FI80801B - KJJUGAT AV EN MONOCLONAL ANTIKROPP OCH ANVAENDNING. ELLER ETT FRAGMENT DAERAV OCH ETT KELATERANDE AEMNE, DESS FRAMSTAELLNING - Google Patents
KJJUGAT AV EN MONOCLONAL ANTIKROPP OCH ANVAENDNING. ELLER ETT FRAGMENT DAERAV OCH ETT KELATERANDE AEMNE, DESS FRAMSTAELLNING Download PDFInfo
- Publication number
- FI80801B FI80801B FI870122A FI870122A FI80801B FI 80801 B FI80801 B FI 80801B FI 870122 A FI870122 A FI 870122A FI 870122 A FI870122 A FI 870122A FI 80801 B FI80801 B FI 80801B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- fragment
- ett
- och
- antibody
- conjugate
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
8080180801
Monoklonaalisen vasta-aineen tai sen fragmentin ja kela-toivan aineen konjugaatti, sen valmistus ja käyttö Tämä keksintö koskee fluorisoivalla aineella merkattua monoklonaalisen vasta-aineen tai sen fragmentin ja kela-toivan aineen konjugaattia in vitro-diagnostiikkaa varten.This invention relates to a fluorescently labeled conjugate of a monoclonal antibody or fragment thereof and a chelating agent for in vitro diagnostics.
Immunologiset menetelmät ovat tulleet standardimenetelmiksi kliinisessä kemiassa, erikoisesti määritettäessä biologisesti aktiivisia yhdisteitä, joiden pitoisuudet ovat alhaisia. Radio-immunoassayt ovat eniten käytettyjä määritysmenetelmiä. Radioaktiivisille leimoille on etsitty vaihtoehtoja niiden terveydellisen haitan ja useissa tapauksissa lyhyen säilyvyysajan vuoksi. EP-hakemukset 0184899 ja 0186947 koskevat paramagneettisia varjoaineita in vivo-diagnostisia, esim. NMR- menetelmiä varten, joka aine erään keksinnön suoritusmuodon mukaan voi olla kela-toivan aineen kautta polymeeriseen tai polymeroituun hiilihydraattiin tai polymeroituun sokerialkoholiin tai sen johdannaiseen sidottu paramagneettinen metalli. Eräs vaihtoehto radioaktiivisille leimoille on fluorisoiva leima. Eräät lantanidi-ionit, erikoisesti Eu3+ ja Tb3+, muodostavat voimakkaasti fluorisoivia kelaatteja sopivien . . orgaanisten monihampaisten ligandien esim. etyleenidiami- notetraetikkahapon (EDTA) ja dietyleenitriaminopentaetik-kahapon (DTPA) kanssa.Immunological methods have become standard methods in clinical chemistry, especially for the determination of biologically active compounds at low concentrations. Radioimmunoassays are the most widely used assay methods. Alternatives to radiolabels have been sought due to their health disadvantage and, in many cases, short shelf life. EP applications 0184899 and 0186947 relate to paramagnetic contrast agents for in vivo diagnostic, e.g. NMR methods, which according to one embodiment of the invention may be a paramagnetic metal bound via a chelating agent to a polymeric or polymerized carbohydrate or polymerized sugar alcohol or a derivative thereof. One alternative to radioactive labels is a fluorescent label. Some lanthanide ions, especially Eu3 + and Tb3 +, form highly fluorescent chelates as appropriate. . with organic multi-toothed ligands e.g. ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and diethylenetriaminopentaacetic acid (DTPA).
Patenttijulkaisussa WO 84/03698 on kuvattu Eu3+:aa kela-toivia DTPA-johdannaisia, joita voidaan liittää vasta-aineisiin in vitro diagnostiikkaa varten. Kelatoivat yhdisteet, esim. N1- ja N2-(p-isotiosyanatobentsyyliJdietylee-nitriamiinitetraetikkahappo, syntetisoidaan työläällä ne-. . livaiheisella menetelmällä, jossa joudutaan käyttämään työturvallisuuden kannalta ärsyttäviä ja myrkyllisiä rea- 2 80801 gensseja (bromietikkahappo ja tiofosgeeni). Synteesin toisessa vaiheessa syntyy isomeeriseos. Isomeerit erotetaan toisistaan HPLCrllä ja synteesisarjaa jatketaan puhtailla isomeereillä. Eu3+ kelatoidaan synteesisarjan kolmanteen vaiheeseen (I Hemmilä et ai., Anal. Biochem. 197 (1984) 335), sekin monivaiheisesti.WO 84/03698 describes Eu3 + chelating DTPA derivatives that can be coupled to antibodies for in vitro diagnostics. The chelating compounds, e.g. The isomers are separated by HPLC and the synthetic sequence is continued with pure isomers, and Eu3 + is chelated to the third step of the synthetic sequence (I Hemmilä et al., Anal. Biochem. 197 (1984) 335), also in several steps.
