FI70594B - Foerfarande foer framstaellning av farmakologiskt vaerdefulla hydroxiaminkolvaetefosfonsyraderivat - Google Patents

Description

70594

Menetelmä valmistaa farmakologisesti arvokkaita hydroksi-aminohiilivetyfosfonihappojohdannaisia. - Förfarande för f ramstälining av farmakologiskt värdefulla hydroxiaminkol-vätefosfonsyraderivat.

Jakamalla erotettu patenttihakemuksesta 772280 Avdelad ur patentansökan 772280

Keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa farmakologisesti a rvokka i ta hydroks iaminohi ilivetyfosfonihappojohdanna is ia, joiden kaava on

OH O

Ί , I tl R1 - N - A'- P - OH (I")

a I

OH

jossa Rl' on asetyyli ja A' on trimetyleeni tai 2-hydroksi-trimetyleeni; tai R1' on formyyli ja A’ on trimetyleeni tai 3.

trans-l-propenyleeni ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suo] oj a.

Yleisesti sanoen edellä määritelty yhdiste (I") valmistetaan viljelemällä tavalliseen tapaan Streptomyces-sukuun kuuluvaa mikro-organismia. Tarkemmin sanoen yhdiste (I") valmistetaan viljelemällä Streptomyces-sukuun kuuluvaa mikro-organismia, kuten seuraavia: Streptomyces rubellomurinus, Streptomyces rubellomurinus subsp. indigoferus, Streptomyces lavendulae ja vastaava. Yhdiste (I"), jossa Rl' on asetyyli ja A' on trimetyleeni (jäljempänä käytetään viitettä FR-900098), valmistetaan fermentoimalla Streptomyces rubellomurnius-lajia ja sen indigoferus-alalajeja; yhdisteet (I"), jossa R^' on formyyli ja A' on trimetyleeni (jäljempänä käytetään viitettä FR-31705) ja R^’ on formyyli ja A' on trans-l-propenyleeni, 3 _______ -- ΤΓ^ 70594 2 valmistetaan fermentoimalla Streptomyces lavendulae-lajia; ja yhdiste (I"), jossa R* ' on asetyyli ja A' on 2-hydroksitri-metyleeni, valmistetaan fermentoimal la Streptomyces rubel.lo-murinus subsp. indigoferus organismia.

Mainittujen mikro-organismien fermentaatio suoritetaan ravin-tomedlumissa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpi-lähteitä, parhaiten aerobisissa olosuhteissa (esimerkiksi ravisteluviljelmä, pinnanalaisviljelmä jne.). Menetelmän yksityiskohdat on esitetty seuraavassa.

Ravintonediumin suositeltuja hii1ilähteita ovat glukoosi, fruktoosi, glyseriini ja tärkkelys. Muita käyttökelpoisia lähteitä ovat laktoosi, arabinoosi, ksyloosi, dekstriini, melassit ja vastaavat.

Suositeltuja typpi lähte itä ovat hiivauute, peptoni, gluteeni-jauho, puuvi11 asiemenjauho, soijapapujauho, corn steep liquor, kuivahiiva, vehnänidut jne. sekä epäorgaaniset että orgaaniset typpiyhdisteet, kuten ammoniumsuolat (esimerkiksi ammonium-nit.raatti, ammon iumsulfaatt i , ammoniumf osf aatt i , jne.), urea, aminohappo ja vastaavat.

Hiili- ja typpilähteitä, vaikka niitä käytetään yhdistelmänä, ei tarvitse käyttää puhtaassa muodossa, koska käyttöön sopivat myös epäpuhtaammat aineet, jotka sisältävät hivenmääriä kasvutekijöitä ja huomattavia määriä mineraaliravinteita. Mediumiin voidaan haluttaessa lisätä myös mineraalisuoloja, kuten kalsiumkarbonaattia, natrium- tai kaliumfosfaattia, natrium- tai kaiiumkloridia, magnesiumsuolaa, kuparisuolaa ja vastaavaa. Tarvittaessa, erityisesti kun kasvatusliuos vaahtoaa paljon, voidaan lisätä vaahdonestoainetta, kuten nestemäistä parafiinia, rasvaöljyä, kasvisöljyä, mineraali-öljyä ja silikoneja.

3 70594

Samoin kuin niissä suositelluissa menetelmissä, joita käytetään muiden antibioottien valmistukseen massamitässä, niin myös yhdisteen (I") valmistamiseen suurina määrinä käytetään aerobista pinnanalaiskasvatusta. Pienempien määrien valmistuksessa käytetään ravisteluviljelmää tai pintaviljelmää astiassa tai pullossa. Lisäksi kun kasvu tapahtuu suurissa säiliöissä, on suositeltavaa käyttää valmistussäiliöiden siirrostamiseen organismin vegetatiivista muotoa, jotta vältettäisiin kasvuviive yhdisteen (I") valmistuksessa. Siten on toivottavaa valmistaa ensin organismin vegetatiivinen ymppi siirrostamalla suhteellisen pieni määrä viljelymediumia organismin itiöillä tai rihmastolla ja kasvattaa tämä ja siirtää kasvatettu vegetatiivinen ymppi aseptisesti suuriin säiliöihin. Mediumin, jossa vegetatiivinen ymppi valmistetaan, voi olla oleellisesti samanlainen tai erilainen kuin mediumin, jota käytetään yhdisteen (I") valmistamiseen.

Kasvatusseoksen sekoittaminen ja ilmastaminen voidaan suorittaa monin eri tavoin. Sekoittaminen voidaan saada aikaan potkurilla tai samanlaisella mekaanisella sekoituslaitteella, pyörittämällä tai ravistelemalla fermenttoria, erilaisten pumppauslaitteiden avulla tai johtamalla steriiliä ilmaa mediumin läpi. Ilmastaminen voidaan suorittaa johtamalla steriiliä ilmaa fermentaatioseoksen läpi.

Fermentaatio suoritetaan tavallisesti lämpötilassa välillä noin 20 ja 40°C, parhaiten 30°C:ssa 50 - 100 tunnin aikana.

Yhdiste (I") voidaan ottaa talteen kasvatusmedlumista tavalliseen tapaan, joita yleisesti käytetään muiden tunnettujen antibioottien talteenotossa.

Yleensä suurin osa muodostuneesta yhdisteestä (I") on kasvatus 1 iuoksessa ja siten yhdiste (I") voidaan erottaa suodok- , 70594 4 sesta, joka on saatu suodattamalla tai sentrifugoimalla liuos, tavanomaisella menetelmällä, kuten väkevöimällä alipaineessa, lyofi1isoimalla, uuttamalla liuottimena, säätämällä pH, käsittelemällä hartsilla (esimerkiksi anioninen tai kationinen ioninvaihtohartsi, ei-ionil1inen absorptiohartsi), käsittelemällä adsorptioaineella (esimerkiksi aktiivihiili, piihappo, silikageeli, selluloosa, alumiinioksidi), kiteyttämällä, kiteyttämällä uudelleen ja vastaavalla tavalla.

(I). Yhdisteen (I"), jossa R1 ’ on asetyyli ja A' on -CH2-CH2-CH2-, so. 3-(N-asetyyli-N-hydroksiamino)propyyli-fosfonihapon (jäljempänä käytetään viitteenä FR-900098) valmistus:

Antibioottia FR-900098 voidaan valmistaa fermentoimalla ravintomediumissa Streptomyces-sukuun kuuluvaa, antibioottia FR-900098 muodostavaa kantaa, kuten Streptomyces rubelle-murinus kantaa ja Streptomyces rubellomurinus subsp. indigoferus-kantaa.

(1) Mikro-organismit:

Mikro-organismit, joita voidaan käyttää uuden antibiootin FR-900098 valmistuksessa, ovat Streptomyces rubellomurinus-kantoja, jotka on äskettäin eristetty Japanissa, Mt. Hira,

Siga Prefecture, otetusta maanäytteestä, ja Streptomyces rubellomurinus subsp. indigoferus-kantoja, jotka on äskettäin eristetty maanäytteestä, jonka ottopaikka on Koganei city,

Toki o, Japani.

Elävän Streptomyces rubellomurinus-organismin viljelmä on tallennettu numerolla ATCC n:o 31215 American Type Culture Collection kokoelman pysyvään vi1jelmävarastoon. Organismin viljelmä on lisäksi tallennettu numerolla 3563 japanilaiseen il 5 70594 5 kokoelmaan Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology.

Elävän Streptomyces rubellomurinus subsp. indigoferus organismin viljelmä on tallennettu numerolla ATCC n:o 31304 American Type Culture Collection kokoelman pysyvään viljelmä-varastoon. Organismin viljelmä on lisäksi tallennettu japanilaiseen kokoelmaan Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology.

Uuden antibiootin valmistaminen ei rajoitu tässä yhteydessä kuvatun tietyn organismin käyttämiseen, mikä on esitetty ainoastaan havainnollisuuden vuoksi. Ts. antibiootin valmis-tamiseen voidaan käyttää sekä keinotekoista mutanttia että luonnonmutantteja. Tällainen keinotekoinen mutantti tehdään tässä yhteydessä kuvatusta organismista tavalliseen tapaan, kuten röntgen-säteilyttämällä, UV-säteilyttämällä, N-metyyli-N'-nitrosoguanidiinilla, 2-aminopuriinilla ja typpi-sinappi-öljyillä.

1) Mikrobiologiset ominaisuudet 1)—1 Streptomyces rubellomurinus ATCC 31215:

Streptomyces rube1lomurinus ATCC 31215 lajilla on seuraavat morfologiset, viljelmä- ja fysiologiset ominaisuudet: 1. Morfologiset ominaisuudet

Viljelmän morfologiaa tarkkailtiin 10 - 14 päivän aikana 30°C:ssa mikroskooppisesti rihmastolla, joka oli kasvatettu seuraavilla alustoilla: sakkaroosi-nitraatti, agar, glyseroli-asparagiini-agar, hiiva-mallasuute-agar ja kaurajauho agar.

70594 6 (1) Itiöitä muodostavien hyyfien haarautumistapa:

Monopodiaalinen haarautuminen (2) Itiöitä muodostavien hyyfien muoto:

Suora tai kaareva (rektifleksiibeli) (3) Itiöiden määrä: 10 - 50 itiötä (4) Itiön pinnan ulkonäkö ja koko:

Sileä, 0,4 - 0,8 x 1,1 - 1,6 mikronia (5) Zoosporien esiintyminen:

Ei havaittu (6) Itiöpesäkkeiden esiintyminen:

Ei havaittu (7) Itiöiden muodostuminen:

Ilmarihmastossa 2 · Vi 1 j elyomi na isuudet:

Kannalla oli seuraavat viljelmäominaisuudet, kun sitä kasvatettiin 10 - 14 päivää 30°C:ssa seuraavilla alustoilla.

