FI121236B - Menetelmä asbestialtistukseen liittyvien keuhkosyöpien tunnistamiseksi - Google Patents

Description

i

Menetelmä asbestiaitistukseen liittyvien keuhkosyöpien tunnistamiseksi Förfarande för att cletektera lung cancer som hänför sig tili exponering av asbest KEKSINNÖN ALA 5

Esillä oleva keksintö perustuu keuhkosyöpäsoluissa esiintyvien genomimuutosten molekyylitason kuvaukseen. Keksintö antaa käyttöön menetelmän asbestiaitistukseen liittyvien keuhkosyöpien tunnistamiseksi havainnoimalla alleeliepätasapainoa (AI) keuhkosyöpäsohiista johdetusta DNA:sta. Esillä oleva keksintö osoittaa myös, että 10 asbestille altistuneilla keuhkosyöpäpotilailla on keuhkokarsinoomissaan selvästi erotettava geeninilmentämisprofiili.

KEKSINNÖN TAUSTA

15 Keuhkosyöpä on syövän johtava aiheuttaja yli miljoonalla kuolemalla vuodessa.

Tupakointi on epäilemättä keuhkosyövän tärkein yksittäinen syy. Tupakan lisäksi keuhkosyöpä on yhteydessä ammatti-ja ympäristöaltistukseen muille karsinogeenisille tekijöille, kuten asbestille. Tupakoinnin on yhdessä asbestialtistuksen kanssa osoitettu vaikuttavan synergistisesti johtaen enemmän kuin lisävaikutukseen keuhkosyövän riskiin 20 (Selikoff, 1968; Vainio, 1994). Asbestialtistuksen etiologinen osuus keuhkosyövästä miehillä on arvioitu olevan 6 - 23 % eri väestöissä (Karjalainen, 1997; Nelson, 2002).

Asbesti on säikeisten silikaattimineraalien ryhmä, joka luokitellaan kuuteen tyyppiin erilaisiin kemiallisiin ja fysikaalisiin piirteisiin perustuen. Niiden eristävät, tulenkestävät ja 25 vahvistavat ominaisuudet ovat tehneet niistä laajasti hyödynnettyjä teollisuudessa. Johtuen asbestin ensialtistuksen ja sairauden välisestä pitkästä latenssivaiheesta, jonka on arvioitu kestävän kauemmin kuin 20 vuotta altistuksen alkamisesta, asbesti aiheuttaa jatkuvasti sairautta myös maissa, joissa asbestin käyttö on kielletty (katsaukseksi katso Consensus report julkaisussa Scandinavian Journal of Work, Environment, and Health, 1997, 23:311 -30 316).

2

Asbestin on osoitettu olevan genotoksinen ja sytotoksinen aine, joka voi tuottaa sekä DNA- että kromosomaalista vauriota. Mekanismeja näiden vaikutusten taustalla voi olla monta. Päämekanismeja ajatellaan olevan reaktiivisen hapen (ROS) ja typpilajien (RNS) muodostuminen, solusyklin etenemisen fysikaalinen häirintä ja useiden 5 signaalitransduktioreaktioteiden aktivointi (Upadhyay, 2003; Jaurand, 1997).

Asbestille altistuneilla työntekijöillä on raportoitu olevan sisarkromatidivaihdosten lisääntyneitä tasoja ja DNA-kaksoisjuosteen katkoksia valkosoluissa (Fatma, 1991; Marczynski, 1994). Sekä asbestille altistuneiden työntekijöiden verestä että 10 keuhkokudoksesta on havaittu 8-hydroksi-2'-deoksiguanosiini (8-OHdG) -DNA-adduktien, jotka ovat ROS-altistuksen eräs markkeri, kohonneita konsentraatioita (Marczynski, 2000). Lisäksi Marsit et ai. (2004) esittävät, että kromosomin 3p21 heterotsygoottisuuden menetys keuhkosyöpäsoluissa on yhteydessä ammatilliseen asbestialtistukseen.

15 Tänään asbestiin liittyvien sairauksien, kuten asbestiin liittyvän keuhkosyövän, kliininen diagnoosi perustuu potilaan yksityiskohtaiseen haastatteluun ja ammatilliseen aineistoon asbestialtistuksesta, sopivaan latenssiin ja oireisiin ja radiologisiin ja keuhkojen fysiologisiin löydöksiin (katso Consensus report, 1997). Kuitenkaan asbestiin liittyvän keuhkosyövän kliiniset merkit ja oireet eivät eroa muista syistä johtuvien keuhkosyöpien 20 kliinisistä merkeistä ja oireista. Siten alan ongelma on, että keuhkosyövän korkeasta esiintyvyydestä tavallisessa väestössä johtuen ei ole mahdollista todistaa täsmällisin ehdoin, että asbesti on aiheuttava aine keuhkosyöpään yksittäisellä potilaalla edes silloin kun asbestoosi on läsnä. Esillä olevan keksinnön käyttöön antama ratkaisu on viiden selvästi erotettavan kromosomaalisen alueen havaitseminen, jotka alueet ovat alttiita 25 alleeliepätasapainolle asbestiin liittyvissä keuhkosyövissä. Siten esillä oleva keksintö kykenee antamaan käyttöön menetelmän asbestiin liittyvien keuhkosyöpien tunnistamiseksi muista keuhkosyövistä havainnoimalla alleeliepätasapainon läsnäolo tai poissaolo keuhkosyöpäsolujen kromosomin tietyissä osissa.

30 KEKSINNÖN YHTEENVETO

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmän ja reagenssipakkauksen asbestialtistukseen liittyvien keuhkosyöpien tunnistamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa otetaan keuhkosyövästä tai asbestialtistuksesta johtuvasta keuhkosyövän riskistä kärsivästä yksilöstä otettujen keuhkosyöpäsolujen näyte ja havainnoidaan asbestiin liittyvälle keuhkosyövälle luonteenomainen alleeliepätasapainon (AI) tyyppi mainittujen keuhkosyöpäsolujen vähintään yhdestä seuraavista kromosomaalisista alueista: o 3 5 a) 19p 13,3-p 12; b) 9q32-34.3; c) 2p21-pl6.3; d) 16pl3.3; ja e) 22ql2.3-ql3.1. Näistä kromosomaalisista alueista havaittu, asbestiin liittyvä AI voi ulottua näitä alueita kauemmaksi.

KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN SELITYS

10 I. Määritelmät

Termi "asbestoosi" määritellään keuhkon diffuusiksi, interstitiaaliseksi fibroosiksi asbestipölylle altistuksen seurauksena.

15

Termi "alleeliepätasapaino" (AI) määritellään tilanteeksi, jossa geeniparin toinen jäsen (eli alleeli) on menetetty (eli heterotsygoottisuuden menetys, LOH) tai monistettu. Alleeliepätasapaino viittaa siten tilanteeseen, jossa alleeleista yhden kopioluku on muuttunut kromosomissa.

20

Termejä "nukleiinihappo", "polynukleotidi" ja "oligonukleotidi" käytetään vaihtovuoroisesti, ja ne viittaavat joko yksi- tai kaksijuosteisessa muodossa olevaan deoksiribonukleotidi- tai ribonukleotidipolymeeriin ja, ellei toisin rajoiteta, käsittävät luonnollisten nukleotidien tunnetut analogit, jotka hybridisoituvat nukleiinihappoihin 25 samalla tavalla kuin luonnollisesti esiintyvät nukleotidit. Ellei toisin esitetä, tietty nukleiinihapposekvenssi sisältää sen komplementaarisen sekvenssin.

Termi "kohdenukleiinihappo" viittaa nukleiinihappoon (joka on usein johdettu biologisesta näytteestä), johon polynukleotidikoettimen suunnitellaan hybridisoituvan spesifisesti. Joko 30 kohdenukleiinihapon läsnäolo tai poissaolo havainnoidaan tai kohdenukleiinihapon määrä määritetään. Kohdenukleiinihapolla on sekvenssi, joka on komplementaarinen kohteelle suunnatun vastaavan koettimen nukleiinihapposekvenssille. Termi kohdenukleiinihappo voi viitata suuremman nukleiinihapon, jolle koetin on summattu, spesifiseen 4 alasekvenssiin tai koko sekvenssiin (esim. geeni tai mRNA), jonka ilmentämistasoa halutaan havainnoida.

"Koetin" tai "polynukleotidikoetin" on nukleiinihappo, joka kykenee sitoutumaan 5 komplementaarisen sekvenssin omaavaan kohdenukleiinihappoon yhden tai useamman tyyppisen kemiallisen sidoksen välityksellä tavallisesti komplementaarisen emäspariutumisen kautta, tavallisesti vetysidoksen muodostumisen kautta muodostaen siten kaksoisrakenteen. Koetin sitoutuu tai hybridisoituu "koetinta sitovaan kohtaan". Koetin voi sisältää luonnollisia (eli A, G, C tai T) tai modifioituja emäksiä (7-10 deatsaguanosiini, inosiini jne.). Koetin voi olla oligonukleotidi, joka on yksijuosteista DNA:ta. Polynukleotidikoettimia voidaan syntetisoida tai valmistaa luonnollisesti esiintyvistä polynukleotideista. Lisäksi koettimessa olevat emäkset voidaan yhdistää muulla kytkennällä kuin fosfodiesterisidoksella niin kauan kuin se ei häiritse hybridisaatiota. Siten koettimet voivat sisältää esimerkiksi peptidinukleiinihappoja, joissa 15 aineosaemäkset on yhdistetty peptidisidoksilla mieluumminkin kuin fosfodiesterikytkennöillä [katso esim. Nielsen et ai, Science 254, 1 497 - 1 500 (1991)]. Joissakin koettimissa voi olla komplementaarista aluetta reunustavia, ei-komplementaarisia johto- ja/tai päätesekvenssejä. "Täydellisesti yhteensopivalla koettimella" on sekvenssi, joka on täydellisesti komplementaarinen nimenomaiseen 20 kohdesekvenssiin nähden. Koetin on tyypillisesti täydellisesti komplementaarinen kohdesekvenssin osaan (alasekvenssiin) nähden. Termi "yhteensopimaton koetin" viittaa koettimiin, joiden sekvenssi on valittu tarkoituksella siten, että se ei ole täydellisesti komplementaarinen nimenomaiseen kohdesekvenssiin nähden.

25 "Aluke" on yksijuosteinen oligonukleotidi, joka kykenee toimimaan templaatin ohjaaman DNA-synteesin alkukohtana tarkoituksenmukaisissa olosuhteissa (eli neljän erilaisen nukleosiditrifosfaatin ja polymerisaatioon tarkoitetun aineen, kuten DNA- tai RNA-polymeraasin tai käänteisen transkriptaasin läsnä ollessa), tarkoituksenmukaisessa puskurissa ja sopivassa lämpötilassa. Alukkeen tarkoituksenmukainen pituus riippuu 30 alukkeen aiotusta käytöstä, mutta tyypillisesti se on 15 - 30 nukleotidiä, vaikka myös lyhyempiä tai pitempiä alukkeita voidaan käyttää. Lyhyet alukemolekyylit vaativat yleensä viileämpiä lämpötiloja riittävän stabiilien hybridikompleksien muodostamiseksi templaatin kanssa. Alukkeen ei tarvitse heijastaa templaatin täsmällistä sekvenssiä, mutta sen täytyy olla riittävän komplementaarinen hybridisoituakseen templaatin kanssa. Termi 5 "alukekohta" viittaa kohde-DNA:n alueeseen, johon aluke hybridisoituu. Termi "alukepari" tarkoittaa alukkeiden yhdistelmää, mukaan lukien 5'-"ylävirran aluke", joka hybridisoituu monistettavan DNA-sekvenssin 5'-pään kanssa, ja 3'-"alavirran aluke", joka hybridisoituu monistettavan sekvenssin 3'-pään komplementin kanssa.

5

Termi "komplementaarinen" tarkoittaa, että toinen nukleiinihappo on identtinen toiseen nukleiinihappomolekyyliin nähden tai hybridisoituu siihen selektiivisesti. Hybridisaation selektiivisyyttä on, kun tapahtuu hybridisaatio, joka on selektiivisempi kuin täydellinen spesifisyyden puuttuminen. Tyypillisesti selektiivinen hybridisaatio tapahtuu, kun 10 vähintään 14 - 25 nukleotidin jaksossa on vähintään noin 55 %:n, edullisesti vähintään 65 %:n, edullisemmin vähintään 75 %:n ja edullisimmin vähintään 90 %:n identtisyys. Edullisesti toinen nukleiinihappo hybridisoituu spesifisesti toiseen nukleiinihappoon.

Katso M. Kanehisa, Nucleic Acids Res. 12:203 (1984).

15 Termiä "polypeptidi", "peptidi" ja "proteiini" käytetään vaihtovuoroisesti viittamaan aminohappotähteiden polymeeriin. Termi soveltuu myös aminohappopolymeereille, joissa yksi tai useampi aminohappo on vastaavien luonnollisesti esiintyvien aminohappojen kemiallisia analogeja.

20 Termit "identtinen" tai "identtisyys"prosentti kahden tai useamman nukleiinihapon tai polypeptidin yhteydessä viittaavat kahteen tai useampaan sekvenssiin tai alasekvenssiin, jotka ovat samoja taljoissa on määrätty prosenttiosuus nukleotideja tai aminohappotähteitä, jotka ovat samoja, kun niitä verrataan ja asetetaan rinnakkain suurimman mahdollisen vastaavuuden suhteen mitattuna käyttämällä sekvenssivertailualgoritmia, kuten esimerkiksi 25 alla kuvattuja, tai visuaalisella tarkastelulla.

Ilmaus "oleellisesti identtinen" kahden nukleiinihapon tai polypeptidin yhteydessä viittaa kahteen tai useampaan sekvenssiin tai alasekvenssiin, joilla on vähintään 75 %:n, edullisesti vähintään 85 %:n, edullisemmin vähintään 90 %:n, 95 %:n tai korkeampi 30 nukleotidi- tai aminohappotähteiden identtisyys, kun niitä verrataan ja asetetaan rinnakkain suurimman mahdollisen vastaavuuden suhteen mitattuna käyttämällä sekvenssivertailualgoritmia, kuten esimerkiksi alla kuvattuja, tai visuaalisella tarkastelulla. Edullisesti oleellinen identtisyys on sekvenssien alueessa, joka on vähintään noin 30 tähteen pituinen, edullisesti pitemmässä alueessa kuin 50 tähdettä, edullisemmin vähintään 6 noin 70 tähteessä ja edullisimmin sekvenssit ovat oleellisesti identtisiä verrattavien sekvenssien, kuten esimerkiksi nukleotidin koodaavan alueen koko pituudelta. Sekvenssin vertailua varten toinen sekvenssi toimii tyypillisesti vertailusekvenssinä, johon testisekvenssejä verrataan. Käytettäessä sekvenssivertailualgoritmia, testi-ja 5 vertailusekvenssit syötetään tietokoneeseen, alasekvenssin koordinaatit määrätään, jos se on tarpeellista, ja sekvenssialgoritmiohjelman parametrit määrätään. Sitten sekvenssivertailualgoritmi laskee sekvenssin i de n tt i s yysp ro s en ti n testisekvenss(e)ille suhteessa vertailusekvenssiin määrättyihin ohjelmaparametreihin perustuen.

10 Optimaalinen sekvenssien rinnastus vertailua varten voidaan toimittaa esim. julkaisun Smith & Waterman, Adv. Appi. Math. 2:482 (1981) mukaisella paikallisen homologian algoritmilla, julkaisun Needleman & Wunsch, J. Mol Biol. 48:443 (1970) mukaisella homologiarinnastusalgoritmilla, julkaisun Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 85:2 444 (1988) mukaisella haulla samanlaisuusmenetelmän suhteen, näiden algoritmien 15 tietokoneella käsitellyillä toteutuksilla (GAP, BESTFIT, FASTA ja TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) tai visuaalisella tarkastelulla [katso esim. Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1995 supplement).

20 Eräs käyttökelpoinen algoritmi sekvenssivertailujen toimittamiseksi on PILEUP. PILEUP käyttää julkaisun Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351 - 360 (1987) mukaisen progressiivisen rinnastusmenetelmän yksikertaistusta. Käytetty menetelmä on samanlainen kuin julkaisussa Higgins & Sharp, CABIOS 5:151 - 153 (1989) kuvattu menetelmä. PILUP:a käyttämällä vertailusekvenssiä verrataan muihin testisekvensseihin sekvenssin 25 identtisyysprosentin suhteen määrittämiseksi käyttämällä seuraavia parametrejä: aukon painon oletusarvo (3,00), aukon pituuden painon oletusarvo (0,10) ja painotetut loppuaukot. PILEUP voidaan hankkia GCG-sekvenssianalyysiohjelmistopaketista, esim. versio 7.0 [Devereaux et ai, Nuc. Acids Res 12:387 - 395 (1984)].

30 Toinen esimerkki algoritmista, joka on sopiva sekvenssin identtisyysprosentin ja sekvenssin samanlaisuuden määrittämiseksi, ovat BLAST-ja BLAST 2.0 -algoritmit, jotka on kuvattu julkaisussa Altschul et ai, J. Mol. Biol. 215:403 - 410 (1990). Ohjelmisto BLAST-analyysien suorittamiseksi on julkisesti saatavana National Center for Biotechnology Information -laitoksen kautta (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Tämä 7 algoritmi käsittää ensiksi korkean pistemäärän omaavien sekvenssiparien (HSP:t) tunnistamisen tunnistamalla kysytystä sekvenssistä W:n pituisia lyhyitä sanoja, jotka joko sopivat yhteen tai tyydyttävät jonkin positiivisen arvon omaavan kyrmyspistemäärän T, kun ne asetetaan rinnakkain tietokantasekvenssissä olevan samanpituisen sanan kanssa,

5 T:tä kutsutaan naapurustosanan pistemäärän kynnysarvoksi (Altschul et ai, edellä). Nämä naapumstosanan ensiosumat toimivat siemeninä hakujen aloittamiseksi niitä sisältävien pitempien HSP:iden löytämiseksi. Sanaosumat ulotetaan sitten molempiin suuntiin pitkin kutakin sekvenssiä niin pitkälle kuin kumulatiivista rinnastuspistemäärää voidaan kasvattaa. Kumulatiiviset pistemäärät lasketaan käyttämällä nukleotidisekvensseillä 10 parametrejä M (palkkiopistemäärä yhteensopivien tähteiden parille; aina > 0) ja N

(rangaistuspistemäärä yhteensopimattomille tähteille; aina < 0). Aminohapposekvensseillä pisteytysmatriisia käytetään kumulatiivisen pistemäärän laskemiseksi. Sanaosumien ulottaminen kumpaankin suuntaan pysähtyy, kun: kumulatiivinen rinnastuspistemäärä putoaa määrällä X suurimmasta saavutetusta arvostaan; kumulatiivinen pistemäärä menee 15 nollaan tai sen alle yhden tai useamman negatiivisesti pisteytetyn tähderinnastuksen kasaantumisesta johtuen; tai saavutetaan jomman kumman sekvenssin pää.

Sen tunnistamiseksi, onko nukleiinihappo tai polypeptidi keksinnön suojapiirissä, BLAST-ohjelmien oletusparametrit ovat sopivia. BLASTN-ohjelma (nukleotidisekvensseille) 20 käyttää oletusarvoina sanan pituutta (W) 11, odotusarvoa (E) 10, M = 5, N = -4 ja molempien juosteiden vertailua. Aminohapposekvensseillä BLASTP-ohjelma käyttää oletusarvoina sanan pituutta (W) 3, odotusarvoa (E) 10 ja BLOSUM 62 -pisteytysmatriisia. TBLATN-ohjelma (joka käyttää proteiinisekvenssiä nukleotidisekvenssin sijasta) käyttää oletusarvoina sanan pituutta (W) 3, odotusarvoa (E) 10 ja BLOSUM 62 -pisteytysmatriisia. 25 [Katso esim. Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10 915 (1989)].

Toinen osoitus, että kaksi nukleiinihapposekvenssiä ovat oleellisesti identtisiä, on että nämä kaksi molekyyliä hybridisoituvat toisiinsa ankarissa olosuhteissa. "Sitoutuvat (sitoutuu) oleellisesti" viittaa komplementaariseen hybridisaatioon koetinnukleiinihapon ja 30 kohdenukleiinihapon välillä ja käsittää vähäisiä yhteensopimattomuuksia, jotka voidaan sovittaa vähentämällä hybridisaatioväliaineen ankaruutta kohdepolynukleotidisekvenssin halutun havainnoinnin aikaansaamiseksi. Ilmaus "spesifisesti hybridisoituva" viittaa molekyylin sitoutumiseen, dupleksin muodostukseen tai hybridisoitumiseen vain tiettyyn 8 nukleotidisekvenssiin ankarissa olosuhteissa, kun sekvenssi on läsnä kompleksisessa seoksessa (esim. sellulaarisessa kokonais-) DNA:ssa tai RNA:ssa.

Termi "ankarat olosuhteet" viittaa olosuhteisiin, joissa koetin hybridisoituu 5 kohdealasekvenssiinsä mutta ei muihin sekvensseihin. Ankarat olosuhteet ovat sekvenssistä riippuvia ja ovat erilaisia eri oloissa. Pitemmät sekvenssit hybridisoituvat spesifisesti korkeammissa lämpötiloissa. Tavallisesti ankarien olosuhteiden on valittu olevan noin 5 °C matalampia kuin nimenomaisen sekvenssin terminen sulamispiste (Tm) määritellyssä ionivahvuudessa ja pH:ssa. Tm on lämpötila (määritellyssä ionivahvuudessa, 10 pH:ssa ja nukleiinihappokonsentraatiossa), jossa 50 % kohdesekvenssille komplementaarisista koettimista hybridisoituu tasapainossa kohdesekvenssiin. (Koska kohdesekvenssejä on tavallisesti läsnä ylimäärin, Trmssä 50 % koettimista on tasapainossa varattuja.) Tyypillisesti ankarat olosuhteet ovat olosuhteita, joissa suolakonsentraatio on alle noin 1,0 M Na-ionikonsentraatio, tyypillisesti noin 0,01 M Na-ionikonsentraatio (tai 15 muita suoloja) pH 7,0 - 8,3 :ssa ja lämpötila on vähintään noin 30 °C lyhyille koettimille (esim. 10 - 50 nukleotidia) ja vähintään noin 60 °C pitkille koettimille (esim. suuremmille kuin 50 nukleotidia). Ankarat olosuhteet voidaan saavuttaa myös lisäämällä destabiloivia aineita, kuten formamidia.

