FI63061C - Stabiliserat tymidinfosforylaspreparat innehaollande renad tymidinfosforylas med foerbaettrad lagringsstabilitet - Google Patents

Description

ΓΠβΕ^Π γβ! m1xKuulutusjulkaisu ,τη,Λ

JeBTq lBJ i11) UTLÄGGNINGSSKRIFT 6 3 0 6 1 • C (45) Fatei'i Lti .-ν'::.... lly 11 C4 1933 ^ (51) Kv.ik?/int.ci.^ c 12 H 9/10, C o? G 7/00 SUOM I — FI N LAN D (21) PtMnttHmkemu· — PKmcina6linift« T9lU8l (22) H«kwnl«pUvi — Amflfcnlnpdm 09.05.79 ^ ^ ¢3) AlkupUvl—Glltlfh«ttdtf 27.01.76 (41) Tullut iulklMlul — Mlvit offantllx pp qc; γρ

Patent- och ragisterstyralMn Anekin uti&gd och utlikrMtn pubiicond 31,12.82 (32)(33)(31) Pyydetty etuellwM*—Begird prtoritM 27.01.75

Englanti-England(GB) 3*+**5/75 (71) The Wellcome Foundation Limited, 183-193 Euston Road, London N.W.l, Englanti-England(GB) (72) Stanley Robert Morris Bushby, Durham, North Carolina, Thomas Anthony Krenitsky, Chapel Hill, North Carolina, USA(US) (7*0 Oy Kolster Ab (5*0 Puhdistettua tymidiinifosforylaasia sisältävä entistä paremman varastointi-kestävyyden omaava stabiloitu tymidiinifosforylaasivalmiste - Stabiliserat tymidinfosforylaspreparat innehallande renad tymidinfosforylas med för-bättrad lagringsstabilitet (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta 760181 (patentti 56856) -Avdelad frän ansökan 76OI8I (patent 56856) Tämän keksinnön kohteena on stabiloitu, entistä paremman varastointi-kestävyyden omaava puhdistettu tymidiinifosforylaasivalmiste.

Keksinnön mukaiselle valmisteelle on tunnusomaista, että se koostuu tymidiinifosforylaasin väkevästä, vähintään 5 mg/ml proteiinia sisältävästä vesipitoisesta liuoksesta ammoniumsulfaattia sisältävässä fosfaattipuskurissa, joka tymidiiniforforylaasi on valmistettu uuttamalla vesipitoiseen väliaineeseen epäpuhdas entsyymi bakteeriviljelmästä, joka sisältää suurena konsentraationa tymidiinifosforylaasia, ja fraktioimalla saatu solu-uute, jolloin ensimmäisenä vaiheena suoritetaan adsorbointi kalsiumfosfaattigee-lille, joka sisältää ekvivalenttiset määrät kalsium- ja fosfaatti-ioneja, ja senjälkeen suoritetaan kromatografointi- ja dialyysivaiheet.

Tymidiinifosforylaasi on aikaisemmin puhdistettu sellaisista bakteereista kuin Salmonella typhimurium, Bacillus cereus, Bacillus stearothermo-philus ja Haempophilus influenzae ja erityisesti Escherishia coli-kannasta, joka tarvitsee 63061 kasvuun tymiiniä ja netioniinia. Viimeksi mainittu puhdistus vaatii erittäin pitkällisen prosessin, johon sisältyy saostus, fraktiointi, useita kromatografia-vaiheita ja dialyysi (Schwartz, M, 1971» Eur. J. Biochem. 21: 191-198). Tällä menetelmällä saatu entsyymivalmiste oli kuitenkin vain 25-kertaisesti puhtaampi kuin raaka solu-uute.

Äskettäin on havaittu, että määrätyt bakteerikannat, varsinkin määrätty E. coli-kanta tuottaa sopivissa kasvuolosuhteissa epätavallisen suuria määriä tymidiinifosforylaasia, ja että tämä entsyymi voidaan eristää ja puhdistaa viemällä solu-uute määrätyille adsorbenteille ja eluoimalla se niistä, jolloin saadaan huomattavasti suuremmalla saannolla paljon puhtaampi valmiste kuin mitä tähän asti on pystytty saamaan. Lisäksi tätä uutta eristys/puhdistusmenetelmää voidaan soveltaa tämän entsyymin tuottamiseen suuressa mittakaavassa.

