FI79036B - Med faoror foersett gelsystem. - Google Patents

Description

1 79036

Uritettu geelijärjestelmä Tämän keksinnön kohteena on uritettu geelijärjestelmä ja erikoisesti sellainen geelijärjestelmä, jossa vääristymät ja proteiinien leviäminen (diffuusio) geelin sisällä ovat eliminoidut tai ainakin minimoidut.

Ihmiskeho sisältää proteiineja, jotka ovat huomattavasti vaih-televia kokonsa, rakenteensa ja biologisen vastuukykyisvytensä suhteen. Niiden molekyylipaino ulottuu muutamasta tuhannesta enemmän kuin miljoonaan. Ne voidaan venyttää pitkiksi lujiksi kuiduiksi tai kääriä tiiviiksi pallosiksi. Ne esiintyvät useissa erilaisissa muodoissa kuten seuraavissa: rakenteellisina proteiineina, sidekudosproteiineina, sulkijalihasproteiineina, entsyymeinä, hormoneina, vasta-aineina, kuljetusmolekyyleinä (kuten hemoglobiini, joka kuljettaa happea soluihin), varastoin-tiproteiineina, solunpintareseptoreina ja sentapaisina.

Eräs perinteellisistä menetelmistä proteiinien erottamiseksi niiden identifiointia varten on elektroforeesi, joka yksinkertaisesti tarkoittaa "sähkön kuljettamaa". Esimerkiksi asianmukaisesti preparoidusta veri- tai virtsanäytteestä proteiinit voidaan erottaa sähkökentässä, koska kutakin erilaista tyyppiä oleva proteiini etenee hieman eri nopeudella riippuen tietyn molekyylin kokonaissähkövarauksesta. Tämä menetelmä, yksiulotteinen elektroforeesi, on osoittautunut erittäin tehokkaaksi tieteelliseksi työvälineeksi.

70-luvun keskivaiheilla kehitettiin kaksiulotteisia menettelytapoja proteiinien erottamiseksi. Eräälle tällaiselle menettelylle annettiin nimitys "geelielektroforeesi", ja se käsittää menetelmän, joka erottaa geelin läpi liikkuvat proteiinit selvästi kuvautuviksi nauhoiksi, jotka voidaan identifioida tiettyinä proteiineina tai proteiinien ryhminä. Menetelmä erottaa yhteen suuntaan liikkuvat proteiinit niiden sähkövarauksen mukaan yksityisiksi riveiksi. Sen jälkeen geeli käännetään sivulleen, ja detorgenttiä lisätään vaikuttamaan sähköisesti yhdessä 2 79036 proteiinien kanssa, saattaen proteiinit liikkumaan toiseen suuntaan, mikä liike lajittelee proteiinit koon mukaan. Lisäksi, kun kaksiulotteinen geeli värjätään väriaineella, tuloksena on ristikkomainen sarja proteiinin "täpliä", niiden jonojen ollessa erotettuna vaakasuorassa proteiinien sähkövarauksen mukaan ja pystysuorassa niiden koon mukaan. Tällainen "proteiini-kartta" voi erottaa paljon suuremman määrän proteiineja näytteestä kuin on mahdollista yksiulotteisessa elektroforeesissa.

Jälkimmäisellä tavalla hyväksi käytetyt geelit voidaan sen jälkeen tutkia keilaamalla, geelin ollessa jaettuna hyvin suureksi määräksi (esim. yhdeksi tai kahdeksi miljoonaksi) pieniä neliöitä, joista kutakin tutkitaan ja analysoidaan tunnetulla tietokoneen tietojenkäsittelytekniikalla. Kun kukin neliö on analysoitu yksityiskohtaisesti, vastaavat tiedot voidaan varastoida tulevaa toistoa, lisäystä (enhancement) ja näyttöä varten. Edelleen tiheysarvot voidaan muuttaa värieroiksi tietokoneella saadun näytön helpompaa erottelua ja katselua varten. Lisäksi "taustakohina", joka tyypillisesti esiintyy tällaisessa keilauk-sella johdetussa informaatiossa, voidaan suodattaa pois tietokonesysteemin avulla, ja vääristymät itse geelissä voidaan myös korjata. Tällaisten kaksiulotteisten elektroforeettisten menettelyjen yksityiskohtainen suoritus on selostettu julkaisussa "High Resolution Two-Dimensional Electrophoresis of Proteins", Patrick H. O'Farrell, The Journal of Biological Chemistry,

Volume 250, n:o 10 (May 25, 1975) , sivut 4007-4021.