7 70594

• rH

.e 4-) c φ

Si :(0 :(0

-rH -rH ·rH

a .* -*

rH I—I

(0 :ra :<0 > (—1 T-l 0) C -ι-l -h Φ (0 (0

c j-ι -tJ

•rH rH *r—t ·*—I rH -rH *rH ·rH «r—( *rH r-t *rH

,ρωωωωωωωωωωω 5

CO

(0 * :ro - ^-:(0--:(0

_y C 4-) C C jJ C u C

;(0 0) -rH CD <D -Η φ -H φ

C-hCCD C C Φ C Φ C

φ c -r-i .y -r-t ή ή jc -h c φ ra oy 3 (0 p p (0^ ijj; to p • η ή 4-) :(0 > 4-) > > 4-) ;(0 4-) :P 4-> >

> ftM H M J) HMD) 0) '—I {Λ Η (Λ rH CO

•h 4J Φ Φ O (1)4-)(0 (0 Φ Φ φ φ Φ (0 •h ---h jy a_y .y ·η jy -y y qjc & iy _y 4-> c φ c “ c φ c c c c (0 :0 M (0 :(0 (0 (0 jy (0 (0 (0 :io (0 :(0 :0 <0 (0 4->4-).*Φ·η.* Φ .y _y _y φ·Ha)·H4J Φ _y m h mh c λ: <h :ra .y .y h c .h c -h i jy

Dili Ιβ Ο Φ 3 (0(OP P CO Φ (0 Φ 1-( (0 p φ :(0 Φ (0 ή ή (0 φ ή ·η ro ·η (0 -h :ro (0 ·η >> a> az > az z > a> a> > z c c - φ φ (0 C C (0

(0 *H *H rH

c g φ φ rH

φ c Cc cceccio c Φ (0 Φ p φ φ p φ c •h c .cc a c c a c c

0 *H C Ή C Ή *- -H c ·Η -H

jy (0(0 (0(0 (0 (0 (0 (0 (0 (0 a

h gS > S Φ S ra g Φ E

(0 Ed) (05 PS H ® E (8 H to « D> W rH 4-) 1—I (0 rH G I—I (0 I—Ip O (0 '—( C <—I (0 rH (0 '—I (0 rH 4* 4_) C -Η Φ -H C> Ή C Ή -H (0 :(0 CO 4-> C > C> |>c>|>(0 :(0 (03 (03 33 C3(03C34y > g c > p as φ p > 3 φ 3 ή £0 (oa ia c a ra a c a ra :ra •h 4.) ro ~ -h 4.) ή c a cc c 4-) (C4J 04-)C4-)04Jjy <0 -H CD >1 g > .y >- φ Ϊ* jy > .y o g > c c Cc rHxocc^cc-H cn γ-Π| >1 P >·Η (0>·Η *H Φ >, 3 >, (0 > Φ ·Η η|γπ & h a ΧΗΚ ω >·η(Χη>^η3: ω io to co 4-J (0

I Φ .H

1 1 *H CO1 -H

•Η -H C *H 4-4

4-) c ή c :Q

4-) ή *rH co a

(0 -H 05 Φ I E

(0 ΟΙ Ό Ο) Φ h HI :(0 C (0 C C 4-> C C (0 Ή -P C (G O G 3(00-4-1 -h io a :Φ (0 3 CT 4-J C (0 :(0 cacoacnGcora a-π > co i co ro φ c ra ra ra Φ a -h co Η Π5 I I (0 CD Ή o a I -h C :(0 (0 I -H 111 0)'H (OrHC l-H C(0 >

0- HiH >1 (0 C (0 3 -H c Itp-H

O CO O rH I -H O E (0 CO -H -H (0 :0

1- l 0 1-) Φ 4-1 *H 4-) I -r-iO-H Cl C

(0 ο Φ j; io en c (0 m o 4-)0 ora :ra jiijjcuffiijJiHO ·η > g g y ra 4) 4-)4-1 a 4ί(03β>-Ι01)01ι > Ή (0 3 3 rH -H as g ic oh niH raw 3 >i ra h ry m η φ ra φ(0 rac/iracracoraHcoH os drajy οοίΣ (¾ l) * 4-)

rHrHfMOOTi-LOCCI^-CXJCrirHrH

70594 8 3. Fysiologiset ominaisuudet: (1) Kasvun lämpötila-alue (Bennett'in agar-vinopinnoi11a):

12 - 40°C, optimi: 27°C

(2) Gelatiinin nesteyttäminen (glukoosi-peptoni-gelatiini-vinopinnalla): negatiivinen (3) Tärkkelyksen hydrolysoituminen (tärkkelys-epäorgaaniset suolat-agarilla): positiivinen (4) Kuoritun maidon koaguloituminen ja peptonisaatio:

Koaguloituminen: positiivinen

Peptonisaatio : heikko (5) Melanoidipigmentin tuotto (tyrosiini-agari11a, peptoni-hiivarauta-agarilla ja tryptoni-hiivauute-1iuoksessa): negat i iv inen (6) Solun seinämä: I-tyyppinen (sisältää LL-diaminopimeliini-happoa) (7) Hii1ilähteiden käyttö (Pridham-Gottlieb-agarilla)

Hiili lähde Kasvu L-arabinoosi ++ D-ksyloosi + Huomautus: ++ = Erittäin hyvin D-glukoosi ++ + = Hyvin S-fruktoosi + ± = Epävarma

Sakkaroosi ± - = Ei käytä

Inositoli L-ramnoosi

Raffinoosi ± D-mannitoli - D-mannoosi

Salisiini 70594 9

Kirjallisuudesta, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" kahdeksas painos (1975)" "The Actinomycetes" Vol. II (1961), kirjoittaja S.A. Waksman ja "The International Streptomyces Project Reports", kirjoittaja E.B. Shirling ja D. Gottlieb (vrt. International Journal of Systematic Bacteriology Vol. 18, sivut 69 ja 279 (1968), Voi. 19, sivu 391 (1969) ja Voi. 22, sivu 265 (1972) on etsitty kantoja, joilla on edellä mainitut ominaisuudet). Tällaisia lajeja, joilla on suhteellisen analogiset ominaisuudet kannan ATCC n:o 31215 kanssa, on havaittu olevan Streptomyces sindenensis, Streptomyces xanthocidicus ja Streptomyces exfaliatus.

Kanta ATCC n:o 31215 eroaa kuitenkin näistä analogisista lajeista seuraavissa suhteissa: i) Streptomyces sindenensis:

Streptomyces sindenensis-lajin valmiit itiöketjut ovat yleensä lyhyitä. Lajin itiöt ovat heikkoja tärkkelys-epäorgaaniset suolat-agarilla. Lajin ilmarihmastoa muodostuu hieman glyseroli-asparagiini-agari11a. Lajin eräs kanta voi assimiloida D-mannitolia.

ii) Streptomyces xanthocidicus:

Streptomyces xanthocidicus-laj in ilmarihmasto on runsasta sekä glyseroli-asparagiini-agarilla että hiiva-mallasuute-agarilla. Eräät lajin kannat tuottavat melanoidipigmenttejä. Eräs lajin kanta voi assimiloida suhteellisen voimakkaasti sakkaroosia ja raffinoosia.

10 70594 iii) Streptomyces ex foii atus:

Streptomyces exf oi iatus muodostaa glyseroli-asparagiini-agarilla ilmarihmastoa. Lajin itiöt ovat hyvin runsaita hiiva-mal1asuute-agari1la. Eräs lajin kanta voi assimiloida suhteellisen hyvin sakkaroosia ja raffinoosia. Rikkoutumista ja lajin itiöiden muodostumista alustarihmastossa ei ole havaittavissa.

Kun otetaan huomioon edellä olevan tarkastelun tulos ja se seikka, että kanta ATCC 31215 pystyy tuottamaan uutta antibioottia FR-900098, kantaa ATCC 31215 voidaan pitää uutena, Streptomyces-sukuun kuuluvana lajina, jolle on annettu nimi Streptomyces rubellomurinus.

l )-2 Streptomyces rubellomurinus subsp. indigoferus ATCC 31304 :

Streptomyces rubellomurinus subsp. indigoferus ATCC 31304 lajilla on seuraavat morfologiset, viljelmä- ja fysiologiset ominaisuudet: 1. Morfologiset ominaisuudet

Viljelmiä, joita kasvatettiin 10 - 14 päivää 27°C:ssa sakkaroosinitraattiagarilla, glyseriini-asparagiiniagarilla, hiivamallasuuteagarilla, kaurajauhoagarilla ja epäorgaaniset suolat tärkkelysagarilla, tarkkailtiin mikroskooppisesti.

(1) Sporoforin morfologia: monopodiaalinen haarautuminen, rektifleksiibeli

Itiöketjut ovat yleensä pitkiä, yli 10 itiötä per ketju.

(2) Itiön pinta: sileä li n 70594 (3) itiön koko: 0,4 - 0,9 x 1,0 - 1,6 mikronia (4) Substraattirihmastossa ei tapahdu hyyfien pilkkoutumista eikä itiöiden muodostumista.

Itiöpesäkkeitä ja zoosporeja ei ole havaittavissa.

2. Viljelmäominaisuudet:

Kannalla on seuraavat vi1jelmäominaisuudet, kun sitä kasvatetaan seuraavassa annetuilla alustoilla 10 päivää alle 27°C:ssa.

i2 70594

X I

X

x C :TO :TO -m Φ X X χ E ι^ί TO 2»J ro 2* 9\ X X X X χ H iO [/1 Λ !/) ;(Π CL, r-ι Q) -Γ-l CL) .

tn tn <"0 *H *rH *r-( Ή .^ > fö m ίΤ3 (Π

0| -P 4J 4-> 4J 4J

C! rH r-H

Φ Ή Ή 1) *rH -r-l φ ·Η -rH *r-f -H *r-l ·Η *r-f -rH

γω ω ω ω ωω ωωω X ί

L :« 1C

C -rH C TO <υ to c 3 to c c c to φ φ > φ 3 χ 3 ra c 3

,—' χ tn h ϋ) ί, p x O S

_ i ,3am to sn ra Se p σ> ? tn 3 i to ji<; to > χ φ ;> χ > to > > * > * X x tn X U) 2d

tg 33 <0 C Q, TO C TO

tO , - MO ·« Φ 24 * g) o » :<0 » 2d x 2d ·.

