FI73086C - Foerfarande foer kvantitativ bestaemning av enkainid och dess 0-demetyl- och 3-metoxi-0-demetyl- -aemnesomsaettningsprodukter i biologisk vaetska. - Google Patents

Description

1 73086

Biologisessa nesteessä olevien enkainidin ja sen 0-de-metyyli- ja 3-metoksi-0-demetyyli-aineenvaihduntatuot-teiden määritysmenetelmä 5 Jakamalla erotettu patenttihakemuksesta 812873

Keksinnön kohteena on biologisessa nesteessä olevien enkainidin ja sen O-deraetyyli- ja 3-metoksi-O-demetyyli-aineenvaihduntatuotteiden kvantitatiivinen 10 määritysmenetelmä, jossa mainitut aineet uutetaan biologisesta nesteestä ja erotetaan korkeapaineneste-kromatografiällä piihapolla täytetyssä pylväässä käyttäen orgaanista liuotinta liikkuvana faasina, ja sille on tunnusomaista, että liikkuvana faasina käytetään etanoli: 15 vesi:metaanisulfonihappo-seosta suhteissa 500:30:0,1.

Enkainidilla on seuraava rakenne: CH CH-1 .

20 [_ .

H3C0 25 Seuraavat julkaisut kuvaavat enkainidin ja sille analogisten aineiden synteesiä:

Dykstra, et ai., J. Med. Chem. 16, (1973) 1015-1020.

Sykstra ja Minielle, US-patenttijulkaisu 3 931 195.

Burne, et ai., J. Pharmacology and Experimental 30 Therapeutics 200, (1977) 147-154.

Enkainidin ja sen aineenvaihduntatuotteiden analyysimenetelmiä on esitetty seuraavissa julkaisuissa.

Mayol ja Gammans, Therap. Drug Monitoring 1, (1979) 507-524.

35 Mayol, US-patenttijulkaisu 4 318 899.

2 73086

Taulukossa I on esitetty enkainidin ja eräiden sen kanssa analogisten aineiden rakenteet, jotka on esitetty edellä mainituissa Dykstran et ai julkaisussa ja patentissa. Taulukossa käytetyt yhdisteiden numerot ovat 5 samat kuin esimerkkinumerot Dykstran et ai patentissa. Lisäksi taulukossa on esitetty yhdiste A, joka on 4-hydroksi-3-metoksi-N-/l2-/2- (1 -metyyli-2-piperidinyyli) -etyyli/fenyylijbentsoamidi ja jonka valmistusta ja ominaisuuksia on kuvattu kantahakemuksessa (FI-patentti-10 hakemus 812873).

Taulukko I

OH CH —L ^

Yhdis- 123 2 q te nro_R_R_R_ 89 (0-demetyylienkainidi HO- H- CH,-

tai ODE) J

107 (enkainidi tai E) CH^O- H- CH3- 108 H- CH30- CH3- 25 109 CH30- CHjO- CH-j- 139 (N-demetyylienkainidi CH70- H- H-

tai NDE) J

A (3-metoksi-O-demetyyli- HO- CH..O- CH,- enkainidi tai 3-met- J ^ oksi-ODE) 30 Mayol ja Gammans ovat julkaisussaan identifioineet yhdisteet 89 ja 139 enkainidin (yhdiste 107) aineenvaihduntatuotteiksi. Yhdiste nro 89 (ODE) on identifioitu pääasialliseksi aineenvaihduntatuotteeksi, jota toisinaan on plasmassa moninkertaisina määrinä enkainidilla tapah-35 tuvaa käsittely seuraavan enkainidipitoisuuteen verrattuna.