On todettava, että tietokonekeilausta käyttäen suoritettua gee-linanalyysiä varten on tärkeää saattaa resoluutio niin pieneksi kuin mahdollista. Toisaalta yritykset resoluution pienentämiseksi ovat aikaisemmin epäonnistuneet diffuusiona (leviämisenä) tunnetun ilmiön esiintymisen vuoksi. Toisin sanoen, elektrofo-reettisen menetelmän ensiulotteisen vaiheen aikana proteiinit jakaantuvat leveyssuuntaan geelin poikki, ja sen jälkeen menetelmän tois-ulotteisen vaiheen aikana proteiinit jakaantuvat pitkittäissuuntaan geelin läpi pitkin omia ratojaan eli kanaviaan. Jälkimmäisen vaiheen aikana voi tapahtua proteiinien diffuusiota (leviämistä), mikä aikaansaa proteiinien vääristyneen jakaantu-

II

3 79036 man, ja tämä vaikuttaa haitallisesti siihen resoluutioon, joka voidaan saavuttaa geelinkeilausmenettelyllä.

Lisäksi geelikerrosten valmistuksen yhteydessä itse geeliaine tulee usein vääristymään, ja tämä vaikuttaa haitallisesti siihen prosessiin, jonka avulla proteiinit jaellaan leveys- ja pit-kittäissuuntaan geelin sisällä elektroforeettisen menettelyn aikana. Tämä aiheuttaa edelleen proteiinin haitallista diffuusiota (leviämistä) geelissä, siten vaikuttaen epäedullisesti niihin tietoihin, jotka on johdettu geelin keilauksesta tietokoneen keilaustoimintavaiheen aikana.

Tämän keksinnön kohteena on uritetty geelijärjestelmä ja erikoisesti sellainen geelijärjestelmä, jossa proteiinitäplien vääristyminen ja leviäminen (diffuusio) geelin sisällä ovat eliminoidut tai ainakin minimoidut. Erikoisesti on keksinnön mukaan geelin tukemiseksi valmistettu muovinen alusta, joka on varustettu urilla, niin että vietäessä geeliä alustalle se täyttää alustassa olevat urat, muodostaen uritetyn geelijärjestelmän.

Johtuen uritetun muovialustan käytöstä geelikerroksen valmistuksen aikana geeliaineen vääristyminen estyy tai tulee ainakin minimoiduksi. Tämä vuorostaan ehkäisee proteiinin diffuusion (leviämisen) elektroforeettisen menettelyn aikana, ja siten resoluutio tulee mahdollisimman pieneksi.

Kun geelikerros on muodostettu uritetulle muovialustalle, lasia tai muovia oleva kansilevy voidaan asettaa geelin päälle, ja geeli voidaan sopivasti järjestää sellaiseksi, että tavanmukainen elektroforeettinen menettely voidaan suorittaa. Tämän menettelyn aikana proteiinit, jotka muuten pyrkisivät diffundoitu-maan eli leviämään niiden dispergoituessa pitkittäissuuntaan pitkin geeliä, eivät tee niin, joten vääristyneiden tulosten saanti tulee estetyksi geelin tietokoneella suoritetun keilauk-sen aikana.

Sen vuoksi tämän keksinnön ensisijaisena tarkoituksena on aikaansaada uritettu geelikerros ja erikoisesti uritettu geelijärjes-telmä.

Keksinnön toisena tarkoituksena on aikaansaada uritettu geeli- järjestelmä, jossa itse geeliaineen vääristyminen, jota muuten muodostuisi valmistusvaiheen aikana, on estetty.

79036

Lisäksi on keksinnön tarkoituksena aikaansaada uritettu geeli-järjestelmä, jossa proteiinien diffuusio (leviäminen) elektro-foreettisen menettelyn aikana on ehkäisty tai minimoitu.

Keksinnön yllä mainitut ja muut myöhemmin ilmenevät tavoitteet sekä keksinnön luonne tulevat selvemmin ymmärretyiksi seuraavan selityksen, oheisten patenttivaatimusten ja oheisten piirustusten yhteydessä.