I, ! £ -t-1 <=*-* C 24 CT C X C * C

hmg φ χ Φ en 3 φ en χ φ χ φ e o coo CM CO) cp—I C p Ό 3 Φ C φ 2* S Ji C Ο 0 c χ 24 χ in e χ C c χ 24 χ c 2»; e jc-h h

c Φ ΟΛ! 3 TOI P P TO Ή d JC u -H X ® X TO H 'P x 4-J :o3 > X C π > 5 X C X μΒ X )h φ χ φ X TO

> C:ttl h ie m x :TO :TO tn tn χ :TO ή k h :d :d £ £ £ h d x X Φ Φ TO Φ > X TO <0 Φ>3ΦΦΦ>Χ <D 24 p ΐ Ui-^ -¾ MO X 24 24 24 MO Φ .¾ Q, 24 X - V V 2)4 c x e φ c c χ φ e x e X e c φ c e e c as to :C 2d m ra TO TO Sj 24 to to d v, ή d :d m o j< :0 ;o φ d l tJ -u it Φ ή jt φ φ 24 24 24 Φ φ >1 φ ·η φ cnjt η χ e φ to

Φ -ή ra —ι C -id ,—ί x :(0 24 2*: χ x Qi x C x x MO x ·η -h h U

01 tt d φ 3 to x tn 3 3 to,—1 p, d φ d ό φ ^ t) tj d e P K; Φ P -p £ «5 Φ Φ χ -h d Φ S d ή e e Φ jo ra ra to χ > > o, > a, z > 24 a, z z > 2d ί > a> -h &> >>>a

M V

to e -CC I Φ e e φ Le

X Φ C ftj -H

i> _ > ---1 C (0 X

>1 C TO TO CC CC 3

X Φ X E <D TO 3 Φ JC

C Sn TO C > O, e o

*· e -H Φ 1—I ~ -rH Π3 e M

TO Φ TO TO e H C TO TO X C TO TO e g TO C TO E 3 -H Φ d £ L, φ φ g χ •p E to O, > C E TO Φ C X TO > Φ Sn X 13 X X X C X TO X >1 0,5 f 53 H ; TO 3 φ TO X 3 TO d H _c Φ a. -h to C. E χ χ Q, E > χ e tn ι e e > p " S e > ι S ι> -to 2^553 E X ex; TO 3 C X e 3 cc g3(0>3 TO >« Φ 3 > 3 Φ 3 Φ 3 Φ-Η X1 C ·η| φ a ex C (0 « & C d C CL e d

'T1 -M C >1 -Ή -m 4J ·Η ·Γ—t ·Η ·Η P

PO ' Im JJ 1)H O Lj μ O OX O® ® ^ J! >t 3' 2dX Φ^ι2ιί·> -V > 2tr £,--1 3 C X M to 1—13 CX,—I (0 rH X H 3

Γ-,ί.ίΡ -S 33 >1-H 'H 5 -r* —t to X P > to te tn >1 ’»H TO TO

Hi> CfSxx xe ω ω >o ί h > g >χω > -r-,

I X

rH Q) 1 1 e tn

rH : -rH -rH *rH

x e x e !

X x O) TO TO

TO x TO TO 1 IX

p CD Sh CD Φ .rH e

ShTOITOSh x ij, ex X1 1-1 CX O Sh 3 TOSh OtXl x te m ra to 3 cd <0 xoro CQr tocx en sh en to en (Xc> I tn I OShIOTOTO I TO φχχ X TO x I TO I en X O CX > X Sh tn 1 e tn en x tox X e ixxto Qxx >,TO e L s 3 - x C I en P tn x xi x 0 B to x tn xx to

Sh e Sh Chjxhh I —1 -tx QxCI

TO, C Φ 2d TO tn e TO TO φ O X O TO O

2dSH2dlHtnSH-idx ο X >Sh Sh C 2h:toXXX

-VTOCTOSTOShO Sh > x TO 3 e 3xCX3x 5 !?H 3 >h ra —ι en to φ x φ φ to <0 to en to o to o to h tn h cc ec to &C (S C'CnccSH^·

3^- . —•H·' — —- OX(M

xjxe^nnj-3· ^«νΟί"- οοσ> χχχ

II

13 3. Fysiologiset ominaisuudet: (1) Kasvun lämpötila-alue (Bennett'in agarvinopinnoilla):

12 - 40°C, optimi: 27°C

(2) Gelatiinin nesteytyminen (glukoosi-peptonigelatiini-vinopinnalla): negatiivinen (3) Tärkkelyksen hydrolysoituminen (tärkkelys-epäorgaaniset suolat-agarilla): hydrolysoituu voimakkaasti (4) Kuoritun maidon koaguloituminen ja peptonisaatio: koaguloituu ja tämän jälkeen heikko peptonisaatio (5) Melanoidipigmentin tuotto (tyrosiiniagari11a, peptoni-hiivarauta-agarilla ja tryptoni-hiivauute-1iuoksella): negati ivinen (6) Hi ililähteiden käyttö (Pridham-Gott1ieb-agari11a): H i i1ilähde Kasvu L-arab inoosi ++

Selluloosa D-fruktoosi + D-galaktoosi + D-glukoosi +

Glyseriini +

Inositoli - Merkki + = positiivinen

Laktoosi - = ei käytä D-maltoosi + D-mannitoli D-mannoosi

Raffinoosi L-ramnoosi --- ' Il 14 70594

Hiililähde Kasvu

Salisiini Tärkkelys + Merkki + = positiivinen

Sakkaroosi - = ei käytä D-ksyloosi +

Edellä mainitut mikroskooppiset tutkimukset ja viljelytutkimukset osoittavat, että kanta ATCC 31304 kuuluu Streptomyces-sukuun. Tätä organismia verrattiin siten Streptomyces-lajeista julkaistuihin kuvauksiin. Edellä mainitun informaation perusteella kannan ATCC 31304 voidaan katsoa muistuttavan läheisesti Streptomyces rubellomurinus ATCC 31215 lajia. Tämä lajin havaittiin kuitenkin poikkeavan kannasta ATCC 31303 siten, että sen vegetatiivinen rihmasto on indigon värinen hiiva-uutetta sisältävällä alustalla. Näiden vertailujen tuloksena kantaa ATCC 31304 pidetään Streptomyces rubellomurinus-lajin alalajina ja sille on annettu nimi Streptomyces rubellomurinus subsp. ind igoferus.

(2) Fermentaatio

Antibiootin FR-900098 valmistamiseksi voidaan fermentaatio suorittaa edellä kuvatuilla tavanomaisilla keinoilla ja myös antibiootin FR-900098 eristäminen voidaan suorittaa edellä kuvatuilla tavanomaisilla keinoilla.

Kuten aikaisemmin on mainittu, muodostuu viljelylluokseen kuitenkin samanaikaisesti sekä antibioottia FR-33289 että FR-900098, kun antibiootin FR-900098 valmistukseen käytetään Streptomyces rubellomurinus subsp. indigoferus-lajia.

Nämä molemmat antibiootit voidaan erottaa tavalliseen tapaan, kuten kromatograafisesti. Seuraavassa on esitetty yksi esimerkki erotusmenetelmästä.

15 70594

Viljelyliuoksen suodos (Vaihe a) Happameksi tehty absorbentti

Absorbaatti

Eluoint i Eluaatt i (Vaihe b) Anioninvaihtohartsi

Eluaatt i (Vaihe c) Selluloosapylvas- kromatograf ia

I I

FR-90098 FR-33289

Vaihe a;

Suodos tehdään tavalliseen tapaan happameksi, esimerkiksi säädetään pH-arvoon 2,8, ja liuos johdetaan sopivaa absor-bent.tiä, kuten hiiltä sisältävän pylvään läpi. Eluointi suoritetaan vesipitoisella liuottimella (esimerkiksi metanoli1la, asetoniilla, jne.).

Vaihe b:

Eluaatti johdetaan anionista ioninvaihtohartsia (esimerkiksi DEAE-Sephadex, Duolite A-6, jne.) sisältävän pylvään läpi. Eluointi suoritetaan esimerkiksi vesipitoisella natriumklori-dilla (esimerkiksi 0,3 N), vesipitoisella ammoniakilla (esimerkiksi 0,2 M) ja vastaavalla. Nämä vaiheet (vaihe a ja b) toistetaan edullisesti useaan kertaan.

ie 70594

Vaihe c:

Eluaatti pylväskromatografioidaan käyttämällä selluloosaa ja sopivaa kehitintä (esimerkiksi vesipitoinen propanoli, jne.). Antibiootti FR-90098 voidaan erottaa keittämällä 75-prosent-tisella vesipitoisella propanolilla ja antibiootti FR-33289 voidaan erottaa keittämällä 70-prosenttisella vesipitoisella propanol ilia.

Viljelylluokseen muodostunut tai viljelyliuoksesta erotettu antibiootti FR-900098 voidaan eristää vapaassa muodossa, so. FR-900098 per se ja kun antibioottia FR-900098 sisältävä liuos tai konsentraatti käsitellään aikaiimetal1i11a tai maa-alkali-metallilla (esimerkiksi natrium- tai kaiiumhydroksidi tai kalsiumkarbonaatti jne.) käsittelyvaiheiden, esimerkiksi uuttaminen, eristäminen tai puhdistaminen, aikana antibiootti FR-900098 voidaan eristää aikaiimetalli- tai maa-alkalimetalli-suolanaan.

Vapaassa muodossa saatu antibiootti FR-900098 voidaan myös muuntaa suolakseen emäksellä, kuten epäorgaanisella emäksellä (esimerkiksi natriumhydroksidi, kaiiumhydroksidi, kalsium-hydroksidi, ammoniakki jne.) tai orgaanisella emäksellä (esimerkiksi etanoliamiini, trimetyyliamiini, disykloheksyyli-amiini jne.) tavalliseen tapaan.

Antibiootin FR-900098 suola voidaan helposti muuntaa vapaaksi muodoksi käsittelemällä tavalliseen tapaan hapolla, kuten mineraalihapolla (esimerkiksi suolahappo jne.).

(3) Antibiootti FR-900098:

Edellä mainitun menetelmän mukaisesti saadun antibiootin FR-900098 mononatriumsuolalla on seuraavat fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet: li 17 70594 (a) Alkuaineanalyysi ( % ) s C 27,73; H 5,03; N 6,66 (muut; fosfori ja happi)

(b) Sp.: 193 - 194°C

(c) Ominaiskiertokyky; [0()25 = o (C = 1,0 vedessä)

D

(d) Ultraviolettiabsorptiospektri; H20 tai 0,1N HC1 = absorptiopääte

0,IN NaOH

^max = 230 nm (olake) 1 % (E 1 cm = 325) (e) Infrapuna-absorptiospektri: v KBr = 3450, 3400, 3350, 3100, 2930, 2800, ma 2420, 2320, 1615, 1570, 1495, 1450, 1420, 1370, 1310, 1280, 1240, 1220, 1200, 1180, 1160, 1090, 1080, 1050, 1040, 990, 980, 925, 910, 885, 810, 780, 760, 740, 710 cm"1 (f) Liukoisuus:

Liukenee hyvin veteen ja metanoliin Niukkaliukoinen asetoniin ja propanoliin

Liukenematon etyyliasetaattiin, kloroformiin, bentseeniin.

(g) Värjäysreaktio:

Positiivinen; kaikki reaktiot ferrikloridin, kaliumpermanganaatin ja jodihöyryn kanssa. Negatiivinen; ninhydriinireaktio ja Molish'in reaktio.

ie 70594 (h) Kiteiden muoto ja väri: Värittömiä prismoja (uudelleenkiteytetty metanolin ja asetonin seoksessa) (I) Ohutkerroskromatografia:

Kantaja; Eastman chromatogram Sheet Cellulose n:o 13254 (kauppanimi, valmistaja Eastman Kodak Co.)

Keh i tys1iuos Rf-arvo 75 % propanolin vesiliuos 0,5 n-butanolin kyllästetty vesiliuos 0 70 % asetonitriilin vesiliuos 0,4

Edellä mainittujen fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksien analyysi ja kemiallisen rakenteen muiden identifiointitutki-musten tuloksena antibiootin FR-900098 rakenne on vahvistettu seuraavaks i:

OH O

I II

CH3CO NCH2CH2CH2P OH

OH

[3-(N-asetyyli-N-hydroks iamino)propyylifosfonihappo] (II) . Yhdisteen (I"), jossa R1' on formyyli ja A' on -CH2-CH2-CH2-t so. 3-(N-formyyli-N-hydroksiamino)propyyli-fosfonihapon (jäljempänä käytetään viitettä FR-31705) ja/tai yhdisteen (I"), jossa Rl' on formyyli ja A' on trans-l-prope-nyleeni, so. 3-(N-formyyli-N-hydroksiamino)-trans-1-prope-nyylifosfonihapon (jäljempänä käytetään viitettä FR-900136) valmistus.