20 Lisäosoitus sille, että kaksi nukleiinihapposekvenssiä tai polypeptidiä ovat oleellisesti identtisiä, on että ensimmäisen nukleiinihapon koodaama polypeptidi on immunologisesti ristireaktiivinen toisen nukleiinihapon koodaaman polypeptidin kanssa, kuten alla on kuvattu. Ilmaukset "sitoutuu spesifisesti proteiiniin" tai "spesifisesti immunoreaktiivinen jkn kanssa", kun viitataan vasta-aineeseen, viittaavat sitoutumisreaktioon, joka määräytyy 25 proteiinin läsnäolosta proteiinien ja muiden biologisten aineiden heterogeenisen populaation läsnä ollessa. Siten määrätyissä immunomääritysolosuhteissa nimenomainen vasta-aine sitoutuu valikoivasti tiettyyn proteiiniin eikä sitoudu merkittävässä määrin näytteessä läsnä oleviin muihin proteiineihin. Spesifinen sitoutuminen proteiiniin tällaisissa olosuhteissa vaatii vasta-aineen, joka on valittu spesifisyytensä suhteen tietylle 30 proteiinille. Tietylle proteiinille spesifisesti immunoreaktiivisten vasta-aineiden valikoimiseksi voidaan käyttää monia eri immunomääritysformaatteja. Proteiinin kanssa spesifisesti immunoreaktiivisten monoklonaalisten vasta-aineiden valikoimiseksi käytetään rutiininomaisesti esimerkiksi kiinteän faasin ELISA-immunomäärityksiä. Katso esim. Harlow ja Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 9

Publications, New York, immunomääritysformaattien ja -olosuhteiden, joita voidaan käyttää spesifisen immunoreaktiivisuuden määrittämiseksi, kuvauksen suhteen.

Tietyn polynukleotidisekvenssin "konservoituneesti modifioidut muunnokset" viittaa 5 niihin polynukleotideihin, jotka koodaavat identtisiä tai oleellisesti identtisiä aminohapposekvenssejä, tai kun polynukleotidi ei koodaa aminohapposekvenssiä, oleellisesti identtisiin sekvensseihin. Geneettisen koodin degeneroituneisuuden vuoksi mitä tahansa tiettyä polypeptidiä koodaa suuri joukko toiminnallisesti identtisiä nukleiinihappoja. Esimerkiksi kodonit CGU, CGC, CGA, AGA ja AGG koodaavat kaikki 10 arginiiniaminohappoa.

Siten jokaisessa asemassa, jossa kodoni määrää arginiinia, kodoni voidaan muuttaa miksi tahansa kuvatuista vastaavista kodoneista muuttamatta koodattua polypeptidiä. Tällaiset nukleiinihappomuunnokset ovat "hiljaisia muunnoksia", jotka ovat "konservoituneesti 15 modifioitujen muunnosten" eräs laji. Jokainen tässä kuvattu polynukleotidisekvenssi, joka koodaa polypeptidiä, kuvaa myös jokaista mahdollista hiljaista muunnosta paitsi milloin toisin mainitaan. Ammattilainen ymmärtää, että kukin nukleiinihapon kodoni (paitsi AUG, joka on tavallisesti ainoa kodoni metioniinille) voidaan modifioida toiminnallisesti identtisen molekyylin tuottamiseksi tavallisilla tekniikoilla. Sen mukaisesti kukin 20 polypeptidiä koodaavan nukleiinihapon "hiljainen muunnos" sisältyy kuhunkin kuvattuun sekvenssiin.

Polypeptidi on tyypillisesti oleellisesti identtinen toiseen polypeptidiin nähden esimerkiksi, kun kaksi peptidiä eroavat vain konservoituneilla substituutioilla. "Konservoitunut 25 substituutio", kun kuvataan proteiinia, viittaa proteiinin aminohappokoostumuksen muutokseen, joka ei muuta oleellisesti proteiinin aktiivisuutta. Siten tietyn aminohapposekvenssin "konservoituneesti modifioidut muunnokset" viittaa niiden aminohappojen aminohapposubstituutioihin, jotka eivät ole ratkaisevia proteiinin aktiivisuudelle, tai aminohappojen substituutioon samanlaiset ominaisuudet omaavien 30 muiden aminohappojen kanssa (esim. hapan, emäksinen, positiivisesti tai negatiivisesti varautunut, polaarinen tai ei-polaarinen jne.) siten, että jopa ratkaisevien aminohappojen substituutiot eivät muuta aktiivisuutta oleellisesti. Toiminnallisesti samanlaisia aminohappoja käyttöön antavat konservoituneet substituutiotaulukot ovat alalla hyvin tunnettuja. Katso esim. Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Company. Lisäksi 10 yksittäiset substituutiot, deleetiot tai additiot, jotka muuttavat, lisäävät tai poistavat yhden aminohapon tai aminohappojen pienen prosenttiosuuden koodatussa sekvenssissä, ovat myös "konservoituneesti modifioituja muunnoksia".

5 Termi "luonnollisesti esiintyvä" sovellettuna kohteelle viittaa tosiasiaan, että kohdetta voidaan löytää luonnosta. Esimerkiksi polypeptidi tai polynukleotidisekvenssi, joka on läsnä organismissa Joka voidaan eristää luonnossa olevasta lähteestä, ja jota ihmiset eivät ole tarkoituksella modifioineet laboratoriossa, on luonnollisesti esiintyvä.

10 Termi "vasta-aine" viittaa proteiiniin, joka koostuu yhdestä tai useammasta polypeptidistä, joita koodaavat oleellisesti immunoglobuliinigeenit tai immunoglobuliinigeenien fragmentit. Tunnistettuja immunoglobuliinigeenejä ovat muuttumattoman alueen kappa-, lambda-, alfa-, gamma-, delta-, epsilon-ja myy-geenit sekä lukemattomat immunoglobuliinin vaihtelevan alueen geenit. Kevyet ketjut luokitellaan joko kapaksi tai 15 lambdaksi. Raskaat ketjut luokitellaan gammaksi, myyksi, alfaksi, deltaksi tai epsiloniksi, jotka vuorostaan määrittelevät samassa järjestyksessä immunoglobuliiniluokat IgG, IgM, IgA, IgD ja IgE.

II. Yleiskatsaus 20

Monia biologisia toimintoja kontrolloidaan muutoksien kautta erilaisten geenien ilmentämisessä transkriptionaalisella (esim. aloituksen, RNA-prosessoinnin jne. kontrollilla) ja/tai translationaalisella kontrollilla. Esimerkiksi pemstavaa laatua oleville biologisille prosesseille, kuten solusyklille, solun erilaistumiselle ja solukuolemalle, on 25 usein luonteenomaista vaihtelut geenien ryhmien ilmentämistasoissa (katso esim.

W002059271). Muutokset geeni-ilmentämisessä ovat myös yhteydessä patogeneesiin. Siten muutokset tiettyjen geenien ilmentämistasoissa voivat osoittaa erilaisten sairauksien läsnäolon ja etenemisen.

30 Keksinnön mukaisesti on havaittu geenejä, joita ilmennetään erottavasti asbestiin liittyvässä keuhkosyövässä. Yhtä tai useampia näistä kohdegeeneistä voidaan käyttää osana "ilmentämisprofiilia", joka on tyypillinen keuhkosyövän tietylle tilalle. Näiden uusien kohdegeenien tunnistaminen mahdollistaa keuhkosyöpien analysoinnin luotettavammin. Nämä tulokset antavat käyttöön myös uusia käsityksiä asbestialtistukseen I 1 liittyviin karsinogeenisiin mekanismeihin ja paljastavat uusia mahdollisia kohdegeenejä asbestiin liittyvien sairauksien, kuten keuhkosyöpien terapiaan. Näitä erottuvasti ilmennettyjä geenejä ja niiden vastaavia proteiineja voidaan käyttää hyödyksi myös "markkereina", jotka karakterisoivat tiettyjä sellulaarisia tiloja keuhkosyöpäsoluilla.

5

Erottuvasti ilmennettyjä, tunnistettuja geenejä voidaan käyttää hyödyksi monissa eri 10 menetelmissä keuhkosyöpien luokittelemiseksi sekä asbestin välittämien muiden sairauksien (esim. asbestoosi, pleuraaliset häiriöt ja mesoteliooma) diagnosoimiseksi ja hoitamiseksi. Käyttöön annetaan myös reagenssipakkauksia ja laitteita Jotka sisältävät yhden tai useamman erottavasti ilmennetyistä geeneistä, näiden geenien koodaamista proteiineista ja/tai vasta-aineita, alukkeita ja koettimia, jotka sitovat näitä proteiineja tai 15 geenejä.

20 III, Erottavasti ilmennetyt geenit

Kuten alla olevissa esimerkeissä on kuvattu täydellisemmin, kokeiden alkusarja toimitettiin keuhkosyöpäsolujen geeninilmentämisprofiilien tunnistamiseksi. Tämä salli tunnistaa ne geenit, jotka ovat osallisina asbestialtistuksessa. Erottavasti ilmennettyjä 25 geenejä ovat esimerkiksi taulukossa 5 luetellut.

12

Geeninilmentämisprofiileihin liittyvä ilmentämisen kuvio voidaan määritellä useilla 5 tavoilla. Geeninilmentämisprofiili voi esimerkiksi olla nimenomaisten, erottavasti ilmennettyjen geenien minkä tahansa joukon absoluuttinen (esim. mitattu arvo) tai suhteellinen transkriptitaso. Muissa tapauksissa geeninilmentämisprofiili voidaan määritellä vertaamalla monien eri geenien ilmentämisen tasoa yhdessä tilassa samojen geenien ilmentämisen tasoon toisessa tilassa (esim. aktivoitunut vastaan aktivoitumaton) 10 tai yhden solutyypin ja toisen solutyypin välillä.

15 Tässä käytetty termi "erottavasti ilmennetty geeni" tai "erottavasti ilmennetty nukleiinihappo" viittaa spesifiseen sekvenssiin, kuten on esitetty nimenomaisessa GenBank-viennissä, joka annetaan tässä käyttöön (katso esim. taulukoita). Termin tarkoitetaan kuitenkin sisältävän laajemmin myös luonnollisesti esiintyvät sekvenssit 20 (mukaan lukien GenBank-vienneille lueteltujen sekvenssien alleelimuunnokset) sekä synteettiset että tarkoituksella muokatut sekvenssit (esim. kohdennetulle mutageneesille alistetut nukleiinihapot). Taulukoissa ja kuvioissa lueteltujen kohdegeenien sekvenssien mainitaan olevan saatavissa julkisissa tietokannoissa. Taulukot antavat käyttöön hakunumeron ja nimen kullekin sekvensseistä. GenBank:ssa olevat geenien sekvenssit 25 sisällytetään tähän varta vasten kokonaisuudessaan tämän hakemuksen jättöpäivämäärästä lukien (katso www.ncbi.mm.mh.gov).

13

Erottavasti ilmennettyjä nukleiinihappoja ovat myös sekvenssit, jotka ovat komplementaarisia luetelluille sekvensseille, sekä geneettisen koodin degeneroituneisuudesta aiheutuvat degeneraattisekvenssit. Siten erottavasti ilmennettyjä 5 nukleiinihappoja ovat: (a) nukleiinihapot, joiden sekvenssit vastaavat luetelluissa GenBank-hakunumeroissa käyttöön annettuja sekvenssejä; (b) nukleiinihapot, jotka koodaavat aminohappoja, joita koodaavat (a)-kohdan mukaiset nukleiinihapot; (c) nukleiinihappo, joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa (a)-kohdan mukaisen nukleiinihapon komplementtiin; ja (d) nukleiinihapot, jotka hybridisoituvat ankarissa 10 olosuhteissa (a) - (c) -kohdissa kuvattuihin nukleiinihappoihin ja jotka ovat siten niiden komplementteja. Keksinnön mukaisia, erottavasti ilmennettyjä nukleiinihappoja ovat myös: (a) deoksiribonukleotidisekvenssi, joka on komplementaarinen lueteltuja GenBank-hakunumeroita vastaaville täysipituisille nukleotidisekvensseille; (b) ribonukleotidisekvenssi, joka on komplementaarinen lueteltuja GenBank-hakunumeroita 15 vastaavalle täysipituiselle sekvenssille; ja (c) nukleotidisekvenssi, joka on komplementaarinen (a)-kohdan mukaiselle deoksiribonukleotidisekvenssille ja (b)-kohdan mukaiselle ribonukleotidisekvenssille. Erottavasti ilmennettyjä nukleiinihappoja ovat lisäksi edellä olevien sekvenssien fragmentit. Mukaan luetaan esimerkiksi nukleiinihappoja, mukaan lukien 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60, 70, 20 80, 90, 100, 125,150,175, 200, 225, 250, 275 tai 300 peräkkäistä nukleotidia (tai mikä tahansa nukleotidien lukumäärä niiden välistä) erottavasti ilmennetystä nukleiinihaposta. Tällaiset fragmentit ovat käyttökelpoisia esimerkiksi alukkeina ja koettimina täysipituisten, erottavasti ilmennettyjen nukleiinihappojen hybridisoimiseksi (esim. tällaisten sekvenssien havainnoimisessa j a monistamisessa).

25

Joissakin tapauksissa erottavasti ilmennetyt nukleiinihapot sisältävät konservoituneesti modifioituja muunnoksia. Siten esimerkiksi joissakin tapauksissa erottavasti ilmennetyt nukleiinihapot on modifioitu. Ammattilainen ymmärtää monia tapoja muutosten muodostamiseksi tietyssä nukleiinihappokonstruktissa. Tällaisia hyvin tunnettuja 30 menetelmiä ovat kohdennettu mutageneesi, PCR-monistus käyttämällä degeneraattipolynukleotideja, nukleiinihappoa sisältävien solujen altistus mutageenisille aineille tai säteilytykselle ja halutun polynnkleotidin kemiallinen synteesi (esim. ligaation ja/tai kloonauksen yhteydessä suurten nukleiinihappojen muodostamiseksi). Katso esim. Giliman ja Smith (1979) Gene 8:81 - 97, Roberts et ai. (1987) Nature 328:731 - 734). Kun 14 erottavasti ilmennetyt nukleiinihapot viedään vektoreihin, nukleiinihapot voidaan yhdistää muiden sekvenssien kanssa, mukaan lukien, mutta ei niihin rajoittuen, promoottorit, polyadenylaatiosignaalit, restriktioentsyymikohdat ja moninkertaiset kloonauskohdat.

Siten nukleiinihapon kokonaispituus voi vaihdella huomattavasti.

5

Kuten edellä on kuvattu, sekvenssin identtisyysvertailut voidaan toimittaa käyttämällä nukleotidisekvenssivertailualgoritmia, kuten alan ammattilaisten tuntemia algoritmeja. Voidaan käyttää esimerkiksi BLASTN-algoritmia. Sopivia parametrejä BLASTN:ssa käytettäväksi ovat sanan pituus (W) 11, M = 5 ja N = -4 ja juuri kuvatut identtisyysarvot ja 10 alueen koot.

IV. Erottavasti ilmennettyjen geenien valmistaminen

Erottavasti ilmennettyjä nukleiinihappoja voidaan hankkia alalla tunnetulla millä tahansa 15 sopivalla menetelmällä, mukaan lukien esimerkiksi: (1) genomi- tai cDNA-kirjastojen hybridisaatio koettimilla homologisten nukleotidisekvenssien havainnoimiseksi; (2) ilmentämiskiijastojen vasta-aineseulonta yhteisten rakenteellisten piirteiden omaavien kloonattujen DNA-fragmenttien havainnoimiseksi; (3) erilaiset monistusmenettelyt, kuten polymeraasiketjureaktio (PCR) käyttämällä alukkeita, jotka kykenevät pariutumaan 20 kiinnostavaan nukleiinihappoon; ja (4) suora kemiallinen synteesi.

Halutut nukleiinihapot voidaan myös kloonata käyttämällä hyvin tunnettuja monistustekniikoita. Esimerkkejä käytännöistä, jotka ovat riittäviä ohjaamaan ammattilaiset in vitro -monistusmenetelmien läpi, mukaan lukien polymeraasiketjureaktio 25 (PCR), ligaasiketjureaktio (LCR), QP-replikaasimonistus ja muut RNA-polymeraasin välittämät tekniikat, löytyy julkaisuista Berger, Sambrook ja Ausubel sekä Mullis et ai. (1987) US-patentti nro 4 683 202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et ai. toim.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Amheim & Levinson (1. lokakuuta 1990) C&EN 36 - 47; The Journal Of NIH Research (1991)3:81 -30 94; (Kvvoh et ai. (1989) Proc Natl. Acad. Sei. USA 86:1 173; Guatelli et ai. (1990) Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 87: 1 874; Lomell et ai. (1989)/. Clin. Chem. 35:1 826; Landegren et ai. (1988) Science 241:1 077 - 1 080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291 - 294; Wu ja Wallace (1989) Gene 4:560; ja Barringer et ai. (1990) Gene 89:117. Parannettuja 15 menetelmiä in vitro -monistettujen nukleiinihappojen kloonaamiseksi kuvataan julkaisussa Wallace et ai., US-pat. nro 5 426 039.

Vaihtoehtona nukleiinihapon kloonaukselle sopiva nukleiinihappo voidaan syntetisoida 5 kemiallisesti. Suoria kemiallisia synteesimenetelmiä ovat esimerkiksi julkaisun Närän g et ai. (1979) Meth. Enzymol. 68:90 - 99 mukainen fosfotriesterimenetelmä; julkaisun Brown et ai., (1979) Meth. Enzymol. 68:109 - 151 mukainen fosfodiesterimenetelmä; julkaisun Beaucage et ai., (1981) Tetra. Lett., 22:1 859 - 1 862 mukainen dietyylifosforamidiittimenetelmä; ja kiinteän alustan menetelmä, joka on kuvattu US-10 patentissa nro 4 458 066. Kemiallinen synteesi tuottaa yksijuosteista polynukleotidia.

Tämä voidaan konvertoida kaksijuosteiseksi DNA:ksi hybridisaatiolla komplementaarisen sekvenssin kanssa tai polymerisaatiolla DNA-polymeraasilla käyttämällä tuota yhtä juostetta templaattina. Samalla kun DNA:n kemiallinen synteesi rajoittuu usein noin 100 emäksen sekvensseihin, pitempiä sekvenssejä voidaan hankkia lyhyempien sekvenssien 15 ligaatiolla. Vaihtoehtoisesti alasekvenssejä voidaan kloonata ja tarkoituksenmukaiset alasekvenssit pilkkoa käyttämällä tarkoituksenmukaisia restriktioentsyymejä. Fragmentit voidaan sitten ligoida halutun DNA-sekvenssin tuottamiseksi.

V, Erottavasti ilmennettyjen nukleiinihappojen ja ilmentämisprofiilien käyttökelpoisuus 20

Kuten on viitattu edellä olevaan ja kuvattu yksityiskohtaisemmin alla, käyttöön annettuja, erottavasti ilmennettyjä nukleiinihappoja voidaan käyttää markkereina monissa eri seulonta-ja diagnostisissa menetelmissä. Erottavasti ilmennetyillä nukleiinihapoilla on käyttökelpoisuutta esimerkiksi hybridisaatiokoettimina tai monistusalukkeina. Tietyissä 25 tapauksissa nämä koettimet ja alukkeet ovat erottavasti ilmennettyjen nukleiinihappojen fragmentteja, joiden pituuksia on kuvattu aikaisemmin tässä kappaleessa. Tällaiset fragmentit ovat yleensä riittävän pituisia hybridisoituakseen spesifisesti kohteesta saadussa näytteessä olevaan RNA:han tai DNA:han. Nukleiinihapot ovat pituudeltaan tyypillisesti 10-30 nukleotidia, vaikka ne voivat olla pitempiä, kuten edellä on kuvattu. Koettimia 30 voidaan käyttää valikoimassa erityyppisiä hybridisaatiokokeita, mukaan lukien, mutta ei niihin rajoittuen, Northern-blotit ja Southem-blotit ja mittatilaussirujen valmistuksessa (katso alempana). Erottavasti ilmennettyjä nukleiinihappoja voidaan käyttää myös alukkeiden suunnittelussa erottavasti ilmennettyjen nukleiinihappojen monistamiseksi ja alukkeiden ja koettimien suunnittelussa kvantitatiiviseen RT-PCR:ään. Alukkeet sisältävät 16 useimmiten erottuvasti ilmennettyjen nukleiinihappojen noin 20 - 30 peräkkäistä nukleotidia halutun stabiilisuustason ja siten selektiivisyyden hankkimiseksi monistuksessa, vaikka hyödyksi voidaan käyttää edellä kuvattuja pitempiä sekvenssejä.

5 Hybridisaatio-olosuhteita vaihdellaan nimenomaisen sovelluksen mukaisesti. Sovelluksiin, jotka vaativat korkeaa selektiivisyyttä (esim. tietyn sekvenssin monistus), käytetään hyödyksi suhteellisen ankaria olosuhteita, kuten 0,02 - noin 0,10 M NaCka noin 50 - noin 70 °C:n lämpötiloissa. Korkean ankaruuden olosuhteet, kuten nämä, sietävät vähän jos yhtään yhteensopimattomuutta koettimen ja templaatin tai erottavasi! ilmennetyn 10 nukleiinihapon kohdejuosteen välillä. Tällaiset olosuhteet ovat käyttökelpoisia esimerkiksi spesifisten geenien eristämiseksi tai tiettyjen mRNA-transkriptien havainnoimiseksi.

