FI81366B - Process for obtaining antibodies which are specific for Clostridium difficile toxins, and the use of antibodies in processes for determining toxins - Google Patents
Process for obtaining antibodies which are specific for Clostridium difficile toxins, and the use of antibodies in processes for determining toxins Download PDFInfo
- Publication number
- FI81366B FI81366B FI840949A FI840949A FI81366B FI 81366 B FI81366 B FI 81366B FI 840949 A FI840949 A FI 840949A FI 840949 A FI840949 A FI 840949A FI 81366 B FI81366 B FI 81366B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- antibodies
- difficile
- toxin
- bound
- antigens
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
1 813661 81366
Menetelmä Clostridium difficile-toksiineille spesifisten vasta-aineiden saamiseksi ja vasta-aineiden käyttö toksiinien määritysmenetelmissä 5 Tämä keksintö koskee menetelmiä vasta-aineiden saa miseksi, jotka ovat spesifisiä Clostridium difficile-toksiineille tai monospesifisiä C. difficilen toksiini A:lie tai B:lle. Keksintö koskee myös menetelmällä saatujen vasta-aineiden käyttöä myrkyllisten C. difficilien tai niiden 10 toksiini A:n tai B:n määritysmenetelmissä. Keksinnölle ovat tunnusomaisia patenttivaatimuksissa määritellyt seikat .This invention relates to methods for obtaining antibodies that are specific for Clostridium difficile toxins or monospecific for C. difficile toxin A or B. This invention relates to methods for obtaining antibodies specific for Clostridium difficile toxins or monospecific for C. difficile toxin A or B. The invention also relates to the use of the antibodies obtained by the method in methods for the determination of toxic C. difficile or their toxin A or B. The invention is characterized by the features defined in the claims.
Anaerobinen organismi Clostridium difficile (C. difficile) on yhdistetty antibioottiin liittyvään valekal-15 voiseen paksusuolentulehdukseen, ja tästä syystä on kehitetty kokeita, jolla varmistetaan C. difficile-antigeenin läsnäolo ihmisen ulostenäytteissä.The anaerobic organism Clostridium difficile (C. difficile) has been associated with antibiotic-associated pseudomembranous colitis, and therefore experiments have been developed to confirm the presence of C. difficile antigen in human stool samples.
Eräs sellainen koe käsittää ihmisen ulosteviljelyn, joka vaatii erityiset laitteet ja pitkän ajan. Tämä koe 20 ilmaisee myös ne C. difficile-kannat, jotka eivät tuota toksiineja, ja antaa näin vääriä positiivisia tuloksia.One such experiment involves the cultivation of human feces, which requires special equipment and for a long time. This experiment 20 also detects those strains of C. difficile that do not produce toxins and thus gives false positive results.
Vielä eräs koe käsittää entsyymi-immunomääritysme-netelmän, joka nykyisin käytettynä ei kuitenkaan erota myrkyllisiä ja myrkyttömiä kantoja toisistaan, ja tästä 25 syystä koe voi antaa virheellisiä tuloksia.Yet another assay comprises an enzyme-linked immunosorbent assay, which, however, does not distinguish between toxic and non-toxic strains when in use today, and for this reason the assay may give erroneous results.
Tässä on tutkittu C. difficilen toksiinien vasta-aineita, C. difficilen toksiineja, ja myrkyllisen C. difficilen määritysmenetelmää.Here, antibodies to C. difficile toxins, C. difficile toxins, and a method for the determination of toxic C. difficile have been studied.
Tässä tarjotaan käyttöön monospesifinen vasta-aine 30 C. difficilen toksiini A:lie ja sellainen monospesifinen vasta-aine ylläpidettynä kiinteällä alustalla.Provided herein is a monospecific antibody to C. difficile toxin A and such a monospecific antibody maintained on a solid support.
Tässä tarjotaan lisäksi käyttöön monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiini B:lle ja sellainen monospesif inen vasta-aine ylläpidettynä kiinteällä alustalla.Also provided herein is a monospecific antibody to C. difficile toxin B and such a monospecific antibody maintained on a solid support.
2 813662,81366
Vielä tarjotaan käyttöön C. difficilen puhdas toksiini A ja sellainen toksiini kiinteällä alustalla.Still provided is pure toxin A of C. difficile and such a toxin on a solid support.
Vielä erään näkökannan mukaan tarjotaan käyttöön määritysmenetelmä C. difficilen toksiini A:lie, jossei me-5 netelmässä käytetään monospesifistä vasta-ainetta toksiini A:lie.In another aspect, an assay method for C. difficile toxin A is provided if the method does not use a monospecific antibody to toxin A.
Vielä erään näkökannan mukaan tarjotaan käyttöön määritysmenetelmä myrkylliselle C. difficilelle.In another aspect, an assay method for toxic C. difficile is provided.
Termi "monospesifinen vasta-aine toksiini A:lie" 10 tässä käytettynä tarkoittaa vasta-ainetta, jolla ei ole mitään määrättyjä paikkoja muille C. difficile-antige.e-neille kuin toksiini A:lie.The term "monospecific antibody to toxin A" as used herein means an antibody that does not have any specific sites for C. difficile antige.e other than toxin A.
Termi "monospesifinen vasta-aine toksiini B:lle" tässä käytettynä tarkoittaa vasta-ainetta, jolla ei ole 15 mitään määrättyjä paikkoja muille C. difficile-antigee-neille kuin toksiini B:lle.The term "monospecific antibody to toxin B" as used herein means an antibody that does not have any specific sites for C. difficile antigens other than toxin B.
Termiin "monospesifinen vasta-aine" tässä käytettynä sisältyy sellainen vasta-aine monoklonaalisessa muodossa.The term "monospecific antibody" as used herein includes such an antibody in monoclonal form.
20 On ymmärrettävä, että monospesifisiä vasta-aineita toksiini A:lie tai toksiini B:lle voidaan valmistaa muista organismeista kuin C. difficilestä, niin kauan kun vasta-aineella ei ole määrättyä paikkaa muille C. dif f icil€!-an-tigeeneille.It is to be understood that monospecific antibodies to toxin A or toxin B may be prepared from organisms other than C. difficile, as long as the antibody does not have a specific site for other C. diff icil anti-antigens.
25 "C. difficile-vasta-aine" tai "vasta-aine C. diffi- cilelle" merkitsee vasta-ainetta, joka ei ole monospesifi-nen, ja joka sen vuoksi käsittää vasta-aineseoksen, joka sisältää vasta-aineet C. difficilen toksiineille (vasta-aine toksiini A:lie ja vasta-aine toksiini B:lle) ja vas-30 ta-aineet C. difficilen ei-toksiineille."C. difficile antibody" or "antibody to C. diffilis" means an antibody that is not monospecific and therefore comprises an antibody mixture comprising antibodies to C. difficile. toxins (antibody to toxin A and antibody to toxin B) and antibodies to C. difficile non-toxins.
Vasta-aine myrkylliselle C. difficilelle tai vasta-aine erityisesti C. difficilen toksiineille tarkoittaa vasta-ainetta, jolla ei ole määrättyjä paikkoja C. difficilen muille antigeeneille kuin toksiini A:lie ja toksiini 35 B:lle (toksiini A:lie spesifisen ja toksiini B:lle spesifisen vasta-aineen seos).An antibody to a toxic C. difficile or an antibody specifically to C. difficile toxins means an antibody that does not have specific sites for C. difficile antigens other than toxin A and toxin 35 B (toxin A specific and toxin Mixture of antibody specific for B).
3 81 6 6 63 81 6 6 6
Toksiini A on C. difficile-toksiini, jota yleensä pidetään suoliston limakalvomyrkkynä. Toksiini Ailia on alkuperäinen molekyylipaino välillä 550 000 ja 600 000, ja isoelektrinen piste 5,5; se ei sisällä havaittavasti hii-5 lihydraatteja tai fosforia, eikä sillä ole havaittavaa proteaasivaikutusta. Se on inertti pHissa 2,0 ja pysyvä pHissa 10,0. Toksiini A eluoidaan DEAEista puskurilla, joka sisältää 0,16 M NaCl.Toxin A is a C. difficile toxin that is generally considered an intestinal mucosal toxin. Toxin Ailia has an initial molecular weight between 550,000 and 600,000, and an isoelectric point of 5.5; it does not contain detectable hii-5 dihydrates or phosphorus and has no detectable protease activity. It is inert at pH 2.0 and stable at pH 10.0. Toxin A is eluted from DEAEs with a buffer containing 0.16 M NaCl.