Bakteerialkuperää olevan puhdistetun tymidiinifosforylaasin valmistus käsittää siten seuraavat vaiheet: raa'an entsyymin uuttamisen bakteereista vesipitoiseen väliaineeseen, uutteen fraktioimisen, joka käsittää kromatografia- ja dialyysivaiheet. Tälle menetelmälle on tunnusomaista, että 1) valitaan bakteeri-kanta, joka pystyy tuottamaan korkeita tymidiinifosforylaasipitoisuuksia sopivissa kasvuolosuhteissa, ja 2) ensimmäisenä puhdistusvaiheena saatu raaka solu-uute viedään kalsiumfosfaattigeeliabsorbentille, joka sisältää olennaisesti ekvivalent-tiset määrät Ca++- ja PO^- -ioneja. Eluentti saatetaan edullisesti tämän jälkeen kosketuksiin dietyyliaminoetyyliselluloosan (DEAE-selluloosa) ja/tai selluloosa-epikloorihydriinitrietanoliamiinin (ECTEOLA-selluloosa) kanssa, ja eluoinnin jälkeen DEAE-selluloosalta ja ennen adsorptiota ECTEOLA-selluloosalle dialysoi-daan vettä tai sopivaa puskuria vastaan.

Escherichia coli B-96 (ATCC 13^73) on huomattavan edullinen käytettäväksi keksinnön tarkoituksiin. Esimerkkinä toisesta bakteerikannasta, joka tuottaa suuria määriä tymidiinifosforylaasia ja on siten sopiva esillä olevan keksinnön käyttöön, on Salmonella typhimurium LT-2 (ATCC 15277). Joissakin tapauksissa, kun halutaan saada lämpöstabiilimpi entsyymi, B. stearothermophilus-bakteerista eristetty entsyymi on osoittautunut tehokkaaksi.

E. coli-kantaa ATCC 13^73 voidaan viljellä minimisuolaväliaineessa, joka sisältää sopivaa hiililähdettä ja lisänä puriineja. Vaihtoehtona on, että bakteeria viljellään hiivauuteväliaineessa. Entsyymin raakauute voidaan sitten valmistaa bakteerisolujen ultraäänikäsittelyllä fosfaattipuskurissa, minkä jälkeen seos lingotaan solujäännösten poistamiseksi.

3 63061

Raakauute sekoitetaan esimerkiksi pienen määrän kanssa kalsiumfosfaatti-geeliä, ja seos lingotaan ei-toivottujen proteiinien poistamiseksi. Näin saatu päällä oleva neste voidaan sitten sekoittaa toiseen erään kalsiumfosfaattigeeliä, jolloin entsyymi absorboituu siihen. Entsyymiaktiviteetti voidaan eluoida geelistä sarjapesuilla fosfaattipuskurilla. Entsyymi voidaan sitten adsorboida DEAE-sellu-loosalle, pestä ja eluoida siitä. Dialyysin jälkeen valmiste voidaan adsorboida ECTEOLA-selluloosalle ja eluoida siitä.

Eluoinnin valvomiseksi entsyymiaktiviteetti mitataan kaikissa puhdistus-vaiheissa sopivasti käyttäen spektrofotometristä mittausta sopivalla aaltopituudella.

Näin saatu puhdistettu entsyymi voidaan sopivasti saattaa käyttöön suspensiona ammoniumsulfaatin vesiliuoksessa.

Puhdistetun entsyymin yksi entsyymiaktiviteettiyksikkö on se entsyymi-määrä, joka katalysoi yhden tymiininanomoolin muodostumisen minuutissa tymidiinin 1 millimolaarisesta liuoksesta 25°C:ssa 200-mmolaarisen kaliumfosfaattipuskurin läsnäollessa pH 7»^:ssä.

Entsyymiä on läsnä myös monissa selkärankaisten kudoksissa, joista sitä voidaan valmistaa puhtaana, mutta imettäväisten kudosten entsyymitasot ovat yleensä paljon alemmat kuin bakteerien. Lisäksi puhdistettu, bakteerialkuperää oleva tymidiinifosforylaasi on useasti aktiivisempi kuin vastaava puhdistettu imettäväisistä saatu.

Hevosen veren on todettu sisältävän ^0-100 yksikköä tymidiinifosforylaa-siaktiviteettia (tässä määritellyn mukaisesti) ml:aa kohti. Esimerkin 1 E. coli ultraäänihajotustuote sisältää enemmän kuin 1 000-kertaisesti tämän pitoisuuden. Siten bakteerilähteestä valmistetun puhdistetun entsyymin taloudellisen tuottamismenetelmän edut ovat monet ja merkittävät. Ei ole ainoastaan kysymys helpommin saatavasta, halvasta entsyymilähteestä, vaan myös menetelmä entsyymin uuttamiseksi ja puhdistamiseksi on huomattavasti taloudellisempi.