Muut sovellukset, kuten aminohappojen substituutio kohdennetulla mutageneesillä, vaativat vähemmän ankaruutta. Näissä olosuhteissa hybridisaatio voi tapahtua, vaikka 15 koettimen ja kohdenukleiinihapon sekvenssit eivät ole täydellisesti komplementaarisia, vaan sisältävät sen sijaan yhden tai useampia yhteensopimattomuuksia. Olosuhteista voidaan tehdä vähemmän ankaria lisäämällä suolakonsentraatiota ja vähentämällä lämpötilaa. Esimerkiksi keskimääräisen ankaruuden olosuhde sisältää noin 0,1 - 0,25 M NaCka noin 37 - noin 55 °C:n lämpötiloissa. Alhaisen ankaruuden olosuhteet sisältävät 20 noin 0,15 M - noin 0,9 M suolaa noin 20 - noin 55 °C:n lämpötiloissa.

VI. Tyypillisiä seulonta-, diagnostisia ja luokittelumenetelmiä A. Yleiset näkökohdat 25 Käyttöön annetut tietyt menetelmät käsittävät yhden tai useamman erottavasti ilmennetyn geenin ilmentämistason määrittämisen testisolupopulaatiosta kontrollisolupopulaation samojen geenien ilmentämistason kanssa tai yhden näytteen ilmentämisprofiilin vertaamisen toiselle näytteelle määritetyn ilmentämisprofiilin kanssa. Erottavasti 30 ilmennettyjen nukleiinihappojen ilmentämisen taso voidaan määrittää joko nukleiinihappotasolla tai proteiinitasolla. Siten ilmaus "ilmentämistason määrittäminen", "geeninilmentämisprofiilin valmistaminen" ja muut sen kaltaiset ilmaukset, kun niitä käytetään erottavasti ilmennettyjen nukleiinihappojen yhteydessä, tarkoittaa, että havainnoidaan transkriptitasoja ja/tai erottavasti koodattujen nukleiinihappojen koodaaman 17 « proteiinin tasoja. Määritettäessä ilmentämistaso taso voidaan määrittää kvalitatiivisesti mutta tavallisesti se määritetään kvantitatiivisesti.

Tässä esitettyyn sekvenssitietoon perustuen tässä kuvattaviin ja alalla tunnettuihin 5 nukleiinihappo- ja proteiinihavainnointimenetelmiin kytkettynä voidaan näiden geenien ilmentämistasot määrittää helposti. Jos määritetään transkriptitasoja, ne voidaan määrittää rutiinimenetelmiä käyttämällä. Tässä annettua sekvenssitietoa (esim. GenBank-sekvenssiviennit) voidaan esimerkiksi käyttää nukleiinihappokoettimien muodostamiseksi käyttämällä tavanomaisia menetelmiä, kuten erilaisia hybridisaatiohavainnointimenetelmiä 10 (esim. Northem-blotteja). Vaihtoehtoisesti annettua sekvenssitietoa voidaan käyttää alukkeiden muodostamiseksi, joita alukkeita vuorostaan käytetään näytteessä läsnä olevien, erottavasti ilmennettyjen nukleiinihappojen monistamiseksi ja havainnoimiseksi (esim. kvantitatiiviset RT-PCR-menetelmät). Jos sen sijaan ilmentämistä havainnoidaan proteiinitasolla, koodattua proteiinia voidaan havainnoida ja mahdollisesti sen määrä 15 määrittää käyttämällä mitä tahansa j oukosta vakiintuneita tekniikoita. Eräs tavallinen lähestymistapa on käyttää vasta-aineita, jotka sitoutuvat immunomääritysmenetelmissä spesifisesti proteiinituotteeseen. Lisäyksityiskohtia koskien menetelmiä erottavan geeni-ilmentämisen toteuttamiseksi annetaan alla.

20 Ilmentämistasoja voidaan havainnoida yhdellä, joillakin tai kaikilla erottavasti ilmennetyillä nukleiinihapoilla, joita luetellaan yhdessä tai useammassa taulukoista. Joillakin menetelmillä määritetään ilmentämistasoja vain 1, 2, 3,4 tai 5 erottavasti ilmennetylle nukleiinihapolle. Muissa menetelmissä määritetään ilmentämistasoja vähintään 6, 7, 8, 9 tai 10 erottavasti ilmennetylle nukleiinihapolle. Vielä muissa 25 menetelmissä määritetään ilmentämistasoja vähintään 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 tai 60 erottavasti ilmennetylle nukleiinihapolle. Vielä muissa menetelmissä määritetään kaikki yhdessä tai useammassa taulukoista olevat erottavasti ilmennetyt geenit.

Ilmentämistasojen määrittäminen suoritetaan tyypillisesti testisolupopulaatiosta otetulla 30 testinäytteellä. Tässä käytetty termi "populaatio" käytettynä solun yhteydessä voi tarkoittaa yhtä solua mutta tyypillisesti se viittaa suureen määrään soluja (esim, kudosnäyte). Tiettyjä seulontamenetelmiä suoritetaan testisoluilla, jotka "kykenevät ilmentämään" yhtä tai useampaa erottavasti ilmennettyä nukleiinihappoa. Kuten tässä yhteydessä on käytetty, 18 ilmaus "kykenee ilmentämään" tarkoittaa, että kiinnostava geeni on ehjässä muodossa ja sitä voidaan ilmentää solussa.

Joukko annettavia menetelmiä käsittää "testisolussa" olevien tiettyjen, erottavasti 5 ilmennettyjen nukleiinihappojen ilmentämistasojen vertailun "kontrollisolussa" (jota kutsutaan joskus "kontrollinäytteeksi", "vertailusoluksi", "vertailuarvoksi" tai yksinkertaiseksi "kontrolliksi") olevien samojen nukleiinihappojen ilmentämistasojen kanssa. Muut menetelmät käsittävät vertailun yhden ilmentämisprofiilin ja perustason ilmentämisprofiilin välillä. Kummassakin tapauksessa kontrollisolun ilmentämistaso tai 10 perustason ilmentämisprofiili osoittaa oleellisesti perustason, jota vastaan kokeellista arvoa verrataan. Ilmentämistasojen vertailu tarkoitetaan tulkittavaksi laajasti, mitä tulee siihen, mitä tarkoitetaan: 1) termillä "solu", 2) ajalla, jossa testi-ja kontrollisolujen ilmentämistasot määritetään ja 3) mitä tulee ilmentämistasojen mittaan.

15 Siten vaikka esimerkiksi termiä "testisolu" ja "kontrollisolu" käytetään mukavuuden vuoksi, termi "solu" tarkoitetaan tulkittavaksi laajasti. Solu voi esimerkiksi viitata solujen populaatioon (esim. kudosnäyte), aivan kuin solujen populaatiolla voi olla yksi ainoa jäsen. Solu voi olla joissakin tapauksissa näyte, joka on johdettu solusta (esim. solulysaatista, homogenaatista tai solufraktiosta). Yleisesti näytteitä voidaan hankkia eri lähteistä, 20 erityisesti keuhkosyövistä tai keuhkosyövästä tai keuhkosyövän riskistä kärsivien yksilöiden ruumiinnesteistä.

Mitä tulee ajoitukseen, ilmentämistasojen vertailu voidaan suorittaa samanaikaisesti (esim. testi-ja kontrollisolu saatetaan kumpikin kosketukseen testiaineen kanssa rinnakkaisissa 25 reaktioissa). Vertailu voidaan vaihtoehtoisesti toimittaa ilmentämistasoilla, jotka on määritetty ajallisesti erillisinä aikoina. Kontrollisolun ilmentämistasoja voidaan esimerkkiksi kerätä ennen testisolun ilmentämistasoja ja säilyttää tulevaa käyttöä varten (esim. ilmentämistasot säilytettynä tietokoneelle yhteensopivassa varastointivälineessä).

30 Kontrollisolun ilmentämistaso tai perustason ilmentämisprofiili (esim. perustason arvo) voi olla yhden solun arvo tai se voi olla keskiarvo, keskimäärä tai muu tilastollinen arvo, joka on määritetty suurelle määrälle soluja. Kontrollisolun ilmentämistaso voi esimerkiksi olla kohteiden poulaation ilmentämistasojen keskiarvo. Muissa tapauksissa kontrollisolun kunkin ilmentämistason arvo on arvojen alueella, joka on tyypillinen nimenomaisella 19 populaatiolla havaitulle alueelle. Ilmentämistason arvot voivat olla myös joko kvalitatiivisia tai kvantitatiivisia. Ilmentämistasojen arvot voidaan myös mahdollisesti normalisoida sellaisen nukleiinihapon ilmentämistason suhteen, joka ei ole analyysin kohteena olevia markkereita.

5

Joissakin menetelmissä tarvittava vertaileva analyysi käsittää sen määrittämisen, ovatko ilmentämistason arvot "vertailukelpoisia" (tai "samanlaisia") tai "eroavatko" ne toisistaan. Joissakin tapauksissa tietyn markkerin ilmentämistasoja testi- ja kontrollisoluissa pidetään samanlaisina, jos ne eroavat toisistaan enintään koevirheen tasolla. Usein ilmentämistasoja 10 pidetään kuitenkin samanlaisina, jos testisolun taso eroaa alle 5 %, 10 %, 20 %, 50 %, 100 %, 150 % tai 200 % suhteessa kontrollisoluun. Siten seuraa, että joissakin tapauksissa tietyn markkerin ilmentämistason testisolussa katsotaan eroavan saman markkerin ilmentämistasosta kontrollisolussa, jos ero on suurempi kuin koevirheen taso tai jos se on suurempi kuin 5 %, 10 %, 20 %, 50 %, 100 %, 150 % tai 200 %. Joissakin menetelmissä 15 vertailu käsittää sen määrittämisen, onko markkerin ilmentämistasossa testi- ja kontrollisoluissa "tilastollisesti merkitsevää eroa". Eron katsotaan tavallisesti olevan "tilastollisesti merkitsevä", jos havaitun, sattumalta esiintyvän eron todennäköisyys (p-arvo) on vähemmän kuin jokin ennaltamääritetty taso. Tässä käytetty "tilastollisesti merkitsevä ero" viittaa p-arvoon, joka on < 0,05, edullisesti < 0,01 ja edullisimmin < 0,001. 20 Jos geenin ilmentäminen lisääntyy riittävästi siten, että se on erilainen (kuten juuri on määritelty) suhteessa kontrollisoluun tai perustasoon, tuon geenin ilmentämisen katsotaan olevan "säädelty ylöspäin" tai "lisääntynyt". Jos sen sijaan geenin ilmentäminen vähentyy siten, että se eroaa kontrollisolun tai pemstason arvosta, tuon geenin ilmentäminen on "säädelty alaspäin" tai "vähentynyt".

25

Ilmentämistasojen vertailu testi- ja kontrollisolujen välillä voi käsittää yhden markkerin tai suuren markkerien määrän (esim, kun vertaillaan ilmentämisprofiileja) tasojen vertailun. Kun yhden markkerin ilmentämistaso määritetään, se ovatko ilmentämistasot testi- ja kontrollisolun välillä samanlaisia vai erilaisia, käsittää yhden markkerin ilmentämistason 30 vertailun. Kun monen markkerin ilmentämistasoja verrataan, vertailuanalyysi voi kuitenkin käsittää kaksi analyysiä: 1) kullakin tutkittavalla markkerilla sen määrittämisen, onko ilmentämistaso samanlainen testi-ja kontrollisolujen välillä ja 2) määrityksen, kuinka monta markkeria tutkittavien markkerien ryhmästä osoittaa samanlaisia tai erilaisia ilmentämistasoja. Ensimmäinen määritys suoritetaan, kuten juuri on kuvattu. Toinen 20 määritys käsittää tyypillisesti sen määrittämisen, osoittaako vähintään 50 % tutkittavista markkereista samanlaisuutta ilmentämistasoissa. Menetelmissä, joissa vaaditaan tiukempia korrelaatioita, vähintään 60 %:n, 70 %:n, 80 %:n, 90 %:n, 95 %:n tai 100 %:n markkereista täytyy kuitenkin osoittaa samanlaisia ilmentämistasoja tutkittavien 5 markkerien ryhmän ilmentämistasoilla, joiden katsotaan olevan samanlaisia testi- ja kontrollisolujen välillä.

B. Seulontamenetelmät 10 1. Tyypillisiä lähestymistapoja

Muutosten seuraaminen geenin ilmentämisessä voi saada aikaan tiettyjä etuja lääkeseulonnan ja -kehityksen aikana. Usein lääkkeitä esiseulotaan kyvyn suhteen toimia vuorovaikutuksessa tärkeimmän kohteen kanssa huolimatta muista vaikutuksista, joita 15 lääkkeillä on soluihin. Usein tällaiset muut vaikutukset aiheuttavat toksisuutta koko eläimessä, mikä estää mahdollisen lääkkeen kehittämisen ja käytön. Nämä yleismuutokset geenin ilmentämisessä antavat käyttöön käyttökelpoisia markkereita diagnostisiin, ennustaviin ja ehkäiseviin käyttöihin sekä markkereita, joita voidaan käyttää sairauden tilojen, sairauden etenemisen ja lääkeaineenvaihdunnan seuraamiseksi. Siten nämä geenien 20 ilmentämisprofiilit antavat käyttöön molekulaarisia työkaluja lääkkeen toksisuuden, lääkkeen tehokkuuden ja sairauden seuraamisen arvioimiseksi.

Ilmentämisprotiilin muutoksia perustason profiilista (esim. aineisto taulukossa 5) voidaan käyttää tällaisten vaikutusten osoituksena. Alan ammattilaiset voivat käyttää mitä tahansa 25 monista eri tunnetuista tekniikoista esillä olevassa hakemuksessa tunnistetun yhden tai useamman geenin ja/tai geenifragmentin ilmentämisen arvioimiseksi muutosten havaitsemiseksi kiinnostavan solun tai näytteen ilmentämisprofiilissa. Ilmentämisaineiston vertailun sekä saatavan sekvenssi- tai muun tiedon voi suorittaa tutkija tai diagnostikko, tai se voidaan suorittaa tietokoneen ja tietokantojen avulla.

30

Joissakin seulontamenetelmissä yhdisteitä ja molekyylejä seulotaan niiden tunnistamiseksi, jotka vaikuttavat kohdegeenin tai kohdegeenin ilmentämisen säätelyyn osallistuvan jonkin muun geenin (esim. toimimalla vuorovaikutuksessa kohdegeenin säätelyalueen tai transkriptiotekijöiden kanssa) ilmentämiseen. Yhdisteitä voidaan seuloa myös niiden 2i tunnistamiseksi, jotka vaikuttavat tällaisten proteiinien aktiivisuuteen (esim. inhiboimalla kohdegeenin aktiivisuutta) tai kohdegeenin säätelyyn osallistuvan molekyylin aktiivisuuteen.

5 Siten joissakin menetelmissä mahdollisia lääkeyhdisteitä esimerkiksi seulotaan sen määrittämiseksi, muuttaako yhdisteen käyttö yhden tai useamman tässä tunnistetun kohdegeenin ilmentämistä. Tämä voi olla hyödyllistä esimerkiksi määritettäessä, onko tietty yhdiste tehokas asbestiin liittyvän keuhkosyövän tai asbestin välittämän muun sairauden hoidossa. Tapauksessa, jossa mahdollinen lääkeyhdiste vaikuttaa geenin 10 ilmentämiseen asbestialtistuksesta kärsivässä solussa, yhdiste viittaa asbestiin liittyvän keuhkosyövän tai muun asbestin välittämän sairauden hoitoon. Samalla tavoin lääkeyhdiste, joka aiheuttaa asbestialtistuksesta kärsivässä solussa normaalisti alaspäin säädellyn geenin ilmentämistä, voi viitata samojen sairauksien hoitoon.

15 Esillä olevan keksinnön mukaisesti taulukossa 5 lueteltuja kohdegeenejä voidaan käyttää myös markkereina ehdokas lääkkeen tai -aineen vaikutusten asbestialtistuksesta kärsivälle solulle arvioimiseksi. Ehdokaslääke tai -aine voidaan seuloa kyvyn suhteen stimuloida nimenomaisen markkerin tai markkerien (lääkkeen kohteiden) transkriptiota tai ilmentämistä tai säädellä alaspäin tai inhiboida markkerin tai markkerien transkriptiota tai 20 ilmentämistä. Esillä olevan keksinnön mukaisesti voidaan myös verrata lääkkeen vaikutusten spesifisyyttä katsomalla lääkkeen vaikuttamien markkerien lukumäärää ja vertaamalla niitä eri lääkkeen vaikuttamien markkerien lukumäärään. Spesifisempi lääke vaikuttaa harvempiin transkriptionaalisiin kohteisiin. Kahdelle lääkkeelle tunnistetut samanlaiset markkerien yhdistelmät osoittavat vaikutuksessa samanlaisuutta.

25

Taulukossa 5 olevien yhden tai useamman geenin koodaaman proteiinin (proteiinien) tasoja, konsentraatiota tai vähintään yhtä aktiivisuutta moduloivien aineiden tunnistamiseksi suunnitellaan joitakin menetelmiä. Tällaiset menetelmät tai määritykset voivat käyttää hyödyksi mitä tahansa keinoja halutun aktiivisuuden seuraamiseksi tai 30 havainnoimiseksi. Määrityksiä ja seulontoja voidaan käyttää sellaisten yhdisteiden tunnistamiseksi, jotka ovat kohdegeenin ilmentämisen tai aktiivisuuden tehokkaita aktivaattoreita tai inhibiittoreita. Määrityksiä ja seulontoja voidaan suorittaa molekyylien fysikaalisella valinnalla kirjastoista ja yhdisteiden digitaalisten mallien 22 tietokonewtailuilla molekulaarisista kirjastoista ja kohdegeenin tuotteen (eli proteiinin) aktiivisen kohdan digitaalisella mallilla.

Määrityksissä ja seulonnoissa tunnistetut aktivaattorit tai inhibiittorit voivat vaikuttaa, 5 mutta eivät rajoitu niihin, sitoutumalla kohdegeenin tuotteeseen, sitoutumalla intrasellulaarisiin proteiineihin, jotka sitoutuvat kohdegeenin tuotteeseen, yhdisteisiin, jotka häiritsevät vuorovaikutusta kohdegeenin tuotteen ja sen substraattien välillä, yhdisteisiin, jotka moduloivat kohdegeenin aktiivisuutta, tai yhdisteisiin, jotka moduloivat kohdegeenin tai kohdegeenin tuotteen ilmentämistä.

10 Määrityksiä voidaan käyttää myös sellaisten molekyylien tunnistamiseksi, jotka sitoutuvat kohdegeenin säätelysekvensseihin (esim. promoottorisekvenssit) moduloiden siten geenin ilmentämistä. Katso esim. Platt (1994), J. Biol. Chem., 269:28 558 - 28 562.

15 2. Menetelmät erottavan geeni-ilmentämisen havainnoimiseksi Määritykset taulukossa 5 määritellyn markkerin tai markkerien ilmentämisen seuraamiseksi voivat käyttää hyödyksi mitä tahansa saatavana olevia keinoja kohdegeenien ilmentämistason muutosten suhteen seuraamiseksi. Kuten tässä on käytetty, aineen 20 sanotaan moduloivan kohdegeenin ilmentämistä, jos se kykenee säätelemään kohdegeenin ilmentämistä ylöspäin tai alaspäin asbestialtistuksesta kärsivässä solussa. Tässä tunnistettujen geenien koodaamat proteiinituotteet voidaan määrittää myös ilmentämisen määrän määrittämiseksi. Voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää, joka on tarkoitettu spesifisen proteiinin tai mRNA:n tai DNA:n tuotteen mittaamiseen spesifisesti ja 25 kvantitatiivisesti. Keksinnön mukaiset menetelmät ja määritykset käyttävät kuitenkin tyypillisesti hyödyksi PCR:ään tai sirun tai mikrosirun hybridisaatioon perustuvia menetelmiä, kun yritetään havainnoida geenien suuren joukon ilmentämistä.

Geenejä, joiden tunnistetaan olevan erottavasti ilmennettyjä asbestialtistuksesta kärsivässä 30 solussa, voidaan käyttää monissa eri nukleiinihappojen havainnointimäärityksissä nimenomaisessa näytteessä olevan geenin tai monien geenien ilmentämistason havainnoimiseksi tai määrän määrittämiseksi. Geenin ilmentämistasojen havainnoimiseksi voidaan käyttää esimerkiksi perinteistä Northem-blottausta, dot-blotteja, nukleaasisuojausta, RT-PCR:ää, erottavia display-menetelmiä, subtraktiivista 23 hybridisaatiota ja in situ -hybridisaatiota. mRNA:n ilmentämisen tasoja voidaan seurata suoraan koettimien hvbridisaatiolla keksinnön mukaisiin nukleiinihappoihin. Jos geenin säätely ylöspäin tai alaspäin vaikuttaa proteiinitasoihin, proteiineja voidaan mitata kaikilla saatavilla menetelmillä, esimerkiksi Westem-blottauksella, ELISAdlaja 5 immunohistokemialla. Katso esim. Sambrook et ai., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Alan ammattilainen ymmärtää, että valtava joukko sirumalleja on sopivia tämän keksinnön mukaiseen käytäntöön. Korkeatiheyksinen siru sisältää tavallisesti joukon koettimia, jotka 10 hybridisoituvat spesifisesti kiinnostaviin sekvensseihin. Katso WO 99/32660 menetelmien suhteen, joissa valmistetaan koettimia tietylle geenille tai geeneille. Lisäksi edullisessa suoritusmuodossa siru sisältää yhden tai useamman kontrollikoettimen.