Toksiini B on C. difficile-toksiini, jota yleensä 10 pidetään C. difficilen solumyrkkynä. Toksiini Billä on alkuperäinen molekyylipaino välillä 380 000 ja 470 000, ja isoelektrinen piste 3,8; se ei sisällä havaittavaa fosforia, mutta sisältää hyvin pieniä määriä hiilihydraatteja (joka voi olla epäpuhtautta), eikä osoita havaittavaa pro-15 teaasivaikutusta. Toksiini B on inertti pH-arvoissa alle 2,0 ja yli 10,0, ja se eluoidaan DEAE-pylväästä suolalla, jonka konsentraatio on 0,4 M.Toxin B is a C. difficile toxin that is generally considered a cellular toxin for C. difficile. Toxin B has an initial molecular weight between 380,000 and 470,000, and an isoelectric point of 3.8; it does not contain detectable phosphorus, but contains very small amounts of carbohydrates (which may be an impurity), and does not show a detectable pro-15 protease effect. Toxin B is inert at pH values below 2.0 and above 10.0 and is eluted from the DEAE column with a salt concentration of 0.4 M.
On ymmärrettävissä kuitenkin, että vaikka toksiini Aita pidetään suoliston limakalvomyrkkynä, toksiini Ailia 20 on myös solumyrkkyominaisuuksia.It is understood, however, that while toxin Ailia is considered an intestinal mucosal toxin, toxin Ailia 20 also has cytotoxic properties.
Tässä kuvataan myös miten toksiini A, joka on osittain puhdistettu erottamalla toksiini Bistä ja jossa vielä on joitakin ei-myrkyllisiä proteiineja, puhdistetaan edelleen puhtaan toksiini A:n saamiseksi. Keksinnön tämän nä-25 kökannan mukaan toksiini Ai n vesiliuoksen pH ja molaari-suus säädetään toksiini Am saostamiseksi ilman, että jäljellä olevat proteiinit saostuvat, jolloin saadaan puhdas toksiini A.Also described here is how toxin A, which has been partially purified by separation of toxin B and still contains some non-toxic proteins, is further purified to obtain pure toxin A. According to this aspect of the invention, the pH and molarity of the aqueous solution of toxin A1 are adjusted to precipitate toxin Am without precipitating the remaining proteins to give pure toxin A.
Tarkemmin ilmaistuna, vesiliuoksen pH säädetään 30 arvoon alle 6,0, jossa toksiini A saostuu ilman muiden proteiinien saostumista tai toksiinin denaturoitumista, ja vesiliuoksen molaarisuus säädetään alemmaksi kuin 0,1 M, jossa toksiini A saostuu ilman muiden proteiinien saostumista.More specifically, the pH of the aqueous solution is adjusted to less than 6.0, where toxin A precipitates without precipitation of other proteins or denaturation of the toxin, and the molarity of the aqueous solution is adjusted below 0.1 M, where toxin A precipitates without precipitation of other proteins.
4 81 3 6 64 81 3 6 6
Yleensä pH on ainakin 5,0, edullisen pH:n ollessa 5,3 - 5,7 ja parhaan tuloksen ollessa saavutettavissa pH:ssa 5.5. Liuoksen molaarisuus on yleensä ainakin 0,001 M, parhaan tuloksen ollessa saavutettavissa 0,01 M:ssä. Molaari- 5 suus ja pH voidaan säätää käyttämällä sopivaa suolapusku-ria, esim. natriumasetaattipuskuria. Molaarisuuden säätö voidaan mukavasti saavuttaa dialyysillä, vaikka muutkin menetelmät ovat sopivia.In general, the pH is at least 5.0, with a preferred pH of 5.3 to 5.7 and the best result being achieved at pH 5.5. The molarity of the solution is generally at least 0.001 M, with the best result being obtained at 0.01 M. The molarity and pH can be adjusted using a suitable salt buffer, e.g. sodium acetate buffer. Molar control can be conveniently achieved by dialysis, although other methods are suitable.
Saostunut puhdas toksiini A saadaan vesiliuoksesta 10 ja se voidaan liuottaa veteen puskuroidussa pH:ssa noin 7.5.The precipitated pure toxin A is obtained from aqueous solution 10 and can be dissolved in water at a buffered pH of about 7.5.
Osittain puhdistettu toksiini A, joka puhdistetaan puhtaan toksiini A:n saamiseksi, voidaan saada alalla yleisesti tunnetuilla menetelmillä. Esimerkiksi sakan yllä 15 oleva neste myrkyllisen C. difficilen soluviljelmästä konsentroidaan ultrasuodatuskalvolla, joka pidättää vain suuret molekyylit (mp. yli 100 000) ja pidättynyt aine käsitellään kromatografiapylväässä. Pylväs (DEAE) eluoidaan sitten natriumkloridigradienteilla (ensimmäinen gradientti 20 on 0,05 - 0,25 M NaCl yhdessä 0,3 M:n NaCl-pesun kanssa, ja toinen gradientti on 0,3 - 0,6 NaCl), ensimmäisen gradientin eluoidessa toksiini A:n ja toisen gradientin toksiini B:n.Partially purified toxin A, which is purified to give pure toxin A, can be obtained by methods well known in the art. For example, the supernatant liquid from a cell culture of toxic C. difficile is concentrated on an ultrafiltration membrane that retains only large molecules (mp. Over 100,000) and the retained material is treated on a chromatography column. The column (DEAE) is then eluted with sodium chloride gradients (first gradient 20 is 0.05 to 0.25 M NaCl along with 0.3 M NaCl wash, and a second gradient is 0.3 to 0.6 NaCl), with the first gradient eluting toxin A and a second gradient of toxin B.
Termi "puhdas toksiini A" tässä käytettynä merkit-25 see sitä, että toksiini A:n valmistus on vapaa epäpuhtauksista (vain toksiini A on läsnä), kun sitä tutkitaan alalla tunnetuilla erittäin tarkoilla analyysimenetelmillä.The term "pure toxin A" as used herein means that the preparation of toxin A is free of impurities (only toxin A is present) when tested by highly accurate analytical methods known in the art.
Termi "osittain puhdistettu" tässä käytettynä merkitsee sitä, että joitakin epäpuhtauksia, mutta ei kaik-30 kia, on poistettu.The term "partially purified" as used herein means that some, but not all, of the impurities have been removed.
Puhdas toksiini A, kun se on valmistettu edellä kuvatuilla menetelmillä, on puhdas, kun se täyttää seuraa-vat kriteerit: yksittäinen vyöhyke akryyliamidigeeli-elektroforeesissa, 35 kun käytetään 100 pg proteiinia geeliliuskaa kohti (Davis-, SDS- ja gradienttigeelit); 5 81366 yksittäinen immunopresipitiinikaari ristikkäisillä immuno-elektroforeesilevyillä antiseerumien kanssa, jotka on tehty täydelliseen C. difficile-antigeenien seokseen; ja puhdas toksiini A eläimeen injektoituna saa aikaan mono-5 spesifisen vasta-aineen valmistumisen toksiini A;lie.Pure toxin A, when prepared by the methods described above, is pure when it meets the following criteria: a single band in acrylamide gel electrophoresis, using 100 pg of protein per gel strip (Davis, SDS and gradient gels); 5,81366 single immunopressipitin arcs on cross-linked immunoelectrophores plates with antisera made up in a complete mixture of C. difficile antigens; and pure toxin A when injected into the animal causes the production of a mono-5 specific antibody to toxin A;
Monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiini A:lie ja monospesifinen vasta-aine C. difficilen toksiini B:lle voidaan valmistaa useilla erilaisilla menetelmillä.A monospecific antibody to C. difficile toxin A and a monospecific antibody to C. difficile toxin B can be prepared by a variety of methods.
Erään menetelmän mukaan C. difficile-viljelmän, 10 joka oli valmistettu tunnetulla viljelymenetelmällä, sakan yllä olevat nesteet keitetään kaikkien kuumuutta kestämättömien proteiiniantigeenien (myrkyllinen ja myrkytön antigeeni) tuhoamiseksi ja näin saadaan aine, joka sisältää vain C. difficilen kuumuutta kestäviä antigeenejä. Nämä 15 antigeenit tuetaan sitten ensimmäiseen syanogeenibromidil-la aktivoituun pylvääseen.According to one method, the supernatants of a precipitate of a C. difficile culture prepared by a known culture method are boiled to destroy all non-heat-resistant protein antigens (toxic and non-toxic antigen) to obtain a substance containing only heat-resistant antigens of C. difficile. These antigens are then supported on a first cyanogen bromide-activated column.
Osittain puhdistettu toksiini A ja osittain puhdistettu toksiini B, joista kumpikin on saatu DEAE-kromato-grafiapylväästä saadusta eluointinesteestä edellä kuvatul-20 la tavalla, liitetään toiseen ja vastaavasti kolmanteen syanogeenibromidilla aktivoituun Sepharose®-pylvääseen.Partially purified toxin A and partially purified toxin B, each obtained from the eluent obtained from the DEAE chromatography column as described above, are coupled to the second and third cyanogen bromide-activated Sepharose® columns, respectively.