DTTA:n isosyanaattijohdannaisen Eu3+-kelaatin annetaan reagoida vasta-aineen kanssa. Reaktio on hidas (yli yön, 4°C) ja konjugaatioaste on huono, noin 10 %, mistä johtuen reagenssia on käytettävä runsaasti ylimäärin (kelaat-ti/vasta-aine = 60:1). Tästä syystä sitoutumaton kelaatti on poistettava geelisuodatuksella. Tällä suhteella konju-gaatti sisältää 7 Eu3+/lgG.The Eu3 + chelate of the isocyanate derivative of DTTA is reacted with the antibody. The reaction is slow (overnight, 4 ° C) and the degree of conjugation is poor, about 10%, which means that a large excess of reagent must be used (chelate / antibody = 60: 1). For this reason, unbound chelate must be removed by gel filtration. In this ratio, the conjugate contains 7 Eu3 + / IgG.
US-patentti 4,454,106 koskee DTPA:n liittämistä vasta-aineeseen seka-anhydridimenetelmällä ja saadun konjugaatin leimaamista mm. fluorisoivalla metallilla, esim. Eu3+. Patentissa kuvatulla menetelmällä saadaan n. 1,5 DTPA/ IgG. Tämä sitoutumissuhde on saatu testaamalla H^In-• leimalla. Patentissa ei ole kuitenkaan esimerkkiä Eu3+:n : käytöstä leimana. Eu3+-leimauksesta ei ole myöskään kir- ; jallisuudessa esimerkkiä DTPA-anhydridien kohdalla, joten leimausta ei voida kuvitella suoritetun jollakin aikai-’ semmin kuvatulla tavalla. Lisäksi esim. TR-FIA:n herk- . . kyyttä ei saada vielä riittäväksi suhteella 1,5 Eu3+/lgG, vaan within-assay ja between-assay variaatiot ovat suuret .U.S. Patent 4,454,106 relates to the incorporation of DTPA into an antibody by a mixed anhydride method and the labeling of the resulting conjugate e.g. with a fluorescent metal, e.g. Eu3 +. The method described in the patent gives about 1.5 DTPA / IgG. This binding ratio has been obtained by testing with the H 2 In • label. However, the patent does not provide an example of the use of Eu3 + as a label. There is also no literature on Eu3 + labeling; example for DTPA anhydrides, so labeling cannot be imagined performed in any of the previously described ways. In addition, e.g., TR-FIA's sensitive. . capacity is not yet sufficient at a ratio of 1.5 Eu3 + / lgG, but within-assay and between-assay variations are large.
DTPA:ta on liitetty proteiineihin myös käyttäen DTPA:n i · 3 80801 syklistä anhydridiä (cDTPAA) (I), jonka kaava on 0 0 0 yH-CH2 ch28oh O N-CH2Ch2-n-CH2CH2-N O (i) C-CH^ \h,-/DTPA has also been attached to proteins using DTPA · 3 80801 cyclic anhydride (cDTPAA) (I) of formula 0 0 0 yH-CH2 ch28oh O N-CH2Ch2-n-CH2CH2-N O (i) C-CH ^ \ h, - /
H SH S
(Hnatowich et ai., Int. J. Appi. Radiat. Isot. 33 (1982) 327). US-julkaisu 4,479,930 (Hnatowich) koskee disyklisen anhydridin käyttöä kelatoivana aineena radioaktiivista metallia varten. Tarkoituksena on aikaansaada stabiileja radioaktiivisesti leimattuja biologisia molekyylejä in vivo-analyysejä varten. cDTPAA:n käytöllä on monia etuja. Se on helposti yhdellä vaiheella syntetisoitavissa oleva aine. Sitä on saatavissa myös kaupallisesti (Sigma, Aldrich). Se on yksiselitteinen kuivissa olosuhteissa stabiili aine toisin kuin seka-anhydridi (US-pat. 4,454,106), joka on valmistettava aina juuri ennen käyttöä. Menetelmän toistettavuus on epästabiilisuuden takia huono, ja syntyneelle anhydridille ei ole luotettavaa analyysimenetelmää.(Hnatowich et al., Int. J. Appl. Radiat. Isot. 33 (1982) 327). U.S. Patent No. 4,479,930 (Hnatowich) relates to the use of dicyclic anhydride as a chelating agent for a radioactive metal. The aim is to provide stable radiolabeled biological molecules for in vivo analyzes. There are many benefits to using cDTPAA. It is a substance that can be easily synthesized in one step. It is also commercially available (Sigma, Aldrich). It is an unambiguous dry stable substance unlike mixed anhydride (U.S. Pat. No. 4,454,106), which must always be prepared just before use. The reproducibility of the method is poor due to instability, and there is no reliable analytical method for the resulting anhydride.
Toisaalta cDTPAA on niukkaliukoinen yhdiste. Hnatowich on käyttänyt pienten cDTPAA-määrien annostelussa kloroformi-suspensiota. Epähomogeenisesta seoksesta annostelu ei ole kovin tarkkaa tällä menetelmällä.On the other hand, cDTPAA is a sparingly soluble compound. Hnatowich has used a chloroform suspension for the administration of small amounts of cDTPAA. Dosing from an inhomogeneous mixture is not very accurate by this method.