C. Diagnostiset menetelmät 15 Käyttöön annetaan myös menetelmiä sen määrittämiseksi, onko keuhkosyövästä kärsivällä kohteella asbestiin liittyvä keuhkosyöpä. Nämä menetelmät käsittävät tavallisesti näytteen hankkimisen kohteelta, jolla on tai epäillään olevan keuhkosyöpä ja/tai jonka tiedetään tai epäillään altistuneen asbestille.

20

Esillä olevan keksinnön mukainen diagnostinen menetelmä tunnistaa tehokkaasti asbestialtistukseen liittyviä keuhkosyöpiä. Edullinen menetelmä käsittää vaiheet, joissa otetaan keuhkosyöpäsolujen näyte, joka on otettu keuhkosyövästä kärsivältä yksilöltä, ja havainnoidaan asbestiin liittyvälle syövälle luonteenomainen alleeliepätasapainon (AI) 25 tyyppi vähintään yhdestä seuraavista keuhkosyöpäsolujen kromosomaalisista alueista (katso taulukkoa 3 ja taulukkoa 6): a) 19pl 3.3-pl 2; b) 9q32-34.3; 30 c) 2p21 -p 16.3; d) 16pl 3.3;ja e) 22q 12.3-q 13.1.

24

Asbestiin liittyvä AI voi ulottua näitä alueita kauemmaksi. Kuten kokeellisessa osassa on esitetty, tunnusomaisen alleeliepätasapainon (AI) läsnäolo vähintään yhdessä mainituista alueista viittaa siihen, että keuhkosyöpäsolun pahanlaatuisuus liittyy asbestialtistukseen. AI:n läsnäolo kahdessa, kolmessa, neljässä tai kaikissa mainituista alueista vahvistaa 5 asbestin välittämien tekijöiden merkityksen syövän kehittymisessä.

Edullisesti alleeliepätasapaino määritetään kromosomaalisesta alueesta 19p 13.3-p 12, jota seuraavat kromosomaaliset alueet 9q32-34.2 ja 2p21-pl6.3.

10 Jos AI esiintyy keuhkosyöpätapauksessa kaikissa kolmessa edellä mainitussa alueessa, tällä tapauksella on 90 %:n todennäköisyys olla asbestiin liittyvä syöpä. Jos AI ei esiinny missään näistä alueista, keuhkosyöpätapauksella on 98 %:n todennäköisyys, ettei se ole asbestin aiheuttama.

15 Kuten taulukossa 7 on esitetty, AI:n läsnäolo kromosomaalisessa alueessa 19pl3.3-pl2 voidaan määrittää seuraavien mikrosatelliittimarkkerien käytöllä: 19S814, 19S883, 19S878, 19S424, 19S894, 19S216, 19S177, 19S1034, 19S873, 19S884, 19S916, 19S583, 19S535, 19S906, 19S221, 19S840, 19S917, 19S895 ja 19S568 tai minkä tahansa muun tämän alueen polymorfisen markkerin käytöllä. AI:tä 19pl3.3-pl2:ssa voidaan käyttää yksinään 20 keuhkosyövän asbestiyhteydelle tarkoitettuna markkerina 65 %:n todennköisyydellä (taulukko 7).

Alleeliepätasapaino (AI) voidaan määrittää monilla eri tavoilla riippuen epätasapainon luonteesta eli asbestiin liittyvän tai asbestiin liittymättömän keuhkosyövän voitosta tai 25 tappiosta. Edullisia menetelmiä määritykseen ovat esim. siruteknologiat, heterotsygoottisuuden menetys (LOH) -analyysit, fluoresenssi in situ -hybridisaatio (FISH) -teknologia ja kvantitatiivinen PCR jne. Koska AI voi olla esimerkiksi tietyn kromosomaalisen alueen vain yhden kopion ero tuumori- ja normaalien solujen välillä, AI:n havainnointi syöpäsoluista voi vaatia syöpäsolujen lasermikrodissektiota näytteessä 30 olevan normaalien solujen kontaminaation välttämiseksi. Lasermikrodissektiota ei tarvita, jos AI, kromosomaalisen materiaalin deleetio tai monistuminen määritetään FISH-teknologialla syöpäsoluja sisältävistä kudosleikkeistä. Spesifisiä siruja, esim. oligo- tai SNP-siruja voidaan suunnitella kromosomaalisille alueille, jotka erottavat asbestiin liittyvät keuhkosyövät niistä keuhkosyövistä, joilla ei ole asbestia aiheuttavana tekijänä.

25

Lisäksi yksittäisten tai monien geenien ilmentämistasoa sekä AI:tä voidaan käyttää asbestin havainnoimiseksi keuhkosyöpätapauksen aiheuttavana tekijänä. Testisolujen populaatio valitaan sisältämään kohteesta olevia keuhkosyöpäsoluja. Geenin (geenien) 5 ilmentämistasoa verrataan sitten edullisesti kontrollinäytteessä olevan saman geenin (geenien) ilmentämistason kanssa. Kontrollinäytteen tilanne, mitä tulee keuhkosyövän läsnäoloon tai poissaoloon, tunnetaan edullisesti (kontrollinäyte on esim. yksilöstä, joka ei kärsi keuhkosyövästä mutta on altistunut asbestille, tai on edullisesti yksilöstä, joka kärsii keuhkosyövästä mutta ei ole altistunut asbestille). Siten esimerkiksi jos kontrollisolu 10 edustaa soluja yksilöstä, joka kärsii keuhkosyövästä mutta ei ole altistunut asbestille, silloin samanlaisuus ilmentämistasossa tai ilmentämisprofiilissa testi-ja kontrollinäytteiden välillä osoittaa, että kohteella ei ole asbestiin liittyvää sairautta. Ero ilmentämistasossa tai -profiilissa sitä vastoin voi viitata siihen, että kohteella, josta testinäyte oli johdettu, on asbestiin liittyvä sairaus.

15 20 VII. Laitteet erottuvasti ilmennettyjen nukleiinihappojen havainnoimiseksi A. Räätälöidyt koetinsirut 1. Koettimet erottavasti ilmennetyille geeneille 25

Erottavasti ilmennettyjä, käyttöön annettuja geenejä voidaan käyttää hyödyksi mittatilauskoetinsirujen valmistamiseksi seulonnassa ja diagnostisissa sovelluksissa käytettäväksi. Yleisesti tällaiset sirut sisältävät koettimia, kuten sellaisia, joita on kuvattu edellä kappaleessa erottavasti ilmennetyistä nukleiinihapoista, ja sisältävät siten koettimia, 30 26 jotka ovat komplementaarisia täysipituisiile, erottavasi! ilmennetyille nukleiinihapoille (esim. cDNA-sirut), ja lyhyempiä koettimia, jotka ovat tyypillisesti 10 - 30 nukleotidia pitkiä (esim. syntetisoidut sirut). Tyypillisesti sirut sisältävät koettimia, jotka kykenevät havainnoimaan suuren määrän keksinnön mukaisia, erottavasti ilmennettyjä geenejä.

5 Tällaiset sirut esimerkiksi sisältävät yleensä koettimia vähintään 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 tai 10 erottavasti ilmennetyn nukleiinihapon havainnoimiseksi. Täydellisempään analyysiin sirut voivat sisältää koettimia vähintään 12, 14, 16, 18 tai 20 erottavasti ilmennetyn nukleiinihapon havainnoimiseksi. Vielä muissa tapauksissa sirut sisältävät koettimia vähintään 25, 30, 35, 40, 45 tai kaikkien tässä tunnistettujen, erottavasti ilmennettyjen 10 nukleiinihappojen havainnoimiseksi.

2. KontroUikoettimet (a) Normalisointikontrollit 15

Normalisointikontrollikoettimet ovat tyypillisesti täysin komplementaarisia nukleiinihapponäytteeseen lisättyihin yhteen tai useampaan leimattuun vertailupolynukleotidiin nähden. Normalisointikontrolleista hybridisaation jälkeen saadut signaalit antavat käyttöön kontrollin hybridisaatio-olosuhteissa, leiman voimakkuudessa, 20 luku- ja analysointitehokkuudessa ja muissa tekijöissä oleville vaihteluille, jotka voivat aiheuttaa täydellisen hybridisaation signaalin vaihtelemisen sirujen välillä. Kaikista muista sirun koettimista luetut signaalit (esim. fluoresenssin voimakkuus) voidaan jakaa kontro Uiko ettimi en signaaleilla (esim. fluoresenssin voimakkuus) normalisoiden siten mittaukset.

25 Käytännöllisesti katsoen mikä tahansa koetin voi toimia normalisointikontrollina. Hybridisaatiotehokkuus voi kuitenkin vaihdella emäskoostumuksen ja koettimen pituuden mukana. Normalisointikoettimet voidaan valita sirussa läsnä olevien muiden koettimien keskimääräisen pituuden heijastamiseksi. Ne voidaan kuitenkin valita myös kattamaan 30 valikoima pituuksia. Normalisointikontrolli(t) voidaan valita myös sirun muiden koettimien (keskimääräisen) emäskoostumuksen heijastamiseksi. Normalisointikoettimet voidaan sijoittaa mihin tahansa sirun asemaan tai moniin asemiin läpi sirun spatiaalisen vaihtelun kontrolloimiseksi tehokkaasti hybridisaatiossa.

27 (b) Yhteensopimattomuuskontrollit

Voidaan antaa käyttöön myös yhteensopimattomuuskontrollikoettimia; sellaiset koettimet toimivat kuten ilmentämistason kontrollit tai normalisointikontrollit.

5 Yhteensopimattomuuskontrollikoettimia käytetään tyypillisesti räätälöidyissä siruissa, jotka sisältävät tunnettuihin mRNA-lajeihin yhteensovitettuja koettimia. Tietyt sirut sisältävät esimerkiksi yhteensopimattomuuskoettimen, joka vastaa kutakin yhteensopivuuskoetinta. Yhteensopimattomuuskoetin on sama kuin sitä vastaava yhteensopivuuskoetin lukuun ottamatta vähintään yhtä yhteensopimattomuusasemaa.

10 Yhteensopimaton emäs on emäs, joka on valittu siten, että se ei ole komplementaarinen vastaavaan emäkseen nähden kohdesekvenssissä, johon koetin voi muuten hybridisoitua spesifisesti. Yksi tai useampia yhteensopimattomuuksia on valittu siten, että tarkoituksenmukaisissa hybridisaatio-olosuhteissa (esim. ankarissa olosuhteissa) testi- tai kontrollikoettimen voidaan odottaa hybridisoituvan kohdesekvenssiinsä mutta 15 yhteensopimattomuuskoetin ei voi hybridisoitua (tai voi hybridisoitua merkittävästi vähemmässä määrin). Yhteensopimattomuuskoettimet voivat sisältää keskisen yhteensopimattomuuden. Siten esimerkiksi kun koetin on 20-meeri, vastaavalla yhteensopimattomuuskoettimella voi olla identtinen sekvenssi lukuun ottamatta yhden emäksen yhteensopimattomuutta (esim. käyttämällä G:tä, C:tä tai T:tä A:n asemesta) missä 20 tahansa asemista 6-14 (keskinen yhteensopimattomuus).

(c) Näytteen valmistus, monistus ja määränmäärityskontrollit

Sirut voivat sisältää myös näytteen valmistuksen/monistuksen kontrollikoettimia. Tällaiset 25 koettimet voivat olla komplementaarisia valittujen kontrolligeenien alasekvensseihin nähden, koska niitä ei normaalisti esiinny määritettävän nimenomaisen biologisen näytteen nukleiinihapoissa. Sopivia näytteen valmistuksen/monistuksen kontrollikoettimia voivat olla esimerkiksi koettimet bakteeri geeneille (esim. Bio B), jolloin kyseinen näyte on eukaryootista oleva biologinen näyte.

30 RNA-näytteeseen voidaan sitten lisätä ennen käsittelyä tunnettu määrä nukleiinihappoa, jolle näytteen valmistuksen/monistuksen kontrollikoetin on komplementaarinen. Näytteen valmistuksen/monistuksen kontrollikoettimen hybridisaation määrän määrittäminen antaa käyttöön käsittelyvaiheiden aiheuttaman nukleiinihappojen runsauden muutoksen mitan.

28 Määränmäärityskontrollit ovat samanlaisia. Tyypillisesti tällaiset kontrollit käsittävät kontrollinukleiinihapon yhdistämisen ennen hybridisaatiota näytenukleiinihapon (-happojen) kanssa tunnettuna määränä. Ne ovat käyttökelpoisia kvantitatiivisen vertailukohdan antamiseksi ja sallivat standardikäyrän määrittämisen hybridisaatiomäärien 5 (konsentraatioiden) määrittämiseksi.

3. Sirusynteesi

Nukleiinihapposiruja esillä olevassa keksinnössä käytettäväksi voidaan valmistaa kahdella 10 yleisellä tavalla. Eräs lähestymistapa käsittää genomi- tai cDNA-kirjastoista olevan DNA:msitomisen jonkin tyyppiseen kiinteään alustaan, esimerkiksi lasiin. [Katso esim. Meier-Ewart, et ai, Nature 361:375 - 376 (1993); Nguyen, C. et ai, Genomics 29:207 -216 (1995); Zhao, N. et ai, Gene, 158:207 - 213 (1995); Takahashi, N., et ai,

Gene: 164:219 - 227 (1995); Schena, et ai, Science 270:467 - 470 (1995); Southern et ai, 15 Nature Genetics Supplement 21:5 -9 (1999); ja Cheung, et ai, Nature Genetics Supplement 21:15 - 19 (1999), joista kukin sisällytetään tähän viitteeksi kokonaisuudessaan kaikkiin tarkoituksiin.)

Toinen yleinen lähestymistapa käsittää nukleiinihappokoettimien synteesin. Eräs 20 menetelmä käsittää koettimien synteesin tavallisten automatisoitujen tekniikoiden mukaisesti ja sen jälkeen synteesin jälkeisen koettimien kiinnittämisen alustaan. Katso esimerkiksi Beaucage, Tetrahedron Lett., 22:1 859 - 1 862 (1981) jaNeedham-VanDevanter et ai, Nucleic Acids Res., 12:6 159 - 6 168 (1984), joista kukin sisällytetään tähän viitteeksi kokonaisuudessaan. Toinen laaja kategoria on niin kutsuttu "spatiaalisesti 25 ohjatun" polynukleotidisynteesin lähestymistapa. Menetelmät, jotka osuvat tähän kategoriaan, sisältävät lisäksi, valaisun eikä rajoittamisen vuoksi, valon ohjaaman polynukleotidisynteesin, mikrolitografian, mustesuihkusovelluksen, mikrokanavasijoittamisen spesifisiin kohtiin ja eristämisen fysikaalisilla esteillä.

30 Valon ohjaamia yhdistelmämenetelmiä nukleiinihappokoettimien valmistamiseksi kuvataan US-patenteissa nro 5 143 854 ja 5 424 186 ja 5 744 305; PCT-patenttijulkaisuissa nro WO 90/15070 ja 92/10092; EP 476 014; Fodor et ai, Science 251:767 - 777 (1991); .Fodor et ai, Nature 364:555 - 556 (1993); ja Lipshutz, et ai, Nature Genetics Supplement 21:20 - 24 (1999), joista kukin sisällytetään tähän viitteeksi kokonaisuudessaan. Nämä 29 menetelmät vaativat valon: käyttöä polynukleotidikoettimien synteesin ohjaamiseksi korkeatiheyksisissä, pienennetyissä siruissa. Algoritmeja maskien suunnitteluun synteesisyklien lukumäärän vähentämiseksi kuvaavat Hubbel et ai., US 5 571 639 ja US 5 593 839jaFodor et ai, Science 251:767 - 777 (1991), joista kukin sisällytetään 5 tähän viitteeksi kokonaisuudessaan.

Muita yhdistelmämenetelmiä, joita voidaan käyttää sirujen valmistamiseksi esillä olevassa keksinnössä käytettäväksi, ovat reagenssien täplittäminen alustalle käyttämällä mustesuihkukirjoittimia. Katso Pease et ai., EP 728 520 ja Blanchard, et ai, Biosensors 10 and Bioelectronics 11:687 - 690 (1996), jotka sisällytetään tähän viitteeksi kokonaisuudessaan. Siruja voidaan syntetisoida myös käyttämällä hyödyksi yhdistelmäkemiaa käyttämällä hyödyksi mekaanisesti rajoitettuja virtausteitä tai mikrokanavia monomeerien jakamiseksi alustan soluihin. Katso Winkler et ai., EP 624 059; WO 93/09668; ja US-pat. nro 5 885 837, joista kukin sisällytetääntähän viitteeksi 15 kokonaisuudessaan.

4. Sirualustat

Alustoja voidaan valmistaa millä tahansa joukosta materiaaleja, jotka kykenevät 20 kannattamaan suurta määrää koettimia ja olemaan yhteensopivia ankaruuspesuliuosten kanssa. Esimerkkejä sopivista materiaaleista ovat esimerkiksi lasi, pii, muovi, nailon tai nitroselluloosa. Alustat ovat tavallisesti jäykkiä ja niillä on tasomainen rakenne. Alustoissa on tyypillisesti 1 - 10 000 000 erillistä, spatiaalisesti kohdistettavaa aluetta tai solua. Alustat, joissa on 10 - 1 000 000 tai 100 - 100 000 tai 1 000 - 100 000 aluetta, ovat yleisiä. 25 Solujen tiheys on tyypillisesti vähintään 1 000, 10 000, 100 000 tai 1 000 000 aluetta neliösenttimetrillä. Kukin solu sisältää vähintään yhden koettimen; useammin erilaiset solut sisältävät monia koettimia. Yleensä kukin solu sisältää yhden tyyppisen koettimen vähintään sellaisena puhtausasteena, joka on saatavissa synteesimenetelmillä, vaikka muissa tapauksissa jotkut tai kaikki soluista sisältävät erityyppisiä koettimia. Sirumallin 30 lisäkuvaus esitetään julkaisuissa WO 95/11995, EP 717 113 ja WO 97/29212, jotka sisällytetään viitteeksi kokonaisuudessaan.

VIII, Reagenssipakkaukset 30 Käyttöön annetaan myös reagenssipakkauksia, jotka sisältävät komponentteja, jotka ovat välttämättömiä keksinnön mukaisten seulonta-ja diagnostisten menetelmien toteuttamiseksi. Jotkut reagenssipakkaukset sisältävät tyypillisesti suuren määrän koettimia, jotka hybridisoituvat ankarissa olosuhteissa annettuihin erilaisiin, erottavasti 5 ilmennettyihin nukleiinihappoihin. Muut reagenssipakkaukset sisältävät suuren määrän erilaisia alukepareja kunkin parin ollessa valikoitu panemaan tehokkaasti alkuun erilaisen, erottavasti ilmennetyn nukleiinihapon monistamisen. Tapauksessa, jossa reagenssipakkaus sisältää koettimia kvantitatiivisessa RT-PCR:ssä käytettäväksi, koettimet voidaan leimata tarvittavilla donori- ja akseptoriväreillä tai ne voidaan sisällyttää reagenssipakkaukseen 10 erillisinä komponentteina käytettäväksi leimattujen koettimien valmistuksessa.

Reagenssipakkaukset voivat sisältää monistusreaktioiden toimittamiseksi myös entsyymejä, kuten erilaisia polymeraaseja (esim. RT ja Taq), sekä deoksinukleotideja ja puskureita. Tiettyihin reagenssipakkauksiin voidaan sisällyttää myös soluja, jotka kykenevät 15 ilmentämään yhtä tai useampaa keksinnön mukaista, erottavasti ilmennettyä nukleiinihappoa. Tyypillisesti reagenssipakkauksen erilaisia komponentteja säilytetään erillisissä säiliöissä. Yleisesti sisällytetään myös ohjeita komponenttien käyttöön analyysin toimittamiseksi.

20 Seuraavat esimerkit tarjotaan annettujen menetelmien ja laitteiden tiettyjen näkökohtien valaisemiseksi; pitäisi ymmärtää, että näiden esimerkkien ei tule tulkita rajoittavan patenttivaatimuksissa esitettyä keksintöä.

KOKEELLINEN OSA 25

Esimerkki 1

Materiaalit ja menetelmät 30 Potilaat: Analysoimme kopiolukuprofiilit 14 pahanlaatuisesta keuhkotuumorista asbestille suuresti altistuneista ja 14 yhteen sovitetusta tuumorista altistumattomista yksilöistä, jotka oli sovitettu yhteen iän, sukupuolen, kansallisuuden ja tupakointihistorian suhteen (taulukko 1). Asbestialtistus arvioitiin työhistoriasta, joka saatiin henkilökohtaisilla haastatteluilla. Lisäksi asbestikuitulukema mitattiin keuhkokudoksen 31 elektronimikroskooppisella analyysillä (Karjalainen 1993). Altistunut ryhmä koostui henkilöistä, joilla oli selvä todennäköinen altistus työhistorian mukaan ja joiden pulmonaalinen asbestikuitulukema oli korkeampi kuin 5 miljoonaa kuitua/g kuivapainoa. Asbestikuitukonsentraation 2 - 5 miljoonaa ajatellaan edustavan karkeasti kaksinkertaisesti 5 lisääntynyttä keuhkosyövän riskiä asbestialtistuksesta johtuen (Karjalainen 1994, Consensus report).

Analysoimme 11 (5 altistunutta/6 altistumatonta) adenokarsinoomaa (AC), 8 (4 altistunutta/4 altistumatonta) levyepiteelikarsinoomaa (SCC), 5 (3 altistunutta/2 10 altistumatonta) suurisoluista keuhkokarsinoomaa (LCLC) ja 2 (1 altistunut/1 altistumaton) adenolevyepiteelikarsinoomaa (AC/SCC) ja pienisoluista keuhkosyöpää (SCLC) kumpaakin.