Ennestään on tunnettua, että bakteerialkuperää oleva tymidiinifosforylaasi on pysyvä -20°C:ssa, mutta että l+°C:ssa aktiviteetti alenee huomattavalla nopeudella. Keksinnön mukainen tymidiinifosforylaasivalmiste on huomattavasti stabiilimpi siihen sisältyvän ammoniumsulfaatin ansiosta sillä edellytyksellä, että valmisteen proteiinipitoisuus on vähintään 5 mg/ml.Entsyymin väkeviä liuoksia (5 mg/proteiinia/ml tai enemmän) fosfaattipuskurissa, joka sisältää 10 % ammonium-sulfaattia, voidaan esimerkiksi varastoida pitkiä ajanjaksoja ilman aktiviteetin vähenemistä tai aktiviteetin vain vähän alentuessa. Voidaan myös valmistaa pysyviä tymidiinifosforylaasin suspensioita vesipitoisessa ammoniumsulfaatissa.

It

Seuraava esimerkki valaisee keksintöä. 63061

Esimerkki

Tymidiinifosforylaasin puhdistus E. coli B-96 (ATCC 13^73) kantaa kasvatettiin ilmastoiduissa astioissa 3U°C:ssa minimisuolaväliaineessa, joka sisälsi Na^HPO^ (18,9 g/l), KH PO^ (6,3 g/l), MgSO^.TH^O (0,2 g/l), (NH^J^SO^ (2,0 g/l), adenosiinia (0,5 g/l) ja kasaminohappo-ja (8,0 g/l), Kun viljelmän optinen tiheys oli 600 nm:ssä (ilman laimennusta) saavuttanut arvon 2,0, solut otettiin talteen linkoamalla. Seuraavat toimenpiteet suoritettiin 3°C:ssa, jollei muuta ilmoiteta. Solutahna (25 g) suspendoitiin oman painonsa kaksinkertaiseen määrään 5-mmolaarista kaliumfosfaattipuskuria, pH 8,0 (puskuri A). Solususpension 5 ml:n eriä ultraäänikäsiteltiin kutakin kahden 12 sekunnin periodin ajan, jolloin käsittelyjen välillä jäähdytettiin 50 sekuntia. Käytettiin Branson Malli 5125 Sonic Oscillatoria voimalukemalla 6. Ultraääni-käsitellyt tuotteet yhdistettiin ja lingottiin 20 minuuttia k8 000 x g:ssä.

Päällä olevaan nesteeseen (vaihe I - katso alla oleva taulukko I) lisättiin hitaasti 25 ml kalsiumfosfaattigeelisuspensiota (31 mg kuivaa kiinteätä ainetta per ml, vanhennettu 3°C:ssa 5 kk). Saatua suspensiota sekoitettiin 10 minuuttia, sitten lingottiin 12 000 x g:ssa 5 minuuttia. Päällä oleva neste sekoitettiin jälleen kalsiumfosfaattigeelisuspension (100 ml) kanssa, ja seosta sekoitettiin 10 minuuttia ja lingottiin 97 000 x g:ssä 15 minuuttia. Saatu geelisaostuma pestiin puskuri A:11a (100 ml) uudelleen suspendoimalla ja linkoamalla 97 000 x g:ssa 15 minuuttia.

Entsyymiaktiviteetti uutettiin geelisaostumasta kahdella peräkkäisellä pesulla: ensiksi 10 mmolaarisella kaliumfosfaattipuskurilla, pH 8,0 (100 ml) ja sitten 20-mmolaarisella kaliumfosfaattipuskurilla, pH 8,0 (100 ml). Molemmat pesuliemet yhdistettiin (vaihe II).