Tämän keksinnön mukaiselle konjugaatille on ominaista, että kelatoiva aine on mono- tai bisyklinen DTPA.The conjugate of this invention is characterized in that the chelating agent is mono- or bicyclic DTPA.
Time-resolved fluoroimmunoassay:ssa (TR-FIA) käytetään hyväksi eroa spesifisen signaalin ja ei-spesifisen taustan fluoresenssin elinaikojen välillä, jolloin signaali-. . kohinasuhde paranee. Melkein kaikissa julkaistuissa mene telmissä käytetään Eu3+ leimattua vasta-ainetta, josta 4 80801 sitoutunut Eu3+ kvantitoidaan dissosiatiivisen fluoresenssin kehittymisen jälkeen. Wallac-LKB on patentoinut DELFIA-menetelmän (Dissociative Eu Fluorescence Enhancement FIA (EP 64484).Time-resolved fluoroimmunoassay (TR-FIA) takes advantage of the difference between the fluorescence lifetimes of a specific signal and a non-specific background, resulting in a signal-. . the noise ratio improves. Almost all published methods use an Eu3 + -labeled antibody, of which 4 80801 bound Eu3 + is quantified after the development of dissociative fluorescence. Wallac-LKB has patented the DELFIA method (Dissociative Eu Fluorescence Enhancement FIA) (EP 64484).
Tämä keksintö yksinkertaistaa patentissa WO 84/03698 kuvattua menetelmää, jossa usealla synteesivaiheella saatu Eu3+-DTTA-kelaatti liitetään vasta-aineeseen 12 h:n reak-tioajalla +4°C:ssa. Tässä keksinnössä proteiinista muodostetaan ensin DTPA-konjugaatti mono- tai bisyklisellä anhydridillä. Bisyklinen anhydridi on joko kaupallinen tuote tai valmistettu Eckelmanin mukaan (Eckelman et ai., J. Pharm. Sei. 64 (1975) 704). Monosyklinen anhydridi on valmistettu Halpernin mukaan (Radioimmunoimaging and Ra-dioimmunotherapy, Ed. S W Burchiel & B A Rhodes, Elsevier 1983, s. 198-9). Tyypillisesti derivaattaa tehtäessä mono-tai bisyklinen anhydridi liuotetaan kuivaan DMSOihon, toisin kuin Hnatowich, jolloin täydellisen liukenemisen seurauksena pienien määrien pipetointitarkkuus on hyvä. Tästä homogeenisesta liuoksesta pipetoidaan sopiva määrä vasta-aineen bikarbonaattiliuokseen. Reaktioaika on l h huoneenlämpötilassa. Näin saatua vasta-aineen DTPA-deri-vaattaa voidaan käyttää erilaisiin diagnostisiin tarkoi- * . tuksiin in vitro ja in vivo.The present invention simplifies the method described in WO 84/03698, in which the Eu3 + -DTTA chelate obtained by several synthetic steps is coupled to an antibody with a reaction time of 12 hours at + 4 ° C. In the present invention, the protein is first formed into a DTPA conjugate with a mono- or bicyclic anhydride. Bicyclic anhydride is either a commercial product or prepared according to Eckelman (Eckelman et al., J. Pharm. Sci. 64 (1975) 704). The monocyclic anhydride has been prepared according to Halpern (Radioimmunoimaging and Radiimmunotherapy, Ed. S W Burchiel & B A Rhodes, Elsevier 1983, pp. 198-9). Typically, when making a derivative, the mono- or bicyclic anhydride is dissolved in dry DMSO, unlike Hnatowich, where complete pipetting has good pipetting accuracy due to complete dissolution. An appropriate amount of this homogeneous solution is pipetted into the bicarbonate solution of the antibody. The reaction time is 1 h at room temperature. The DTPA derivative of the antibody thus obtained can be used for various diagnostic purposes. in vitro and in vivo.
. TR-FIA:ssa Eu3+-kelaatin on oltava riittävän stabiili mutta helposti dissosioituva happamissa olosuhteissa. Mitä useampihampainen kompleksinmuodostaja on, sen stabiilimman kompleksin se muodostaa. Tällaisista komplekseista dissosioituminen on myös hidasta. On kuitenkin havaittu (I Hemmilä, Lanthanides as Probes for Time-resolved Fluo-rometric Immunoassays, Thesis 1986), että neljä kelatoi-vaa happoryhmää sisältävästä epäsymmetrisestä N'-bentsyy-li-DTTA:sta Eu3+ dissosioituu nopeammin (1 min) kuin vastaavasta symmetrisestä N2-bentsyyli-DTTA:sta (20 min).. In TR-FIA, the Eu3 + chelate must be sufficiently stable but easily dissociable under acidic conditions. The more toothed the complexing agent, the more stable the complex it forms. Dissociation from such complexes is also slow. However, it has been found (I Hemmilä, Lanthanides as Probes for Time-resolved Fluorometric Immunoassays, Thesis 1986) that asymmetric N'-benzyl-DTTA containing four chelating acid groups dissociates Eu3 + faster (1 min) than the corresponding from symmetric N2-benzyl-DTTA (20 min).