Antibioottia FR-31705 ja/tai antibioottia FR-900136 voidaan valmistaa fermentoimalla ravintomediumissa Streptomyces-sukuun il 19 70594 kuuluvaa, antibioottia FR-31705 ja/tai antibioottia FR-900136 tuottavaa kantaa, esimerkiksi Streptomyces lavendulae-kantaa.

(1) Mikro-organismi:

Mikro-organismi, jota voidaan käyttää uusien antibioottien FR-31705 ja/tai FR-900136 valmistamiseen, on Streptomyces lavendulae-kanta, joka on äskettäin eristetty maanäytteestä, jonka ottopaikka on Fukue city, Nagasaki prefecture, Japani.

Elävän organismin viljelmä on tallennettu numerolla ATCC n:o 31279 American Type Culture Collection kokoelmaan ja numerolla 3808 japanilaiseen kokoelmaan Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology.

2) Mikrobiologiset ominaisuudet 2)-l Streptomyces lavendulae ATCC 31279

Streptomyces lavendulae ATCC 31279-laji1la on seuraavat morfologiset, viljelmä- ja fysiologiset ominaisuudet: 1. Morfologiset ominaisuudet:

Viljelmän morfologiaa tarkkailtiin mikroskooppisesti rihmastolla, jota oli kasvatettu glyseroli-asparagiiniagarilla, h i i va-ma 11. asuuteagar i 1 la , kaura j auhoagar i 11 a ja epäorgaaniset suolat-tärkkelysagarilla.

(1) Itiöitä muodostavien hyyfien haarautumistapa:

Monopodiaalinen haarautuminen (2) Itiöitä muodostavien hyyfien muoto:

Retinakuliaperti: avoin silmukka, koukku ja joskus rektus ja spiraali 70594 20 (3) Itiöiden määrä: 10 - 50 itiötä (4) Itiön pinnan ulkonäkö ja koko:

Sileä, 0,5 - 1,2 x 1,4 - 2,0 mikronia (5) Zoosporien esiintyminen:

Ei havaittu (6) Itiöpesäkkeiden esiintyminen:

Ei havaittu (7) Itiöiden muodostuminen:

Ilmar ihmastossa (8) Substraattirihmaston pilkkoutuminen:

Ei havaittu 2. Viljelmäominaisuudet:

Kannalla on seuraavat viljelmäominaisuudet, kun sitä kasvatetaan 10 - 14 päivää 30°C:ssa seuraavilla alustoilla.

il 70594 21 3 t

-U

S j i s § H > CL (0 <o J c m :(¾ ro x: > (Ο φ -p φ o <o

Φ ; g Λί jtf P

c Φ CO Ή a) </)(/)

φ -P ,·Ρ P -p -P -H 3 :(0 -p 3 -p DO

ft ω ft ω ω :π P ^ ω S ω Se

j I

ft I

f | i :<T3 (0

—< P

0) c

C -M -H

p OI >1 :nj a £> c a p M -ι-t Cu - -p - :m (0 - :ic P :(0 *- :io :ro S (0 Φ - :(0 (0 -p c p :ia p c p p p cu φ cn

:(0 Φ -P > ·Ρ φ -P -H y Φ Ή Ji -P

c -H C Φ C Φ C φ Φ - (OM c « κι - >, φ c -p .* ra .* -p .* .* c p co -p .* p c a C φ (0 4* E -* Φ -* -*Φ P φ (Ο -V P Φ Qj

•p -p P :ra P :ro p :ra :(0 C C Q, P :(0 2 C S

> CL Λ h ie Φ c i—i ι/i en -p :ra ;(o h cn :(0 -h Ci :(0 ρ ρ Φ Φ φ φ Φ guu>:iii®i> ρ p •p -h ji a | a a - Οι :Φ -h :ro -r-ι .v c. :(0 :(0 - -p P C φ C ' C C C > φ p cn C 4-) > C Φ (0 :0 -* (0 :<0 :C :(0 (0 :ro :0 :i0 C .* Ρ -p ro :(0 P (0 C tn :0 ^ 4) U 4L φ Ή JJ-H Φ-H U-H (0-^ Φ >|Φ·Η φ D (0 (0 Ρ Φ -Ρ :ί0 *—I C -Ή C ι—ι C ·Η C Ε -Φ ft a I—I C --Η 5 Ε CD ·ρ *(0 ςηΡίΛΦΦΡφΦΦΡφΕφί-ιαΦΦ'—icfiCccitfi Φ :Φ Φ (0 -ρ :(0 ·γ-ι (Ο ·ρ :ι0 -ρ φ φ φ S (0 ·η φ ro φ φ :ro Φ >|> a > a|> ο^> a > a hi δϋ ρ > a .* ϋ ρ > a Ρ

>i C CC

χ: φ φ φ

>1 C CC

ι—I -Ρ - C - C - Ή - ·Ρ (ΟίΟφίΟΦ- (ΟΦΦΦ c ggciocc (οεφε Φ C S Ε ·Η Ε ·Η φ ΕφΕφ , c φ ft ρ ra ρ ra c fid Ch O-HC r-ΗίθΕΦΕ-^ (Or-1 (0 r-l PO-Η -p x: ra x; ra o C χ: -h χ; ·ρ c KJiiB -hCHCHi:® ΊΞ > Έ > - Φ

(Oi—I E 1 C C (O H 10 H ι—1C (ODfuOCC

E (0 (0 Φ D > -ρ > -ρ (O -ρ > 3 > D Φ -P

£>Hca(o>(j>>5 (o α (ο a c (o

•H ι—I ·Ή jJ xJ t JJ Jj *f~( P

P - -r-ι o u L U li U - Φ p p Ci p O Φ (0ρ>4*:>ίφ>1φ>1ρχ; φ >, φ >- .* x; edoppcx:cx:do c x: c x: ft d

H£ 2 5 >p >,p >|£ (Jd 3 > 3 > (0 (0 -P -H

mo a > ft ft ft ft —ι o -ft|ft ft .-ι ft ft > ·η ω ω

I P

Ρ Φ I I C (Λ

ι—I -ι—I - r-l · rH

p c -H C

P -r-l CD (0 (0

(0 -·—t (0 (0 I IP

(0 CD Ci CD Φ -H c

Ci (O (O Cl ρ P C -P

ρ p a ο ρ ο φ o a p ra cn :ra ra 3 cd ρ O (0 caraacDPcnraac > I CO I Φ Ρ (0 (0 (0 I Φ-H -r-l

•p (0 ·>--ι 1 (0 I CD ft O a > -P P

cn ι c cn σ-r-i ίο h jz i -p x: ra

0-r-l-d >| « C I <o 3 ·Η C ICD

o in -π η ι -π O E <0 cn -r-ι -p ra C C Cl φ p -p p ι -n Q -P ci (0 o a) jc (C m c (o ro opo ΟΌ u<;cjcpinp4»rpo >pp j<(0p pp

_C(0D(0>i(0COP ι > -P(0D OP-p CuD

(0 CD ι-H: rD,r-l Öi:(OD>r (0 -P CD (Ο Η φ IJ φ (0 ic d c u it o (0 H k h os χον: ο σΣ ftp

Jj 1 » '---!---I- s = r-l CM p LTl i'cC r- CC jCT> rH < 22 70594 3. Fysiologiset ominaisuudet (1) Kasvun lämpötila-alue (Bennett'in agar):

12 - 40°C, optimi: 26°C

(2) Gelatiinin nesteytyminen (glukoosi-peptoni-gelatiini- vinopinnalla): negatiivinen (3) Tärkkelyksen hydrolysoituminen (tärkkelys-epäorgaaniset suolat-agari11a): positiivinen (4) Kuoritun maidon koaguloituminen ja peptonisaatio:

Koaguloituminen: negatiivinen

Peptonisaatio : peptonisoituu hitaasti (5) Melanoidipigmentin tuotto: (a) Positiivinen peptoni-hiiva-rauta-agarilla (b) Negatiivinen tyrosiiniagarilla (6) Hii1ilähteiden käyttö (Pridham-Gottlieb-agarilla)

Hiililähde Kasvu L-arabinoosi

Selluloosa - D-fraktoosi D-glukoosi + D-galaktoosi +

Inositoli - Merkit: + = hyvä D-mannoosi ± ± = epävarma D-mannotoli - = ei käytä L-ramnoosi

Raffinoosi

Suk.roosi

Sai isiini + D-ksyloosi kl 23 7 0 5 9 4

Edellä mainitut mikrobiologiset ominaisuudet osoittavat, että kanta ATCC 31279 kuuluu Streptomyces-sukuun. Tämän seurauksena etsittiin kirjallisuudesta, "Bergey's Manual of Determinavite Bacteriology" kahdeksas painos (1975), "The Actinomycetes"

Voi. II (1961), kirjoittaja S.A. Waksman ja "The International Streptomyces Project Reports", kirjoittaja E.B. Shirling ja D. Gottlieb [Vert. International Journal of Systematic Bacteriology Voi. 18, sivut 69 - 189 ja 279 - 392 (1968), Voi. 19, sivut 391 - 512 (1969) ja Voi. 22, sivut 265 - 394 (1972)] kantoja, joilla on edellä mainitut ominaisuudet, jolloin vahvistui, että kannan ATCC 31279 mikrobiologiset ominaisuudet ovat identtiset Streptomyces lavendulae-laj in kanssa.

Tämä havainto vahvistettiin myös vertaamalla kannan ATCC 31279 ja tyyppiviljelmän, Streptomyces lavendulae IAM 0009, mikrobiologisia ominaisuuksia.

Edellä mainittujen havaintojen perusteella kannalle on annettu nimi Streptomyces lavendulae.

(2) Fermentaatio:

Fermentaatio antibiootin FR-31705 ja antibiootin FR-900136 valmistamiseksi voidaan suorittaa edellä mainituilla tavanomaisilla menetelmillä ja myös näiden antibioottien eristäminen voidaan vastaavasti suorittaa edellä mainituilla tavanomaisilla menetelmillä.

Kuten edellä mainittiin, sisältää viljelyliuos sekä antibioottia FR-31705 että antibioottia FR-900136. Nämä molemmat antibiootit voidaan erottaa tavalliseen tapaan, kuten kromato-grafisesti. Seuraavassa on annettu yksi esimerkki erotusmenetelmästä.

24 70594

Viljelyliuoksen suodos (Vaihe a') Happameksi tehty absorbentti

Absorbaatti

Eluointi

Eluaatti (Vaihe b') Anioninvaihtohartsi

Eluaatti (Vaihe c') Selluloosapylväs- kromatografia

I- I

FR-31705 FR-900136

Vaihe a *;

Suodos tehdään tavalliseen tapaan happameksi (säädetään esimerkiksi pH-arvoon 2,0) ja liuos johdetaan sopivaa adsorbenttia, kuten hiiltä sisältävän pylvään läpi. Eluointi suoritetaan vesipitoisella liuottimena (esimerkiksi metanoli, asetoni jne.).