Kudosnäytteet; Kudosnäytteet hankittiin tuumorikeuhkoleesion kirurgisen operaation 15 aikana. Pakastetut tuumorinäytteet leikattiin 4 pm:n leikkeiksi DNA-eristystä varten ja tuumorin solupitoisuuden (> 50 %:n vaatimus) varmistamiseksi käytettävää tavallista hematoksyliini-ja eosiinivärjäystä varten. DNA eristettiin tuumori-ja vertailu (perifeeristä verta kahdelta miesluovuttajalta) -näytteistä QIAamp DNA Mini -reagenssipakkauksella (QIAGEN®, Valencia, CA).

20

Klassinen CGH: Klassinen CGH suoritettiin kaikilla 28 tuumorinäytteellä julkaisun Björkvist et ai. (1998) mukaisesti. Lyhyesti, hybridisaatioihin käytettiin 1 μ g digestoitua ja leimattua vertailu (TexasRed-5-dUTP ja -dCTP)- ja tuumori (FITC-5-dUTP ja -dCTP) -DNA:ta (NEN™ Life Science Products Inc., Boston, MA). Objektilasit hybridisoitiin yön 25 yli 37 °C:ssa ja pestiin tavallisten käytäntöjen mukaisesti. Analyysiin käytettiin

MetaSystemsin (MetaSystems GmbH, Altlussheim, Saksa) CGH-ohjelmaa, Isis (versio 3). Käytettiin tavallisia kynnysarvon katkaisurajoja, deleetioille < 0,85, monistumisille > 1,17 ja korkean tason monistumisille > 1,5, kuten on kuvattu julkaisussa Björkqvist et ai. (1998).

30 Siru-CGH: Siru-CGH-analyysit toimitettiin 20 yksittäisellä näytteellä (11 altistunutta ja 9 altrstumatonta, taulukko 1). Kaupallisia cDNA-mikrosiruja (Human 1.0; Agilent Technologies, Palo Alto, CA), jossa oli 12 814 ainutkertaista kloonia (97 % kartoittuu nimettyihin ihmisen geeneihin), käytettiin, kuten on kuvattu julkaisussa Wikman et ai. (2005). Lyhyesti, hybridisaatiot suoritettiin 5 pg:lla digestoitua (25 U Alul/25 U Rsal) 32 vertailu-ja tuumori-DNA.ta, jotka oli leimattu (Cy3 dUTP-tuumori, Cy5 dUTP-vertailu; Amersham FJ harmaa ia Biotech, Piscataway, NJ, USA) random priming -menetelmällä (RadPrime DNA Labelling System, Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Yön yli 65 °C:ssa suoritetun hybridisaation jälkeen objektilasit pestiin, kuivattiin sentrifugissa ja luettiin 5 Agilentin DNA Microarray Scanner -laitteella (G2565AA).

Aineiston käsittely: Raakasignaalin voimakkuudet saatiin siruista käyttämällä Feature Extraction -ohjelmistoa (Agilent Technologies). Mittaukset, jotka Feature Extraction -ohjelmisto liputti epäluotettavina, poistettiin myöhemmästä analyysistä. Lisäksi poistettiin 10 mittaukset, jotka määriteltiin virheellisiksi omilla kuva-analyysimenetelmillämme. Kuva-analyysimme virheellisten mittaustäplien havainnoimiseksi suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu (Ruosaari & Hollmen 2002), paitsi että täplän edusta-ja tausta-alueet saatiin kullekin täpläpikselin ympäristölle suoritetun kahden Gaussin jakauman sovittamisen tuloksena käyttämällä odotusarvo-maksimointi (EM) -algoritmia. Tässä tutkimuksessa 15 myöhempään analyysiin sisällytettyjen täplien laatuarviointikriteerit olivat seuraavat: 1) täplän koko oli suurempi kuin 15 pikseliä, 2) edustan ja taustan pikselien mediaanien voimakkuusero oli vähintään 50 ja 3) paikallisen taustan mediaaniarvo oli alle 170. Nämä laatuarvioinnin kynnysarvot saatiin muodostamalla ensin vastaavat jakaumat asiantuntijan leimaamille hyville ja virheellisille harjoitustäplille. Parametrit valittiin harjoitustäplien 20 väärinluokittelun (virheelliset täplät luokiteltu virheellisiksi ja virheelliset täplät luokiteltu hyviksi) todennäköisyyden minimoimiseksi. Suodatuksen jälkeen oikea signaali, jolla oli geenilokuksen informaatio, voitiin saada 7 730 - 9 071 siruissa olevalle geenille. Kaikille siruille normalisoitiin yhtä suuri varianssi ja keskimääräiset Log2-signaalisuhteet.

25 Bioinformatiikka-analyysi: Altistukseen liittyvien poikkeamien tunnistamiseksi yksittäisten potilaiden siru-CGH-aineisto analysoitiin ryhmätasolla vertaamalla altistuneiden ja altistumattomien potilaiden tuumorien geenikopiolukuja. Altistukseen liittyvien alueiden tunnistus suoritettiin käyttämällä 0,5 - 1 Mbp:n päällekkäin meneviä segmenttejä. Ensiksi aineisto järjestettiin geenien kromosomaalisen sijainnin mukaisesti.

30 Seuraavaksi kussakin segmentissä olevat geenit havainnoitiin ja oikein luokiteltujen asbestille altistuneiden ja altistumattomien potilaiden lukumäärä laskettiin.

Altistukseen liittyvät poikkeavat alueet tunnistettiin hypoteesin testauksen avulla. Kaksisuuntaisessa testauksessa nollahypoteesi asetettiin seuraavasti: "segmentin 33 luokittelukyky ei ole poikkeava" ja vaihtoehtoinen hypoteesi: "segmentin luokittelukyky on poikkeava". Kussakin segmentissä olevilla geeneillä oikein luokiteltujen potilaiden lukumäärää käytettiin testin tunnuslukuna. Alueet, jotka ovat todennäköisesti yhteydessä altistukseen, havaittiin permutaatiotestillä 10 000 permutaatiolla käyttämällä 5 permutaatiojakauman empiirisiä prosenttipisteitä 2,5 ja 97,5. Alueet, jotka sisälsivät alle 5 geeniä, suodatettiin pois.

Tulokset ja pohdinta 10 Klassinen CGH: Klassisella CGHdla havaittiin tyypillisiä poikkeamien kuvioita keuhkosyövän erilaisille histologisille tyypeille SCLCdlä ollessa eniten poikkeamia altistukseen katsomatta (taulukko 2) (ajantasainen CGH-tietokanta, saatavissa: http://www.helsinki.fi/cmg/cgh_data.html). Havaitsimme klassisella CGHdla yleensä enemmän lisäyksiä kuin menetyksiä johtuen luultavasti tosiasiasta, että emme käyttäneet 15 mikrodissektoitua materiaalia. Tavallisimmat muutokset kaikilla potilailla olivat lisäykset seuraavissa: Iq23-q24 (46 %), lq41 (64 %), 2p23 (39 %), 3q22-q23 (39 %), 5pl4-pl5.1 (39 %), 7pl4 (25 %), 8q24.1 (53 %) ja 20ql3.1-ql3.2 (68 %) ja menetykset seuraavissa: 9p23-p24 (14 %) ja 5q (7 %).

20 Kun verrataan erilaisia histologisia tyyppejä, kaikilla tyypeillä SCC:tä lukuun ottamatta oli hieman enemmän poikkeamia altistuneessa ryhmässä (poikkeamien keskiarvoluku altistuneessa ryhmässä 6,7 ja altistumattomassa ryhmässä 3,2 kaikissa histologisissa tyypeissä lukuun ottamatta SCC:tä). SCC-tuumoreilla oli enemmän poikkeamia altistumattomien kuin altistuneiden potilaiden näytteissä johtuen kahdesta näytteestä, 25 joissa toisessa oli 13 ja toisessa 23 poikkeamaa. Yksi ainoa monistuminen, joka näytti eroavan merkittävästi klassisessa CGH:ssa asbestille altituneen ja altistumattoman ryhmän välillä, oli vähäinen päällekkäin menevä alue 2p23:ssa. Tämä monistuminen oli läsnä 57 %:ssa (8/14 tapausta) altistuneiden ja 14 %:ssa (2/14 tapausta) altistumattomien potilaiden näytteistä (p = 0,025). Monistuminen sisälsi seitsemässä kahdeksasta altistuneesta 30 tapauksesta myös 2p22:n ja neljässä tapauksessa 2p21:n.

Siru-CGH: Koska emme havainneet 2p:n monistumista lukuun ottamatta mitään selviä muutoksia, jotka erosivat näiden kahden ryhmän välillä klassisessa CGH:ssa, valitsimme siru-CGH-tulostemme analysoimisen ryhmätasolla vertaamalla signaalin log-suhteita 34 segmenteissä. Tämän tyyppinen analyysi ei vaadi poikkeamien tyypin ennakkotietoa yksittäisistä potilaista. Erityisesti tämän tyyppisissä vertailevissa tutkimuksissa, jolloin on tarkoitus havainnoida tiettyyn tekijään liittyviä muutoksia, tilastollisen menetelmän valintamme on suotuisa johtuen synergeettisistä syistä. Poikkeamien tunnistaminen 5 yhdestä siruaineistosta erikseen on myös mahdollista, mutta pieniä muutoksia ei voida havaita johtuen sirujen taustahäiriöstä. Lisäksi kun verrataan useaa kopiolukuaineistoa samanaikaisesti, voidaan havaita pieniä muutoksia, jotka ovat yhteisiä potilaiden ryhmälle, ja merkittäviä alhaisen kopioluvun muutoksia.

10 Tämän tyyppistä yhdistettyä tilastollista analyysiä siru-CGH:lle käyttämällä havaitsimme 18 aluetta (Ip36.12-p36.ll, lq21.2, 2p21-pl6.3, 3p21.31, 4q31.21, 5q35.2-q35.3, 9q32, 9q33.3-34.11, 9q34.13-q34.3, 11ρ15.5, 1 Iql2.3-ql3.1, llql3.2, 14ql 1.2, 16pl3.3, 17pl3.3-pl3.1, 19pl3.3-pl3.11, 22ql2.3-ql3.1 ja Xq28), jotka erosivat merkittävästi kopioluvultaan näiden kahden ryhmän välillä (taulukko 3). Kuten klassisen CGH:n 15 aineistosta on odotettua, mikään näistä alueista ei sisältänyt korkean kopioluvun muutosta vaan joko alhaisen tason lisäyksen tai deleetion. Yhdistetyn analyysin käytön valinta ei kuitenkaan ehkä kompensoi täysin normaalin solun kontaminaation aiheuttamaa sirujen häiriötä. Siten on mahdollisuus, että esimerkiksi lisäys yhdessä potilaiden ryhmässä tulkitaan väärin menetykseksi toisessa ryhmässä. Lisäksi jotkut näistä lokuksista näyttivät 20 olevan sekä monistuneita yhdessä ryhmässä että deletoituneita toisessa.

Useimmat lokukset olivat hyvin pieniä (mediaanikoko 1,76 Mbp) suurimman esiintyessä 19pl3.3-pl3.1:ssä (18.53 Mbp). Kaksi alueista, 17p ja 19p, olivat tarpeeksi suuria (6,96 Mbp ja 18,53 Mbp) havainnoitaviksi klassisella CGHdla, kun taas loput alueet käsittivät 25 0,9 - 3,75 Mbp:tä, joka on tavallisesti liian pieni havainnoitavaksi klassisella CGHdla (Forzan et ai., 1997). Klassisella CGHdla ei kuitenkaan havaittu näitä kahta suurempaa aluetta. Tämä menetelmä ei ehkä havainnut näitä menetysalueita normaalien solujen kontaminaation vuoksi, jolle klassisen CGH:n tuloksemme näyttivät olevan herkempiä. Lisäksi nämä alueet sekä alue 16p (3.14 Mbp) ovat klassisessa CGH:ssa niin kutsuttuja 30 ongelmallisia alueita, jotka antavat usein vääriä positiivisia tai negatiivisia tuloksia hybridisaatioartefakteista johtuen (el-Rifai et ai, 1997). Näiden molempien alueiden LOH-analyysit ovat todellakin osoittaneet, että keuhkotuumorit sisältävät usein alleeliepätasapainon näissä lokuksissa (Girard et ai, 2000). LOH:n on myös raportoitu 35 vaikuttavaa alueeseen 9q34 (3,75 Mbp) keuhkosyövässä (Suzuki et ak, 1998) ja se on ongelmallinen alue myös CGH:ssa (Larramendy et ai, 1998).

On mielenkiintoista, että lisäys 2p:ssä näytti oleva spesifinen altistuneelle ryhmälle sekä 5 sirun että klassisen CGH:n tuloksiin perustuen. Hieman yllättävästi kuitenkin vähäinen päällekkäin menevä alue klassisessa CGH:ssa oli 2p23, kun taas 2p21 havaittiin muuttuneeksi siru-CGH:ssa. Klassisella CGH:lla 2p23:n lisäys oli kuitenkin useimmissa tapauksissa suurempi ja 50 %:ssa tapauksista se sisälsi 2p21:n. Tämä aika suuri alue voisi siten olla kohteena lisätutkimukselle, sillä ihmisen 2p21-25:lle homologisen alueen on 10 aikaisemmin raportoitu monistuvan radonilla indusoiduissa rotan keuhkotuumoreissa (Dano et ak, 2000). Muuten 2p-monistumisia on kuvattu harvoin NSCLC:ssä. Samalla tavoin alueen 14ql 1.2 ei ole koskaan tietääksemme raportoitu muuttuneen keuhkosyövässä, mutta sen on otaksuttu olevan osallisena kromosomaalisissa poikkeamissa (inversioissa ja translokaatioissa) pitkittyneelle, matalan annosnopeuden 60Co-gammasäteilytykselle 15 altistuneen väestön verinäytteissä (Hsieh et ak, 2002). Tämä voisi olla kiinnostavaa ottaen huomioon, että säteilytys voisi aiheuttaa asbestiin nähden samanlaisia poikkeamia ROS:n tuoton välityksellä (Leach et ak, 2001).

Monen merkittävistä alueista, joiden on havaittu erottavan nämä kaksi ryhmää, osallisuus 20 keuhkokarsinogeneesissä yleisesti on paljastettu aikaisemmin, mukaan lukien 1ρ36.1, lq21.2, 3p21.31, 4q31.21, 5q35.2-q35.3, 9q34, llpl5.5, 17pl3.3, 19pl3 ja 22ql3 (http://www.helsinki.fi/cmg/cgh_data.html). Aikaisempi raportti on kuitenkin osoittanut asbestialtistuksen olevan merkittävästi yhteydessä 3p21-LOH:iin (Marsit, 2004). Asbestikuidut osallistuvat myös in vitro pääasiassa katkojen aiheuttamiseen kromosomiin 25 1 ja 9 (Dopp & Schiffmann, 1998; Lohani et ak, 2002).

Kromosomaalisissa käsivarsissa 4q ja 22q olevien alueiden on raportoitu olevan tavallisesti hävinneitä myös mesotelioomassa (Björkqvist et ak, 1998; De Rienzo, 2000), joka on hyvin läheisesti asbestialtistukseen kytketty syöpätyyppi. Samalla tavoin 1 lql3.1 30 sisältää FOSL1 (Fra-1) -geenin, jonka on raportoitu olevan säädelty ylöspäin transformoituneissa mesoteelisoluissa asbestialtistuksen jälkeen (Shukla et ak, 2004).

Ihmisgenomissa on 125 lueteltua haurasta kohtaa, ja 11 näistä sattuu tuloksissamme yhteen 18 mahdollisesti asbestiin liittyvän alueen kanssa (p = 0,08) (taulukko 3). Hauraat kohdat 36 ovat ennalta määräytyviä kromosomaalisia katkosalucita, jotka voidaan osoittaa kokeellisesti kohdespesifisinä aukkoina tai katkoina metafaasin kromosomeissa replikatiivisen rasituksen olosuhteissa. Ne tunnetaan geneettisen epästabiilisuuden kromosomaalisena ilmentämisenä ja niiden on siten esitetty näyttelevän roolia syövässä.

5 Esimerkiksi FHIT-geeni FRA3B:ssä (3pl4.2) on usein vaurioitunut tuumoreissa ja toimii oletettavasti tuumorisuppressorina (Glover, 1998) kuten myös FRA16D (Finnis et ai., 2005). Lisäksi kohdunkaulasyövässä on tunnistettu äskettäin 1 lql3.2:ssa 700 kb:n deleetio sisältäen hauraan kohdan FRA11 A. Tämä 700 kb:n alue sijaitsee myös lähes kokonaan alueessamme (Chr 11:65 886 588 - 67 191 050 bp) (Zainabadi et ah, 2005). Hauraat 10 kohdat on kuitenkin enimmäkseen kartoitettu G-raidoitusmenetelmien mukaisesti, emmekä voi päätellä korkeammalla erotuskyvyllä, ovatko alueemme täsmälleen samoja kuin hauraiden kohtien alueet, lukuun ottamatta 1 lql3.2:ta.

Johtopäätöksenä mahdollisten poikkeamien paljastamiseksi siruaineistosta 15 asbestialtistukseen liittyen valitsimme aineistoanalyysin suorittamisen käyttämällä yhdistettyä siruaineistosarjaa. Tätä menetelmää käyttämällä voimme havaita ensimmäistä kertaa useita, enimmäkseen pieniä kromosomaalisia alueita, jotka poikkesivat DNA-kopioluvultaan näiden potilaiden keuhkosyöpien kahden ryhmän välillä. Poikkeamat olivat joko alhaisen kopioluvun lisäyksiä tai menetyksiä, joissa ei ollut korkean kopioluvun 20 monistumisia. Aikaisemmat tutkimukset ovat paljastaneet, että tupakointi tekee solujen geneettisestä järjestelmästä haavoittuvampia asbestin haitallisille vaikutuksille (26, 27). Tämä näyttö on sopusoinnussa klassisen CGH:n tulostemme kanssa, joissa havaittiin yleisesti samat monimutkaiset poikkeamien kuviot molemmissa ryhmissä altistuneessa ryhmässä ollessa juuri hieman enemmän poikkeamia. Lisäksi siru-CGH-tuloksemme 25 osoittivat, että monet näistä kohdista sattuivat yhteen hauraiden kohtien kanssa, mikä viittasi siihen, että tupakointi ja asbestikuidut voivat aiheuttaa valikoivasti poikkeamia hauraissa kohdissa. Lopuksi, raportoimme ensimmäistä kertaa asbestialtistukseen liittyviä geenin kopioluvun poikkeamia. Analyysin lisävarmistamista esimerkiksi ilmentämisaineistoa käyttämällä tarvitaan sen osoittamiseksi, ovatko nämä alueet spesifisiä 30 ja sisältävätkö ne otaksuttuja kohdegeenejä.

Esimerkki 2

Materiaalit ja menetelmät 37

Potit as ma teriaa l i

Kaikki potilaat olivat alkuperältään suomalaisia valkoihoisia miehiä, joilla oli histologisesti varmistettu primäärinen keuhkosyöpä eikä aikaisempia pahanlaatuisuuksia.

5 Näytteet geeninilmentämisanalyysiin koostuivat keuhkotuumorin ja vastaavista normaalin keuhkon näytteistä 14 suuresti asbestille altistuneesta ja 14 altistumattomasta potilaasta (taulukko 4). Myöhemmissä fragmenttianalyyseissä alleeliepätasapainon suhteen analysoitiin 15 lisätuumoria altistumattomista potilaista ja 8 tuumoria potilaista, joilla oli ammattialtistus asbestille (kohtalaisen altistuksen ryhmä) (taulukko 4). Kaikki tuumorit 10 luokiteltiin viimeisimmän WHO-luokituksen mukaisesti.

Yksityiskohtainen informaatio potilaiden työhistoriasta sekä heidän tupakointitavoistaan ja eloonjäämisaineistostaan kiijattiin. Asbestialtistuksen taso arvioitiin sekä työhistorian avulla että pulmonaalisen asbestikuitukonsentraation mittauksella 15 pyyhkäisyelektronimikroskoopilla, jossa on energiadispersiivinen spektrometri (Karjalainen et ai., 1993). Raskaan altistuksen ryhmään sisällytettiin vain potilaita, joilla oli selvä tai todennäköinen ammattialtistus asbestille (Karjalainen et ai., 1993) ja yli 5 miljoonaa kuituja kuivan keuhkokudoksen grammaa kohti. Potilaat, joiden konsentraatio oli 1 - 5 miljoonaa kuitua grammaa kohti, luokiteltiin kohtalaisesti altistuneiksi. Vähintään 20 1 miljoonaa kuitua kuivan keuhkokudoksen grammaa kohti pidetään tavallisesti merkkinä ammattialtistuksesta asbestille (Karjalainen et ai., 1993). Keuhkosyövän kaksinkertainen riski on yhteydessä kuitutasoihin 2 - 5 miljoonaa kuivan keuhkon grammaa kohti (Karjalainen et ai., 1994; Consensus report, 1997).

25 Kaikkia potilaita haastateltiin henkilökohtaisesti ja heidän suostumuksensa tutkimukseen osallistumiseen ja kudoksensa käyttöön hankittiin. Työterveys- ja -turvallisuustutkimuksen eettinen toimikunta, Helsingin ja Uudenmaan sairaanhoitopiiri, on hyväksynyt tutkimuskäytännön (75/E2/2001).

30 cDNA-mikrosirut RNA eristettiin Ultraspec™ RNA -eristysj ärjeste! mäl 1 ä tuumorista ja viereisestä normaalista perifeerisestä keuhkokudoksesta kullakin potilaalla, kuten on kuvattu (Wikman, 2002). Kukin tuumorinäyte leikattiin jääleikemikrotomissa ja kunkin näytteen tuumorisisältö varmistettiin HE-värjäyksellä. Vain näytteet, joissa oli yli 50 % 38 tuumorisoluja, valittiin analyysiin. Alkueristyksen jälkeen RNA puhdistettiin edelleen Qiagen RNase Minikit -pylväspuhdistnksella. RNA:n laatu arvioitiin 2100 Bioanalyzer -laitteella (RNA Nano Labchip, Agilent Technologies, Palo Alto, CA) ja määrä määritettiin spektrofotometrillä.