Loppuosa valmistuksesta suoritettiin 25°C:ssa. Yhdistetyt pesunesteet vietiin DEAE-selluloosapylvääseen, läpimitta 1,8 cm, korkeus 6 cm, joka oli etukäteen tasapainoitettu 20-mmolaarisella kaliumfosfaatilla, pH 6,1+ (puskuri B). Täytetty pylväs pestiin puskurilla B (100 ml), ja entsyymi eluoitiin sitten fosfaattipuskurin lineaarisella gradientilla. Tämä gradientti valmistettiin lisäämällä huolella sekoittaen 200-mmolaarista kaliumfosfaattipuskuria, pH 6,U (200 ml) sekoi-tusastiaan, joka oli alunperin täytetty puskuri B:llä (200 ml), sellaisella nopeudella, että sekoitusastiassa pysyi koko ajan vakiotilavuus. Korkeimman entsyy-miaktiviteetin omaavat fraktiot yhdistettiin (vaihe lii) ja dialysoitiin vettä 63061 vastaan (2 l) tunnin ajan käyttäen selluloosadialyysiputkea (läpimitta 8 mm). Dialyysi toistettiin, ja sitten dialysaatti vietiin ECTEOLA-selluloosapylvääseen (1,8 x 5 cm), joka oli etukäteen tasapainotettu puskuri A;lla, Täytetty pylväs pestiin puskuri A:lla (100 ml). Sitten entsyymi eluoitiin eluentin lineaarisella gradientilla, joka oli valmistettu yllä esitetyllä tavalla käyttäen sekoitus-astiaa, joka oli alunperin täytetty puskuri A:11a (200 ml), ja johon sifonoitiin 200-mmolaarista kaliumfosfaattipuskuria, pH 8,0 (200 ml) painovoiman avulla sitä mukaan kuin pylvään liuos eteni. Entsyymiaktiviteettia sisältävät fraktiot yhdistettiin (vaihe IV), ja tähän lisättiin riittävästi ammoniumsulfaattia aikaansaamaan entsyymin suspensio 80-$:isessa ammoniumsulfaattiliuoksessa. Tällä menetelmällä saatiin kaikkiaan 100-kertainen ominaisaktiviteetin kohoaminen proteiinin suhteen ja olennaisesti täydellinen nukleiinihappojen poistuminen.

Tymidiinifosforylaasiaktiviteetti kokeiltiin mittaamalla spektrofotomet-risesti absorbanssin pieneneminen 290 nmtssä tymidiinin muututtua tymidiinifos-forylaasin vaikutuksesta tymiiniksi. 290 nm:ssä pH 7,^:ssä tymidiinillä on korkeampi ekstinktiokerroin kuin tymiinillä (Δ £ = -ί*8θ M 1cm 1). Koeseos sisälsi 200 mmolaarista kaliumfosfaattipuskuria, pH 7,^ ja 1 mmoolin tymidiiniä, kokonaistilavuus oli 2,5 ml. Yksi entsyymiaktiviteettiyksikkö on se määrä, joka katalysoi yhden tyrniininanomoolin muodostumisen tymidiinistä 1 minuutissa 25°C:ssa.

Taulukkoon I on koottu tulokset tässä esimerkissä kuvatusta puhdistuksesta. Menetelmä on suoritettu 60-kertaisilla määrillä vastaavin tuloksin.

6 63061 co ίΐ s s s ••3 -S .5 .5

-5 I f0 rö <xJ

P -P Ή P

® aJ

x x x i, i i

SH O i—I

o ^ ^ S

.s § §5 5 O CM O 00 m dP o oo co .3· tn w 1-1

•H

Cu il +-> .S > -P I :CT £ O o o o

rn -H -μ ·Η -μ ft 1-0 CO O O

ΰ μ φ ι/ι·Η cd οο ο οο

3 X ® Χ··0 W

35 < 4-> >>-y CM Γ' CM CD

'P CNJ 00 CO

& Λ ~ P ·Η ΰ Φ Η σι rH σ>

i2 P S a> (O rH

"tj 0 ^ ·> »> n 3 Päg? o o o o

•H

T3 " £> :CT £ oooo 4-1 ro oooo

-.-H ro o co o CM

W H :θ H λ λ »» f,

^ ίξ ^ CO LO CD CO

Jtoocoj* 3 Jj W ·Ή en co h co

5° ^ CD* * ^ O

H-5 ω

•H

:S

CT I I OOOO

Ä >Η·Η oooo (-L· > 4-> 1 :cö o co lo t'- _( Ή P 'H P r r> rt Λ JS ή Φ ω *h H co r~ o o +r ,χ <D Pc :θ E o 01 00 co

“ <C P >,X rH

CO

CD

CQ

s ai

u ·Η w LO CO CM CO

H co o lo co •3 <x

1 I

ΐΐ CT M M M >

S > M H M

W M

dl R itJ

P rH I :ct tn

(fl 4) g P I Q

Φ -μ 9 en CT O

C -μ ·η -h tn H

•H iiri n 9 CT en rH Φ o r-1

> :CT CT Φ H rH

ω 32 32 W) 9 0) :CT 1—I ·Ρ ·Η rH tn

E O C ·Η P rH ·Η I, "P

rP :CTdPPCTP<CP

0) :CT :CT Φ -P CT tn P -1 P>

4-i rH CT Φ CTCT I CT O CT

2j 1¾ ä8 öS

J3 ^OHiCTHOyHOH

Ä. di d ·π :j Uh q φ 14 <u