li 5 80801 Käytettäessä DTPA:n syklistä anhydridiä vasta-aineen DTPA-derivaatan valmistamisessa syntyy epäsymmetrinen, neljä kelatoivaa happoryhmää sisältävä konjugaatti (II), jonka rakenne on vastaava kuin N'-bentsyyli-DTTA-konju-gaatilla (III). Vain DTTA:n proteiiniin liittävä ryhmä ja sidos ovat erilaisetli 5 80801 The use of a cyclic anhydride of DTPA in the preparation of a DTPA derivative of an antibody gives an asymmetric conjugate (II) containing four chelating acid groups, the structure of which is similar to that of the N'-benzyl-DTTA conjugate (III). Only the protein-binding group and bond of DTTA are different
HOOCHOOC
j) ^H2 CHjCOOH yCHjCOOHj) H 2 CH 2 COOH y CH 2 COOH
Prot-NH-C-Nft/OVcH2“N-CH2CH2-N-CH2CH2N (III) ^—' CH2coohProt-NH-C-Nft / OVcH2 "N-CH2CH2-N-CH2CH2N (III) - CH2cooh
HOOCHOOC
p ch2 ch2cooh ch2cooh Prot-NH-C-H-CH2CH2Hl-CH2CH2“1i ch2cooh (II) Näin ollen syklisellä anhydridillä valmistettu vasta-aineen DTPA-derivaatta on verrattavissa N-bentsyyli-DTTA-derivaattaan käytettäväksi TR-FIA:aan. Syklisellä anhydridillä työskentely on yksinkertaisempaa ja hyvin paljon nopeampaa. Kaupallisen tai yhdellä helpolla synteesivai-heella valmistetun DTPA-anhydridin annetaan reagoida vasta-aineen kanssa 1 h huoneenlämmössä.p ch2 ch2cooh ch2cooh Prot-NH-C-H-CH2CH2H1-CH2CH2 “1i ch2cooh (II) Thus, a DTPA derivative of an antibody prepared with a cyclic anhydride is comparable to an N-benzyl-DTTA derivative for use in TR-FIA. Working with cyclic anhydride is simpler and very much faster. DTPA anhydride, commercially available or prepared in one easy synthetic step, is reacted with the antibody for 1 h at room temperature.
. . Ylimäärä DTPA:ta poistetaan dialysoimalla samalla kun puskuri vaihdetaan leimaukseen sopivaksi. Kelatoiva aine lisätään kaupallisesti edullisesti saatavana kloridina. EuCl3:ta ei tarvitse käyttää ylimäärin vaan testattua sopivaa määrää, joten geelisuodatusta ei tarvitse suorittaa. Sen sijaan patenttijulkaisussa WO 84/03698 kuvattu reagenssi valmistetaan työläästi neljällä synteesivai-heella. Synteesissä syntyy kaksi isomeeriä, joista vain toinen muodostaa nopeasti dissosioituvan Eu-kelaatin. Tästä seuraa, että käyttökelpoisen kelaatin saanto isomeerien erotuksen jälkeen on huono. Lisäksi, koska konju- β 80801 gaatioaste on huono, työläästi syntetisoitavan reagenssin kulutus on suuri. Lisäksi, koska kelatoitava metalli liitetään tässä keksinnössä viimeisessä vaiheessa, samaa vasta-aineen DTPA-konjugaattia voidaan käyttää eri diagnostisiin tarkoituksiin, sekä in vitro että in vivo valitsemalla metalli kuhunkin tarkoitukseen sopivaksi.. . Excess DTPA is removed by dialysis while changing the buffer to suit labeling. The chelating agent is added as a commercially available chloride. EuCl3 does not need to be used in excess but in a suitable amount tested, so gel filtration does not need to be performed. Instead, the reagent described in WO 84/03698 is laboriously prepared by four synthetic steps. Two isomers are formed in the synthesis, only one of which forms a rapidly dissociating Eu chelate. It follows that the yield of useful chelate after separation of the isomers is poor. In addition, due to the poor degree of conjugation of β 80801, the consumption of laboriously synthesized reagent is high. In addition, since the metal to be chelated is incorporated in the final step of this invention, the same antibody DTPA conjugate can be used for different diagnostic purposes, both in vitro and in vivo, by selecting the metal as appropriate for each purpose.
Johdannaisten teossa on käytetty PAP:n (Prostatic Acid Phosphatase) monoklonaalisen vasta-aineen puhdistettua F(ab')2-fragmenttia ja puhdistettua kokonaista vasta-ainetta sekä SHBG:n (Sex Hormone Binding Globulin) puhdistettua monoklonaalista vasta-ainetta. Bisyklinen DTPA on ollut Sigman valmistama. Mono cDTPA:n olemme valmistaneet itse. Dimetyylisulfoksidi (DMSO) on SNEA:n tai Aldrichrn valmistamaa.The purified F (ab ') 2 fragment of the PAP (Prostatic Acid Phosphatase) monoclonal antibody and the purified whole antibody and the purified monoclonal antibody of SHBG (Sex Hormone Binding Globulin) have been used in the derivation. Bicyclic DTPA has been manufactured by Sigma. We have made the mono cDTPA ourselves. Dimethyl sulfoxide (DMSO) is manufactured by SNEA or Aldrich.
