ja n3 , joiden koot ovat 312 bp, 1347 bp ja 582 bp, vastaavasti. Ensimmäinen 312 bp pituinen avoin lukujakso alkaa emäsparista 112 ja lopetuskodoni on emäs-parin 426 kohdalla. 70 bp tämän jälkeen seuraa toinen 1347 bp pi_ tuinen avoin lukujakso. Kolmas 582 bp pituinen avoin lukujakso alkaa 14 bp toisen avoimen lukujakson lopetuskodonin jälkeen ja lukujakso vaihtuu. Nukleotidisekvenssistä johdettujen geenituot-teiden sekvenssien koot ovat 11447 Da, 49614 Da ja 22937 Da. Kokeellisesti osoitettiin, että kaikki 3 geeniä, doxA, doxB ja doxC, tarvitaan indigon tuottoon E. colissa.

Esimerkki 3

Kolmea dox-geeniä ekspressoiva kolibakteeri muuttaa naftaleenin haihtumattomiksi yhdisteiksi.

Naftaleenidioksygenaasiaktiivisuus voidaan määrittää solu-uutteesta seuraamalla radioaktiivisen naftaleenin muuttumista haih-tumattorniksi yhdisteiksi <Ensley ym., 1982, 3. Bact. 149:948-954). Kolme dox-geeniä sisältävä kolikanta SK 302 konvertoi 16 tunnin aikana 45 X reaktioseoksen naftaleenista haihtumattomiksi yhdisteiksi, kun vastaava kolikanta ilman dox-geenejä konvertoi alle 0,1 % .

Claims (3)