Vaihe b1:

Eluaatti johdetaan anioninvaihtohartsia (esimerkiksi DEAE-Sephadex, Duolite A-6, jne.) sisältävän pylvään läpi. Eluointi suoritetaan esimerkiksi vesipitoisella natriumkloridilla (esimerkiksi 0,3 M) ja vesipitoisella ammoniakilla (esimerkiksi 0,2 M).

25 705 94

Vaihe c':

Eluaatti pylväskromatografioidaan käyttämällä selluloosaa ja sopivaa kehitinliuotinta (esimerkiksi vesipitoinen propanoli, jne.). FR-31705 voidaan erottaa esimerkiksi kehittämällä 97 %:lla vesipitoisella propanolilla ja FR-900136 voidaan erottaa kehittämällä 95 %:lla vesipitoisella propanolilla.

Viljely1iuoksessa muodostuneet tai viljelyliuoksesta erotetut antibiootit FR-31705 ja FR-900136 voidaan eristää vapaassa muodossa, so. FR-31705 per se. Nämä antibiootit voidaan lisäksi eristää alkali- tai maa-alkalimetal1isuolanaan käsittelemällä antibiootteja sisältävää liuosta alkali- tai maa-alkaiimetal-lilla (esimerkiksi natrium- tai kaiiumhydroksidi tai kalsium-karbonaatti jne.) käsiteltyjen, esimerkiksi uuttamisen, eristämisen tai puhdistamisen aikana.

Vapaina muotoinaan saadut antibiootit voidaan myös muuntaa suoloikseen emäksillä, kuten epäorgaanisella emäksellä (esimerkiksi natriumhydroksidi, kaiiumhydroksidi, kalsiumhydroksidi, ammoniakki jne.) ja orgaanisella emäksellä (esimerkiksi etanoliamiini), trimetyyliamiini, disykloheksyyliamiini jne.) tavalliseen tapaan.

Näiden antibioottien suolat voidaan helposti muuntaa vapaaksi hapoksi käsittelemällä niitä tavalliseen tapaan, kuten mineraalihapol1 a (esimerkiksi suolahappo jne.).

3) Antibiootit FR-31705 ja FR-900136: 3)-1 Antibiootti FR-31705

Edellä mainitulla menetelmällä saadun antibiootin FR-31705 monokalsiumsuolalla on seuraavat fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet: 26 70594 (a) Alkuaineanalyysi (%): C 21,62; H 4,07; N 6,36; K 17,99 (b) Sp.: 202 - 204°C (haj.) (c) Infrapuna-absorptiospektri: nuj oii

Vmax = 2950, 2925, 2850, 2550, 2380, 1650, 1460, 1410, 1395, 1375, 1320, 1300, 1260, 1220, 1190, 1150, 1120, 940, 890, 810, 785, 700 cm-1 (d) NMR-spektri S(ppm) D20:ssa 1,25 - 2,3 (4H, m), 3,65 (2H, t, J=6Hz), 8,00 (s) ^

8,35 (s) ·* 1H

Edellä mainittujen fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksien ja kemiallisen rakenteen muiden identifioimistutkimusten perusteella antibiootin FR-31705 kemiallinen rakenne on tunnistettu seuraavaksi:

OH O

I II

HCO-NCH2CH2CH2P-OH

OH

f 3-(N-formyy1i-N-hydroks i amino)propyyli fosfon ihappo] 3)-2 Antibiootti FR-900136

Edellä mainitulla menetelmällä saadun antibiootin FR-900136 monokaliumsuolalla on seuraavat fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet.

27 70594 (a) Alkuaineanalyysi (%) C 21,32; H 3,26; N 6,00; H20 1,49 (b) Sp.; 178 - 180°C (haj.) (c) Infrapuna-absorptiospektri; nujoii

Vmax = 2960, 2930, 2870, 2600, 2350, 1660, 1530, 1460, 1440, 1400, 1380, 1365, 1290, 1250, 1180, 1125, 1070, 1010, 980, 960, 950, 890, 830, 780, 700 cm-1 (d) NMR-spektri 6(ppm) D20:ssa 4,30 (2H, m), 6,01 (1H, m), 6,38 (1H, m),

8,02 (s) -j 8,32 (s) * 1H

Edellä olevien fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksien ja kemiallisen rakenteen muiden indentifioimistutkimusten perusteella antibiootin FR-900136 kemiallinen rakenne on tunnistettu seuraavaksi:

OH O

I II

hco-n-ch2ch=chp-oh

OH

[3-(N-formyy1i-N-hydroks iamino)-trans-1-propenyylifosfoni- happo] (III). Yhdisteen (I"), jossa R1' on asetyyli ja cl

A’ on OH

-ch2-ch-ch2-, ______ - ι; 28 70594 so. 3-(N-asetyyli-N-hydroksiamino)-2-hydroks ipropyylifosfoni-hapon (jäljempänä käytetään viitettä FR-33289) valmistus:

Antibioottia FR-33289 voidaan valmistaa fermentoimalla ravintomedlumissa Streptomyces-sukuun kuuluvaa, antibioottia FR-33289 tuottavaa kantaa, kuten Streptomyces rubellomurinus subsp. indigoferus-kantaa.

(1) Mikro-organismi:

Suositellusta mikro-organismista, jota voidaan käyttää uuden antibiootin FR-33289 valmistuksessa, voidaan mainita esimerkkinä Streptomyces rubellomurinus subsp. indigoferus ATCC 31304.

Kannan ATCC 31304 mikrobiologiset ominaisuudet on kuvattu edellä, mihin tarvittaessa viitataan.

Fdelleen on huomattava, että Streptomyces rubellomurinus subsp. ind igoferus ATCC 31304 voi tuottaa viljelylluokseen samanaikaisesti sekä antibioottia FR-900098 että antibioottia FR-33289, kuten edellä mainittiin.

(2) Fermentaatio:

Fermentaatio antibiootin FR-33289 valmistamiseksi voidaan suorittaa edellä mainituilla normaaleilla tavoilla ja myös antibiootin eristäminen voidaan suorittaa edellä mainituilla tavanomaisilla keinoilla.

Kuten edellä mainittiin, viljelyliuos sisältää sekä antibioottia FR-900098 että antibioottia FR-33289. Nämä molemmat antibiootit voidaan erottaa.

Suositellut erotustavat ovat samat kuin mitä edellä mainittiin.

29 70594 (3) Antibiootti FR-33289:

Edellä mainitulla menetelmällä saadun antibiootin FR-33289 mononatriumsuolalla on seuraavat fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet: (a) Infrapuna-absorptiospektri:

KBR

Vmax = 3300, 2900, 2400, 1740, 1620, 1420, 1240, 1140, 1040, 900 cm"1 (b) NMR-spektri: S (ppm) Ö2O:ssa 1,88 (2H, d,d. J=6 S 18Hz), 2,16 (3H, s), 3,66 - 3,9 (2H, m), 4,30 (1H, m) (c) Värjäysreaktio:

Positiivinen: reaktio ferrikloridin, kaliumpermanganaatin ja jodihöyryn kanssa.

(a) Ohutkerroskromatografia:

Kantaja; Eastman chromatogram Sheet Cellulose n:o 13254 (kauppanimi, valmistaja Eastman Kodak Co.)

Keh i tysliuos Rf 60 % propanolin vesiliuos 0,6

Edellä olevien kemiallisten ominaisuuksien ja kemiallisen rakenteen muiden identifioimistutkimusten perusteella antibiootin FR-33289 kemiallinen rakenne on tunnistettu seuraavaksi:

OH OH O

l I II

CH3CO-N-CH2CHCH2-P-OH

OH

30 70594 [3-(N-asetyyli-N-hydroks iamino)-2-hydroks ipropyylifosfoni-happol

Hydroksiaminohiilivetyfosfonihappojohdannaisten biologiset ominaisuudet

Antimikrobiaalinen aktiivisuus:

Kohdeyhd isteillä, hydroksiaminohiilivetyfosfon ihappoj ohdan-naisilla (I), niiden fosfonoryhmän estereillä ja niiden suoloilla, on havaittu olevan voimakas antibakteerinen aktiivisuus patogeenisiä mikro-organismeja, kuten gram-positiivisia ja -negatiivisia bakteereita, mukaanlukien Bacillus, Sareina, Escherichia, Proteus, Salmonella, Pseudomonas, Shigella ja Enterobacter suvut, vastaan. Tämän keksinnön mukaiset kohdeyhdisteet ovat siten hyödyllisiä hoidettaessa tällaisten patogeenisten bakteereiden aiheuttamia infektiotauteja ihmisissä ja eläimissä. Seuraavassa on havainnollistettu eräiden tyypillisten kohdeyhdisteiden (I) biologisia ominaisuuksia.

1. 3-(N-asetyyli-N-hydroksiamino)-propyylifosfonihapon monona tr iumsuola:

Pienin ehkäisevä konsentraatio (M.I.C.) M.I.C.-testi suoritettiin käyttämällä tavanomaista sarjalai-mennusmenetelmää ravintoagarilla, jota inkuboitiin 20 tuntia 37°C:ssa. M.I.C.-arvo ilmoitetaan 3-(N-asetyyli-N-hydroksi-amino)propyylifosfonihapon mononatriumsuolan sinä pienimpänä konsentraationa (mikrogramma/ml), joka ehkäisee mikro-organismin kasvua. Tulokset ovat seuraavat:

II

„ 70594

Koeorganismi M.I.C (pg/ml)

Staphylococcus aureus FDA209P JC-1 > 1000

Bacillus subtilis ATCC6633 125

Sareina lutea PCI 1001 8

Escherichia coli NIHJ JC-2 63

Escherichia coli 1341-29 32

Klebsiella pneumoniae NCTC 418 500

Proteus vulgaris IAM 1025 125

Proteus mirabilis 1 > 1000

Proteus morganii 30 > 1000

Proteus rettgeri 15 63

Pseudomonas aeruginosa IAM 1095 250

Salmonella typhi T-287 2

Shigella flexneri IaEW8 8

Serratia narcescens 5 250

Citrobacter freundii 20 500

Enterobacter aerogenes 10 32

Enterobacter cloacae 25 63

Suojaava vaikutus hiirillä kokeellisesti aiheutetuissa infektioissa: 3-(N-asetyyli-N-hydroksiamino)propyylifosfonihapon mono-natriumsuolan aktiivisuus in vivo Escherichia coli-lajia vastaan testattiin käyttämällä ICR-kannan koirashiiriä, joiden paino oli 20 - 25 g. Kaksi ryhmää, joihin kumpaankin kuului neljä hiirtä, pidettiin paastolla 24 tuntia ennen testausta.

Kuhunkin hiireen injektoitiin intraperitoneaalisesti patogeenisen bakteerin, Scherichia coli kanta n:o 1341-29, suspensiota 2,5 %:ssa Mucin'in vesiliuoksessa (0,5 ml).