Vasta-aineet karkeille C. difficile-antigeenimyr-kyille (joka myrkky sisältää sekä toksiini A:ta että toksiini B:tä, kuten myös monia muita bakteerin tuottamia 25 antigeenejä) valmistetaan sopivissa eläimissä, esim. vuohissa, ja syntynyt vasta-aine koostuu C. difficile-anti-geenien vasta-aineseoksesta (sellainen vasta-aineseos sisältää vasta-aineita toksiini A:lie ja toksiini B:lle, sekä vasta-aineita myrkyttömille antigeeneille, mukaan-30 luettuina vasta-aineet kuumuutta kestäville antigeeneille). Myrkyttömät vasta-aineet (paitsi vasta-aineet myrkyttömille kuumuutta kestäville antigeeneille) poistetaan vasta-aineseoksesta saattamalla ne kosketuksiin myrkyttömän C. difficile-kannan kokonaisten solujen kanssa, jol-35 loin ne siinä yhteydessä sitovat muut vasta-aineet ei-myr- 6 81366 kyllisiin aineisiin (paitsi vasta-aineet myrkyttömille kuumuutta kestäville antigeeneille).Antibodies to coarse C. difficile antigenic toxins (which contain both toxin A and toxin B, as well as many other antigens produced by the bacterium) are prepared in suitable animals, e.g., goats, and the resulting antibody consists of C from an antibody mixture of difficile antigens (such an antibody mixture contains antibodies to toxin A and toxin B, as well as antibodies to non-toxic antigens, including antibodies to heat-resistant antigens). Non-toxic antibodies (except antibodies to non-toxic heat-resistant antigens) are removed from the antibody mixture by contact with whole cells of a non-toxic C. difficile strain, thereby binding other antibodies to non-toxic 6,81366 substances (except antibodies to non-toxic heat-resistant antigens).
Sen jälkeen vasta-aineseos (joka nyt sisältää vasta-aineet toksiineille ja vasta-aineet myrkyttömille kuu-5 muutta kestäville antigeeneille) pannaan sitten ensimmäiseen pylvääseen, jossa on kuumuutta kestäviä C. difficile-antigeenejä, jolloin sokerivasta-aineet kuumuutta kestä-ville antigeeneille sitoutuvat.The antibody mixture (which now contains antibodies to toxins and antibodies to non-toxic heat-resistant antigens) is then applied to a first column of heat-resistant C. difficile antigens, with the sugar antibodies to heat-resistant antigens binding. .
Seos, jossa ei ole vasta-ainetta kuumuutta kestäviä 10 antigeenejä vastaan ja joka sisältää vasta-aineet toksiini A: lie ja B:lle, jaetaan sitten kahteen osaan; yksi osa pannaan toiseen pylvääseen, jossa on puhdasta toksiini A:ta, ja toinen osa pannaan kolmanteen pylvääseen, jossa on osittain puhdistettua toksiini B:tä, jolloin toisessa 15 pylväässä vasta-aine toksiini A:lie sitoutuu selektiivisesti tuettuun toksiini A:hän ja kolmannessa pylväässä vasta-aine toksiini B:lle sitoutuu selektiivisesti tuettuun toksiini B:hen.The mixture, which has no antibody against heat-resistant antigens and which contains antibodies to toxin A and B, is then divided into two portions; one part is placed on a second column with pure toxin A and the other part is placed on a third column with partially purified toxin B, wherein in the second column the antibody to toxin A binds selectively to the supported toxin A and in the third in the column, the antibody to toxin B binds selectively to the supported toxin B.
Vasta-aineet toksiini A:lie ja vasta-aineet toksii-20 ni B:lle eluoidaan sen jälkeen toisesta ja vastaavasti kolmannesta pylväästä esim. käyttämällä kaliumtiosyanaat-tia saamaan monospesifinen vasta-aine toksiini B:lle.Antibodies to toxin A and antibodies to toxin-20 ni B are then eluted from the second and third columns, respectively, e.g., using potassium thiocyanate to give a monospecific antibody to toxin B.
Joissakin tapauksissa, kuten tässä jäljempänä on kuvattu, vasta-aineen toksiini A:lie ja vasta-aineen tok-25 ' siini B:lle muodostama seos (sen jälkeen kun myrkyttömät antigeenit on poistettu) voidaan käyttää erottamatta mono-spesifiseen vasta-aineeseen kullekin toksiinille, esim. määritettäessä myrkyllistä C. difficileä.In some cases, as described below, a mixture of antibody to toxin A and antibody to toxin 25 '(after removal of non-toxic antigens) can be used without separation to a monospecific antibody for each toxin. , e.g., in the determination of toxic C. difficile.
Vaihtoehtoisesti voidaan monospesifinen vasta-aine 30 toksiini A:lie valmistaa panemalla karkea C. difficile- vasta-aine pylvääseen, joka on tuettu immobilisoidulla puhtaalla toksiini Ailia. Myrkyttömät A-vasta-aineet poistetaan pylväästä runsaasti pesemällä ja jäljellä olevat vasta-aineet, jotka ovat liittyneet toksiini A:hän, eluoi-35 daan kaliumtiosyanaatilla.Alternatively, a monospecific antibody to toxin A can be prepared by placing a coarse C. difficile antibody on a column supported on immobilized pure toxin A1. Non-toxic A antibodies are removed from the column by extensive washing and the remaining antibodies associated with toxin A are eluted with potassium thiocyanate.
Il 7 81 3 6 6Il 7 81 3 6 6
Vaihtoehtoisesti monospesifinen vasta-aine toksiini A:lie voidaan valmistaa puhdistetusta toksiini A:sta, joka on valmistettu edellä kuvatulla tavalla, injektoimalla toksiini A (sekoitettuna pieneen määrään formaldehydiä 5 myrkyllisyyden alentamiseksi tuhoamatta antigeenisyyttä tai neutraloituna vasta-aineen kanssa) sopivaan eläimeen, esim. vuoheen. Monospesifinen vasta-aine toksiini A: lie saadaan sitten edellisessä kappaleessa kuvatulla menetelmällä.Alternatively, a monospecific antibody to toxin A can be prepared from purified toxin A prepared as described above by injecting toxin A (mixed with a small amount of formaldehyde to reduce toxicity without destroying antigenicity or neutralizing with the antibody) in a suitable animal, e.g., a goat. . The monospecific antibody to toxin A is then obtained by the method described in the previous paragraph.
10 Monospesifisiä vasta-aineita ja toksiineja voidaan tämän keksinnön mukaisesti ylläpitää kiinteällä alustalla käytettäväksi C. difficilen määritykseen. Vaihtoehtoisesti sellaisia vasta-aineita ja toksiineja voidaan käyttää sellaisessa määrityksessä kannakkeettomassa muodossa.Monospecific antibodies and toxins can be maintained in accordance with this invention on a solid support for use in the detection of C. difficile. Alternatively, such antibodies and toxins may be used in such an assay in unsupported form.
15 Käytettäessä kiinteää alustaa, kiinteä alusta voi olla mikä tahansa monista kiinteistä aineista ja missä tahansa muodossa monista mahdollisista, esim. levyinä, tarjottimina, hiukkasina, putkina, laattoina jne.15 When a solid substrate is used, the solid substrate may be any of a number of solids and in any form many possible, e.g., sheets, trays, particles, tubes, tiles, and the like.
Edustavina esimerkkeinä sopivista alustoista voi-20 daan mainita synteettiset polymeerialustat, kuten poly- styreeni, polypropyleeni, substituoitu polystyreeni (esim. aminoitu tai karboksyloitu polystyreeni), polyakryyliami-dit, polyamidit, polyvinyylikloridi jne., lasialusta, aga-roosi jne. Alustat voivat sisältää reaktiivisia ryhmiä, 25 esim. karboksyyliryhmiä, aminoryhmiä jne. antamaan mahdollisuus suoraan sitoutumiseen alustaan.Representative examples of suitable substrates include synthetic polymeric substrates such as polystyrene, polypropylene, substituted polystyrene (e.g., aminated or carboxylated polystyrene), polyacrylamides, polyamides, polyvinyl chloride, etc., glass substrate, agarose, etc. reactive groups, e.g., carboxyl groups, amino groups, etc. to allow direct binding to the support.
Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut vasta-aineet ja toksiinit voidaan tukea kiinteälle alustalle monilla eri tavoilla, esimerkiksi absorptiolla, kovalenttisella 30 kytkennällä, aktivoimalla sopiva alusta proteiinilla A jne.The antibodies and toxins prepared in accordance with this invention can be supported on a solid support in a variety of ways, for example, by absorption, covalent coupling, activation of the appropriate support with protein A, and the like.
Edustavina esimerkkeinä sopivista kytkentäaineista voidaan mainita dialdehydit, esimerkiksi glurataldehydi, sukkiinialdehydi, malonialdehydi jne., tyydyttämätön alde-35 hydi jne., karbodi-imidit, di-isosyanaatit, dimetyyliadi- 8 81 3 6 6 pimaatti, syaaniuriinikloridi jne. Sopivan kytkentäaineen valinnan pitäisi olla selvää alaan perehtyneille tässä annetuista tiedoista.Representative examples of suitable coupling agents include dialdehydes, for example, glurataldehyde, succinic aldehyde, malonic aldehyde, etc., unsaturated aldehyde, etc., carbodiimides, diisocyanates, dimethyl adiphenylate, clear to those skilled in the art from the information provided herein.