5

Geeninilmentämisprofilointi toimitettiin käyttämällä Affymetrixin HUI33A GeneChip:eillä (Affymetrix, Santa Clara, CA) 6 pg:lla kokonais-RNA:ta. RNA konvertoitiin cDNA:ksi yhden syklin cDNA-synteesireagenssipakkauksella (Invitrogene, Carlsbad, CA), puhdistettiin ja konvertoitiin leimatuksi cRNA:ksi (Enzo, Farmingdale, NY) 10 Affymetrixin suositusten mukaisesti. Fragmentoitua cRNA:ta hybridisoitiin 16 tuntia. Objektilasien pesu, värjäys ja kartoitus suoritettiin Affymetrixin standardikäytäntöjen mukaisesti. Hybridisaatiot Affymetrix-mikrosiruilla toteutettiin kunkin 28 potilaan tuumorin ja normaalin keuhkon RNA-näytteillä.

15 Geeninilmentämisaineiston aineistoanalyysi

Kaikki objektilasit skaalattiin arvoon 100. Tuumorimikrosirut skaalattiin niiden yhteen sovitettujen normaalin keuhkon mikrosirujen suhteen. Kolmella tapauksella, joilla normaalin keuhkon tulos puuttui, käytettiin vertailuna sen sijaan samasta altistusryhmästä olevien näytteiden keskiarvosignaalia. Geenit, jotka olivat läsnä (Affymetrix- p-arvo < 20 0,04) vähintään kolmanneksessa altistuneista tai altistumattomista näytteistä, sisällytettiin analyyseihin. Seuraavaksi aineisto log2-transformoitiin ja Lowess-normalisoitiin.

Kaksivaiheista analyysimallia käytettiin erottavasti ilmennettyjen geenien havainnoimiseksi ja pienimmän geenien yhdistelmän tunnistamiseksi, joka voisi erottaa 25 altistuneen ryhmän altistumattomasta ryhmästä. Käytimme ohjattua luokittelumenetelmää, joka on samanlainen kuin van't Veerin et ai. (van't Veer, 2002) kuvaama. Ensimmäiseksi vaiheeksi valittiin AUROC (ROC) -analyysimalli (Kettunen, 2004) kahden altistusryhmän samanlaisesta koosta johtuen. Geenit, joiden ROC-arvot olivat suuremmat kuin 0,4 tai pienemmät kum 0,6 ja p-arvo pienempi kuin 0,4, sisällytettiin myöhempiin analyyseihin.

30

Toisessa vaiheessa laskettiin kullekin geenille korrelaatiokerroin geeni-ilmentämiselle ja altistustilalle (asbestille altistunut vastaan altistumaton). Koska olimme ensijaisesti kiinnostuneita eroista asbestille altistuneiden ja altistumattomien potilaiden tuumorien välillä minimoidaksemme vaihtelun vaikutuksen geeni-ilmentämisessä normaalin 39 keuhkokudoksen yksittäisten näytteiden välillä, aineisto skaalattiin uudelleen ennen korrelaatioanalyysin toimittamista. Asbestille altistuneiden ja altistumattomien tuumorien välisten erojen korostamiseksi asbestiin liittyvien tuumorien signaalit skaalattiin liittymättömien tuumorien mediaanisignaalin avulla ja liittymättömien tuumorien signaalit 5 asbestiin liittyvien tuumorien mediaanisignaalin avulla.

Geenit järjestettiin järjestysluvun mukaan korrelaatiokertoimen absoluuttisen arvon mukaisesti. Tuumorien oikeaan luokitteluun tarvittavien geenien lukumäärän optimoimiseksi geenit lisättiin peräkkäin niiden järjestysluvun mukaan ja oikein 10 luokitelujen potilaiden lukumäärä määritettiin. Ristiinvalidointiin käytettiin "yksi pois" -menetelmää.

Yhdistetyn geeninilmentämis- ja DNA. n kopiolukuaineiston analyysi Olemme kuvanneet myös asbestille altistuneiden vastaan altistumattomien potilaiden 15 keuhko tuumori en poikkeama (monistumiset ja deleetiot) -profiilit siru-CGH-analyysillä (katso esimerkkiä 1). Altistukseen liityvien alueiden määrittelemiseksi edelleen yhdistimme esillä olevassa tutkimuksessa samoilta potilailta olevien tuumorien geeninilmentämis- ja kopiolukuprofiilit.

20 Altistukseen liittyviä muutoksia sisältävien kromosomaalisten alueiden tunnistus suoritettiin vertaamalla altistuneiden geeninilmentämissuhteita altistumattomiin 0,5-1 Mbp:n päällekkäin menevissä segmenteissä. Erottavat alueet tunnistettiin hypoteesin testauksen avulla. Kunkin geenin geeni-ilmentämisellä oikein luokiteltujen potilaiden lukumäärä laskettiin ja testitunnuslukuna käytettiin segmentin keskimääräistä 25 luokittelukykyä. Tässä analyysissä havaittuja alueita verrattiin alueisiin, joissa havaittiin olevan altistukseen liittyviä kopiolukumuutoksia. Alueita, jotka havaittiin sekä ilmentämisettä kopiolukuaineistoyhdistelmissä, pidettiin huomattavan kiinnostavina.

Fragmenttianälyysi alleeliepätasapainon havainnoimiseksi 30

Fragmenttianalyyseissä käytetyt näytteet sisälsivät sekä mikrodissektoituja että ei-mikrodissektoituja DNA-näytteitä. Alkuperäiset 28 tuumorinäytettä suuresti asbestille altistuneista ja altistumattomista potilaista makrodissektoitiin, kun taas mikrodissektiota käytettiin DNA:n hankkimiseksi lisäksi tulevista 23 potilasnäytteestä. Koska 28 40 potilasnäytteestä, joita ei ollut mikrodissektoitu, saatiin epäselviä tuloksia (useilla markkereina piikin korkeuksien suhde tuumori-ja normaaleilla alleeleilla oli lähellä l,5:tä), kokeet kuitenkin toistettiin vastaavalla mikrodissektoidulla materiaalilla.

5 Mikrodissektio suoritettiin käyttämällä Arcturus Veritas -laitetta 9 μ m: n kudosleikkeillä, jotka oli värjätty 1 %:isen toluidiinisinisen ja 0,2 %:isen metyleenisinisen liuoksella. Laser capture -mikrodissektio (LCM) -teknologiaa käytettiin hyödyksi syöpäsolujen keräämiseksi heterogeenisistä tuumorikudoksista, DNA eristettiin käyttämällä PicoPure™ DNA Extraction -reagenssipakkausta (Arcturus) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

10

Kromosomaalisen alueen 19pl3.3-pl2 (chrl9:550811-22287245 bp; 22,29 Mbp) alleelitasapaino määritettiin käyttämällä 19 mikrosatelliittimarkkeria, joiden likimääräinen peitto oli 22 Mbp:tä. FAM:lIa tai HEXdlä pääteleimattuja alukepareja käytettiin 80 - 300 bp:n pituisten di- tai trinukleotiditoistofragmenttien monistamiseksi. Alukesekvenssit 15 markkereille hankittiin National Center for Biotechnology Information -laitoksen tietokannoista ja syntetisoitiin TEB MOLBIOL Syntheselabor GmbH -yhtiössä. Kohdesekvenssit monistettiin PCR:llä 5 μ1:η tai 10 μ1:η tilavuudessa, joka sisälsi kullekin erikseen 200 μΜ dNTP:itä, 700 nM kumpaakin aluketta, 1 x PCR-puskuria, joka sisälsi 15 mM MgC^ta, 0,13 tai 0,25 yksikköä HotStarTaq-DNA-polymeraasia(Qiagen) ja 2,5 - 25 20 ng genomi-DNA:ta. Alkudenaturointivaihetta 10 min 95 °C:ssa seurasi 35 sykliä 95 °C:ssa 40 s, 40 s optimoidussa pariutumislämpötilassa ja 72 °C:ssa 1 min. Sitten PCR-tuotteet analysoitiin 3100-Av ant Genetic Analyzer -laitteella (Applied Biosystems).

Alleeliepätasapainon (AI) määritys suoritettiin heterotsygoottisille markkereille laskemalla 25 tuumori- ja normaalien alleelien piikin korkeuksien suhde. Alleelit määriteltiin kahtena korkeimpana piikkinä odotetussa kokoalueessa. Suhteet, jotka olivat 1,5 tai korkeampia, pisteytettiin ALksi. Mikrosatelliitin epästabiilisuus (MSI) määriteltiin uusien piikkien läsnäololla tuumori-DNA:ssa, joiden piikkien koko erosi normaalista DNA:sta toistoyksiköiden kokonaisluvulla. Lisäksi mononukleotiditoistoa BAT-26 käytettiin sen 30 korrelaation testaamiseksi MSI-fenotyyppi en kanssa keuhkosyövässä. Tätä markkeria on käytetty aikaisemmin sporadisen kolorektaalisen ja mahasyövän korkeatiheyksisen MSI-fenotyypin osoittamiseksi 99,4 - 100 %:n tarkkuudella (Hoang, 1997).

Tulokset 41

Geeninilmentämisprofiilit ROC-analyysi toteutettiin käyttämällä geeninilmentämisaineistoa sellaisten geenien havainnoimiseksi, jotka erottivat parhaimmin 14 suuresti asbestille altistunutta 5 altistumattomista potilaista. Ensimmäiseen ROC-analyysiin sisällytettiin 12 865 geeniä (sisällyttämiskriteeri oli signaalin läsnäolo vähintään kolmasosassa potilaista jommassa kummassa altistusryhmässä). Geenit järjestettiin niiden ROC- ja p-arvojen mukaisesti.

Raaka, ohjaamaton, hierarkinen ryhmittelyalgoritmi, joka perustuu geeneihin, joilla on 10 korkeimmat ROC-arvot (< 0,4 tai > 0,6 ja joiden p-arvo on pienempi kuin 0,4) sallivat meidän ryhmittää 28 tuumoria kahteen ryhmään niiden altistuksen perusteella (aineistoa ei esitetty). Tuumorien selvä jako altistuneisiin ja altistumattomiin tuumoreihin viittasi siihen, että tuumorit voidaan jakaa näihin kahteen tyyppiin noin 6 000 geenitranskriptin perusteella.

15

Seuraavaksi geeni-ilmentämisen korrelaatiokerroin äitistustilan (asbestille altistunut vastaan altistumaton) kanssa laskettiin kullekin geenille. Sen pienimmän geenien yhdistelmän tunnistamiseksi, joka voisi erottaa nämä kaksi tuumoriryhmää, geenit järjestettiin järjestysluvun mukaan korrelaatiokertoimen absoluuttisen arvon mukaisesti.

20 Altistukseen liittyvien geenien tunnistaminen paljasti 47 geeniä, joiden Pearsonin korrelaatiokerroin oli suurempi kuin 0,79 tai pienempi kuin -0,79. Havaitsemme, että vertailun valintamme (asbestiin liittyvien tuumorien mediaanisignaalit skaalattiin liittymättömien tuumorien mediaanisignaaleilla ja päin vastoin) saa aikaan suhteellisen korkean korrelaatiokertoimen, mutta samanlaisia tuloksia saadaan, kun kummankin 25 ryhmän normaalikudoksen mediaanisignaaleja käytettiin vertailuna. 38 geeniä 47 huippugeenistä ovat identtisiä molempia vertailuja käyttämällä. Aineiston satunnaispermutaation jälkeen voitiin havaita vain yksittäisiä geenejä, joilla oli tällainen korrelaatiokertoimen suuruus. Tämän pienen huippugeenien (47) yhdistelmän toiminnallinen selitys ei tuottanut spesifisen toiminnon tai kromosomaalisen sijainnin 30 selvää yliedustusta. Näille 47 geenille saadut hierarkisen ryhmittelyn tulokset esitetään taulukossa 5.

Geeninilmentämisprofiilien yhdistelmä DNA-poikkeamaprofiilien kanssa 42

Altistukseen liittyvien alueiden tunnistaminen ilmentämismuutoksilla paljasti 34 aluetta (alueet 5 Mbp:n sisällä yhdistettiin), joissa asbestille altistuneet potilaat erosivat altistumattomista (aineistoa ei esitetty). Alueiden havainnointi suoritettiin vertaamalla näiden kahden potilasryhmän geeninilmentämisaineistoa toisiinsa 0,5 - 1 Mbp:n 5 segmenteissä samalla tavoin kuin tehtiin CGH-sirulla (katso esimerkkiä 1). Alueet, joissa oli altistukseen liittyviä muutoksia, tunnistettiin permutaatiotestauksen avulla 5 %:n luottamusväleillä. Lokusten tunnistamiseksi sekä altistukseen liittyvän mRNA:n (Affymetrix) että DNA:n tason (CGH-siru) muutoksilla, tulokset näistä kahdesta aineistoanalyysistä yhdistettiin. Kuusi aluetta oli yhteisiä näissä kahdessa analyysissä, 10 nimittäin 2p21 -p 16.3, 3p21.31, 5q35.2-q35.3, 16p 13.3, 19pl3.3.-13.11 ja 22ql2.3-ql3.1 (taulukko 6). Aineisto viittaa siihen, että 2p21 voisi olla monistunut samanaikaisesti altistuneessa ja deletoitunut altistumattomassa potilaiden ryhmässä, kun taas 3p21.3-p21.1, 5q35.3 ja 22q 13.1 näyttävät olevan deletoituneita altistuneessa potilaiden ryhmässä. Suurin merkittävä alue havaittiin kromosomissa 19p 13.3-19p 13.1. Altistuneimmilla potilailla oli 15 geenien deleetion ja alaspäin säätelyä tässä alueessa, kun taas joillakin altistumattomista potilaista oli mahdollista lisäystä.

Fragmenttianalyysi 19pl3.3-12:lla 20 Fragmentti (LOH) -analyysi suoritettiin altistukseen liittyvien muutosten olemassaolon varmistamiseksi kromosomin 19 p-käsivarressa ja poikkeaman laajuuden osoittamiseksi. Käytettiin 19 mikrosatelliittimarkkeria, jotka ulottuivat 22,3 Mbp:n alueelle 19p 13.3-pl2:ssa (taulukko 7). Altistuneista potilaista 79 % (11/14) ja altistumattomista 45 % (13/29) (p = 0,02) havaittiin olevan alleeliepätasapainon (AI) kantajia 19p-alueessa. Lisäksi AI 25 havaittiin 75 %:ssa (6/8) kohtalaisesti altistuneista potilaista (taulukko 7). Potilaat, joilla havaittiin AI, olivat hyvässä sopusoinnussa CGH-sirulla osoitettujen tulosten kanssa. AI-aste yksittäisillä markkereilla oli välillä 50 - 90 % altistuneilla, 40 - 100 % kohtalaisesti altistuneilla ja 20 - 50 % altistumattomilla potilailla (vain informatiiviset markkerit otettu huomioon). Kun keskityttiin eroihin AI:n tiheydessä yksittäisissä markkereissa, havaittiin 30 erottava erottelu tutkitun 19 markkerin välillä. Kromosomaalisten muutosten tiheys oli merkittävästi korkeampi 10/19 markkereista asbestille altistuneiden potilaiden tuumorinäytteissä verrattuna altistumattomiin potilaisiin.

43

Lisäksi 10 %:lla (3/29) altistumattomista potilaista havaittiin olevan mikrosatelliittiepästabiilisuutta (MSI), joka ulottui läpi tutkitun alueen. Kun MSI määritettiin edelleen koolonin MSI-markkerilla BAT-26, kahdella kolmesta tapauksesta (149 ja 62), joilla oli korkea epästabiilisuus yksittäisissä markkereissa, oli epästabiilisuutta 5 myös tässä markkerissa. Lisäksi potilailla 11 ja 143, joilla molemmilla oli yksi MSLtä osoittava markkeri 19p-alueessa, oli epästabiilisuutta myös markkerissa BAT-26,

Pohdinta 10 Selvän käsityksen tuottamiseksi asbestiin liittyvään keuhkosyöpään yhteydessä olevista geeneistä, joista säätely oli poistettu, suoritimme yhdistetyn cDNA-ja CGH-mikrosiruseulonta-analyysin 28 primäärisellä keuhkotuumorilla. Asbestille suuresti altistuneita potilaita verrattiin altistumattomiin keuhkotuumoreihin ja kuvattiin eroja sekä geeninilmentämistasossa että kopiolukumuutoksissa näiden kahden ryhmän välillä. Eräs 15 kiinnostavimmista alueista, 19p, varmistettiin edelleen laajennetulla potilaiden joukolla.

Käytimme kaksivaiheista aineistoanalyysimenettelyä geeninihnentämistuloksille ja havaitsimme 47 geenin sarjan, joka luokitteli potilaat oikein asbestille altistuneeseen ja altistumattomaan ryhmään. Hierarkinen ryhmittelyanalyysi näillä 47 geenillä osoittaa 20 näiden kahden altistusryhmän selvän jakaantumisen. Erottelu on riippumaton histologisesta keuhkosyöpätyypistä. Tämä 47 markkerigeenin sarja sisälsi geenejä, jotka edustavat laajaa valikoimaa toimintoja, joissa mikään yksittäinen reaktiotie ei ole yliedustettuna. Vaikka useat näistä geeneistä ovat tällä hetkellä melko tuntemattomia, aivan muutaman niistä on havaittu olevan muuttunut monissa erilaisissa tuumorityypeissä. 25 Näitä ovat geenit, joiden on havaittu olevan ylöspäin säädeltyjä WFDC2, TDE1 ja SLC6A15 ja alaspäin säädeltyjä RUNX1, ATM}& UVRAG altistuneissa potilaissa. WFD2:vl (HE4) on osoitettu olevan biomarkkeri munasarjakarsinoomalle (Hellström, 2003) ja SLC6A15:n on osoitettu olevan säädelty ylöspäin kolorektaalisessa syövässä (Gupta, 2005). RDRi-geenin on osoitettu olevan säädelty ylöspäin keuhkosyöpäsolulinjoissa (Bossalasco, 30 1999). UVRAG-geenin, joka oli säädelty alaspäin altistuneiden joukossa, osoitettiin äskettäin olevan mutatoitunut koolonsyövässä (Ionov, 2004) kun taas ATM:n tiedetään olevan promoottorihypermetylaation hiljentämä keuhkosyövässä (Safar, 2005). Kun homologisen RUNX3-geenin on osoitettu olevan metylaation alaspäin säätelemä keuhkotuumoreissa (Li, 2004), RUNXl-translokaatioita, -mutaatioita ja -metylaatio on kuvattu pääasiassa erilaisissa leukemioissa mutta äskettäin myös mahasyövässä (Sakakura, 2005; Blyth, 2005).

44

Addusiini - proteiinikinaasi C:n (PKC) substraatti - on ollut yhteydessä asbestialtistukseen.

5 PKC:n signaalitransduktioreaktiotien on esitetty olevan eräs asbestialtistuksen jälkeen aktivoituvista pääviestitysreaktioteistä (Shukla, 2003). Todellakin hiiret, jotka ovat hengittäneet asbestia, osoittavat lisääntynyttä addusiinin ilmentämistä alveolaarityypin il keuhkoepiteelisoluissa (Lounsbury, 2002). Samalla tavoin näiden havaintojen kanssa addusiinin havaittiin olevan säädelty ylöspäin tämän tutkimuksen altistuneiden potilaiden 10 joukossa.

Äskettäinen tutkimus osoitti, että on äärimmäisen vaikeaa havaita stabiileja ja luotettavia molekyyliallekirjoituksia mikrosiruaineistosta jopa silloin, kun aineistosarjat ovat suuria (Michiels, 2005). Olemme siksi tietoisia, että suorittamalla tämäntyyppisen analyysin 15 tuhansilla geeneillä mutta harvoilla potilailla, on suuri mahdollisuus havaita vääriä positiivisia tuloksia. Sen vuoksi, kuten olemme nähneet aikaisemmassa tutkimuksessamme klassisisella ja CGH-siruaineistolla, että keuhkosyöpä voidaan erottaa DNA-kopiolukuprofiiliensa mukaisesti (katso esimerkkiä 1), päätimme tutkia, voitaisiinko nämä spesifiset kromosomaaliset alueet saattaa vastaavuussuhteeseen 20 geeninilmentämismuutosten kanssa. Mahdollisia hyviä markkereita, joilla on biologista merkitystä, ovat ne poikkeamat, joilla on vaikutusta geeni-ilmentämiseen. Todellakin tällä menetelmällä voimme havaita kuusi kromosomaalista aluetta, jotka olivat muuttuneet samanaikaisesti sekä DNA- että RNA-tasolla ja jotka näyttivät olevan spesifisiä toiselle tuumorien ryhmälle. On kiinnostavaa, että neljä alueista näytti olevan deleetioita 25 altistuneessa ryhmässä.