(Haasteannos: 1 x 106 elävää solua/hiiri). Toista ryhmää käytettiin suojaavan vaikutuksen mittaamiseen ja toista _._ - ti 32 70594 vertailuna.

Tunnin kuluttua infektoinnin jälkeen injektoitiin koeryhmän jokaiseen hiireen 3-(N-asetyyli-N-hydroksiamino)propyyli-fosfonihapon mononatriumsuolaa (4 mg) vedessä (0,5 ml). Vertailuryhmän hiiriä ei käsitelty antibiootilla.

Kummastakin ryhmästä laskettiin eläimet, jotka kuolivat ja jäivät eloon, yhden viikon ajalta.

Koeryhmän kaikki hiiret jäivät eloon, kun taas vertailuryhmän kaikki hiiret kuolivat.

Akuutti toksisuus: 3-(N-asetyyli-N-hydroksiamino)propyylifosfonihapon mononat-riumsuolan liuosta vedessä (0,5 ml) injektoitiin laskimonsisäisesti viiteen hiireen (annos: 5 g/kg) . Kaikki tulokset olivat normaaleja 10 päivän kuluttua antamisesta.

Hypolipideeminen aktiivisuus: Tämän keksinnön mukaisella kohdeyhdisteellä (I) on myös hypolipideeminen aktiivisuus, kuten hypokolesteroleeninen aktiivisuus, ja se on hyödyllinen terapeuttisena aineena hyperlipemian hoidossa.

Esimerkiksi 3-(N-hydroksiamino)propyylifosfonihapon, joka on eräs kohdeyhdisteistä, hypokolesteroleeminen aktiivisuus eli lähes sama kuin markkinoilla olevan "Klofibraatin", testissä, jossa Wistar-kannan rotille annettiin kolesterolia sisältävää, runsasrasvaista ravintoa.

2. 3-(N-formyyli-N-hydroksiamino)propyylifosfonihapon mono-ammoniumsuola: 33 70594

Pienin ehkäisevä konsentraatio (M.I.C.): M.I.C.-testi suoritettiin käyttämällä tavanomaista sarjalai-mennusmenetelmää (ymppi: 10^ solua/ml) ravintoagari1la, jota inkuboitiin 20 tuntia 37°C:ssa. M.I.C.-arvo ilmoitetaan 3-(N-formyyli-N-hydroksiamino)propyylifosionihapon sinä pienimpänä konsentraat.iona (|jg/ml), joka ehkäisee mikro-organismien kasvua. Tulokset ovat seuraavat:

Koeorganismi M.I.C (pg/ml)

Staphylococcus aureus FDA209P JC-1 800

Bacillus subtilis ATCC6633 6,25

Sareina lutea PCI 1001 0,1

Escherichia coli NIHJ JC-2 200

Escherichia coli 1341-18(R) 12,5

Klebsiella pneumoniae NCTC 418 100

Proteus vulgaris IAM 1025 3,13

Proteus mirabilis 1432-75 6,25

Proteus morganii 1433-2 800

Proteus rettgeri 1434-3 1,56

Proteus inconstans 1436-21 3,13

Pseudomonas aeruginosa IAM 1095 0,78

Salmonella enteritidis 1891 0,39

Salmonella typhi 0-901 0,39

Salmonella paratyphi A-1015 12,5

Salmonella typhimurium 1406 25

Shigella flexneri IaEW8 12,5

Shigella sonnei I EW33 100

Serratia marcescens 1421-4 100

Citrobacter freundii 1381-3 3,13

Enterobacter aerogenes 1402-10 6,25

Enterobacter cloacae 1401-4 6,25 34 70594

Suojaava vaikutus hiirillä kokeellisesti aiheutetuissa infektioissa: (a) Koeyhdiste: 3-(N-formyyli-N-hydroksiamino)propyylifosfonihapon mono- ammoniumsuola (b) Koe-eläin: ICR-kannan koirashiiriä, joiden ikä oli 4 viikkoa ja paino 24 ± 1 g. Jokainen koeryhmä käsitti 8 eläintä.

(c) Koemenetelmä:

Jokaiseen koe-eläimeen injektoitiin intraperitoneaalisesti patogeenisiä bakteereita tietty määrä 5 %:ssa Mucin’in vesiliuoksessa (0,5 ml).

Tämän jälkeen jokaiselle koe-eläimelle annettiin edellä mainittua koeyhdistettä vedessä (0,25 ml) ihonalaisesti kolme kertaa tunteita 0, 1 ja 3 tai suun kautta yhden kerran tuntina 1 patogeenisillä bakteereilla suoritetun infektoinnin jälkeen.

Kaikkien koe-eläinten eloonjäämistä tai kuolemista tarkkailtiin yhden viikon ajan ja ED50~arvot laskettiin probit-menetelmällä. Tulokset on annettu seuraavassa taulukossa.

il 70594 35

Hiirtä kohti siirrostettu- ED5Q (mg/hiiri)

Patogeeninen jen elävien suun kautta ihon alle bakteeri solujen määrä_annettuna annettuna

Pseudomonas aeruginosa 1,2 x 10δ 0,228 0,280 1101-76___________ F s c h e r i c h a coli 1341-67_6,9 x 107_0,167_2,559

Proteus mirabilis 1432-75_8,0 x 107__0,236_4,331

Akuutti toksisuus (a) Koeyhdiste: 3-(N-formyyli-N-hyd roks iamino)propyyli fosfonihapon mononatr iumsuola.

(b) Koe-eläin: ICR-kannan koiras- ja naarashiiret, ikä 6 viikkoa.

(c) Tarkkailuajat:

Yksi viikko (d) Laskentamenetelmä:

Litchfield'in ja Wilcoxon'in menetelmä LD5O (mg/kg) suun kautta ihon alle

Eläin Sukupuol i _annettuna_annettuna

Hiiri koiras 11.000 8.050 ________naaras_____11.000__8.270__

Rotta___ koiras___ 11.000___8.000__ 70594 36 3. 3-( N-formyy1i-N-hydroks iamino)-trans-1-propenyylifosfoni-hapon monokaliumsuola:

Pienin ehkäisevä konsentraatio (M.I.C.) M.I.C-testi suoritettiin käyttämällä tavanomaista sarjalai-mennusmenetelmää (ymppi: 10^ solua/ml), ravintoagarilla, jota inkuboitiin 18 tuntia 37°C:ssa. M.I.C-arvo ilmoitetaan 3-(N-formyy1i-N-hydroksiamino)-trans-1-propenyylifostonihapon mono-kaliumsuola sinä pienimpänä konsentraationa (pg/ml), joka ehkäisee mikro-organismien kasvua. Tulokset ovat seuraavat:

Koeorganismi M.I.C (pg/ml)

Staphylococcus aureus FDA209P JC-1 100

Bacillus subtilis ATCC6633 6,25

Sareina lutea PCI 1001 0,2

Escherichia coli 1341-18(R+) 25

Klebsiella pneumoniae NCTC 418 100

Proteus vulgaris IAM 1025 1,56

Proteus mirabilis 1432-75 0,39

Proteus morganii 1433-2 100

Proteus rettgeri 1434-3 6,25

Proteus inconstans 1436-21 25

Pseudomonas aeruginosa IAM 1095 1,56

Salmonella enteritidis 1891 6,25

Salmonella typhi 0-901 0,78

Salmonella paratyphi A-1015 25

Salmonella typhimurium 1406 12,5

Shigella flexneri IaEW8 50

Shigella sonnei I EW33 25

Serratia marcescens 1421-4 100

Citrobacter freundii 1381-3 12,5

Enterobacter aerogenes 1402-10 50

Enterobacter cloacae 1401-4 12,5

II

70594 37

Hydroks iaminohiilivetyfosfonihappojohdannaisia sisältävä farmaseuttinen seos Tämän keksinnön mukaiset kohdeyhdisteet (I), tämän keksinnön mukaiset hydroksiaminohiilivetyfosfonihappojohdannaiset sen fosfonoryhmässä, voidaan formuloida antamista varten millä tahansa tarkoituksenmukaisella tavalla, analogisesti tunnettujen antibioottien kanssa, seoksena toksittoman farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoaineen kanssa.

Yhdisteen (I) farmaseuttisesti hyväksyttävä suola voi olla suola epäorgaanisen tai orgaanisen emäksen kanssa, kuten natriumsuola, kaliumsuola, kalsiumsuola, ammoniumsuola, etanoliamiinisuola, trietyyliamiinisuola, disykloheksyyli-amiinisuola ja vastaava ja suola epäorgaanisen tai orgaanisen hapon kanssa, kuten hydrokloridi, sulfaatti, sitraatti, maleaatti, fumaraatti, tartraatti, p-tolueenisulfonaatti ja vastaava, ja edelleen suola aminohapon kanssa, kuten arginiinisuola, aspartiinihapposuola, glutamiinihapposuola, ja vastaava.

Antimikrobista seosta voidaan siten käyttää farmaseuttisena valmisteena, esimerkiksi kiinteässä, puolikiinteässä tai nestemäisessä muodossa, joka sisältää aktiivista kohdeyhdis-tettä seoksena farmaseuttisen orgaanisen tai epäorgaanisen kantoaineen tai apuaineen kanssa, joka sopii ulkoiseen, enteraaliseen tai parenteraaliseen sovellutukseen. Aktiivinen ainesosa voi olla seostettu esimerkiksi tavanomaisten toksittomien, farmaseuttisesti hyväksyttävien kantoaineiden kanssa, jotka on tarkoitettu tabletteihin, pelleteihin, kapseleihin, lääkepuikkoihin, liuoksiin, emulsioihin, suspensioihin ja mihin muuhun tahansa käyttöön sopivaan muotoon. Käyttökelpoisia kantoaineta ovat vesi, glukoosi, laktoosi, akaasiakumi, gelatiini, mannitoli, tärkkelystahna, 70594 38 magnesiumtrisi1ikaatti, talkki, maissitärkkelys, keratiini, kolloidaalinen silika, perunatärkkelys, urea ja muut kanto-aineet, jotka sopivat preparaattien valmistukseen kiinteässä, puolikiinteässä tai nestemäisessä muodossa, ja lisäksi voidaan käyttää apuaineita, stabilointiaineita, sakeuttimia ja värjäysaineita ja parfyymejä, Antimikrobiset seokset voivat sisältää myös säilytysaineita tai bakteriostaattisia aineita, joiden avulla pidetään haluttujen preparaattien aktiivinen ainesosa aktiivisuudeltaan stabiilina, Antimikrobinen seos sisältää aktiivista kohdeyhdistettä sellaisen määrän, että se riittää aiheuttamaan halutun terapeuttisen vaikutuksen bakteereiden infektoimaan prosessiin tai tilaan.

Kun tätä seosta annetaan ihmisille, se tapahtuu parhaiten laskimonsisäisenä, lihaksensisäisenä tai oraalisena antotapana. Vaikkakin tämän keksinnön mukaisen kohdeyhdisteen annostus tai terapeuttisesti tehokas määrä vaihtelee ja riippuu kunkin hoidettavan yksittäisen potilaan iästä ja tilasta, päiväannoksena tautien hoidossa käytetään tavallisesti noin 2 - 100 mg aktiivista ainesosaa ihmisen tai eläimen painokiloa kohti. Keskimääräisenä yksittäisannoksena annetaan tavallisesti noin 50 mg, 100 mg, 250 mg ja 500 mg.

