FI62843C - Foerfarande foer framstaellning av ett syraadditionssalt av 1--etylsisomicin - Google Patents

Description

I- Γβ1 KUULUTUSJULKAISU /90/7

jA&A W ^1) UTLÄCCHINOSSKRIFT 62 84 O

C Patentti myönnetty 10 03 1933 •255 w Patent oeddelat ^ ^ ^ (51) K».lk?/lnt.CL3 C 07 H 15/22 SUOMI—FINLAND pi) μμιμμμ-ρημοιμι^ 80271+6 (22) H*k«mi«paiv· — AnaOfcnlnpd^ 01.09.80 (23) AlkupUvf—CIW|h*t*d«j 01.08.?1+ (41) Tulkit (ulklMkil — Bllvtc oflwwHj 01.09.80 FMttl· ]· rakirtmri halittu* (44) NlhtMkripenen „ kwlU)wMtitoun taan*· oeh rafistarityralMn AMdkan utltgd odi mtakrlltM puMicarad 30.11.82 (32)(33χ31) pyritty «uoMtm—surt prior»* 06.08.73 19.03.7^, 19.03.7*+ USA(US) 385 751, 1+52 600, 1+52 586 (71) Oy Kolster Ab, Lönnrotsgatan 19 B, 00120 Helsingfors 12, Suomi -Finland(Fl) (72) Marvin Joseph Weinstein, East Brunswick,. New Jersey, Peter J^hn Lovell Daniels, Cedar Grove, New Jersey, Gerald Howard Wagman,

East Brunswick, New Jersey, Raymond Testa, Verona, New Jersey,

Alan Keith Mallams, West Orange, New Jersey, John Jessen Wright,

Orange, New Jersey, Tattanahalli Laksminarayan Nagabhushan,

East Orange, New Jersey, USA(US) (51+) Förfarande för framställning av ett syraadditionssalt av 1-N-etyl-sisomicin - Menetelmä 1-N-etyylisisomisiinin happoadditiosuolan valmi stami seksi (62) Avdelad frän ansökan 230U/7I+ (patentti 62100) -

Jakamalla erotettu hakemuksesta 230I+/7I+ (patent 62100) Föreliggande uppfinning avser ett förfarande för framställning av ett syraadditionssalt av 1-N-etylsisomicin med formeln CH_NH„ NH_ nh5 h

v~\ I

H3<Yy-1

OH

2 62843

Saltet framställes enligt kända metoder, s&som genom neutra-lisering av den fria basen med en syra till ungefär pH 5. Lämpliga syror för detta ändamäl är saltsyra, svavelsyra, fosforsyra, salpeter-syra, bromvätesyra, ättiksyra, propionsyra, raaleinsyra, askorbinsyra, citronsyra och liknande. Fysikaliskt karakteriseras syraadditionssal-terna av föreningarna enligt uppfinningen säsom vita fasta substanser, vilka är lösliga i vatten, svärlösliga i flertalet polära lösnings-medel och olösliga i icke-polära organiska lösningsmedel.

De enligt förfarandet framställda föreningarna utgör bredspekt-rum-antibakteriella medel som pä ett fördelaktigt sätt uppvisar akti-vitet mot mänga organismer, särskilt gramnegativa organismer. De kan användas separat eller i kombination med andra antibiotiska medel för förhindrande av tillväxten eller reduktion av antalet bakterier i oli-ka miljöer. De kan t.ex. användas för desinfektion av laboratorieglas och dental och medicinsk apparatur. Aktiviteten av föreningarna mot gramnegativa bakterier gör dessa föreningar användbara för bekämpning av infektioner, förorsakade av gramnegativa bakterier, säsom arter av Proteus och Pseudomonas. De har veterinärmedicinsk användning, särskilt vid behandling av mastit hos nötkreatur och Salmonella-induce-rad diarre hos husdjur, säsom hos hund och katt.

Utgängsmaterialet för förfarandet enligt uppfinningen kan fram-ställas enligt kända metoder ur sisomicin eller genom fermentering av stammen Micromonospora inyoensis 1550F-1G, av vilken en kultur depo-nerats hos U.S. Department of Agriculture, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, under betecknin-gen NRRL 5742.

1-N-etylering av sisomicin utföres företrädesvis genom omsätt-ning med acetaldehyd i närvaro av ett reduktionsmedel.