Piirustuksissa kuvio 1 on perspektiivikuva tämän keksinnön mukaisesta uritetusta geelijärjestelmästä, kuvio 2 on kuva päältäpäin uritetusta alustalevystä, jota käytetään keksinnön mukaisessa uritetussa geelijärjestelmässä, kuvio 3 on kuva edestäpäin keksinnön mukaisesta uritetusta geeli- j ärj estelmästä.

Keksintöä selitetään seuraavassa tarkemmin viitaten piirustusten eri kuvioihin.

Kuten ilmenee kuviosta 1, joka on perspektiivikuva keksinnön mukaisesta uritetusta geelijärjestelmästä, uritetty geelijärjes-telmä 10 käsittää perusosinaan uritetun pohjalevyn 12 ja kansi-levyn 14. Tietyssä osassa 16 pohjalevyä 12 on pitkittäisiä uria pohjalevyn päälle sijoitetun geelin vastaanottamiseksi. Sopi-vimmin urat ovat hyvin kapeita ja tiheässä, niiden välin ollessa millimetrin osan suuruusluokkaa.

Keksinnön mukaisen uritetun geelijärjestelmän konstruointimene-telmä selostetaan seuraavassa viitaten kuvioon 2, joka on kuva uritetusta pohjalevystä 12 päältäpäin. Uritettu pohjalevy 12 on edullisimmin valmistettu muovista tai muusta sentapaisesta sähköäjohtamattomasta materiaalista ja, kuten edellä on mainittu, 5 79036 käsittää hyvin pienin välein uritetun osan 16. Uritetun pohja-levyn sijaitessa vaakasuorassa asennossa geeliä viedään sen päälle siten, että geeli täyttää pohjalevyn 12 uritetun osan 16 sisältämät urat.

Kuvio 3 on kuva edestäpäin keksinnön mukaisesta uritetusta geelijärjestelmästä. Kuten siitä näkyy, uritetulle osalle 16 viety geeli täyttää urat muodostaen yhtenäisen, lujan ja hyvin tuetun rakenteen pohjalevylle 12.

Kuten kuvioista 1 ja 3 edelleen ilmenee, kansilevy 14 asetetaan sen jälkeen uritetun pohjalevyn 12 päälle siten, että se puristaa geelin levyjen väliin. Kansilevy 14 on sopivimmin muovia, lasia tai muuta sähköäjohtamatonta ja läpinäkyvää materiaalia.

On tarpeetonta mainita, että uritettu geelijärjestelmä on varustettava jonkinlaisella sisäänpääsyvälineellä tai aukolla (ei esitetty piirustuksessa), niin että kun kansilevy 14 on asetettu uritetun pohjalevyn 12 päälle, geelin ollessa puristettuna levyjen väliin uritetussa osassa 16, proteiininäytteitä voidaan viedä tiettyyn kohtaan osassa 16. Kun proteiininäytteet on viety uritettuun osaan 16, elektroforeettinen menettely voidaan suorittaa. Toisin sanoen ensimmäisen vaiheen aikana proteiinit voidaan erottaa isoelektrisen pisteen mukaan fokusoimalla iso-elektrisesti ensimmäisessä dimensiossa, ja sen jälkeen toisen vaiheen aikana proteiinit erotetaan molekyylipainon mukaan suorittamalla elektroforeesi toisessa dimensiossa.

Erikoisesti, kuten edellä on mainittu, ensimmäisen vaiheen aikana geelin elektroforeesi suoritetaan käyttämällä poikki geelin ulottuvaa leveyssuuntaista sähkökenttää (ts. suuntaan vasemmalta oikealle kuvioissa 1-3). Tämä erottaa geelin läpi liikkuvat proteiinit selvästi kuvautuviksi nauhoiksi, jotka voidaan identifioida tiettyinä proteiineina tai proteiiniryhminä. Tämä menettely erottaa yhteen suuntaan liikkuvat proteiinit niiden sähkövarauksen perusteella erillisiksi riveiksi.

6 79036

Sen jälkeen geeli käännetään sivulleen ja toinen elektroforeet-tinen menettely suoritetaan (esimerkiksi detergenttiä voidaan lisätä vaikuttamaan sähköisesti yhdessä proteiinien kanssa kussakin erillisessä rivissä). Proteiinit kussakin rivissä saatetaan liikkumaan toiseen suuntaan, pitkittäisesti geelin poikki (ts. alapäästä yläpäähän kuviossa 2), ja proteiinit tulevat tällä tavalla lajitelluiksi koon mukaan.