Esimerkki fermentaatiosta (1) Kasvatusalusta (100 ml), joka sisälsi 2 % tärkkelystä, 1 % puuvillasiemenjauhoa ja 1 % kuivattua hiivaa, kaadettiin viiteen 500 ml:an Sakaguchi-pulloon ja steriloitiin 20 minuutin aikana 120°C:ssa. Silmukallinen Streptomyces rubellomu- rinus FERM n:o (ATCC n:o 31215) mikro-organismin vinopinta-viljelmässä siirrostettiin kuhunkin alustaan ja kasvatettiin 2 päivää 30°C:ssa. Saatu viljelmä siirrostettiin alustaan (20 1), joka sisälsi 5 % liukenevaa tärkkelystä, 0,5 % puuvillasiemen jauhoa, 2,5 % gluteenijauhoa, 0,5 % kuivahiivaa,

II

70594 39 1 % MgSC>4 · 4H20, 1 % KH2PO4 ja 0,7 % Na2HPC>4 . I2H2O 30 litran fermentorissa, joka oli etukäteen steriloitu 20 minuutin aikana 120°C:ssa, ja kasvatettiin 3 päivää 30°C:ssa.

Kun kasvatus oli suoritettu loppuun, kasvatuslluokseen lisättiin piimaata (400 g) ja seos suodatettiin. Suodos (20 1) väkevöitiin alipaineessa 1 litraksi. Konsentraattiin lisättiin metanolia (4 1) ja seosta sekoitettiin, jolloin muodostui sakkaa. Sakka otettiin talteen suodattamalla ja suodos väkevöitiin 1 litraksi. Saatu konsentraatti johdettiin aktiivi-hiiltä sisältävän pylvään läpi. Pylvään läpi kulkenut liuos säädettiin pH-arvoon 2,0 kationinvaihtohartsi11a, Duolite 020 (kauppanimi, valmistaja Diamond Shamrock Chemical Co.) (H+-tyyppi; 500 ml) ja johdettiin Duolite A6 (kauppanimi, valmistaja Diamond Shamrock Chemical Co.) (0H“-tyyppi; 500 ml) pylvään läpi. Tämän jälkeen eluoitiin 0,1 N vesipitoisella natriumhydroksidi1iuoksella (1500 ml). Eluaatti säädettiin pH-arvoon 2,0 Duolite C-20 (H+-tyyppi) hartsilla ja johdettiin sen jälkeen aktiivihiilipylvään läpi. Kohdeyhdiste eluoitiin 70 %:lla vesipitoisella asetonilla (1 1). Kohdeyhdistettä sisältävät jakeet otettiin talteen ja väkevöitiin aiipaineessa. Näin saatu jäännös säädettiin pH-arvoon 6,5 6 N vesipitoisella natriumhydroksid iliuoksella ja pylväskromatografioiti in selluloosalla (300 ml) käyttämällä eluenttia (80 % vesipitoista propanolia). Kohdeyhdistettä sisältävät jakeet otettiin talteen ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin valkoista jauhetta (600 mg). Jauhe liuotettiin kuumentamalla pieneen määrään metanolia. Sen jälkeen liuokseen lisättiin pieni tilavuus asetonia. Seoksen annettiin seistä yön yli 4o£.ssa/ jolloin muodostui kiteitä, jotka suodatettiin ja kuivatettiin. Näin saatiin värittöminä kiteinä antibiootin FR-900098 mono-natriumsuolaa (300 mg).

(2) Vesipitoinen alusta, joka sisälsi 2 % perunatärkkelystä, 70594 40 1 % gluteenijauhoa, 1 % kuivahiivaa ja 1 % corn steep liquoria, säädettiin pH-arvoon 7,0 6 N vesipitoisella natrium-hydroksidi 1 iuoksel la . Tämän jälkeen alustaa kaadettiin 100 ml kuuteen 500 ml:an Erlenmeyer-pulloon ja pulloja steriloitiin 20 minuuttia 120°C:ssa. Jokainen kasvatusalusta siirrostettiin silmukallisella Streptomyces lavendulae ATCC 31279 vinopinta-viljelmään ja organismia kasvatettiin pyöriväliikkeisessä ravistelulaitteessa 3 päivää 30°C:ssa. 30 litran fermenttoriin kaadettiin erikseen vesipitoinen alusta (20 1), joka sisälsi 3 % metyy1ioleaattia, 1 % puuvillasiemenjauhoa, 1 % vehnän- ituja, 0,5 % kuivahiivaa, 05 % corn steep liquor, 1 % kalium-bifosfaattia ja 1 % sekundääristä natriumfosfaattia, ja sterilointi suoritettiin 30 minuutin aikana 120°C:ssa. Tähän alustaan lisättiin edellä saatu kasvatusliuos kokonaisuudessaan ja sen jälkeen organismia kasvatettiin 3 päivää 30°C:ssa. Kasvatuksen aikana fermentaatio suoritettiin sekoittamalla kasvatus 1iuosta potkurilaitteistolla nopeudella 250 kierr./min. johtamalla kasvatusliuoksen läpi steriiliä ilmaa 20 1/liuos/min. ja pitämällä ferrnenttorin sisäisenä paineena 0,5 (kg/cm2).

Kun kasvatus oli suoritettu loppuun, kasvatusliuos suodatettiin piimään (2 kg) avulla. Suodos (15 1) säädettiin pH-arvoon 2,0 1 N suolahapolla ja johdettiin aktiivihiiltä (5 1) sisältävän pylvään läpi. Pylväs pestiin vedellä, minkä jälkeen eluointi suoritettiin 70 %:lla vesipitoisella asetonilla (4 1). Elu-aatti väkevöitiin 1 litraksi, säädettin pH-arvoon 2 6 N suolahapolla ja johdettiin sen jälkeen anioninvaihtohartsia Duolite A-6 (OH--tyyppi) (kauppanimi, Diamond Shamrock Chemical Co.) (500 ml) sisältävän pylvään läpi. Pylväs pestiin vedellä, minkä jälkeen se eluoitiin 0,1 N vesipitoisella natriumhydroksidi1iuoksella (1,5 1). Eluaatti johdettiin kationinvaihtohartsia Duolite C-20 (H+-tyyppi) (kauppanimi, Diamond Shamrock Chemical Co.) sisältävän pylvään läpi.

I! 70594 41

Pylväs pestiin vedellä, minkä jälkeen se eluoitiin 60 %:lla vesipitoisella asetonilla (500 ml). Eluaatti väkevöitiin alipaineessa öljymäiseksi jäännökseksi, joka pylväskromato-grafioitiin selluloosalla (300 ml) (kehitysliuotin: 80 % vesipitoinen asetonitriili). Kohdeyhdistettä sisältävät jakeet otettiin talteen ja väkevöitiin alipaineessa, jolloin saatiin öljymäinen jäännös, joka säädettiin pH-arvoon 7,0 1 N vesipitoisella kaliumhydroksidiliuoksella ja pylväskroma-tografioitiin selluloosalla (300 ml) (kehitysl luotin: 60 % vesipitoinen propanoli). Kohdeyhdistettä sisältävät jakeet otettiin talteen ja väkevöitiin alipaineessa öljymäkseksi jäännökseksi, joka liuotettiin etanoliin (200 ml). Liuokseen lisättiin asetonia (20 ml) ja dietyylieetteriä (200 ml), jolloin saatiin sakkaa, joka erotettiin suodattamalla ja kuivattiin puhdistamattomaksi jauheeksi (150 mg). Jauhe liuotettiin veteen (150 ml) ja liuos säädettiin pH-arvoon 7 ja johdettiin aktiivihiiltä (100 ml) sisältävän pylvään läpi. Pylvään läpijohdettu liuos väkevöitiin alipaineessa öljymäiseksi jäännökseksi, joka pylväskromatografioitiin selluloosalla (200 ml) (kehitysliuotin: 65 % vesipitoinen propanoli). Kohdeyhdistettä sisältävät jakeet otettiin talteen ja väkevöitiin alipaineessa öljymäiseksi jäännökseksi, joka liuotettiin metanoliin (1 ml). Liuosta lämmitettiin 50°C:ssa ja siihen lisättiin asetonia (10 ml). Seoksen annettiin seistä yön yli 4°C:ssa, jolloin muodostui kiteitä, jotka otettiin talteen suodattamalla ja kuivattiin. Näin saatiin antibiootin FR-31705 monokaliumsuola (5 mg) neulasina.

(3) Vesipitoista alustaa, joka sisälsi 1 % kaiiumtärkkelystä, 1 % glyserolia, 1 % pellavasiemenjauhoa ja 1 % kuivahiivaa, kaadettiin 100 ml kymmeneen 500 ml:n Erlenmeyer-pulloon ja steriloitiin 20 minuuttia 120°C:ssa. Jokaiseen alustaan siirrostettiin yksi silmukallinen Streptomyces lavendulae ATCC 31279 vinopintavi1jelmää ja organismia kasvatettiin 70594 42 pyöriväliikkeisessä rasitelulaitteessa 3 päivää 30°C:ssa.

100 litran fermenttoriin kaadettiin erikseen 80 litraa vesipitoista kasvatusalustaa, joka sisälsi 3 % metyylioleaattia, 1 % puuvillasiemenjauhoa, 1 % vehnänitiöitä, 0,5 % corn steep liquor, 0,5 % kuivahiivaa, 1 % kaiiumbifosfaattia ja 1 % sekundääristä natriumfosfaattia, ja steriloitiin 30 minuuttia 120°C:ssa. Tähän alustaan siirrostettiin edellä saatu kasvatus-liuos kokonaisuudessaan ja organismia kasvatettiin 72 tuntia 30°C:ssa. Kasvatuksen aikana fermentaatio suoritettiin siten, että kasvatusliuosta sekoitettiin potkurilaitteistolla kierrosnopeudel1 a 130 kierr./min., kasvatusliuoksen läpi johdettiin steriiliä ilmaa 80 1itraa/1iuos/minuutti ja fermenttorin sisäisenä paineena pidettiin 1 (kg/cm^).

Sen jälkeen, kun kasvatus oli suoritettu loppuun, kasvatus-liuos suodatettiin piimään (5 kg) avulla. Suodos (70 1) säädettiin pH-arvoon 2 6 N suolahapolla ja sen jälkeen käsiteltiin aktiivihiilellä (20 1). Eluointi suoritettiin 20 %:lla vesipitoisella asetonilla. Asetoni poistettiin eluaatista alipaineessa. Saatu vesiliuos säädettiin pH-arvoon 2 kationinvaihtohartsilla Duolite C-20 (H+-tyyppi) ja sen jälkeen liuos johdettiin anioninvaihtohartsia Duolite A-6 (OH~-tyyppi) sisältävän pylvään läpi. Eluointi suoritettiin 0,2 N vesipitoisella ammoniakilla. Eluaatti säädettiin pH-arvoon 6 ja lyofilisoitiin raakajauheeksi (100 g), joka liuotettiin veteen (3 1). Liuos säädettiin pH-arvoon 2 6 N suolahapolla ja käsiteltiin aktiivihiilellä (6 1).