Odling av NRRL 5742 mäste utföras i närvaro av 1-N-etyl-2-deoxi-streptamin.

Exempel 1-N-etylsisomicinsulfat 1. 1-N-etylering av sisomicin

En lösning av 5 g sisomicin i 250 ml vatten försättes med 1-n svavelsyra, tills pH i lösningen inställts pä ungefär 5. Den bildade lösningen av sisomicinsvavelsyraadditionssalt försättes med 2 ml acetaldehyde man omrör 10 minuter, och tillsätter 0,85 g natriumcyanbor-hydrid. Fortsätt omrörningen 15 minuter vid rumstemperatur, koncent-rera lösningen i vakuum tili en volym av ungefär 100 ml, behandla lös- 3 62843 ningen med ett basiskt jonbytarharts /sasora Axnberlite ® IRA 401S (OH )J och lyofilisera till en äterstod, omfattande 1-N-etylsisomi-cin.

Rena genom kromatografering pä 200 g silika, eluera med den lägre fasen av systemet kloroform/metanol/7-% ammoniurnhydroxid (2:1:1). Kombinera lika eluat, säsom fastställes genom tunnskikts-kromatografering och koncentrera de kombinerade eluaten av huvudkom-ponenten i vakuum till en äterstod, omfattande 1-N-etyl-sisomicin (utbyte 1,25 g). Rena äter genom kromatografering pä 100 g silikagel och eluera med systemet kloroform/metanol/3,5-% ammoniurnhydroxid (1:2:1). Lät de kombinerade, likadana eluaten (säsom fastställes genom tunnskiktskromatografering) passera genom en pelare av basiskt jonbytarharts och lyofilisera eluatet för bildning av 1-N-etylsiso-micin (utbyte 0,54 g) ; +164° (0,3 %, H20) ; PMR (ppm) (D20) : 61,05 (3H, t, J = 7Hz{ -CH2CH3); 1/19 (3H, s, -C-CH3); 2,5 (3H, s, N-CH3), 4r 85 (1H, m, =CH-)· 4,95 (1H, d, J = 4Hz, H^”); 5,33 (1H, d, J = 2,5Hz, H1').

Masspektrum: (M+1)+m/e 476 ocksä m/e 127, 154, 160^ 173, 191, 201, 219, 256, 299, 317, 332, 345, 350, 360, 378, 390, 400.

2. Framställning av 1-N-etylsisomicin genom fermentering A. Framställning av ympämne av Micromonospora inyoensis-stammen 1550F-1G.

Groningssteg 1: Under aseptiska betingelser nedför en lyofi-liserad kultur feller celler erhällna frän en snedkultur) av Micromonospora inyoensis 1550F-1G i en 300 ml skakkolv, innehällande 100 ml av följande sterila medium:

Biffextrakt 3 g

Tryptos 5 g Jästextrakt 5 g

Dextros 1 g

Stärkelse 24 g

Kalciumkarbonat 2 g

Vattenledningsvatten 1000 ml

Inkubera kolven och dess innehäll under 2-5 dagar vid 35°C pä en roterande skakanordning (280 varv per minut, 5 cm slaglängd).

Groningssteg p. {Jverför aseptiskt 25 ml av fermenteringsme-diet frän gronningssteg 1 till en 2-liters skakkolv, innehällande 500 ml av nämnda sterila groningsmedium. Inkubera kolven och dess innehäll under tre dagar vid 28°C pä en roterande skakanordning (280 varv per minut, 5 cm slaglängd).

4 62843

Fermenteringssteg: överför aseptiskt 500 ml av ympämnet erhället frän groningssteg 2 tili en 14-liters fermentationstank, innehällande 9,5 liter av följande sterila medium:

Dextrin 50 g

Dextros 5 g

Sojabönmjöl 35 g

Kalciumkarbonat 7 g

Koboltklorid 10 6 molar

Vattenledningsvatten 1000 ml

Antiskummedel (GE 60) 10 ml B. Inställ före sterilisering av det i steg A beskrivna mediet pä pH 8 och tillsätt en vattenlösning, innehällande 8,0 g 1-N-metyl- 2-deoxi-D-streptamin. Fermentera innehället under aeroba betingelser under 48 - 240 timmars omröring med en hastighet av 250 varv per minut och ett luftintag av 4,5 liter per minut vid 2,5 at. pH i fermen-teringsmediet ändras obetydligt under antibiotikumprodukten inom ett intervall av ungefär 6,8 - 7,3.