Kromosomin 3p, 5q, 19p ja 22q poikkeamia, joiden havaitsimme olevan merkittävästi yhteydessä asbestialtistukseen, on kaikkia havaittu aikaisemmin keuhkokarsinogeneesissä yleensä. Kuitenkin äskettäin kuvattiin 3p:n menetyksen ja asbestialtistuksen yhteys, mikä 30 osoitti, että vaikka molemmilla ryhmillä todellakin on poikkeamia, 3p:n tiheys on merkittävästi korkeampi altistuneessa ryhmässä (Marsit, 2004). Lisäksi 22q:ssa olevan alueen on raportoitu olevan yleisesti kadonnut mesotelioomassa, syöpätyypissä, joka on hyvin läheisesti kytkeytynyt asbestialtistukseen (De Rienzo, 2000). Kun 2p:n monistumisia on harvoin kuvattu keuhko tuumoreissa, se on osoitettu, sillä ihmisen 2p21- 45 25:lle homologisen alueen on aikaisemmin raportoitu olevan monistunut radonin indusoimissa rotan keuhkotuumoreissa (Dano, 2000). 16p 13.3 sisältää geenin TSC2, johon LOH:n on kuvattu vaikuttavan 29 %:ssa keuhkoadenokarsinoomia (Takamochi, 2004), ja geenin NTHL1, joka on osallisena 8oxoG-korjauksessa ja jolla on osoitettu olevan 5 alhaisempaa ilmentämistä keuhkosyövässä verrattuna normaaliin keuhkokudokseen (Radak, 2005).

Tässä tutkimuksessa varvistettiin lisäksi yhden mahdollisesti asbestiin liittyvistä kromosomaalisista alueista - 19pl3:n - yhteys. 19p:n LOH on yleinen keuhkosyövissä 10 (Sanchez-Cespedes 2001), mutta sen suhdetta asbestistukseen ei ole aikaisemmin tutkittu. Tässä fragmenttianalyysi toteutettiin AI:n osoittamiseksi. Kuten odotettua, kromosomaaliset muutokset eivät rajoittuneet vain altistuneisiin potilaisiin, mutta olivat merkittävästi yleisempiä altistuneilla kuin altistumattomilla (p = 0,02). AI havaittiin 19p 13-alueessa 79 %:lla altistuneista, 75 % :11a kohtalaisesti altistuneista ja 45 %:lla 15 altistumattomista potilaista, mikä osoitti, että altistus näyttää toimivan tämän alueen poikkeaman eduksi. Markkerit, joilla on paras erottelu, ovat levinneet läpi 19p-alueen, mikä osoittaa, että alueessa ei ehkä ole spesifisiä asbestialtistukseen liittyviä kuumia pisteitä vaan mieluumminkin yhteys asbestin ja koko kromosomikäsivarren epätasapainon kanssa.

20

On huomionarvoista, että kaksi geeniä, joiden on aikaisemmin raportoitu olevan inaktivoituneita keuhkosyövässä, sijaitsevat proksimaalisesti joihinkin merkittävimmin erottaviin markkereihin nähden. Inaktivaation mutaatioiden ja markkerin D19S883 vieressä sijaitsevan tuumorisuppressorigeenin STK1 l/LKBl:n LOH:n kautta on havaittu 25 esiintyvän 30 %:ssa sporadisesta keuhkoadenokarsinoomasta (Sanchez-Cespedes, 2002). Lisäksi BRGl/SMARCA4-gemtilä, joka sijaitsee lähellä markkeria D19S906, on viitattu olevan rooli keuhkon tuumorigeneesissä (Medina, 2005). SMARCA4-proteiinin on raportoitu olevan kadonnut noin 10 %:ssa primääristä keuhko tuumoreista (Reisman, 2003).

30 Fragmenttianalyysi ei kuitenkaan erota alleelin lisäyksen ja menetyksen välillä, ja siten muutokset markkereissa voidaan raportoida vain AI:nä. Siru-CGH-tuloksemme kuitenkin viittaavat siihen, että tuumorinäytteiden 19p 13-alueella on sekä menetyksiä että lisäyksiä, lisäyksiä erityisesti altistumattomien potilaiden näytteiden joukossa. Siten esillä olevat tuloksemme voivat aliarvioida tämän alueen yhteyttä altistuksen kanssa. Lisätutkimuksia 46 pitäisi siten toteuttaa esim. kvantitatiivisen PCR:n avulla paremman selkeän käsityksen saamiseksi tässä alueessa esiintyvien muutosten luonteesta. Tällaisten tutkimusten odotetaan vahvistavan 19p-poikkeaman, erityisesti menetyksen, yhteen liittymisen asbestialtistukseen.

5

Johtopäätöksenä, yhdistämällä erilaisia korkean suorituskyvyn menetelmiä osoitamme ensimmäistä kertaa, että asbestin altistamilla keuhkosyöpäpotilailla on selvästi erotettava geeninilmentämisprofiili tiettyjen kromosomaalisten alueiden, kuten 19p:n, ollessa merkittävästi yhteydessä altistukseen.

10

On ymmärrettävää, että tässä kuvatut esimerkit ja suoritusmuodot ovat vain valaisutarkoituksiin ja että sen valossa alan ammattilaisten mieleen tulee erilaisia 15 modifikaatioita tai muutoksia, ja niiden on määrä sisältyä tämän hakemuksen henkeen ja piiriin ja liitteenä olevien patenttivaatimusten suojapiiriin. Kaikki tässä viitatut julkaisut, patentit, patenttihakemukset ja ihmisen genomiaineisto (esim. GenBank-hakunumerot) sisällytetään tähän viitteeksi kokonaisuudessaan kaikkiin tarkoituksiin samassa laajuudessa, kuin kukin yksittäinen julkaisu, patentti, patenttihakemus ja sekvenssiaineisto olisi 20 spesifisesti ja yksittäin osoitettu näin sisällytettäväksi viitteeksi.

47 T aulukot

Taulukko 1. Potilasnäytteet Näyte Sukupuoli Ikä Asbestikuitu* _Tupakointi_ Diagnoosi nro. Ikä- Ikä- sav/päivä PKYT aloitus_lopetus_

Altistuneet potilaat_

1 M 64 72,9 20 33 15 48 AC

2* M 59 12,6 50 105 17 - AC

3* m 59 35,0 20 36 19 55 AC

4* M 65 9,4 10 25 16 - AC

5* M 65 10,8 15 23 20 50 AC

6* M 63 10,8 17 27 16 60 SCC

7* M 62 6,0 30 65 14 57 SCC

8* M 65 5,9 20 32 18 - SCC

9* M 57 6,6 20 36 17 53 SCC

10* M 67 8,4 20 20 36 56 LCLC

lit m 66 19,0 15 35 17 61 LCLC

12* M 58 90 30 65 15 - LCLC

13 M 64 145 20 22 19 43 AC/SCC

14 _M 62_12j8_23 55_14_:_SCLC

keskiarvo_62,6_31,8_22,1_41,4_184__

Altistumattomat potilaat_

Ι5Ϊ M 55 0,0 20 36 19 - AC

16* M 69 0,0 20 47 23 - AC

17 M 70 0,0 15 38 18 68 AC

18* M 65 0,0 20 52 12 - AC

19 M 55 0,1 28 54 16 55 AC

20* M 67 0,0 25 50 27 - AC

21 M 65 0,0 20 47 13 60 SCC

22 M 65 0,0 15 25 30 64 SCC

23* M 50 0,0 20 35 15 - SCC

24 M 64 0,0 20 45 19 - SCC

25t§ M 67 0,0 20 47 19 66 SCC

26* M 71 0,5 35 89 20 - LCLC

27* M 72 0,5 22 36 18 49 LCLC

28* M 41 0,0 25 31 15 40 AC/SCC

29_M_64_0j0_30_66_17_:_SCLC

keskiarvo_64,2_0,08_22,1_47,6_19___.

* miljoonaa kuitua/g kuivaa keuhkokudosta * pakkausvuotta (20 savuketta/päivä) * käytetty siru-CGH:ssa ^ käytetty vain siru-CGH:ssa AC, adenokarsinooma; SCC, levyepiteelikarsinooma; LCLC, suunsoluinen keuhkosyöpä; AC/SCC, adeno-levyepiteelikarsinooma; SCLC, pienisoluinen keuhkosyöpä -w , rN __ __ ~η- <""7 Λ r- Τ — — οο — cn ο- „ cn ^ 1 —' τ>„ γ- c£ ^ Λ . γ-

r~r-, QJ <D

Π 7 $. τ

τ~-1 O' V CN

u 7¾ ο.

:9 fi en cn _Γ -9 rp Η Ν σ^ · cr Ο -W 5 ΓΤ ^°° ^ 1 3 © 3 > — Γ4 ~ <·^ιη ι »>. ϋ c5 ρ ^ CO rn^u- d cn

4) _ρ o rsi ^ CT* r—HI O CT

ΡΛίωο 'ρ< o< ρ- cn cf o — d Q V! O' ro — CT Ό — 3 ?υ U . 2 I ~ ^3 CN Oh '> -p ^ O en CN cr OL ^ ^ ^ 23 '5 7 -7 C\ .7 VO — CN „

S3 7 o d - 7* 7 4 .p- S

<D ΕΛ i „ £) " fCl Vh ^ ^ 7 7; , - 7 T o 7 7, £ 7 ftri ->0 — PL 7 — — cTm JiT —1 2 u §· s s 37 Sao g 2 J 73 - ft ftro ' qhOv £ ^ .« · - . Ti ro ^ ro S 00 ^ 7 —" 9 ε | 7 ^92 «r 3 3 13S 7 2 ft S „ 7 ^ N 3 o S cr « a n σ' 2, Tn - s i) 71 !, JS ft £j S 'm t t~- 7 rn ft 7 ti, ti ft ro „ 00

Sh 7. - 3h7 TTäf ^· Τ' - ft- • 2 ft S GO rt “ ft ^ S ^1

Ti— .52 - cn Tn 2 9 7 00 oj _ο ^ S E Ö rA oi 00 TTo

S- 3 ft 'h ro; Nh ^ NNN

S s I 4 h|ö7 “

me s 73 C— — τΥ7— ovi7hP. 1—1 ftftS

£ I § # £7 SU- 2 h £3U° M - -^7 3u S - S- 3 r 2*ö S u p 4 * ftrA S 7 7 - 7 s Ψ ^ « σ' o — 7 σ-ΰ - » Ji 171¾. n“ .7 h — ro ft ' cö - 3 ft ~ 7 7 3 ft^ft^ro^erft^roft % rA-^ <z> Ö t4 r- i λ cr ^i-tmiNp^^cN. cn cr · · ^ . 23 S .^* ^-h (N CN <N P (N ^ ^ 3o *5 _r rn σ m E~ oi cn ^ cr cn o 5 cr cr ro cu - u o ·2 cr >—i cr ocr exerem ct^n cvria σ' (N cr q*p<oo O e ^ Ai r-H^ r- ^ ^ 2 Σλ

2 S

3-¾ o> a s

° d >,.5 S

S -¾ 2 ITI O N oo 0\ O — (Nro rt 'O t~~ 2SÄ

OO dd ^ X; g — — NN(N (N (N <N CN (N(N

» i" U) o -g—----------------- ----- ’ N ^ f) ^ — <3 'βΚοΓ' oo — U — ό n (N ror- <Nio)73 O ^ ^ r^· dj u <υ £ ^ T ft -j; ö e S °^ — Ό d 5 m 4 cr — ^ Pr^ g oo — 10 n UJ„ & ftO ft^ ω e (O Q V! cn- m-' J2 g >> 7 g S , „ , _s,

Tn ·ρ o r. J- i_t *( O4 lii 3^3 § £ψ Ιέ- d g s “«Ts n 2 r <4- r s|7 d«| ^ iT S2 ^ ^ ^(o· 2 S S| 7 ~ ^ °i r ^ e- S S'^5 t7 (A ^ >4 05S kH hn S cr r- 1 ^ )0,. ^ ^

οα'Β £ΐ 7 w 7 S S' 07 T

g g 2 00 O, ftO ro ft 30 cr 7 M p^7 g^ft „ ftU 7^ “7 7 ^ - ro-7

7 Is .2 "°- SU ^uo Ö "Ur Ms UöT

lid I ”TS7 ftft· 7 <4 7 S 7 rSft- (K _, NO 3 ,w ‘'O vo r^j CN T ,d T1 — CT ι σ .

w 3 ^ -w ftN— NftCpvO oo —1 (N 1 β i rf — zT; 3ci .ti d- .2 ft ft - 7 7 co M r^ft σ' “ 9 n crTr00 S 9 T C e <N O CN cr 7 T ft CN ro rth.— ftiNrod

3 2 g I o'ftl'ftTA ^ σ' τ;7 o' ά σ" CTgj 7 B

C~Bh ?, NN cn . ton CN ^^-^,^^00^7,7 A^ ^ 'm -Ξ, cd en ^ μΛ +j ^ ί ^ ^ ’ί ri in

23 S O Uh ^_j -H- ’—1 C> ,—rt ’—1 Ok _^Γ · ^ jy ' w ' Td* rr (N iS CN -w r*H ^i-L

0 h JS s iT 7T 7S „ S h 7 r S 7 S747B77 g ^ -7 7 tr- I ^ ^ ro; 4 7 7-" 7 ^ ro, 3- - 7 7g n ro r S 5 -K— p — — CN I ro ro T ro — — — rf(N — — rt — ...

C 74 *h *5 ^ H rv) ίη M cr rr , 7 M rs M H p- CN ’—‘(NN CTfNrOfNfN^N ft g Ό h .52^ o cr-2 cr cn S cr cn σ' σ' cr cr cr crroftcrr-ftcrcrcrocNo

• *—e q (jj /\ I ’—1 O4 ’“' '—H '—1 ’—* ,—' OO »—h CO C*7 h—1 ’—1 CT CN CO e—h cN r—h OO e-—< CN O4 CN

g o. 7 3 3 δ a K/ ^ ^ S;

£ O 4) S

eN S 2 ti ϊρ .0-¾^¾ O - NN^·

ro Tf ^ Or-CO CN

”5 cd cv ^ ^ ^OO o 1 s S 7 S Su « -ft O .2 O o O U q ^3 A a ·< GO ft <00

CQ

ON

X ___

—- ,Ξ, CO CO CO

(o' 22 —; C-τ' fE era" X 2 <n +t m N co co ro XX X w- cr 5 ά cr 25-S 3 — E on 3χ

-g χ 3 2 χ ^ ET E" 2 X

« s aöf3-^ 43-43 x χ 4- S -* 43 4- 3 <3 3 N -.- - r X X - X .- - . co 53 <3 CQ < m

:oS 2 -< ix, 0 0X3 — — C* CN O

>2 XX of 10 ON. X -3-, χ cn ?< e 3 ££ 3

X 3¾ ES u, X X X Cox XXX

4S

0 42

SX X

:° 33 5? > o 0 X o

2 E

3 .— <L> X X X Q- X X Eh^oC^n C _,E 2 X E 2 rtcdcJcdE 8 m :g

3 ._, x ϊ s a s ti 1 Sc S

j-H 3 -}- -j- -{- ^~~· + -f- 2 S S H Q P ^ r0

Sr- SScacapaFiSpasssSSSSSSoScfi 0 § £ |S§s|g§s§i§sgsg||l||§||3B a .»g Is 1111 s 1 s .1 s .a s I s -s -s -b x 111 ^ 2 b j

3 I sb^; I

3 a 2^&χχΧίηΧΐΛΧΐΛΧΐΛΧι/Ν£<&&&ΧιηΧο^>'*Γ; t-

^Ph <iS<IOQQSQSQsDaD oi-^<I<l<iIQ niQ-—--—-<! S

X 2 i

x- a S

5 * 3 Eu .2, 2 2 0 3 os CO ω ωΧ M On r~~ CO in CJN — IN — —< Nf CN CN -J3

Xee _< « Tf 01 ΓΊ Γν) <N CN CO CN n CM CN IT) pj S i S X cn <n O E 3 o in 00 ro ^*c2(Nr^of co o O 2 ,χ X X C^ — -N -< -N ~ - ON o M Nf -H — ON w

X X

CO σ3

cd P

0 o _ ft ,2 s ro .2 cd Ä £0 en >n X -Nf co -cf in l> 00 *-> -cf vo »n cocogp,

+J O 5 U On in On Λ N ^ r- X X X X X X X X O0 X X M O

Jj ι4 βΡ d d n 0 x es <n X cd x -xx o no" — ^ S E

§ « S

a on 3 3 [--. i/e c-·- me o —*1 o U ft

2 ce \o in h n O ft 00 O O On ft «NOC^S

H fi 00 Ό CO -1 1—‘ OO ΓΛ me OO 0\ ΌΜΕγΛγΛ^Ο *—' r-. ^ o η (X3 x 0 0 r-~ <n ^ ^^0,2 Ό ON CO On (N - C\ rf -ON —’ ^ ° s 2 2 on m~) r—* (N -1 me xf o\ me r- o\ o\ r~~> c\ \o o ceogo.^j x* Έ (x '/ι rf h- oo Tf oo ö rj- O —I O C\ me Gv (N On C3 =<

Sfi — fN ΓΛ ME ’t ro ro r. co VO Tt 2’w PS £ C^ T-< ^t- *3- r-< —H — — —^ (N o NO Π ΓΟ CO —' rE -—<

ö g ^ S

4_J Ä CO <ϊ>

03 Λ O

T3 2 '-£* ¢3 +3

Cjg (N ’χί* OO ON ON co ^^22eU2 C3© O ME O M oo CO ° £ g ft £

M J —I (N h ^ 'i C\ ON EE 00 —< 00 *-c Ef CEONrXO <D

rrt© ME 0\ Ej- EE -1 ME EE ON Ό NO EEOMEOeE CN (ΝΓ^Ρ-^ Ό ft; c OEtr-OEEt> — Εί- on r- r-voEtvooN oo ^ ^ -¾ -«f - OOfNrOCNh EE CN r-- Ej· rl CO O h 't CO NOOcog j ^ ? 0_ -3 MO h ΙΛ in IT, ΙΛ ON !>· CN O ME OO O CO Ον Γ-- CO O rt :c3 qj

3^6=3 E 2 2 2 S S S S E ^ Ee„Q

υ 11 g g 5 S Eaoj

w5 -ESeS

. Ci ^ — EE

^ ?3 SO ^ ^Ef EE EEEEEEc^fD^.^ ©P EE EE ME EfEE --

=§© CE^ ΓΕ EE cr 71 CECECT^ODdO

Jai $ξ CN ?" EE ME EE CN ΓΝ EE EE CE EE & ö ^ Ö P c ^ ^ ^ ^ ME CNEE^EEEE CE CN-njidiD^n'' Λ4 CO Tt r-H _ ^00^--^Ρη

2 J H EECNCNCNCECE EE EE E^i £E Cr’CTCT'P^dE CE '^rrS’d^S

r^khft £E CT CE £E CT CT CT CT CT — ©n Hä€^ '—1 -—1 CN EE "'vf* ΈΝ CN CN CN t-< fN »>S * ·»- ++ ^ 50

Taulukko 4. Syöpäpotilasaineisto

RASKAS EI ALTISTUSTA EI ALTISTUSTA KOHTALAINEN ALTISTUS siru (_OH ALTISTUS

n= 14 n=14 n=29 n= 8

Histologia AC 5 6 12 4 SCC 4 4 11 3 LCLC 3 2 2 1 SCLC 112 AC-SCC 112 asbesti1 (keskiarvo ± 31.8 ±41.8 0.1 ±0.2 0.1 ±0.2 2.6 ±1.0 SD)

Ikä (keskiarvo ± 62.6 ± 3.2 62.5 + 9.0 62.0 ± 11.4 66.6 ±9.9 SD) vaihe2 I 7 6 11 3 il 12 3 2 III 3 3 7 3 IV 2 2 4 aste2 I 1 - - II 3 3 9 4 III 8 8 13 3 tupakointi3 ei - 1 entinen 9 7 14 4 tämän- 5 7 15 2 hetkinen PY4 (keskiarvo ± 41.4 ± 23.6 48.1 ± 15.0 41.1 ±16.5 44.7 ± 26.0 SD) tup. vuosia (keskiarvo ± 35.8 ± 8.4 42.1 + 8.0 40.5 + 10.3 41.3 ± 15.0 _SD]_ 1 kuitujen keskiarvo/g kuivattua keuhkoa 2 vaihe ja aste puuttuu yhdeltä altistumattomalta potilaalta ja aste yhdeltä kohtalaisesti altistuneelta.

3 entiset tupakoijat = lopettaneet tupakoinnin yli 6 kuukautta ennen leikkausta, tupakointiaineisto puuttuu yhdeltä kohtalaisesti altistuneelta potilaalta.