Esimerkki 1 DTPA:n liittäminen monoklonaaliseen vasta-aineeseen 1) Proteiinin käsittelyExample 1 Coupling of DTPA to a monoclonal antibody 1) Protein treatment
Puhdistettu monoklonaalinen PAP-vasta-aine käytetään sellaisenaan tai pilkotaan pepsiinillä F(ab')2:ksi, joka puhdistetaan käyttäen proteiini-A-Sepharose-4B-affini-teetti-kromatografiaa. Saatu F(ab')2-fraktio (0,02 M PBS-puskurissa, pH 8,0) tai kokonainen monoklonaalinen vasta-aine (IgG) konsentroidaan Amiconin konsentrointilaitteel-la ja dialysoidaan NaHCO3-puskuriin, pH 8,0. Dialysoitu näyte kylmäkuivataan ja pakastetaan. F(ab')2 liuotetaan veteen juuri ennen käyttöä siten, että proteiinikonsen-; traatioksi tulee 10 mg/ml ja NaHC03:n konsentraatioksi 0,1 M. SHBG-vasta-aine on käytetty kokonaisena (IgG).The purified PAP monoclonal antibody is used as such or cleaved with pepsin to F (ab ') 2, which is purified using protein A-Sepharose-4B affinity chromatography. The resulting F (ab ') 2 fraction (0.02 M in PBS buffer, pH 8.0) or whole monoclonal antibody (IgG) is concentrated on an Amicon concentrator and dialyzed against NaHCO3 buffer, pH 8.0. The dialyzed sample is lyophilized and frozen. F (ab ') 2 is dissolved in water just before use so that the protein concentrate; the concentration becomes 10 mg / ml and the NaHCO 3 concentration becomes 0.1 M. The SHBG antibody has been used in its entirety (IgG).
li 7 80801 2) Derivaatan teko A. cDTPA/F(ab')2-derivaatta/lgG-derivaattali 7 80801 2) Derivatization A. cDTPA / F (ab ') 2 derivative / IgG derivative
Konjugaatioreaktiota varten cDTPAA liuotetaan kuivaan DMSO:iin, josta pipetoidaan haluttu määrä proteiiniliuok-seen. Liuosta sekoitetaan 30 s-1 min ja inkuboidaan huoneenlämmössä 1 tunti. Liuoksen pH tarkistetaan. Näyte dialysoidaan 0,1 M Na-sitraattipuskuriin, pH 5 vapaan DTPA:n poistamiseksi. Esim. cDTPA/F(ab')2/IgG = 5 tehtäessä cDTPA-DMSO-liuosta (17,85 mg/ml) pipetoidaan 5 /ui proteiiniliuokseen, jossa 5 mg F(ab')2 tai IgG/0,5 ml.For the conjugation reaction, cDTPAA is dissolved in dry DMSO, from which the desired amount is pipetted into the protein solution. The solution is stirred for 30 s-1 min and incubated at room temperature for 1 hour. The pH of the solution is checked. The sample is dialyzed against 0.1 M Na citrate buffer, pH 5 to remove free DTPA. For example, when making cDTPA / F (ab ') 2 / IgG = 5, a cDTPA-DMSO solution (17.85 mg / ml) is pipetted into a 5 μl protein solution with 5 mg F (ab') 2 or IgG / 0.5 ml .
Lisättäessä DMSOra proteiiniliuokseen on otettava huomioon, ettei DMS0:n määrä ole yli 5 % proteiiniliuoksen tilavuudesta .When adding DMSO to the protein solution, it must be taken into account that the amount of DMSO does not exceed 5% of the volume of the protein solution.
B. mono cDTPA/F(ab1)2-derivaatta/IgG-derivaattaB. mono cDTPA / F (ab1) 2 derivative / IgG derivative
Tehdään vastaavasti kuin syklinen derivaatta. Mono cDTPAA lisätään DMSO-liuoksessa proteiiniliuokseen.Made in the same way as a cyclic derivative. Mono cDTPAA in DMSO solution is added to the protein solution.
Esimerkki 2 PAP-vasta-aineen tai sen F(ab')2-fragmentin DTPA-konju-gaatin leimaus EuCl3:llaExample 2 Labeling of a DTPA conjugate of a PAP antibody or its F (ab ') 2 fragment with EuCl3
Leimaus suoritettiin käyttäen 10 M Eu:ta suhteessa vasta-aine-DTPA-konjugaattiin. Kun leimausta suoritetaan patentissa WO 84/03698 kuvatulla Eu-DTPA-johdannaiskelaatilla, käytetään sitä 160 M ylimäärin suhteessa vasta-aineeseen.Labeling was performed using 10 M Eu relative to the antibody-DTPA conjugate. When labeling with the Eu-DTPA derivative chelate described in WO 84/03698, it is used in an excess of 160 M relative to the antibody.