övervaka antibiotikumprodutionen med tillämpning av den ana-lysmetod soin beskrives i J. Antibiotics (Japan) voi. XXIII, och när topproduktion uppnätts, skörda produkten (fermenteringen är vanli-gen fullständig inom ungefär 7 dagar).

C. Isolering av 1-N-etylsisomicin Sätt under omröring 7,0 g oxalsyra tili fermentationshelväts-kan frän steg B. Surgör vätskan tili pH 2,0 med användning av 6-n svavelsyra. Omrör blandningen ungefär 15 minuter och filtrera med användning av ett lämpligt filterhjälpmedel. Neutralisera (pH 7,0) filtratet med 6m ammoniumhydroxid. För filtratet genom en 1,0-liters (S) pelare av katjonbytarharts i ammoniumform (säsom Amberlite^ IRC-50, Rohm and Haas, Philadelphia, Pa.). Bortkasta förbrukad vätska, eluera pelaren med 2-n ammoniumhydroxid och tillvaratag fraktioner om ungefär 100 ml. övervaka pelareluatet genom skältestning av varje fraktion mot Staphylococcus aureus ATCC 6538P. Kombinera de aktiva frak-tionerna, indunsta tili ungefär 100 ml i vakuum och lyofilisera för bindning av en fast produkt. Triturera produkten flera gänger med varm etanol, filtrera och indunsta filtsratet tili en äterstod. Kro-matografera produkten pä 25 g silikagel med använgning av den lägre fasen av systemet kloroform/metanol/koncentrerad ammoniumhydroxid (1:1:1) säsom elueringsmedel. Kombinera och indunsta de fraktioner som uppvisar antibiotikumaktivitet för bildning av 1-N-etylsisomicin.

62843 3. 1-N-etylsisomlclnsulfat Lös 5,0 g 1-N-etylsisomicin i 25 ml vatten och inställ pH i lösningen pä 4,5 med 1-n svavelsyra. Häll lösningen i ungefär 300 ml metanol under kraftlig omröring, fortsätt omröringen ungefär 10 -20 minuter och filtrera. Tvätta fällningen med metanol och torka vid ungefär 60°C i vakuum.

NMR-spektrum för 1-N-etylsisomicinsulfat; 20-% (vikt/volym) lösning

1 denteriumoxid med natrium-2,2-dimetyl-2-sila-pentan-5-sulfonat sä-som inre referens; 20°C

Proton Kemisk förskjutning Intensitet Multiplicitet $(ppm) 1-NHCH2CH3 1,33 3H tripletU; J = 7Hz 4"-CH3 1,35 3H singlett 2,3 1,67 - 2,83 4H multipletter 3"-NHCH3 2,93 3H singlett 1-NHCH2CH3 3f 18 2H kvartett; J = 7Hz 3" 3', 45 1H dublett; J = 11Hz 5"-axial 3,47 1H dublett, J = 12Hz OI, , dublett av dubletter 2 4'26 1H J = 4Hz, J = 10Hz 1" 5,20 1H dublett; J = 4Hz 4' 5,25 1H multiplett 1' 5,67 1H dublett; J = 1,5Hz HDO 4,78 6 62843 IR-spektrum för 1-N-etylsisomicinsulfat; KBr-brikett -1

Frekvens (cm ) Strukturella grupper och joner 3500 - 2500 (s, br) OH, NH3+, NH2+ , NH-tänjning 1690 (w) cyklisk C=C-tänjning 1620 (m) NH3+' NH2+-asymmetrisk vridning 1530 - 950 (vs, br) C-O, SO^-tänjning 610 (s, 440 (w) S02~vridning (w = svag; m = medium· s = stark; vs = mycket stark» br = bred)

Claims (2)

7 62843

1. Förfarande för framställning av ett, säsora läkemedel använd-bart syraadditionssait av 1-N-etylsisomicin, kännetecknat därav, att en förening med formeIn I ch2nh2 nh2 γγ^ο-γγ NH2 h OH omsättes med en syra och det pä sS sätt erhällna syraadditionssaltet isoleras.

2. Förfarande enligt patentkravet 1 för framställning av 1-N-etylsisomicinsulfat, kännetecknat därav, att förenin-gen med formeln I omsättes med svavelsyra.