Eluointi suoritettiin 0,03 N vesipitoisella ammoniakilla. Kohdeyhdistettä sisältävä eluaatti väkevöitiin alipaineessa 1 litraksi. Konsentraatti säädettiin pH-arvoon 2, väkevöitiin edelleen alipaineessa ja pylväskromatografioitiin selluloosalla (1 1). Pylväs pestiin asetonilla (1 1). Sen jälkeen eluointi suoritettiin 97 %:lla vesipitoisella asetonilla,

II

70594 43 jolloin saatiin eluaattia, joka sisälsi antibioottia FR-31705. Sama toimenpide suoritettiin 95 %:lla vesipitoisella asetonilla, jolloin saatiin antibioottia FR-900136 sisältävää eluaattia. Antibioottia FR-900136 sisältävä eluaatti neutraloitiin 1 N vesipitoisella natriumhydroksidi1iuoksella ja väkevöitiin alipaineessa jäännökseksi, joka tehtiin jauhemaiseksi asetonin ja dietyylieetterin seoksella. Näin saatiin antibiootin FR-900136 mononatriumsuolaa (50 mg) jauheena.

(4) Neljä 500 ml:n Erlenmeyer-pulloa, jotka sisältävät 100 ml vesipitoista alustaa, joka sisälsi 1 % perunatärkkelystä, 1 % glyserolia, 1 % puuvillasiemenjauhoa ja 1 % kuivahiivaa, steriloitiin 10 minuutin aikana 120°C:ssa. Jokaiseen pulloon siirrostettiin silmukallinen Streptomyces rubellomurinus subsp. indigoferus ATCC 31304 vinopintaviljelmää, minkä jälkeen organismia kasvatettiin pyöriväliikkeisessä raviste-lulaitteessa 3 päivää 30°C:ssa. 100 litran fermenttoriin kaadettiin erikseen vesipitoinen alusta (70 1), joka sisälsi 2 % liukenevaa tärkkelystä, 0,25 % corn steep liquor, 0,25 % kuivahiivaa, 0,5 % puuvillasiemenjauhoa, 0,5 % vehnänitiöitä, 0,5 % kaiiumdivetyfosfaattia, 0,5 % Na2HP04·12H2O ja 0,000125 % C0Cl2*12H20, ja sterilointi suoritettiin 30 minuutin aikana 120°C:ssa. Alustaan lisättiin edellä saatu kasva-tusliuos kokonaisuudessaan ja organismia kasvatettiin 3 päivää 30°C:ssa. Kasvatusjakson aikana fermentaatio suoritettiin siten, että kasvatusliuos sekoitettiin potkurilaitteistolla 300 kierr./min., kasvatusliuoksen läpi johdettiin steriiliä ilmaa 70 litraa/liuos/minuutti ja fermenttorin sisäisenä paineena pidettiin 0,5 kg/cm^).

Kun kasvatus oli suoritettu loppuun, kasva tus 1iuos säädettiin pH-arvoon 2,8 6 N suolahapolla. Saatu sakka erotettiin suodattamalla. Suodos johdettiin aktiivihiiltä (10 1) sisältävän pylvään läpi. Sen jälkeen eluointi suoritettin 70 %:lla vesi- 70594 44 pitoisella asetonilla (20 1). Eluaatti väkevöitiin alipaineessa jäännökseksi, johon lisättiin vettä, jolloin saatiin vesiliuos (15 1). Vesiliuos johdettiin DEAE-Sephadex, (H+-tyyppi) (8 1) (kauppanimi, valmistaja Pharmacia A.B.) pylvään läpi, joka oli etukäteen käsitelty 1/100 M fosfaatti-purskuriliuoksella (pH 6,0). Eluointi suoritettiin 0,3 M natriumkloridin vesiliuoksella (10 1). Eluaatti säädettiin pH-arvoon 3,3 6 N suolahapolla ja sen jälkeen johdettiin aktiivihiiltä (2 1) sisältävän pylvään läpi. Läpi johdettuun liuokseen lisättiin vettä niin, että kokonaistilavuudeksi tuli 30 1. Saatu vesiliuos säädettiin pH-arvoon 2,8 6 N suolahapolla ja sen jälkeen johdettiin aktiivihiiltä 70 %:lla vesipitoisella asetonilla. Aktiiviset jakeet otettiin talteen, säädettiin pH-arvoon 6,0 6 N natriumhydroksidin vesiliuoksella ja väkevöitiin alipaineessa 100 ml:ksi. Konsentraatti pylväs-kromatografioitiin selluloosalla (1 1). Pylväs kehitettiin 75 %:lla vesipitoisella propanolilla (2 litraa), jolloin saatiin jae (A), ja sen jälkeen pylväs kehitettiin 70 %:lla vesipitoisella propanolilla (2 litraa), jolloin saatiin jae (B) .

Jae (A) väkevöitiin alipaineessa 40 ml:ksi ja saatu konsentraatti johdettiin Sephadex G-15 (1 1) kauppanimi, valmistaja Pharmacia A.B.) pylvään läpi ja tämän jälkeen pylväskromato-grafioitiin selluloosalla. Pylväs kehitettiin 80 %:lla vesipitoisella propanolilla. Aktiiviset jakeet otettiin talteen ja väkevöitiin alipaineessa jäännökseksi, joka lyofi1isoitiin, jolloin antibiootin FR-900098 mononatriumsuolaa (300 mg) saatiin valkoisena jauheena.

Edellä saatu jae (B) väkevöitiin alipaineessa 60 ml:ksi ja saatu konsentraatti johdettiin Sephadex G-15 (1 1) pylvään läpi ja sen jälkeen pylväskromatografioitiin selluloosalla. Pylväs kehitettiin 75 %:lla vesipitoisella propanolilla.

ii 70594 45

Aktiiviset jakeet otettiin talteen ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin antibiootin FR-33289 mononatriumsuolaa valkoisena jauheena (600 mg).

Esimerkkejä antimikrobisesta seoksesta (i) Injektiovalmiste (1) Lääkepulloihin laitettiin tarvittu määrä steriiliä antibioottia , 3-(N-asetyyli-N-hydroks iamino)propyylifosfonihapon mononatriumsuolaa, jolloin pullot sisälsivät aktiivista ainesosaa 500 mg. Pullot suljettiin hermeettisesti bakteereiden pääsyn estämiseksi. Kun pullot otetaan käyttöön, niihin lisätään 2 ml steriiliä tislattua injektiovettä ja pullo käytetään.

Oleellisesti samalla tavoin kuin esimerkissä (1) valmistettiin seuraavissa esimerkeissä (2) - (4) havainnollistettu antibioottinen injektiovalmiste.

(2) Ruiskeen aktiivisena ainesosana käytettiin 3-(N-formyyli-N-hydroksiamino)propyylifosfonihapon monoammoniumsuolaa (250 mg).

(3) Ruiskeen aktiivisena ainesosana käytettiin 3-(N-formyyli-N-hydroksiamino)trans-1-propenyylifosfonihapon monokaliumsuolaa (250 mg).

(4) Ruiskeen aktiivisena ainesosana käytettiin 3-(N-asetyyli-N-hydroksiamino)-2-hydroks ipropyylifosfonihapon mononatr iumsuolaa (500 mg).

(5) Ruiskeen aktiivisena ainesosana käytettiin 3-(N-formyyli-N-hydroksiamino)-2-hydroksipropyylifosfonihapon monokaliumsuolaa (250 mg).

_ ΤΓ^ 70594 46 (ii) Tabelttivalmiste (1) Sopiva tablettiformulaatio muodostuu seuraavasta seoksesta. 3-(N-formyy1i-N-hydroksiamino)propyyli- fosfonihapon mononatriumsuola 200 mg

Mannitoli 400 mg Tärkkelys 50 mg

Magnesiumstearaatti 10 mg (iii) Kapselivalmiste 3-(N-formyy1i-N-hydroks iamino)propyyli- fosfonihapon monokaliumsuola 300 mg

Magnesiumstearaatti 15 mg Nämä ainesosat sekoitettiin ja laitettiin sen jälkeen tavalliseen tapaan kovagelatiinikapseliin.

(iv) Ö1jysuspensiovalmiste 3-(N-formyy1i-N-hydroks iami no)propyyli- fosfonihapon mononatriumsuola 200 mg lanetta vaha SX (kauppanimi) 50 mg

Vaseliini 100 mg

Brilliant blue FCF 25 mg Nämä ainesosat sekoitettiin nestemäisen parafiinin kanssa niin, että infuusiovalmistetta saatiin yhteensä 3 g.

Claims (5)

70594

1. Menetelmä valmistaa farmakologisesti arvokkaita hydroksi-aminohiilivetyfosfonihappojohdannaisia, joiden kaava on OH O I ti Rl - N - A'- P - OH (I") a I OH jossa R^' on asetyyli ja A' on trimetyleeni tai 2-hydroksi-trimetyleeni; tai R^'ori formyyli ja A' on trimetyleeni tai trans-l-propenyleeni ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja, tunnettu siitä, että viljellään kaavan (I") mukaista fosfonihappojohdannaista tuottavaa Streptomyces rubellomurinus ATCC 31215, Streptomyces rubellomurinus subsp. indigoferus ATCC 31304 tai Streptomyces lavendulae ATCC 31279 kantaa vesipitoisessa ravintovällaineessa aerobisissa olosuhteissa kunnes väliaine tulee oleellisesti antibioottisesti aktiiviseksi ja näin tuotettu kaavan (I") mukainen fosfoni-happojohdannainen otetaan talteen viljelysliuoksesta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljellään Streptomyces-sukuun kuuluvaa 3-(N-ase-tyyli-N-hydroksiamino)propyylifosfonihappoa tuottavaa kantaa, Streptomyces rubellomurinus ATCC 31215 tai Streptomyces rubellomurinus subsp. indigoferus ATCC 31304 organismia vesipitoisessa ravintoalustassa aerobisissa olosuhteissa, kunnes mainittu alusta tulee oleellisesti antibioottisesti aktiiviseksi ja saadaan 3-(N-asetyyli-N-hydroksiamino)propyylifosfoni-happoantibioottia.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljellään Streptomyces lavendulae ATCC 31279 organismia vesipitoisessa ravintoalustassa aerobisissa olo- 70594 suhteissa, kunnes mainittu alusta tulee oleellisesti anti-bioottisesti aktiiviseksi ja saadaan 3-(N-formyyli-N-hydroksi-amino)propyylifosfonihappo-antibioottia.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljellään Streptomyces lavendulae ATCC 31279 organismia vesipitoisessa ravintoalustassa aerobisissa olosuhteissa, kunnes mainittu alusta tulee oleellisesti antibioottisesti aktiiviseksi ja saadaan 3-(N-formyyli-N-hydroks iamino)trans-1-propenyyli fosfonihappo-antibioottia.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljellään Streptomyces rubellomurinus subsp. indigoferus ATCC 31304 organismia vesipitoisessa ravinto-alustassa aerobisissa olosuhteissa, kunnes alusta tulee oleellisesti antibioottisesti aktiiviseksi ja saadaan 3-(N-asetyyli-N-hydroks iamino)-2-hydroks ipropyy1 ifosfonihappo-antibioottia , li 70594