Samalla tavalla antigeeni voidaan tukea aktivoimal-5 la sopiva alusta, esimerkiksi syanogeenibromidilla aktivoitu agaroosi.Similarly, the antigen can be supported by activating a suitable support, for example cyanogen bromide-activated agarose.
Tämän keksinnön näkökannan mukaan keksinnön mukaisesti valmistettuja vasta-aineita ja mainittuja toksiineja voidaan käyttää C. difficilen joko toksiini A:n tai tok-10 siini B:n tai myrkyllisen C. difficilen (sekä toksiini A:ta että toksiini B:tä) määritysmenetelmissä.According to an aspect of the present invention, the antibodies of the invention and said toxins can be used in methods for assaying C. toxin for either toxin A or toxin 10 B or toxic C. difficile (both toxin A and toxin B).
Joissakin sellaisista määritysmenetelmistä käytetään yhtä tai useampaa ainetta "leimatussa" tai "merkityssä" muodossa, ja sellaiset leimat tai merkit ovat alalla 15 tunnettuja määrityksessä käytettäviksi. Niinpä esimerkiksi leima tai merkki voi olla radioaktiivinen aine, kuten radioaktiivinen jodi, radioaktiivinen koboltti, tritium jne., entsyymi, fluoresoiva aine, kemiluminesenssi-aine jne.Some such assays use one or more substances in "labeled" or "labeled" form, and such labels or marks are known in the art for use in the assay. Thus, for example, the label or label may be a radioactive substance such as radioactive iodine, radioactive cobalt, tritium, etc., an enzyme, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, etc.
20 Leimat voidaan lisätä eri aineisiin menetelmillä, joita alalla yleensä käytetään. Samalla tavalla leima tai merkki voidaan havaita alalla tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi radioaktiivisten leimojen laskureilla, entsyymien kolorimetrisella määrityksellä jne.20 Labels can be added to various substances by methods commonly used in the art. Similarly, a label or label can be detected by methods known in the art, for example, radiolabel counters, colorimetric determination of enzymes, etc.
25 Tässä kuvattuja vasta-aineita ja toksiineja voidaan käyttää tuetussa ja/tai tukemattomassa muodossa C. difficilen määritykseen.The antibodies and toxins described herein can be used in supported and / or unsupported forms for the detection of C. difficile.
Keksinnön erään suoritusmuodon mukaan tarjetaan käyttöön koe C. difficilen toksiini A:lie käyttämällä mo-30 nospesifistä vasta-ainetta toksiini A:lie.According to one embodiment of the invention, there is provided an assay for C. difficile toxin A using a monospecific antibody to toxin A.
Tämän suoritusmuodon erään näkökannan mukaan vasta-aine C. difficilelle tuetaan kiinteälle alustalle, esimerkiksi mikrotiitterilevylle. Tuettu C. difficile-vasta-aine saatetaan sitten kosketukseen näytteen (analyytti), kuten 35 potilaan ulosteen laimennuksen kanssa, ja tuloksena sei- g 81 3 6 6 laisesta kosketuksesta mikä tahansa analyytissä läsnäoleva toksiini A, kuten myös muut C. difficilen antigeenit, sitoutuvat tuettuun C. difficile-vasta-aineeseen. Sen jälkeen sitoutunut analyyttierä saatetaan kosketukseen C.In one aspect of this embodiment, the antibody to C. difficile is supported on a solid support, e.g., a microtiter plate. The supported C. difficile antibody is then contacted with a dilution of a sample (analyte), such as the feces of 35 patients, and as a result of 81 3 6 6 contact, any toxin A present in the analyte, as well as other C. difficile antigens, bind supported C. difficile antibody. The bound batch of analyte is then contacted C.
5 difficilen toksiini A:lie monospesifisen vasta-aineen kanssa (kasvatettu erilaisessa eläimessä kuin se, jossa C. difficile-vasta-aine kasvatettiin), ja sellainen monospe-sifinen vasta-aine sitoutuu vain mihin tahansa analyytti-erässä läsnäolevaan toksiini A:hän.5 difficile toxin A with a monospecific antibody (raised in a different animal than the one in which the C. difficile antibody was raised), and such a monospecific antibody binds only to any toxin A present in the analyte batch.
10 Tämä monospesifinen vasta-aine voi sinänsä olla leimattu entsyymillä, fluoresenssiaineella tai radioaktiivisella aineella kuten edellä on kuvattu, ja toksiini A:n läsnäolo voidaan määrittää havaitsemalla tämän leiman läsnäolo.This monospecific antibody may itself be labeled with an enzyme, fluorescent agent or radioactive agent as described above, and the presence of toxin A can be determined by detecting the presence of this label.
15 Vaihtoehtoisestri toksiini A:hän sitoutunut mono- spesifinen vasta-aine voidaan havaita käyttämällä leimattua vasta-ainetta, joka on spesifinen sen eläimen vasta-aineelle, jossa monospesifinen vasta-aine tuotettiin. Tämä sitoutuu monospesifiseen vasta-aineeseen, joka on liitty-20 nyt toksiini A:hän. Tätä menetelmää kutsutaan alalla ELISA-kokeen kaksinkertaiseksi vasta-aineen kerrostumaksi.Alternatively, a monospecific antibody bound to the toxin A can be detected using a labeled antibody specific for the antibody of the animal in which the monospecific antibody was produced. This binds to a monospecific antibody that is now associated with toxin A. This method is referred to in the art as double antibody deposition in an ELISA assay.
Toksiini A:n läsnäolo analyytissä voidaan määrittää sen vuorovaikutuksen avulla toksiini A:lie monospesifisen vasta-aineen kanssa kokeessa.The presence of toxin A in the analyte can be determined by its interaction with the toxin A monospecific antibody in the assay.
25 Edellä esitettyä menetelmää voidaan myös käyttää toksiini B:n määrittämiseen analyytissä käyttämällä mono-spesifistä vasta-ainetta toksiini B:lle, toksiini A: lie monospesifisen vasta-aineen sijasta.The above method can also be used to determine toxin B in an analyte using a monospecific antibody to toxin B, instead of a monospecific antibody to toxin A.
Toisessa C. difficilen toksiini A:n kokeessa mono-30 spesifinen vasta-aine toksiini A:lie voidaan tukea kiin-teälle alustalle esimerkiksi mikrotiitterilevylle, ja tuettu monospesifinen vasta-aine toksiini A:lie saatetaan kosketukseen analyytin kanssa, jonka epäillään sisältävän toksiini A:ta, jolloin näytteessä läsnäoleva toksiini A 35 (ja vain toksiini A) sitoutuu tuettuun monospesifiseen ίο 81 3 6 6 vasta-aineeseen. Sitoutuneen toksiini A:n läsnäolo ja/tai määrä voidaan sitten määrittää saattamalla sitoutunut toksiini A kosketukseen C. difficile-vasta-aineen leimatun muodon kanssa, jolloin sellainen leimattu vasta-aine si-5 toutuu sitoutuneeseen toksiini A:hän. Analyytissä läsnäolevan toksiini A:n läsnäolo ja/tai määrä määritetään sitten määrittämällä sitoutuneen leimatun vasta-aineen läsnäolo ja/tai määrä.In another C. difficile toxin A assay, a mono-30 specific antibody to toxin A can be supported on a solid support, such as a microtiter plate, and the supported monospecific antibody to toxin A is contacted with an analyte suspected of containing toxin A: where toxin A 35 (and toxin A only) present in the sample binds to the supported monospecific ίο 81 3 6 6 antibody. The presence and / or amount of bound toxin A can then be determined by contacting the bound toxin A with a labeled form of a C. difficile antibody, wherein such labeled antibody binds to the bound toxin A. The presence and / or amount of toxin A present in the analyte is then determined by determining the presence and / or amount of bound labeled antibody.
Edellä esitettyä menetelmää voidaan myös käyttää 10 kokeessa toksiini B:lle korvaamalla toksiini A:lie mono-spesifinen vasta-aine toksiini B:lle monospesifisellä vasta-aineella.The above method can also be used in 10 experiments for toxin B by replacing a mono-specific antibody to toxin A with a monospecific antibody to toxin B.