5 82265 Patenti ivaat imukset

1. DNA-eekvenesit, tunnetut siitä, että ne koodaavat kolmea proteiinia käsittävää proteiinisysteemiä, joka saa aikaan indigo-väriaineen tuoton bakteerissa sen ollessa transformoitu näillä DNA-sekvensseillä, ja jonka proteiinisysteemin kolmella proteiinilla on seuraavat aminohappojärjestykset s > OoxA: H»t Thr Vai Us Trp Ut 61u Ali Vai AU Leu Ser Asp Ile Leu Slu Bly Asp Vai Leu Bly Vai Thr Vai 61u Sly Lys Blu Leu AU Itu Tyr Blu Vai 61u Sly Blu Ut Tyr AU Thr Asp Asn Leu Cys Thr Kis 6ly Ser AU Arg het Ser Asp Bly Tyr Leu Blu Bly Arq 61u Ile 61u Cys Pro Leu His Bio 61y Arg Phe Asp Vai Cys Thr Bly Lys AU Leu Cys AU Pro Vai Thr Bin Asn Ile Lys Thr Tyr Pro Vai Lys Ile Blu Asn Leu Arg Vai Net Ut Asp Leu Sr b ) DoiB: Het Asn Tyr Asn Asn Lys Ile Leu Vai Ser Slu Ser Bly Leu Ser Bln Lys His Leu lit His Bly Asp Blu Blu Leu Phe Bln His 61u Leu Lys Thr Ile Phe AU Arg Asn Trp Leu Phe Leu Thr His Asp Ser Leu Ile Pro AU Pro Sly Asp Tyr Vai Thr AU Lys Het Bly Ile Asp Blu Vai Ile Vai Ser Arg Bin Asn Asp 61y Ser Ile Arg AU Phe Leu Asn Vai Cys Arg His Arg Bly Lys Thr Leu Vai Ser Vai Blu AU Bly Asn AU Lys 61 y Phe Vai Cys Ser Tyr His Bly Trp Bly Phe 6ly Ser Asn Bly Blu Leu Bin Ser Vai Pro Phe Blu Lys Asp leu Tyr Bly Blu Ser Leu Asn Lys Lys Cys Leu Bly Leu Lys Slu Vai AU Arg Vai Blu Ser Phe His Bly Phe Ile Tyr Bly Cys Phe Asp Gin Slu AU Pro Pro Leu Het Asp Tyr Leu Bly Asp AU AU Trp Tyr Leu 61u Pro Het Phe Lys His Ser Bly Bly Leu Blu Leu Vai Bly Pro Pro Sly Lys Vai Vai Ile Lys AU Asn Trp Lys AU Pro AU Slu Asn Phe Vai Bly Asp AU Tyr His Vai Bly Trp Thr His AU Ser Ser Leu Arg Ser Gly 61 u Ser Ut Phe Ser Ser Leu AU Bly Asn AU AU Leu Pro Pro Blu 61y AU Sly Leu Bin Het Thr Ser Lys Tyr Bly Ser Bly Het Bly Vai Leu Trp Asp Bly Tyr Ser Sly Vai His Ser AU Asp Leu Vai Pro Slu Leu Het AU Phe Bly Bly AU Lys Bin Blu Arg Leu Asn Lys Blu Ut Bly Asp Vai Arg AU Arg Ile Tyr Arg Ser His Leu Asn Cys Thr Vai Phe Pro Asn Asn Ser Het Leu Thr Cys Ser Sly Vai Phe Lys Vai Trp Asn Pro Ile Asp AU Asn Thr Thr Blu Vai Trp Thr Tyr AU Ut Vai Blu Lys Asp Het Pro Blu Asp Leu Lys Arg Arg Leu AU Asp Ser Vai Bln Arg Thr Phe Bly Pro AU Bly Phe Trp Slu Ser Asp Asp Asn Asp Asn Het Blu Thr AU Sk Bln Asn Sly Lys Lys Tyr Bin Ser Arg Asp Ser Asp Leu Leu Ser Asn Leu Bly Phe Sly Blu Asp Vai Tyr Bly Asp AU Vai Tyr Pro Bly Vai Vai Gly Lys Ser AU Ile Bly 61u Thr Ser Tyr Arg Bly Phe Tyr Arg AU Tyr Bin AU His Vai Ser Ber Ser Asn Trp AU Blu Phe Blu His AU Ser Ser Thr Trp His Thr Slu Leu Thr Lys Thr Thr Asp Arg 6 82265 c ) OoiC: Hit Hit III Asn lit 61n Slu Asp lys Liu Vil Sir All His Asp All 6lu Slu 11· Liu Arg Phi Phi Asn Cys His Asp Sir Ali Lm 61n Gin 6lu Ali Tbr Thr Liu Liu Thr Gin Slu All His Liu Lni Asp Ui Gin Ali Tyr Arg All Trp Liu 6lu His Cys Vil 6iy Sir Slu Vil Sin Tyr Gin Vil III Sir Arg Slu Liu Arg All All Sir Elu Arg Arg Tyr Lys Lw Asn 61u All Hit Asn Vil Tyr Asn Slu Asn Phi Gin Gin Liu Lys Vil Arg Vil Slu His Bln Liu Asp Pro Sin Asn Trp Sly Asn Sir Pro Lys Liu Arg Phi Thr Arg Phi Hi Thr Asn Vil Gin All All Hit Asp Vil Asn Asp Lys Glu Liu Liu His III Arg Sir Asn Vil Hi Liu His Arg All Arg Arg Sly Asn Bln Vil Asp Vil Phi Tyr All All Arg Slu Asp Lys Trp Lys Arg Sly Slu 6ly Sly Vil Arg Lys Liu Vil Sin Arg Phi Vil Asp Tyr Pro 61u Arg III Liu 61n Thr His Asn Liu Hit Vil Phi Liu

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset DNA-sekvenssit, tunnetut siitä, että niillä transformoitu bakteeri on E. coli.

3. Menetelmä aromaattisia yhdisteitä, kuten naftaleenia ja indo-lia, muuttavien bakteerien tuottamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: a) eristetään naftaleenia sisältävällä alustalla kasvaneen Pseudomonas putidan NCIB 9616 DNA:sta patenttivaatimuksen 1 mukaiset DMA-sekvenssit; b) siirretään kohdan (a) sopivin promoottorein varustetut sekvenssit bakteerisoluun. £.at9ntKtay