EuCl3 (Fluka 46130) liuotettiin 0,1 M natriumsitraatti-puskuriin, pH 5-6, 2,75 mg EuCl3/ml, 15 min ennen käyttöä. vasta-aineen tai sen fragmentin DTPA-konjugaatti liuotettuna 0,1 M natriumsitraattipuskuriin (10 mg konju- s 80801 gaatti/ml, pH 5-6) sekoitettiin sopivaan määrään EuCl3-natriumsitraattiliuosta ja inkuboitiin 1 h huoneenlämpö-tilassa. Leimaantumis-% on 98.EuCl 3 (Fluka 46130) was dissolved in 0.1 M sodium citrate buffer, pH 5-6, 2.75 mg EuCl 3 / ml, 15 min before use. the DTPA conjugate of the antibody or fragment thereof dissolved in 0.1 M sodium citrate buffer (10 mg conjugate 80801 gate / ml, pH 5-6) was mixed with an appropriate amount of EuCl 3 sodium citrate solution and incubated for 1 h at room temperature. The% staining is 98.
Esimerkki 3 SHBG-vasta-aineen DTPA-konjugaatin leimaus EuCl3:llaExample 3 Labeling of SHBG antibody DTPA conjugate with EuCl3
Vasta-aineen DTPA-johdannainen oli valmistettu käyttäen suhdetta DTPA/IgG = 20:1. EuCl3 (Fluka 46130) liuotettiin 0,1 M natriumsitraattipuskuriin pH:ssa 6. Leimaus suoritettiin käyttäen Eu:ta noin 10 M suhteessa IgG-DTPA-johdannaiseen huoneenlämpötilassa yhden tunnin ajan.The DTPA derivative of the antibody was prepared using a ratio of DTPA / IgG = 20: 1. EuCl 3 (Fluka 46130) was dissolved in 0.1 M sodium citrate buffer at pH 6. Labeling was performed using Eu at about 10 M relative to the IgG-DTPA derivative at room temperature for one hour.
Esimerkki 4Example 4
Vertailun vuoksi leimattiin SHBG-vasta-aine patenttijulkaisussa WO 84/03698 kuvatulla Eu-kelaatilla. Tällöin käytettiin Eu-kelaattia 160 M ylimäärin suhteessa vasta-, . aineeseen. Muut leimausolosuhteet olivat: 50mM K2HP04, pH = 9,4, inkubaatio yli yön +4eC:ssa. Leimatun vasta-aineen erotus suoritettiin geelisuodatuksella ylimääräisen : kelaatin poistamiseksi.For comparison, the SHBG antibody was labeled with the Eu chelate described in WO 84/03698. In this case, an excess of 160 M Eu chelate was used relative to the counterpart. material. Other labeling conditions were: 50 mM K 2 HPO 4, pH = 9.4, overnight incubation at + 4eC. Separation of labeled antibody was performed by gel filtration to remove excess: chelate.
Inkuboinnin jälkeen reaktioseos kaadettiin geelisuodatus-kolonniin (Sepharose 6B 1,5 cm x 30 cm, ylhäällä Sephadex 6-25, 1,5 cm x 5 cm). Eluointi suoritettiin käyttämällä 0,05 M Tris-HCl, 0,9 % NaCl, 0,1 % NaN3 (ph 7,75, 25°C) eluointipuskurina.After incubation, the reaction mixture was poured onto a gel filtration column (Sepharose 6B 1.5 cm x 30 cm, top Sephadex 6-25, 1.5 cm x 5 cm). Elution was performed using 0.05 M Tris-HCl, 0.9% NaCl, 0.1% NaN 3 (pH 7.75, 25 ° C) as elution buffer.
Fluoresenssi määritettiin siten, että otettiin 10 /ul:n näyte 200 /ul:aan Delfia Enhancement-liuosta. Ravistelun jälkeen mitattiin fluoresenssi Arcus fluorometrilla. Eu-; : pitoisuus laskettiin käyttämällä arvoa 0,2 pmol Eu = 106cps vertailuarvona.Fluorescence was determined by taking a 10 μl sample in 200 μl of Delfia Enhancement solution. After shaking, fluorescence was measured with an Arcus fluorometer. European Union-; : concentration was calculated using 0.2 pmol Eu = 106cps as a reference.
9 808019 80801
Vertailutulokset: Käytettäessä EuCL3-leimaa saatiin seuraavat määrä Eu-mo-lekyylejä kiinni vasta-aineisiin:Comparative results: Using the EuCL3 label, the following number of Eu molecules were attached to the antibodies:
Eu-molekyylit/proteiinimolekyylit cDTPA/F(ab')2 (5:1) 1,9-2,0 CDTPA/F(ab')2 (10:1) 2,7 cDTPA/IgG (10:1) 2,4 cDTPA/IgG (20:1) 3,7 (esim. 3) CDTPA/IgG (50:1) 6,9 m-CDTPA/IgG (300:1) 11,0Eu molecules / protein molecules cDTPA / F (ab ') 2 (5: 1) 1.9-2.0 CDTPA / F (ab') 2 (10: 1) 2.7 cDTPA / IgG (10: 1) 2 , 4 cDTPA / IgG (20: 1) 3.7 (e.g. 3) CDTPA / IgG (50: 1) 6.9 m-CDTPA / IgG (300: 1) 11.0
Patenttijulkaisun WO 84/03698 esimerkissä leimattaessa 60 M ylimäärällä Eu-kelaattia saadaan 7 Eu-molekyyliä/IgG ja nostettaessa suhdetta 160-500 M ylimäärin Eu-kelaattia ei suhde nouse yli 10 Eu-molekyyliä/IgG. Suhteella 160 M Eu-kelaattia ylimäärin saatiin 9,3 Eu-molekyyliä yhteen vasta-ainemolekyyliin (esim. 4).In the example of WO 84/03698, labeling with an excess of 60 M Eu chelate gives 7 Eu molecules / IgG and increasing the ratio of 160-500 M excess Eu chelate does not increase the ratio above 10 Eu molecules / IgG. An excess of 160 M Eu chelate gave 9.3 Eu molecules per antibody molecule (e.g. 4).