Vielä erään toksiini A:lie olevan kokeen mukaan analyytti, joka sisältää tai jonka oletetaan sisältävän 15 toksiini A:ta, tuetaan kiinteälle alustalle, kuten mikro-tiitterilevylle niin, että ainakin toksiini A analyytissä on tuettu kiinteälle alustalle. Tämän toksiini A:n läsnäolo havaitaan sitten toksiini A:lie monospesifisellä vasta-aineella. Tuettu toksiini A sitoo selektiivisesti vain 20 toksiini A:lie monospesifisen vasta-aineen. Niinpä mono-spesifinen vasta-aine tuetaan kiinteälle alustalle analyy-tin tuetun toksiini A:n avulla. Tällä vasta-aineellci voi olla liittyneenä leima, kuten entsyymi, joka sallii sen havaitsemisen tai voidaan käyttää leimattua vasta-ainetta, 25 joka reagoi toksiiniin sitoutuneeseen vasta-aineeseen (kerros-ELISA-menetelmä). Sitoutuneen leimatun vasta-ai-neen läsnäolo ja/tai määrä on analyytissä olevan toksiini A:n läsnäolon tai määrän merkki.According to another experiment on toxin A, an analyte containing or suspected of containing toxin A is supported on a solid support, such as a microtiter plate, so that at least toxin A in the analyte is supported on a solid support. The presence of this toxin A is then detected by a monospecific antibody to toxin A. Supported toxin A selectively binds only 20 toxin A monospecific antibodies. Thus, the mono-specific antibody is supported on a solid support by the toxin A supported by the analyte. This antibody may be associated with a label, such as an enzyme that allows it to be detected, or a labeled antibody that reacts with a toxin-bound antibody may be used (layered ELISA method). The presence and / or amount of bound labeled antibody is an indication of the presence or amount of toxin A in the analyte.
Vielä erään analyysin mukaan toksiini A voidaan 30 havaita agglutinaatiomenetelmällä. Tällaisen menetelmän mukaisesti kiinteät hiukkaset, jotka on herkistetty toksiini A: lie monospesif isellä vasta-aineella, saatetaan kosketukseen analyytin kanssa, joka sisältää tai jonka epäillään sisältävän toksiini A:ta, ja toksiini A:n läsnä-35 ollessa aiheutuu tällaisten hiukkasten agglutinaatio.According to another analysis, toxin A can be detected by an agglutination method. According to such a method, solid particles sensitized to a toxin A monospecific antibody are contacted with an analyte containing or suspected of containing toxin A, and agglutination of such particles occurs in the presence of toxin A.
Il li 81 3 6 6Il li 81 3 6 6
Agglutinaatiomääritys on myös sopiva toksiini B:n havaitsemiseen käyttäen toksiini B:lle monospesifisiä vasta-aineita toksiini A:lie monospesifisten vasta-aineiden sijasta.An agglutination assay is also suitable for detecting toxin B using antibodies specific for toxin B instead of monospecific antibodies to toxin A.
5 Vielä erään toisen menetelmän mukaan toksiini A5 According to yet another method, toxin A
voidaan määrittää estämällä agglutinaatiomenetelmää saattamalla puhtaalle toksiini A:lie herkistyneet kiinteät hiukkaset (tai karkealle toksiini A: ta sisältävälle C. difficile-toksiinille herkistyneet) kosketukseen sekä ana-10 lyytin kanssa, joka sisältää tai jonka epäillään sisältävän toksiini A:ta, että C. difficilen monospesifisten vasta-aineiden kanssa, jolloin toksiini A: n läsnäollessa ana-lyytissä monospesifisillä vasta-aineilla tapahtuva herkistyneiden hiukkasten agglutinaatio estyy.can be determined by inhibiting the agglutination method by contacting pure toxin A-sensitized solid particles (or sensitizing to coarse toxin A-containing C. difficile toxin) with both an analyte containing or suspected of containing toxin A and C. difficile monospecific antibodies, thereby preventing agglutination of sensitized particles by monospecific antibodies in the presence of toxin A in the analyte.
15 Tätä menetelmää voidaan käyttää myös määritettäessä toksiini B:tä herkistämällä hiukkaset karkealle toksiinille ja käyttämällä toksiini B:lle monospesifistä vasta-ainetta.This method can also be used to determine toxin B by sensitizing the particles to a coarse toxin and using a monospecific antibody to toxin B.
Lisämuunnoksena menetelmää voidaan käyttää määrit-20 tämään myrkyllinen C. difficile (toksiini A ja/tai toksiini B) käyttämällä vasta-ainetta myrkylliselle C. diffi-cilelle (seos, jossa on toksiini A:lie monospesifinen vasta-aine ja toksiini B:lle monospesifinen vasta-aine, joilla ei ole määrättyjä paikkoja myrkyttömille antigeeneil-25 le). Käyttämällä tällaisten monospesifisten vasta-aineiden seosta on mahdollista määrittää toksiini A:n ja toksiini B:n läsnäolo näytteessä.As a further modification, the method can be used to determine toxic C. difficile (toxin A and / or toxin B) using an antibody to toxic C. diffile (a mixture of a toxin A monospecific antibody and a toxin B monospecific antibody). antibody that does not have specific sites for non-toxic antigens (25 le). Using a mixture of such monospecific antibodies, it is possible to determine the presence of toxin A and toxin B in a sample.
Tätä keksintöä kuvataan edelleen seuraavien esimerkkien avulla.The present invention is further illustrated by the following examples.
30 Esimerkki 1 Tämä esimerkki kohdistuu toksiini A:lie monospesi-fisen vasta-aineen valmistukseen, ja toksiini B:lle mono-spesifisen vasta-aineen valmistukseen.Example 1 This example is directed to the production of a monospecific antibody to toxin A, and to the production of a monospecific antibody to toxin B.
12 81 3 6 612 81 3 6 6
Bakteerit ja kasvuolosuhteet 2 litran aivo-sydän-infuusio-dialyysiputkellisiin pulloihin siirrostettiin 0,1 ml C. difficile VPI-kannan 11186 (myrkytön) ja C. difficile VPI-kannan 10463 (myrkyl-5 linen) aktiivisesti kasvavia viljelmiä, ja pulloja inku-boitiin 37°C:ssa 3 päivää. Solut saatiin dialyysipussin sisältä sentrifugoimalla sisältö (9 000 x g, 15 minuuttia ).Bacteria and growth conditions In 2-liter cerebral-infusion-dialysis tubes, 0.1 ml of actively growing cultures of C. difficile VPI strain 11186 (non-toxic) and C. difficile VPI strain 10463 (toxic) were inoculated, and the flasks were incubated. at 37 ° C for 3 days. Cells were obtained from inside a dialysis bag by centrifugation of the contents (9,000 x g, 15 minutes).
Solujen keitetyn pesunesteen valmistus (BCW) -10 Sepharosffi toksiini A (Tox A) - Sepharose®, toksiini B (Tox B)_- Sepharosd®Preparation of boiled cell wash (BCW) -10 Sepharosffi toxin A (Tox A) - Sepharose®, toxin B (Tox B) _- Sepharosd®
Kannan 10463 pakatut solut (noin 15 ml saatuna 12 pullosta) pestiin 3 kertaa (30 ml/pesu) 0,1 M NaHC03/0,5 M NaCl-liuoksella (pH 8). Solujen pesunesteet yhdistettiin 15 ja seosta kuumennettiin 100°C:ssa 15 minuuttia. Saostunut aine poistettiin sentrifugoimalla (12 000 x g, 30 minuuttia) ja neste sakan yltä (n. 34 mg proteiinia 90 ml:ssa) lisättiin 60 mlraan Sepharose!® 4B:tä (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi), joka oli aktivoitu 18 g:11a CNBr. 20 Suspensiota sekoitettiin hiukan 4°C:ssa yön yli ja liittymätön aine poistettiin pesemällä geeli pylvään tilavuudella 0,1 M NaHC03/0,5 M NaCl-liuosta. Pesunesteen proteiini-analyysi osoitti, että geelivalmiste sisälsi noin 0,3 mg proteiinia ml:ssa geeliä. Sepharos^-geelissä jäljellä ole-25 vat aktiiviset ryhmät salvattiin lisäämällä pylvään tilavuus 1 M etanoliamiinia (pH 8) ja sekoittamalla geeliä 4°C:ssa yön yli. Geeli, merkitty BCW-Sepharose, pestiin 4 kertaa vaihtelevilla tilavuuksilla (2 pylvään tilavuutta-/pesu) 0,1 M natriumasetaatti/0,5 M. NaCl-liuosta (pH 4) ja 30 0,1 M NaHCOj/O, 5 M NaCl-liuosta (pH 8).The packed cells of strain 10463 (approximately 15 ml obtained from 12 flasks) were washed 3 times (30 ml / wash) with 0.1 M NaHCO 3 / 0.5 M NaCl solution (pH 8). The cell washes were combined and the mixture was heated at 100 ° C for 15 minutes. The precipitate was removed by centrifugation (12,000 xg, 30 minutes) and the supernatant (ca. 34 mg of protein in 90 ml) was added to 60 ml of Sepharose® 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) activated 18 g: 11a CNBr. The suspension was stirred slightly at 4 ° C overnight and unbound material was removed by washing the gel with a column volume of 0.1 M NaHCO 3 / 0.5 M NaCl solution. Protein analysis of the washing liquid showed that the gel preparation contained about 0.3 mg of protein per ml of gel. The remaining active groups on the Sepharos® gel were blocked by adding a column volume of 1 M ethanolamine (pH 8) and stirring the gel at 4 ° C overnight. The gel, labeled BCW-Sepharose, was washed 4 times with varying volumes (2 column volumes / wash) of 0.1 M sodium acetate / 0.5 M NaCl solution (pH 4) and 0.1 M NaHCO 3 / 0.5 M NaCl solution (pH 8).