Lopuksi, kuten edellä on mainittu, jos kaksiulotteinen geeli sen jälkeen värjätään väriaineella, tuloksena on ristikkomainen sarja proteiinin "täpliä", niiden jonojen ollessa erotettuna vaakasuorassa proteiinin sähkövarauksen mukaan ja pystysuorassa koon mukaan. Tämä "proteiinikartta" voidaan sen jälkeen saattaa tietokoneella suoritetun keilausmenettelyn alaiseksi, jossa menettelyssä tietokonesysteemiin yhdistetty keilain voi keilata uritetun geelin pinnan (samanlaisella tavalla kuin televisiossa suoritetaan rasterikeilaus), niin että saadaan "proteiinikarttaa" koskevat tiedot. Kuvion 3 mukaan tällainen keilaus voidaan suorittaa kansilevyn 14 läpinäkyvyyden ansiosta (kansilevyn ollessa, kuten edellä on mainittu, sopivimmin muovia, lasia tai muuta läpinäkyvää sähköäjohtamatonta materiaalia).

Edelleen on huomattava, että elektroforeettisen menettelyn aikana ja erikoisesti sen toisen vaiheen aikana proteiinit vaeltavat pitkittäissuuntaan pitkin alustalevyn 12 uritettua osaa 16 (alhaalta ylöspäin kuviossa 2). Koska uritettua alustalevyä 12 käytettiin geelikerroksen valmistuksen yhteydessä, geelikerros tulee olemaan rakenteeltaan yhtenäinen omaten vain hyvin vähän tai ei lainkaan fysikaalista vääristymää. Tämä on omiaan ehkäisemään proteiinien diffuusion eli leviämisen niiden vaeltaessa pitkittäissuuntaan pitkin uritettua osaa 16.

Lisäksi uritetun osan 16 urien ansiosta elektroforeettisen menettelyn toisen vaiheen aikana proteiinien luontainen diffuusio eli leviäminen niiden vaeltaessa pitkittäissuuntaan pitkin uritettua osaa 16 tulee minimoiduksi tai eliminoiduksi, nimittäin uritetun osan 16 sisältämien urien kanavoivan vaikutuksen johdosta. Toisin sanoen uritetun osan 16 sisältämien urien seinämät

II

7 7)016 toimivat siten, että ne estävät proteiinin leveyssuuntaisen diffuusion (leviämisen) sen vaeltaessa pitkittäissuuntaan (alhaalta ylöspäin kuviossa 2) pitkin alustalevyn 12 uritettua osaa 16.

Vaikka vain eräitä edullisia muotoja ja järjestelmiä on esitetty keksintöä selitettäessä, on selvää, että erilaisia muutoksia yksityiskohdissa ja järjestelyissä voidaan tehdä poikkeamatta patenttihakemuksen ajatuksesta ja suoja-alasta.

Claims (9)

1. Uritettu geelijärjestelmä, tunnettu siitä, että se käsittää alustaosan, jossa on leveyssuunta ja pitkittäissuun-ta ja joka sisältää uritetun osan, urien ulottuessa mainittuun pitkittäissuuntaan, uritettuun osaan viedyn ja sen urat täyttävän geelin, sekä alustaosan päälle sijoitetun kansiosan, geelin tullessa puristetuksi näiden osien väliin, jolloin proteiinin diffuusio, kun sitä on viety geeliin ja saatettu elektroforeesin alaiseksi, tulee olennaisesti eliminoiduksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen järjestelmä, tunnet-t u siitä, että alustaosa on sähköäjohtamatonta materiaalia.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen järjestelmä, t u n n e t-t u siitä, että sähköäjohtamattomana materiaalina on muovi.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen järjestelmä, tunnet- t u siitä, että kansiosa on tehty sähköjohtamattomasta materiaalista.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen järjestelmä, t u n n e t-t u siitä, että sähköäjohtamattomana materiaalina on lasi.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen järjestelmä, tunnet-t u siitä, että sähköäjohtamattomana materiaalina on muovi.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen järjestelmä, tunnet-t u siitä, että kansiosa on läpinäkyvää materiaalia.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen järjestelmä, tunnet-t u siitä, että läpinäkyvänä materiaalina on lasi.

8 79036

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen järjestelmä, tunnet-t u siitä, että läpinäkyvänä materiaalina on muovi. li