Esimerkkien 3 ja 4 leimat testattiin SHBG Delfia kit menetelmällä käyttäen suunnilleen samaa proteiinipitoisuutta molempien leimausten laimennuksessa. Tämä tarkoittaa lyhyesti sitä, että mikrotiitterilevyjen kaivot päällystettiin polyklonaalisilla anti-SHBG-vasta-aineilla. ver-tailutulokset ja leimaukset pipetoitiin kaivoihin ja in-kuboitiin, pestiin ja mitattiin Delfia Enhancement-liuos-ta käyttäen.The labels of Examples 3 and 4 were tested by the SHBG Delfia kit method using approximately the same protein concentration at dilution of both labels. Briefly, wells of microtiter plates were coated with polyclonal anti-SHBG antibodies. control results and labels were pipetted into wells and incubated, washed and measured using Delfia Enhancement.
80801 SHBG-vertailuliuokset EuCl3-leimaus Eu-kelaatti-leimaus nmol/1 (esim. 3) cps (esim. 4), cps 0 3197 4281 6,25 43535 81940 12,5 77255 147983 25 146026 263334 50 238831 442793 100 389177 841566 200 787518 1579440 SHBGtn TR-FIA toimi samalla tavoin molemmilla leimauksilla ja niiden erotuskyky eri standardien suhteen oli yhtä hyvä.80801 SHBG reference solutions EuCl3 labeling Eu chelate labeling nmol / l (e.g. 3) cps (e.g. 4), cps 0 3197 4281 6.25 43535 81940 12.5 77255 147983 25 146026 263334 50 238831 442793 100 389177 841566 200 787518 1579440 SHBGtn TR-FIA worked similarly on both labels and had equally good resolution with respect to different standards.
Erään sovellutuksen mukaan keksintö koskee myös menetelmää kelatoivan aineen ja biologisen molekyylin välisen konjugaattiasteen määrittämiseksi. Konjugaattiasteella tarkoitetaan moolisuhdetta kelatoiva aine/biologinen molekyyli. Konjugaattiaste määritellään tavallisesti siten, että konjugaatin kelatoiviin ryhmiin liitetään jokin radioaktiivinen isotooppi. Tämä määritystapa on kuitenkin hankala ja epätarkka johtuen isotooppien lyhyestä puoliintumisajasta. Kun sen sijaan, kuten tässä keksinnössä, liitetään Eu:ta kelatoiviin ryhmiin ja mitataan fluoresenssi, voidaan konjugaattiaste määrittää hyvin tarkasti ja yksinkertaisesti.In one embodiment, the invention also relates to a method for determining the degree of conjugate between a chelating agent and a biological molecule. The degree of conjugate refers to the molar ratio of chelating agent / biological molecule. The degree of conjugate is usually determined by attaching a radioactive isotope to the chelating groups of the conjugate. However, this assay is cumbersome and inaccurate due to the short half-life of the isotopes. Instead, as in the present invention, by attaching Eu to the chelating groups and measuring the fluorescence, the degree of conjugate can be determined very accurately and simply.