Osittain puhdistettu toksiini A ja toksiini B valmistettiin ioninvaihtokromatografialla DEAE-Sepharosd® Cl-6B:llä (Pharmacia Fine Chemicals) kuten on kuvattu esimerkissä 2, ja jokaista valmistetta dialysoitiin yön yli 35 4°C:ssa 0,1 M NaHC03/0,5 M NaCl-liuosta vastaan. ToksiiniPartially purified toxin A and toxin B were prepared by ion exchange chromatography on DEAE-Sepharosd® Cl-6B (Pharmacia Fine Chemicals) as described in Example 2, and each preparation was dialyzed overnight at 35 ° C with 0.1 M NaHCO 3 / 0.5 M against NaCl solution. The toxin
IIII
i3 81 3 6 6 A (noin 3,3 mg proteiinia 20 ml:ssa) ja toksiini B (noin 1,1 mg proteiinia 20 ml:ssa) liitettiin molemmat kuten on kuvattu BCW-Sepharoselle 20 ml:aan Sepharos^) 4B: tä, joka oli aktivoitu 7 g:11a CNBr. Proteiinianalyysit pesunes-5 teistä osoittivat, että Tox A-Sepharose ja Tox B-Sepharose sisälsivät 170 yg proteiinia ja vastaavasti 54 yg proteiinia ml:ssa geeliä.i3 81 3 6 6 A (about 3.3 mg protein in 20 ml) and toxin B (about 1.1 mg protein in 20 ml) were both combined as described for BCW-Sepharose in 20 ml Sepharos ^) 4B: activated with 7 g of CNBr. Protein analyzes of the wash 5 showed that Tox A-Sepharose and Tox B-Sepharose contained 170 μg of protein and 54 μg of protein per ml of gel, respectively.
Toksiini A:n ja toksiini B:n vastaisten monospesi-fisten antiseerumien puhdistus 10 Valmistettiin vuohen antiseerumi kuten aikaisemmin kuvattiin, käyttäen jäähdytettyä formaldehydiä (M. Ehrich, R. L. Van Tassell, J. M. Libby ja T. D. Wilkins, 1980; Production of Clostridium difficile antitoxin; Infect. Im-mun. 28, ss. 1041 - 1043) karkeata toksiini A:ta ja tok-15 siini B:tä sisältävää C. difficile-toksiinivalmistetta vastaan. Antiseerumia (5 ml) lisättiin suspensioon, jossa oli kannan 11186 soluja (1,5 ml pakattuja soluja 3 ml:ssa 0,85-%:ista NaCl) ja seos homogenisoitiin varovasti Potter Elvehjam-kudosjauhimella ja pyöritettiin sitten 2 tuntia 20 huoneen lämpötilassa. Solut poistettiin sitten sentrifu-goimalla (12 000 x g, 30 minuuttia) ja sakan yllä oleva neste vietiin 0,45 ym:n kalvon läpi ja konsentroitiin IX:een Minicon B15-konsentroijalla (Amicon Corp., Lexington, Mass., USA). Kannan 11186 solu-absorboitu antiseerumi 25 (4,1 ml) pantiin BCW-Sepharose-pylvääseen (1,5 x 31,4 cm) ja absorboitumaton aine eluoitiin huoneen lämpötilassa 2 pylvään tilavuudella 0,1 M NaHC03/0,5 M NaCl-liuosta (pH 8) virtausnopeudella 40 ml/min. Eluaatti konsentroitiin IX:een ultrasuodatuksella solusekoituslaitteessa, jossa 30 oli PM 10-kalvosuodatin (Amicon Corp.). BCW-Sepharose- eluaatti (4,1 ml) jaettiin 2 erään, jotka pantiin Tox A-Sepharose- ja Tox B-Sepharose-pylväisiin (1 x 25 cm). Absorboitumaton aine eluoitiin huoneen lämpötilassa jokaisesta pylväästä 2 pylvään tilavuudella 0,1 M NaHC03/0,5 M 35 NaCl-liuosta (pH 8) virtausnopeudella 40 ml/min. Eluaatit konsentroitiin lX:een ultrasuodatuksella.Purification of monospecific antisera against toxin A and toxin B Goat antiserum was prepared as previously described using chilled formaldehyde (M. Ehrich, RL Van Tassell, JM Libby, and TD Wilkins, 1980; Production of Clostridium difficile antitoxin; Infect Immun. 28, pp. 1041-1043) against a C. difficile toxin preparation containing coarse toxin A and toxin-15 B. Antiserum (5 ml) was added to a suspension of strain 11186 cells (1.5 ml packaged cells in 3 ml of 0.85% NaCl) and the mixture was gently homogenized with a Potter Elvehjam tissue grinder and then spun for 2 hours at 20 room temperature. The cells were then removed by centrifugation (12,000 x g, 30 minutes) and the supernatant was passed through a 0.45 μm membrane and concentrated to IX on a Minicon B15 concentrator (Amicon Corp., Lexington, Mass., USA). Cell-absorbed antiserum 25 (4.1 mL) of strain 11186 was applied to a BCW-Sepharose column (1.5 x 31.4 cm) and the unabsorbed material was eluted at room temperature with 2 column volumes of 0.1 M NaHCO 3 / 0.5 M NaCl. solution (pH 8) at a flow rate of 40 ml / min. The eluate was concentrated to IX by ultrafiltration in a cell mixer equipped with a PM 10 membrane filter (Amicon Corp.). The BCW-Sepharose eluate (4.1 ml) was divided into 2 aliquots which were applied to Tox A-Sepharose and Tox B-Sepharose columns (1 x 25 cm). The unabsorbed material was eluted at room temperature from each column with 2 column volumes of 0.1 M NaHCO 3 / 0.5 M NaCl solution (pH 8) at a flow rate of 40 ml / min. The eluates were concentrated to 1x by ultrafiltration.
1« 813661 «81366
Tox A-Sepharoseen ja Tox B-Sepharoseen sitoutuneiden vasta-aineiden eluointiElution of antibodies bound to Tox A-Sepharose and Tox B-Sepharose
Kun absorboitumaton aine oli eluoitu Tox A-Sepharo-sesta ja Tox B-Sepharosesta, pylväät pestiin 0,1 M NaHC03/ 5 0,5 M NaCl-liuoksella (pH 8), kunnes ei ollut enää mitään havaittavaa absorbanssia 280 nm:ssä. Geeleihin sitoutuneet vasta-aineet eluoitiin käyttämällä 5 ml 3,5 M KSCN (pH 6,8) jokaiseen pylvääseen ja pesemällä 0,1 M NaHC03/0,5 M NaCl-liuoksella. Noin 2 pylvään tilavuutta kerättiin jo-10 kaisesta pylväästä. Eluaatit dialysoitiin 4 l:aa vastaan 0,1 M boraattipuskuroitua suolaliuosta (pH 5,8) 4°C:ssa yön yli ja konsentroitiin IXreen ultrasuodatuksella.After the unabsorbed material was eluted from Tox A-Sepharose and Tox B-Sepharose, the columns were washed with 0.1 M NaHCO 3/5 0.5 M NaCl solution (pH 8) until there was no more detectable absorbance at 280 nm. Antibodies bound to the gels were eluted using 5 ml of 3.5 M KSCN (pH 6.8) on each column and washed with 0.1 M NaHCO 3 / 0.5 M NaCl solution. Approximately 2 column volumes were collected from already 10 columns. The eluates were dialyzed against 4 L of 0.1 M borate buffered saline (pH 5.8) at 4 overnight and concentrated by IXreen ultrafiltration.
Tox A-Sepharose-pylväästä eluoitu vasta-aine on monospesifinen vasta-aine C-difficilen toksiini A:lie ja 15 Tox B-Sepharose-pylväästä eluoitu vasta-aine on monospesi-finen vasta-aine C-difficilen toksiini Brlle.The antibody eluted from the Tox A-Sepharose column is a monospecific antibody to C-difficile toxin A and the antibody eluted from the Tox B-Sepharose column is a monospecific antibody to C-difficile toxin Br.
IgG-fraktion puhdistusPurification of the IgG fraction
Tox A-Sepharose- ja Tox B-Sepharose-pylväästä eluoidut vasta-aineet puhdistettiin kromatografialla DEAE 20 Affi-Gel Blue'11a (Bio-Rad Laboratories, Rockville Centre, NY, USA) valmistajan suosittelemalla kanin IgG:n puhdistukseen sopivalla tavalla.Antibodies eluted from the Tox A-Sepharose and Tox B-Sepharose columns were purified by chromatography on DEAE 20 Affi-Gel Blue'11a (Bio-Rad Laboratories, Rockville Center, NY, USA) as recommended by the manufacturer for the purification of rabbit IgG.