3 73086

Keksinnön kohteena olevan Mayolin ja Gammansin julkaisussa esitetyn korkeapainenestekromatografia-analyysimenetelmän parannuksen seurauksena on havaittu, että myös yhdiste A on ihmisessä enkainidin pääasiallinen 5 aineenvaihduntatuote annettaessa enkainidia suun kautta ja että sitä on läsnä veriplasmassa oleellisesti suurempia pitoisuuksina kuin yhdistettä nro 89 kahden tai useamman tunnin kuluttua suun kautta tapahtuneet 50 mg:n enkainidikloorivety-annoksen jälkeen.

10 Mayolin ja Gammansin julkaisussa esitetystä HPLC- analyysimenetelmästä on nyt havaittu, ettei sillä voida erottaa toisistaan yhdistettä nro 89 ja yhdistettä A.

On arveltu, että yhdistettä A tuotetaan yhdisteen nro 89 rungosta biologisella muunnosprosessilla.

15 Keksintöä kuvataan seuraavalla esimerkillä.

Esimerkki Analyysimenetelmä A. Biologisen nesteen uuttaminen Kierrekannellisessa putkessa olevaan 1 ml:aan 20 plasmaa tai virtsaa lisätään 0,2 ml 0,5-m Tris-HCl puskuria (2-amino-2-hydroksimetyyli-1,3-propaanidioli), pH 8,5, ja 10 ml n-butyylikloridia, joka sisältää 5 tilavuus-% isopropanolia. Tämän jälkeen näyte ravistetaan värähtelevässä sekoittimessa ja sentrifugoidaan 25 faasien erottamiseksi. Orgaanisesta faasista erotetaan 9 ml annos ja haihdutetaan kuiviin typpivirtauksessa ja jäännös liuotetaan uudelleen 10 pl:aan etanolia. Tätä liuosta ruiskutetaan 50 μ1:η annos korkeapainenestekromatograf in kolonniin.

30 B. Korkeapainenestekromatografin (HPLC):n olosuhteet Käytetään normaalia faasi-piihappokolonnia, jonka mitat ovat 3,9 mm halkaisijaltaan ja 30 cm pituudeltaan, yhdistettynä aallonpituudeltaan säädettävään UV-detekto-riin, joka on asetettu 254 nm:iin. Käytetty liikkuva faa-35 si koostuu 500 ml:sta etanolia, 30 ml:sta vettä ja 0,1 ml:sta metaanisulfonihappoa ja sen virtausnopeus on 4 73086 1 ml minuutissa. Standardisarjat, joissa on 0, 25, 100 ja 500 ng/ml jokaista määritettävää ainetta, valmistettiin käyttäen eri henkilöiden yhdistettyä plasmaa. Näitä standardeja käsiteltiin kuten edellä on esitetty. Ainemäärät saatiin detektorivasteesta numeerisella integraatiolla tai mittaamalla piikkien korkeudet. Jokaiselle komponentille saatiin standardikäyrä lineaarisen regression avulla mittaamalla detektorivaste plasmastandardien konsentraation funktiona. Yhdisteen konsentraatio näytteessä interpoloitiin tämän jälkeen näistä käyristä.

C. Tulokset

Enkainidin ja sen O-demetyyli- ja 3-metoksi-O-demetyyli-aifteenvaihduntatuotteiden suhteellinen eluutio-järjestys ja niiden retentioajat ovat seuraavat: Yhdiste nro 89, 8,3 minuuttia; yhdiste A, 9,7 minuuttia? yhdiste nro 107, 11,4 minuuttia. Viimeisen kolonnista eluoidun endogeenisen plasmakomponentin retentioaika on 3,6 minuuttia ja pohjataso on erittäin vakaa alueella, jolla aineenvaihduntatuotteet eluoituvat. Näin ollen endogeenisista plasmakomponentiesta ei aiheudu interferenssiä. Yksittäisten komponenttien erilaisten uuttumistehok-kuuksien, spesifisten molaaristen absorptiviteettien ja ja retentioaikojen takia on kunkin komponentin analyysi-herkkyys seuraava: Yhdiste nro 89, 10 ng/ml; yhdiste A, 20 ng/ml; yhdiste nro 107, 15 ng/ml.