lili
Claims (6)
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI870122A FI80801C (en) | 1987-01-14 | 1987-01-14 | KJJUGAT AV EN MONOCLONAL ANTIKROPP OCH ANVAENDNING. ELLER ETT FRAGMENT DAERAV OCH ETT KELATERANDE AEMNE, DESS FRAMSTAELLNING |
PCT/FI1987/000163 WO1988005537A1 (en) | 1987-01-14 | 1987-12-08 | Conjugate of biological molecules and a chelating agent |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FI870122A FI80801C (en) | 1987-01-14 | 1987-01-14 | KJJUGAT AV EN MONOCLONAL ANTIKROPP OCH ANVAENDNING. ELLER ETT FRAGMENT DAERAV OCH ETT KELATERANDE AEMNE, DESS FRAMSTAELLNING |
FI870122 | 1987-01-14 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI870122A0 FI870122A0 (en) | 1987-01-14 |
FI870122A FI870122A (en) | 1988-07-15 |
FI80801B true FI80801B (en) | 1990-03-30 |
FI80801C FI80801C (en) | 1990-07-10 |
Family
ID=8523765
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI870122A FI80801C (en) | 1987-01-14 | 1987-01-14 | KJJUGAT AV EN MONOCLONAL ANTIKROPP OCH ANVAENDNING. ELLER ETT FRAGMENT DAERAV OCH ETT KELATERANDE AEMNE, DESS FRAMSTAELLNING |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
FI (1) | FI80801C (en) |
WO (1) | WO1988005537A1 (en) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5792444A (en) * | 1989-05-09 | 1998-08-11 | The General Hospital Corporation | Labeled chemotactic peptides to image focal sites of infection or inflammation |
EP0709100A1 (en) * | 1994-09-30 | 1996-05-01 | Nihon Medi-Physics Co., Ltd. | Contrast agent, containing several detection groups per molecule |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4647447A (en) * | 1981-07-24 | 1987-03-03 | Schering Aktiengesellschaft | Diagnostic media |
US4668503A (en) * | 1982-07-26 | 1987-05-26 | Trustees Of University Of Massachusetts | Process for labeling amines with 99m Tc |
US4479930A (en) * | 1982-07-26 | 1984-10-30 | Trustees Of The University Of Massachusetts | Amines coupled wth dicyclic dianhydrides capable of being radiolabeled product |
NL194579C (en) * | 1983-01-21 | 2002-08-05 | Schering Ag | Diagnostic. |
SE465907B (en) * | 1984-11-01 | 1991-11-18 | Nyegaard & Co As | DIAGNOSTIC AGENT CONTENT AND PARAMAGNETIC METAL |
DD229595A1 (en) * | 1984-12-14 | 1985-11-13 | Adw Ddr | METHOD FOR THE PRODUCTION OF CHELATE FIXED BIOMOLECULARS |
WO1987007955A1 (en) * | 1986-06-17 | 1987-12-30 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Homogeneous fluoroassay methods employing fluorescent background rejection and water-soluble rare earth metal chelate fluorophores |
-
1987
- 1987-01-14 FI FI870122A patent/FI80801C/en not_active IP Right Cessation
- 1987-12-08 WO PCT/FI1987/000163 patent/WO1988005537A1/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI870122A (en) | 1988-07-15 |
FI80801C (en) | 1990-07-10 |
FI870122A0 (en) | 1987-01-14 |
WO1988005537A1 (en) | 1988-07-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4808541A (en) | Determination method utilizing reagents covalently labelled with essentially non-fluorescent lanthanide chelates in combination with time-resolved fluorescence spectroscopy and the reagents to be used in the method | |
Heirwegh et al. | Recent advances in the separation and analysis of diazo-positive bile pigments | |
Mukkala et al. | The synthesis and use of activated N-benzyl derivatives of diethylenetriaminetetraacetic acids: alternative reagents for labeling of antibodies with metal ions | |
EP0108399B1 (en) | Substituted carboxyfluoresceins | |
JP2866419B2 (en) | Rare earth cryptate, its production method, its synthetic intermediate and its use as a fluorescent tracer | |
US4082738A (en) | Cyanocobalamin derivatives | |
Bailey et al. | Terbium chelate for use as a label in fluorescent immunoassays | |
FI67760C (en) | FOERFARANDE FOER BESTAEMNING AV CONCENTRATIONS AV EN FRI LIGAND FRAON EN BIOLOGISK VAETSKA | |
US4337339A (en) | Process for preparation of folic acid derivatives | |
JPS58757A (en) | Method of executing immunity examination using no isotope, analytic substance labelled and kit used for such examination | |
JPH02504640A (en) | Macrocyclic complexes of yttrium, lanthanides and actinides with surface coupling functionality | |
CA1152490A (en) | Beta-galactosyl-umbelliferone-labeled protein and polypeptide conjugates | |
US3925355A (en) | Labelled digoxin derivatives for radioimmunoassay | |
CN105572095A (en) | Detection reagent and quantitative detection method of human serum albumin | |
DE69400709T2 (en) | PTERIN DERIVATIVES AND ITS APPLICATION FOR THE PRODUCTION OF IMMUNOTEST PROCEDURES | |
SK374392A3 (en) | Method of determination of concentration of different matters | |
US4314988A (en) | Folic acid derivatives and process for preparation | |
JPH08208691A (en) | Oligopeptide conjugant | |
FI87022C (en) | MAERKTA OCH MAERKNINGSBARA REAGENSER FOER FLUOROMETRISKA BESTAEMNINGAR | |
Yang et al. | Time-resolved fluorescence immunoassay with measurement of a europium chelate in solution: dissociation conditions and application for determination of cortisol | |
JP3713087B2 (en) | Hapten immunoassay, hapten tracer antibody complex usable therefor, and method for producing the same | |
EP0100543B1 (en) | Method for quantitative analysis of low molecular weight components contained in protein-containing liquid sample | |
US6190923B1 (en) | Diethylenetriamine-N,N′,N″-triacetic acid derivatives | |
US4371514A (en) | Radioimmunoassay of pterins and novel pterin derivatives useful therefor | |
Van Vunakis et al. | Production and specificity of antibodies directed toward 3, 4, 5-trimethoxyphenylethylamine, 3, 4-dimethoxyphenylethylamine and 2, 5-dimethoxy-4-methylamphetamine |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM | Patent lapsed |
Owner name: INNOFARM OY |