Antiseeruminäytteet (2 ml) pantiin DEAE Affi-Gel Blue-pylvääseen (1 x 31,8 cm) ja eluoitiin virtausnopeu-25 della 20 ml/h. Fraktiot (2 ml), jotka sisälsivät puhdistettua IgG, yhdistettiin ja konsentroitiin IXreen ultra-suodatuksella .Antiserum samples (2 ml) were applied to a DEAE Affi-Gel Blue column (1 x 31.8 cm) and eluted at a flow rate of 20 ml / h. Fractions (2 mL) containing purified IgG were combined and concentrated by IXreen ultrafiltration.
Esimerkki 2 Tämä esimerkki kohdistuu C. difficilen puhtaaseen 30 toksiini A:hän.Example 2 This example is directed to the pure toxin A of C. difficile.
Bakteerikantabacterial strain
Clostridium difficile VPI-kantaa 10463 kasvatettiin 2 litran aivo-sydän-infuusio (BHI)-dialyysipulloissa 72 tuntia 37°Crssa. Kun oli sentrifugoitu (8 000 x g, 10 mi-35 nuuttia) ja suodatettu 0,45 pmrn kalvosuodattimen läpiClostridium difficile VPI strain 10463 was grown in 2-liter brain-heart infusion (BHI) dialysis bottles for 72 hours at 37 ° C. After centrifugation (8,000 x g, 10 ml-35 minutes) and filtration through a 0.45 pmrn membrane filter
IIII
15 81 366 (Millipore Corp., Bedford, MA, USA), viljelmän neste (noin 750 ml) konsentroitiin 50 ml:ksi ultrasuodatuksella 4°C:ssa käyttäen XM-100-kalvosuodatinta (Amicon Corp.) kanavatyyp-pisellä konsentroijalla. Pidättynyt aine pestiin 1 500 5 ml:11a 50 mM TRIS-HCl-puskuria (pH 7,5) (4°C) ja konsentroitiin lopulliseen tilavuuteen 40 - 50 ml. Tämä poisti monia pienimolekyylipainoisia epäpuhtauksia. Konsentroitu neste ladattiin 2,5 x 10 cm:n DEAE-Sepharos^Cl-6B-pylvää-seen, joka oli tasapainotettu 50 mM TRIS-HCl:lla (pH 7,5). 10 Näytteen latauksen jälkeen pylväs pestiin 200 ml:11a 50 mM TRIS-HC1 (pH 7,5), joka sisälsi 0,05 M NaCl. Näyte eluoi-tiin ensin 300 ml:n suoralla NaCl-gradientilla 50 mM TRIS-HCl-puskurissa (0,05 - 0,25 m NaCl) ja sen jälkeen 150 ml:11a 50 mM TRIS-HC1 (pH 7,5), joka sisälsi 0,3 M NaCl. 15 Toinen 300 ml:n suora gradientti (0,3 - 0,6 M NaCl) samassa puskurissa seurasi 0,3 M NaCl-pesua. Pylväiden virtausnopeus oli 55 - 60 ml/h (painovoima) 4°C:ssa. Fraktiot (4,2 ml) kerättiin ja analysoitiin solumyrkkyjen suhteen käyttäen CHO-KI-soluja.15 81 366 (Millipore Corp., Bedford, MA, USA), the culture liquid (about 750 ml) was concentrated to 50 ml by ultrafiltration at 4 ° C using an XM-100 membrane filter (Amicon Corp.) with a channel type concentrator. The retained material was washed with 1,500 5 mL of 50 mM TRIS-HCl buffer (pH 7.5) (4 ° C) and concentrated to a final volume of 40-50 mL. This removed many low molecular weight impurities. The concentrated liquid was loaded onto a 2.5 x 10 cm DEAE-Sepharos® Cl-6B column equilibrated with 50 mM TRIS-HCl (pH 7.5). After loading the sample, the column was washed with 200 ml of 50 mM TRIS-HCl (pH 7.5) containing 0.05 M NaCl. The sample was eluted first with a 300 ml direct NaCl gradient in 50 mM TRIS-HCl buffer (0.05-0.25 m NaCl) and then with 150 ml of 50 mM TRIS-HCl (pH 7.5). containing 0.3 M NaCl. A second 300 ml straight gradient (0.3-0.6 M NaCl) in the same buffer was followed by 0.3 M NaCl washing. The column flow rate was 55-60 ml / h (gravity) at 4 ° C. Fractions (4.2 mL) were collected and analyzed for cytotoxicity using CHO-KI cells.
20 Fraktiot, jotka sisälsivät korkeimmat solumyrkky- tiitterit, yhdistettiin, suodatussteriloitiin ja säilytettiin 4°C:ssa. Toksiinit, jotka eluoituivat ensimmäisessä ja toisessa NaCl-gradientissa, merkittiin toksiini A:ksi ja toksiini B:ksi, ja ne ovat osittain puhdistettua toksiini 25 A:ta ja toksiini B:tä.Fractions containing the highest cytotoxic titers were pooled, filter sterilized and stored at 4 ° C. The toxins eluting in the first and second NaCl gradients were designated toxin A and toxin B and are partially purified toxin 25 A and toxin B.
5 - 10 ml toksiinifraktioita ensimmäisestä DEAE-gradientista (toksiini A) dialysoitiin 1 litraa vastaan 0,01 M natriumasetaattipuskuria (pH 5,5) 4°C:ssa 18 - 24 tuntia. Dialysoitu aine sentrifugoitiin (169 x g, 10 mi-30 nuuttia) sakan saamiseksi ja pestiin sitten 5 ml:11a samaa asetaattipuskuria ja sentrifugoitiin jälleen. Sakka liuotettiin 5-10 ml:aan 50 mM TRIS-HC1 (pH 7,5), joka sisälsi 0,05 M NaCl, ja puhtaan toksiini A:n liuos suodatussteriloitiin ja säilytettiin 4°C:ssa.5 to 10 ml of toxin fractions from the first DEAE gradient (toxin A) were dialyzed against 1 liter of 0.01 M sodium acetate buffer (pH 5.5) at 4 ° C for 18 to 24 hours. The dialyzed material was centrifuged (169 x g, 10 ml-30 minutes) to obtain a precipitate and then washed with 5 ml of the same acetate buffer and centrifuged again. The precipitate was dissolved in 5-10 ml of 50 mM TRIS-HCl (pH 7.5) containing 0.05 M NaCl, and the pure toxin A solution was filter sterilized and stored at 4 ° C.
ie 81366ie 81366
Esimerkki 3Example 3
Seuraavia puskureita käytetään analysoitaessa toksiini A:ta ja toksiini B:tä.The following buffers are used to analyze toxin A and toxin B.
Karbonaattipuskuri (pinnoitepuskuri) 5 1,59 g Na2C03 2,93 g NaHC03 0,20 g NaN3 täytä litraksi dH20:lla (pH 9,6); säilytä huoneen lämpötilassa (käytä 2 viikon ku-10 luessa).Carbonate buffer (coating buffer) δ 1.59 g Na 2 CO 3 2.93 g NaHCO 3 0.20 g NaN 3 fill to one liter with dH 2 O (pH 9.6); store at room temperature (use within 2 weeks of reading).
Fosfaattipuskuroitu suolaliuos-Tweeri^ 20 (PBS-T) 8,0 g NaCl 0,2 g KH2P04 2,9 g Na2HOP4 . 12 H20 (2,2 g Na2HOP4 . 7 H20 15 0,2 g KC1 0,5 ml TweeiP* 20 (polyoksietyleenisorbitaanimono-lauraatti) 0,2 g NaN3 täytä litraksi dH20:lla (pH 7,4) 20 Dietanoliamiinipuskuri (emäksiselle fosfataasisubstraeitil-le) 97 ml dietanoliamiinia 800 ml dH20 0,2 g NaN3 25 100 mg MgCl2 . 6 H20 titraa pH-arvoon 9,8 1 M HCl:lla ja täytä tilavuus litraksi dH20:11a; säilytä tummassa pullossa huoneen lämpötilassa; substraattiliuokseksi lisää 1 g substraattia ml:aan 30 puskuria.Phosphate buffered saline-Tweer® 20 (PBS-T) 8.0 g NaCl 0.2 g KH 2 PO 4 2.9 g Na 2 HOP 4. 12 H 2 O (2.2 g Na 2 HOP 4. 7 H 2 O 15 0.2 g KCl 0.5 ml TweeiP * 20 (polyoxyethylene sorbitan mono-laurate) 0.2 g NaN3 fill to one liter with dH2O (pH 7.4) 20 Diethanolamine buffer (for basic phosphatase substrate) -le) 97 ml diethanolamine 800 ml dH 2 O 0.2 g NaN 3 25 100 mg MgCl 2 6 H 2 O titrate to pH 9.8 with 1 M HCl and make up to 1 liter with dH 2 O, store in a dark flask at room temperature, add substrate solution 1 g of substrate per ml of 30 buffers.
Clostridium difficilen toksiini A:n ja toksiini B:n määritys: 1) Lisää 200 μΐ 1/10 000 laimennusta (karbonaattipus kurissa; pH 9,6) kanin antiseerumia (vasta-aine C. diffi-35 cilelle) jokaiseen Dynatech Immulon 2-tyyppisen mikrotiit-terilevyn koloon. Inkuboi 4°C:ssa yön yli.Determination of Clostridium difficile toxin A and toxin B: 1) Add 200 μΐ 1 / 10,000 dilutions (in carbonate buffer; pH 9.6) of rabbit antiserum (antibody to C. diffi-35 cilele) to each Dynatech Immulon 2- to the well of a microtite blade of the type. Incubate at 4 ° C overnight.
Il 81366 2) Tyhjennä levy ja lisää 200 mg PBS-T, joka sisältää 0,5 % naudan seerumin albumiinia, jokaiseen koloon. Inku-boi levyä 37°C:ssa 30 minuuttia.Il 81366 2) Empty the plate and add 200 mg PBS-T containing 0.5% bovine serum albumin to each well. Incubate the plate at 37 ° C for 30 minutes.
3) Tyhjennä levy ja lisää 200 μΐ PBS-T jokaiseen ko-5 loon. Inkuboi huoneen lämpötilassa 5 minuuttia.3) Empty the plate and add 200 μΐ PBS-T to each well. Incubate at room temperature for 5 minutes.
4) Tyhjennä levy ja lisää 200 μΐ näytteen laimennusta tai toksiinin laimennusta (1:2) PBS-T:ssä koloihin. Inkuboi levyä joko 37°C:ssa 1 tunti tai huoneen lämpötilassa yön yli.4) Empty the plate and add 200 μΐ sample dilution or toxin dilution (1: 2) in PBS-T to the wells. Incubate the plate either at 37 ° C for 1 hour or at room temperature overnight.
10 5) Tyhjennä levy ja pese jokainen kolo 3 kertaa PBS-T:llä.10 5) Empty the plate and wash each well 3 times with PBS-T.
6) Lisää 200 μΐ 1/1 000 laimennusta PBS-T:ssä monospe- sifistä vasta-ainetta joko toksiini A:lie tai toksiini B:lle jokaiseen koloon. Inkuboi levyä 37°C:ssa 1 tunti.6) Add 200 μΐ 1/1000 dilution in PBS-T of monospecific antibody to either toxin A or toxin B in each well. Incubate the plate at 37 ° C for 1 hour.
15 7) Tyhjennä levy ja pese jokainen kolo 3 kertaa PBS-T:llä.15 7) Empty the plate and wash each well 3 times with PBS-T.
8) Lisää 200 μΐ 1/800 laimennusta PBS-T:ssä kanin an- tivuohi-IgG:tä liitettynä emäksiseen fosfataasiin, jokaiseen koloon. Inkuboi levyä 37°C:ssa 1 tunti.8) Add 200 μΐ 1/800 dilution in PBS-T to rabbit anti-goat IgG coupled to alkaline phosphatase in each well. Incubate the plate at 37 ° C for 1 hour.
20 9) Tyhjennä levy ja pese jokainen kolo 3 kertaa PBS-T:llä.20 9) Empty the plate and wash each well 3 times with PBS-T.
10) Lisää 200 μΐ p-nitrofenyylifosfaattia (1 mg/ml di-etanoliamiinipuskurissa) jokaiseen koloon. Inkuboi levyä huoneen lämpötilassa 1 tunti.10) Add 200 μΐ p-nitrophenyl phosphate (1 mg / ml in diethanolamine buffer) to each well. Incubate the plate at room temperature for 1 hour.
25 11) Lisää 20 μΐ 5 N NaOH jokaiseen koloon reaktion lo pettamiseksi .11) Add 20 μΐ 5 N NaOH to each well to complete the reaction.
12) Sekoita sisällöt jokaisesta kolosta 0,8 ml:n kanssa dH20 (kokonaistilavuus koeseoksessa noin 1 ml) ja mittaa absorbanssi 405 nm:ssä.12) Mix the contents of each well with 0.8 ml of dH 2 O (total volume in the test mixture about 1 ml) and measure the absorbance at 405 nm.
30 Tämä keksintö on erityisen edullinen siksi, että sillä on mahdollista tuottaa vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä vain C. difficile-toksiineille. Lopputuloksena tarjotaan käyttöön menetelmä, jolla on tarkoitus määrittää näiden toksiinien läsnäolo, pikemmin kuin C. difficilen 35 läsnäolo, mikä vähentää tai poistaa väärät positiiviset tulokset.This invention is particularly advantageous because it makes it possible to produce antibodies that are specific only for C. difficile toxins. As a result, a method is provided for determining the presence of these toxins, rather than the presence of C. difficile, which reduces or eliminates false positive results.
18 81 36618 81 366
Edelleen tämä keksintö tarjoaa sen edun, että se sallii menetelmän, joka voidaan suunnata joko jompaan kumpaan toksiineista tai molempiin toksiineihin.Furthermore, the present invention offers the advantage of allowing a method that can be directed to either one of the toxins or to both toxins.
Esitetty toksiinien määritysmenetelmä on nopea ja 5 myös halvempi kuin aikaisemmat menetelmät.The presented method for the determination of toxins is fast and also cheaper than previous methods.
Lukuisat muunnokset ja variaatiot tästä keksinnöstä ovat mahdollisia edellä esitetyn tiedon valossa, ja siten oheisten vaatimusten alueella keksintöä voi käyttää muutenkin kuin nyt on erityisesti kuvattu.Numerous modifications and variations of this invention are possible in light of the above teachings, and thus, within the scope of the appended claims, the invention may be practiced otherwise than as specifically described herein.
IlIl
Claims (38)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI840949A FI81366C (en) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | Method for Obtaining Antibodies Specific to Clostr idium difficile Toxins and Using Antibodies in Methods for Determining Toxins |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI840949A FI81366C (en) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | Method for Obtaining Antibodies Specific to Clostr idium difficile Toxins and Using Antibodies in Methods for Determining Toxins |
| FI840949 | 1984-03-08 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI840949A0 FI840949A0 (en) | 1984-03-08 |
| FI840949A FI840949A (en) | 1985-09-09 |
| FI81366B true FI81366B (en) | 1990-06-29 |
| FI81366C FI81366C (en) | 1990-10-10 |
Family
ID=8518693
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI840949A FI81366C (en) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | Method for Obtaining Antibodies Specific to Clostr idium difficile Toxins and Using Antibodies in Methods for Determining Toxins |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FI (1) | FI81366C (en) |
-
1984
- 1984-03-08 FI FI840949A patent/FI81366C/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI840949A (en) | 1985-09-09 |
| FI840949A0 (en) | 1984-03-08 |
| FI81366C (en) | 1990-10-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4533630A (en) | Toxins and antibodies of C. difficile | |
| US4868109A (en) | Immunological antibody complex, its preparation and its use | |
| US3966898A (en) | Method and reagent for determining immunologic materials | |
| US4879218A (en) | Antibody for C.difficile | |
| CA1163193A (en) | Mycobacteria tuberculosis for immunoassay | |
| KR100756117B1 (en) | Monoclonal antibody, hybridoma, i?unoassay method and diagnosis kit | |
| US4575484A (en) | Binding assay for the detection of mycobacteria | |
| US4530833A (en) | Toxins and antibodies of C. difficile | |
| EP0153519B1 (en) | Toxins and antibodies of c. difficile | |
| CA2656756C (en) | Toxin detection method | |
| US4489158A (en) | Binding assay for the detection of mycobacteria | |
| Crane et al. | Bacillus licheniformis 749/C plasma membrane penicillinase, a hydrophobic polar protein | |
| Nickerson et al. | Indirect visualization of Staphylococcus aureus protein A | |
| FI81366B (en) | Process for obtaining antibodies which are specific for Clostridium difficile toxins, and the use of antibodies in processes for determining toxins | |
| CA2212711A1 (en) | Immunoassay method | |
| Peterkin et al. | Rapid enumeration of Staphylococcus aureus in foods by direct demonstration of enterotoxigenic colonies on membrane filters by enzyme immunoassay | |
| FI80712C (en) | FOERFARANDE FOER FRAMSTAELLNING AV RENT TOXIN A UR CLOSTRIDIUM DIFFICILE OCH EN ENLIGT FOERFARANDET FRAMSTAELLD PRODUKT. | |
| CN111748528B (en) | Hybridoma cell strain secreting monoclonal antibody against fipronil and metabolite thereof and application of hybridoma cell strain | |
| EP0154064A1 (en) | Toxins and antibodies of C. difficile | |
| CA1222695A (en) | Toxins and antibodies of clostridium difficile | |
| CA1237073A (en) | Toxins and antibodies of c.difficile | |
| Aleixo et al. | A fluorescent enzyme immunoassay for Salmonella detection | |
| CN105842448A (en) | Oriented antibody immunomagnetic beads of aflatoxin and preparation method and application of oriented antibody immunomagnetic beads | |
| JPS61228353A (en) | Immunological concentration determination method of amine, monochronal antibody and reagent set for executing said method | |
| WO1986002363A1 (en) | Monoclonal antibodies and their use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: LYERLY, DAVID MAXWELL Owner name: WILKINS, TRACY DALE |