4 PY=pakkausvuosia 51

Taulukko 5. Korrelaatioanalyysissä havaitut 14 asbestille altistuneen potilaan keuhkokarsinoomat 14 altistumattoman potilaan keuhkokarsinoomista erottavat 47 tärkeintä geeniä Järjestys- Koetinyhdistelmä Hakir’ Geenisymboli Sijainti' P-arvo5 Korrelaatio6 luku1 ID2_____ 1 220127_s_at NM_017703.1 FBXL12 19pl3.2 0,0001 -0,90 2 210365_at D43967.1 RUNX1 21q22.3 0,0004 -0,89 3 204594_s_at NM 013298.1 FLJ20232 22ql3 0,0075 -0,88 4 217147_s_at AJ240085.1 IRAT 1 3ql3 0,0395 -0,87 5 208030_s_at NM_001119.2 ADD1 4pl6.3 0,0004 0,86 6 217580_x_at AW301806 ARL6IP2 2p22.2-p22.1 0,0126 -0,86 7 202801_at NM_002730.1 PRKACA 19p 13.1 0,2547 -0,86 8 212517 at AL132773 ATRN 20pl3 0,0141 0,85 9 203241_at NM_003369.1 UVRAG llql3.5 0,0001 -0,84 10 208994_s_at AI638762 PPIG 2q31.1 0,0380 -0,84 11 209494_s_at AI807017 ZNF278 22ql2.2 0,0609 -0,84 12 208442__s_at NM_000051.1 ATM Ilq22-q23 0,0012 -0,84 13 221971__x__at BE672818 lOq 0,0179 -0,84 14 221104_s_at NM_018376.1 NIPSNAP3B 9q31.1 0,0822 -0,84 15 213094_at AL033377 GPR126 6q24.1 0,0091 0,83 16 20947 l_s_at L00634.1 FNTA 8p22-qll 0,0003 -0,83 17 204834_at NMJ306682.1 FGL2 7ql 1.23 0,0001 -0,83 18 205884_at NM_000885.2 ITGA4 2q31.3 0,0445 -0,83 19 205673_s_at NM_024087.1 ASB9 Xp22.2 0,0110 0,83 20 204527_at NM_000259.1 MY05A 15q21 0,0273 -0,83 21 210835_s_at AF222711.1 CTBP2 10q26.13 0,0861 0,83 22 207633_s_at NM_005592.1 MUSK 9q31.3-q32 0,0956 -0,82 23 210187_at BC005147.1 FKBP1A 20pl3 0,0295 -0,82 24 219174 at NM_025103.1 CCDC2 9p21.2 0,0866 0,82 25 203892_at NM_006103.1 WFDC2 20ql2-ql3.2 0,0155 0,82 26 219613 s at NM_016539.1 SIRT6 19pl3.3 0,0592 -0,82 27 203412_at NM_006767.1 LZTR1 22qll.l-ql 1.2 0,0014 -0,82 28 219666_at NM_022349.1 MS4A6A llql2.1 0,0104 -0,82 29 212215_at AB007896.1 PREPL 2p22.1 0,0194 0,82 30 217718_s_at NM_014052.1 YWHAB 20ql3.1 0,0398 0,82 31 20428 8_s_at NM_021069.1 ARGBP2 4q35.1 0,0098 0,82 32 201 186_at NM_002337.1 LRPAP1 4pl6.3 0,0218 0,81 33 219795_at NM_007231.1 SLC6A14 Xq23-q24 0,0031 0,81 34 207922_s_at NMJ005882.2 MAEA 4pl6.3 0,0265 0,81 35 22147 l_at AW173623 TDE1 20ql3.1-13.3 0,0236 0,81 36 210915_x_at M15564.1 TRBV19, TRBC1 7q34 0,0106 -0,81 37 205876_at NM_002310.2 LIFR 5pl3-pl2 0,1244 0,81 38 219777__at NM_024711.1 GIMAP6 7q36.1 0,0000 -0,81 39 206978_at NMJ300647.2 CCR2 3p21 0,0076 -0,81 40 218559_s_at NM_005461.1 MAFB 20ql 1.2-ql 3.1 0,0022 -0,80 41 209276_s_at AF162769.1 GLRX 5ql4 0,0072 -0,80 52 42 214080_x_at AI815793 PRKCSH 19pl3.2 0,0547 -0,80 43 204523_at NM_003440.1 ZNF140 12q24.32-q24.33 0,0000 0,80 44 3422 l_at D83778 ΚΙΛΑ0194 5q33.1 0,0036 -0,79 45 210895_s at L25259.1 CD86 3q21 0,0686 -0,79 46 33197_at U39226 MY07A llql3.5 0,2430 -0,79 47 205597_at NM 025257.1 C6orf29 6p21.3 0,1272 0,79 1 Geenit järjestetty korrelaationsa mukaisesti altistustilanteen kanssa (asbestille altistunut vs. altistumaton) -y "Affymetrix-koetin ID 3 GenBank-hakunumero 4Kohde-DNA-sekvenssin kromosomaalinen sijainti 3P-arvo laskettu geenin erottavasta ilmentämisestä asbestille altistuneessa vs, altistumattomassa. Signaalit skaalattiin niiden yhteensovitettu]en normaalin keuhkon signaalien suhteen tai samasta altistusryhmästä olevien normaalin keuhkon näytteiden keskiarvosignaalin suhteen.

6Geeni-ilmentämisen korrelaatiokerroin altistustilanteen kanssa (asbestille altistunut vs. altistumaton). Asbestiin liittyvien tuumorien signaalit skaalattiin yhteenliittymättömien tuumorien mediaanisignaalilla ja yhteenliittymättömien tuumorien signaalit asbestiin liittyvien tuumorien mediaanisignaalilla.

53

Taulukko 6, Yhdistetyt tulokset geeninilmentämis- ja DNA-poikkeamaprofiloinnista

Kromosomaalinen Koko Bp-asema Altistunut Altistumaton alue_(Mbp) (USCS )_ 2p21-p16.3 3.00 45527471- Lisäys Menetys 48530340 3p21.31 0.90 48530340- Menetys 49429317 5q35.2-q35.3 2.74 175775918- Menetys 178511817 16p13.3 3.14 258760- Menetys 3399193 19p13.3-p13.1 18.53 367882- Menetys Lisäys 18901114 22q12.3-q13.1 1.43 34861230- Menetys __36292422_ o.

(N

cd

G

<D

ϋ Ό § μ3 . . . 00 .

d < ~ 1 1 1 ' ~ S ^ S m

| S -S

oo

Oj I s gggg|-|<g|g5S< g g I S ~g3g~-ggg~"~g § g I 1 “5g35<<z"5z<z5 gg ” g -ggg-5““5g<g-g -g

<D

DO

I g ~~3g~3~3~333~3 g g I g -g^g^^gg^g^ 13 s 1 g gggg~g~~g~3333 - 3 ^ cd g £ -^^^-gggggg^^^ g- w w g I ~^g3~3ggg^£3g^ co ^ <§? £ H^<H^HHHH^H^ VJ g ii s - 3 O -g S ΐ| “55z"<--5"5z5z g -

M £ jU

f | li -5z"-^---3~~3 <g

If 1 g -“5g“g--“3"5“4 gg S ^ 5 cd 4> rj C ti Μ H-(i—<1—I H-1 i-h^i^^h™,^ *-< m gig S gg < £ | 3 2 || | 2 "~333233~3£3333 g 3 ^ g • H a omcnroLTiOiricxj^uriiNONCAO a -—‘ oo t'- O S (NtN^j-CNcor^OOOOCA'^l-Lrir'OOO ίώ — (ί Q ^ ff — r-lr-l·—<r-Hr-i(NCNlCNCNn ,¾ 2 M ^V 3 r jut £ P s 5 “a Ϊ »3 G ea ^ «ai Va 2 3 G S3 «ώ?> ^ T-A 'w 3 -s α?·2 -¾ .2 s -s ««5 a ^ H 3 H C< « < Ö HH >—-« HH' _ _ _ cn _ ^ s s s

)mm»^ (—I ΠΠ I 1 |( > "' < HH HH HH ) ( Γf) Η™4 -<^ (ssH \ 1 1 '< HH

g Z ~ «ί z M~zZZZ^Z^~M^z^^w~^Z

z ^ ^ ^ ^ z z^z^z^z^^zzz^zz^z •<f* <f^ tarai <f^ H«H HH HH HH r/*\ HH H—i <J^ HH Y—H HH <3^ Z Z ~ ~ Z ~~<Ζ~ΖΖ^^Ζ~ΖζΖ~~Ζ«ίζ λ—.V--·-· jwwj W'-W >—^ 'j } t > '( > ( W—H ^'>·-".ι''ι| fr' ' "( frrWM^ ^^^ZZZ ^^ZZ^^Z^^^ZZZz^^""^^

J J HH M

^ g ^ g g

HH HH j HH

ΗΗ l·1 '"'( HH )ssm{ HH ^sb^ rf\ ) ( HH >aa^ HH Γ/"\ Γ^)

hH

►—(^►-H^^l-H >—it-H^^^j^^M^HHg^H-Hh-l)—<>—(h-H^t—I

Z^^Z^z HH H—I |

< ^ ^ ^ H ^ HH^^H^H|HW^^|H^H

^O _____ HH HH

j' ) ( } '"'ΐ

HH HH

^ ^ ^ ^ ^ M ^^g^^g^^^^Z^Z^^^Z^^

fes*^ HH HH HH HH HH HH <ΐ^ HH <f* HH HH Γ/“) HH

H < «3 Z Z g ^^^Zz^^^^^^Z^ZiZS^^Z

HH HH HH HH ^H HH HH HH HH ΓΛ HH HH HH HH HH -<3** f/") ^H

< w -< z <: <d ^^^zz^^^gzz-^^zz^^^z HH HH ,

HH HH HH HH HH H—' HH HH HH ^H Γ/“\ HH' HH HH HH HH Γ/") HH <T

<c < z Z Z Z M^C^Z^^M^Z^<iZZZ^^^z

HH HH

).’ r..::.'.:| H*H ^ιιτ ti^ \ imiii ^ ^11 )>' ί HH HH HH Γ’H*H HH ^“H Γ"HH fssH HH

C^^zzz ^^ZZZ^Z^^^^CZZZ^Z^Z

^ g ^ ^ ^ -

arorfCNvOOOmOr-CNmOa'vr-^OCNO's-'tO'sCN

ή (N m co Ό ^r-H^oi^r^unun^OOco^Or^r^^tOVOoo s

*»H

=¾ ¾ fej o' D tn — , o o 2 Ή O' G °" •Ζ :g g. <t> -

.2- -S0 s o 'c S

„ 13 S ^ <-r S t'

w Tt co ^ O

et 43 ^3 co ^ £2 s ri «tt CO · ’—' e-"} 2t ^^3 2 g o g 2- 2 - o m b o 35 B 00 o X 2 S D 3 m X od -G O <—, rj S g a.s° »g

<$* >—-4 -f—4 H-H l-M t—< !—( N W n I Γ r^H

zzz^2222~^ 5 § m ä g ^ o .s.5 5 £ <<<<<<<<<< 2 S o ^ x G o' g £ .| S 8 3 s - M ,-r< .V _ ·§ (U ο^'δ o iSo s c „ ö _r z s g2Z< Is 11 |l o- q ·'—i ·^ cd O^ +t \q M hH )—* i; rrt P-ι rZj tt rv] ~ ^ ~ _ -H ^ ^ ~ Z X « 2 g°.^“ et 3 'S a^ tJi , o o <d ^ ^ et o tms^ £t r/\ *~~! ö <^> y-v -a| X (H I—I G ~ cd O tn

Ct L-< q CD 5—( c/3 ί==^ Γ/Ί <f*. >“=< HN ^ rn j”t rt } O· ^ -3| - ^ ^2ωπ°8 ~>^ w , S.S ^2o'3°« jg ^ is S ?S § § '.E* ^ O --g g cd o' ö o, .2,

h—! Γ/’) H-H NH >—< £t ^ β W Γ no (^> rO

O ϋ > s S ^ c< ·Η^ 'tldOCnrt i—i ^ ä ·β :G -ΰ cT H-j CJ |

^ >—1 1—1 w '—1 ^-1 1—1 ^ *—* 1—1 ^ S 2 s 'δ o' ^ ° M

z :2 γε S § 2 o S o o ^ «öii.0g'3c2>>^

MD ^ r/o ί=< i=™( NH +t 'Tri '"""^ rg . 32 CD £3 O CD

3 §aft ö5-TooO

^ ί .ti S cd O Ph \o - ϋ ‘ rj CD f? t-η :et m3 pinui-·^ I I ! ’,^~ CL/ r\ * a »

SsS.

£ β J- ^ ^ o" S m M

rG O 2 or cd On ^ _, ^ M i.j Q g · t-( O fg g r/0 -öog>2 S e o S 5 “ S 'g m 'gGi g > ^ δ ΰ 2<uo.$?bc$ _3 rt d w n :c^ u ^

Nsa^ ^ V-( ^ ^ 'D ' w c'—N ’ r~~i »“Π il—[ h S H cd λ rt M -HCdrf § g Nf S 6 u

Sb| I S8J.SO

^ X-^2'wö°-'SO

- HH :5 d ff 'Π o 3! O “ O

<r m m « i—i Xcdt* oi—icdi/O-G^— g a ·| äiägls o o ” Λ s f2 cö 5 ° )s3^ y—-i co tD C C Γ ·'—j · >~h /«n < ----¾ sa S s ? ^ « e 5 m |3g ^Ntg =¾¾

<C ΓΓ) y^i >—* K/. ' i—i ""O · jD rtj r~i CO

t S t > ^ OO CD ‘P 0 z S ^ ^ ^ Gcdx 3 g w » a 8 „ 09 g > "" ( . h Ct » M (—* · r-« CO O ( ( ^ s * z |S| |"1I|°

§2Cf '3 7 cd 2 O N

< q <^Z, < S'bS M ^ g “ Λ! n 2 o 3 jj » o 'δ ^ o G· O' Os O CO vo un — oo O 2 U 3 j M 3 ·" o « ιλ" CNömNfd-d-ifliohoo

--NfMNNNNMN 2 S cd S ° 'X O O Ö O

et no et · £-5 m ‘ m ti --Γ cd .—Γ co w et -jf~i * fv et O' »rD ·ν—^ § « O 2 o o'

ä 2 jS> O :¾ M O 2 S

< S x rl-1 S' S o" o. o' 57

KIRJALLISUUS

Selikoff I, Hammond E, Churg J. Asbestos exposure, smoking, and neoplasia. J AMA 1968;204(2): 106-12.

Vainio H, Boffetta P. Mechanisms of the combined effect of asbestos and smoking in the etiology of lung cancer. Scandinavian Journal of Work, Environment & Health 1994;20(4):235-42.

Karjalainen A, Anttila S. Asbestos exposure and the risk of lung cancer in urban population. Houston, Texas: Gulf Publishing Company; 1997.

Nelson H, Kelsey K. The molecular epidemiology of asbestos and tobacco in lung cancer. Oncogene 2002;21(48):7284-8.

Upadhyay D, Kamp DW. Asbestos-Induced Pulmonary Toxicity: Role of DNA Damage and Apoptosis. Experimental Biology and Medicine 2003;228(6):650-659.

Jaurand M. Mechanisms of fiber-induced genotoxicity. Environ Health Perspectives 1997; 105(S5): 1073-84.

Fatma N, Jain A, Rahman Q. Frequency of sister chromatid exchange and chromosomal aberrations in asbestos cement workers. Br J Ind Med 1991 ;48(2):103-5.

Marczynski B, Czuppon A, Marek W, Reichel G, Baur X. Increased incidence of DNA double-strand breaks and anti-ds DNA antibodies in blood of workers occupationally exposed to asbestos. Human Experimantal Toxicology 1994;13(1).

Marczynski B, Rozynek P, Kraus T, Schlosser S, Raithel HJ, Baur X. Levels of 8- hydroxy-2'-deoxyguanosine in DNA of white blood cells from workers highly exposed to asbestos in Germany. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 2000;468(2): 195-202.

Karjalainen A, Anttila S, Heikkilä L, Karhunen P, Vainio H. Asbestos exposure among Finnish lung cancer patients: Occupational history and fiber concentration in lung tissue. Am J Ind Med 1993;23:461-471.

Karjalainen A, Anttila S, Vanhala E, Vainio H. Asbestos exposure and the risk of lung cancer in a general urban population. Scand J Work Environ Health 1994;20(4):243-50.

Wikman H, Kettunen E, Seppänen JK, Kaijalainen A, Hollmen J, Anttila S, et al.

Identification of differentially expressed genes in pulmonary adenocarcinoma by using cDNA array. Oncogene 2002;21 (37):5804-13.

van't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, He YD, Hart AA, Mao M, et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 2002;415(6871 ):530-6.

58

Kettunen E, Anttila S, Seppänen JK, Karjalainen A, Edgren H, Lindström I, et ai.

Differentially expressed genes in nonsmall cell lung cancer: expression profiling of cancer-related genes in squamous cell lung cancer. Cancer Genet Cytogenet 2004; 149(2):98-106.

Hoang JM, Cottu PH, Thuille B, Salmon RJ, Thomas G, Hamelin R. BAT-26, an indicator of the replication error phenotype in colorectal cancers and cell lines. Cancer Res 1997;57(2):300-3.

Hellström I, Raycraft J, Hayden-Ledbetter M, Ledbetter JA, Schummer M, McIntosh M, et al. The HE4 (WFDC2) protein is a biomarker for ovarian carcinoma. Cancer Res 2003;63( 13):3695-700.

Gupta N, Miyauchi S, Martindale RG, Herdman AV, Podolsky R, Miyake K, et al. Upregulation of the amino acid transporter ATB0,+ (SLC6A14) in colorectal cancer and metastasis in humans. Biochim Biophys Acta 2005; 1741(1-2):215-23.

Bossolasco M, Lebel M, Lemieux N, Mes-Masson AM. The human TDE gene homologue: localization to 20q 13.1-13.3 and variable expression in human tumor cell lines and tissue. Mol Carcinog 1999;26(3): 189-200.

Ionov Y, Nowak N, Perucho M, Markowitz S, Cowell JK. Manipulation of nonsense mediated decay identifies gene mutations in colon cancer Cells with microsatellite instability. Oncogene 2004;23(3):639-45.

Safar AM, Spencer H, 3rd, Su X, Coffey M, Cooney CA, Ratnasinghe LD, et al.

Methylation profiling of archived non-small cell lung cancer: a promising prognostic system. Clin Cancer Res 2005;11(12):4400-5.

Li QL, Kim HR, Kim WJ, Choi JK, Lee YH, Kim HM, et al. Transcriptional silencing of the RUNX3 gene by CpG hypermethylation is associated with lung cancer. Biochem Biophys Res Commun 2004;314(1):223-8.

Sakakura C, Hagiwara A, Miyagawa K, Nakashima S, Yoshikawa T, Kin S, et al. Frequent downregulation of the runt domain transcription factors RUNX1, RUNX3 and their cofactor CBFB in gastric cancer. Int J Cancer 2005;113(2):221-8.

Blyth K, Cameron ER, Neil JC. The RUNX genes: gain or loss of function in cancer. Nat Rev Cancer 2005;5(5):376-87.

Lounsbury KM, Stem M, Taatjes D, Jaken S, Mossman BT. Increased localization and substrate activation of protein kinase C delta in lung epithelial cells following exposure to asbestos. Am J Pathol 2002; 160(6): 1991-2000.

59

Michiels S, Koscielny S, Hill C. Prediction of cancer outcome with microarrays: a multiple random validation strategy. Lancet 2005;365(9458):488-92.

Marsit CJ, Hasegawa M, Hirao T, Kim D-H, Aldape K, Hinds PW, et al. Loss of Heterozygosity of Chromosome 3p21 Is Associated with Mutant TP53 and Better Patient Survival in Non-Small-Cell Lung Cancer. Cancer Res 2004;64(23):8702-8707. De Rienzo AT, JR. Recent advances in the molecular analysis of human malignant mesothelioma. Clin Ter. 2000;151(6):433-8.

Dano L, Guilly MM, M. Morlier, JP. Altmeyer, S. Vielh, P. El-Naggar, AK. Monchaux, G. Dutrillaux, B. Chevillard, S. CGH analysis of radon-induced rat lung tumors indicates similarities with human lung cancers. Genes Chromosomes Cancer 2000;29(l):l-8. Takamochi K, Ogura T, Yokose T, Ochiai A, Nagai K, Nishiwaki Y, et al. Molecular analysis of the TSC1 gene in adenocarcinoma of the lung. Lung Cancer 2004;46(3):271-281.

Radak Z, Goto S, Nakamoto H, Udud K, Papai Z, Horvath I. Lung cancer in smoking patients inversely alters the activity of hOGGl and hNTHl. Cancer Lett 2005 ;219(2): 191-5.

Sanchez-Cespedes M, Ahrendt SA, Piantadosi S, Rosell R, Monzo M, Wu L, et al.

Chromosomal Alterations in Lung Adenocarcinoma from Smokers and Nonsmokers.

Cancer Res 2001 ;61 (4): 1309-1313.

Sanchez-Cespedes M, Parrella P, Esteller M, Nomoto S, Trink B, Engles JM, et al. Inactivation of LKB1/STK11 is a common event in adenocarcinomas of the lung. Cancer Res 2002;62(13):3659-62.

Medina PP, Carretero J, Ballestar E, Angulo B, Lopez-Rios F, Esteller M, et al.

Transcriptional targets of the chromatin-remodelling factor SMARCA4/BRG1 in lung cancer cells. Hum Mol Genet 2005; 14(7):973-82.

Reisman DN, Sciarrotta J, Wang W, Funkhouser WK, Weissman BE. Loss of BRG1/BRM in human lung cancer cell lines and primary lung cancers: correlation with poor prognosis. Cancer Res 2003;63(3):560-6.

Björkqvist, A. M., Tammilehto, L., Nordling, S., Nurminen, M., Anttila, S., Mattson, K., and Knuutila, S. Comparison of DNA copy number changes in malignant mesothelioma, adenocarcinoma and large-cell anaplastic carcinoma of the lung. Br J Cancer, 77: 260-269, 1998.

60

Wikman, H., Nymark, P., Väyrynen, A., Jarmalaite, S., Kallioniemi, A,, Salmenkivi, K., Vainio-Siukola, K., Husgafvel-Pursiainen, K., Knuutila, S., Wolf, M., and Anttila, S. CDK4 Is a Probable Target Gene in a Novel Amplicon on 12ql3.3-ql4.1 in Lung Cancer. Genes Chromosomes Cancer. 42: 193-199, 2005.

Ruosaari, S. and Hollmen, J. Image analysis for detecting faulty spots from microarray images. Lecture Notes In Computer Science, 2534: 259 - 266, 2002.

Forozan, F., Karhu, R., Kononen, J., Kallioniemi, A., and Kallioniemi, O.-P. Genome screening by comparative genomic hybridization. Trends Genet, 13: 405-409, 1997.

el-Rifai, W., Larramendy, M., Björkqvist, A., Hemmer, S., and Knuutila, S. Optimization of comparative genomic hybridization using fluorochrome conjugated to dCTP and dUTP nucleotides. Lab Invest, 77: 699-700, 1997.

Girard, L., Zochbauer-Muller, S., Virmani, A. K., Gazdar, A. F., and Minna, J. D. Genome-wide Allelotyping of Lung Cancer Identifies New Regions of Allelic Loss, Differences between Small Cell Lung Cancer and Non-Small Cell Lung Cancer, and Loci Clustering. Cancer Res, 60: 4894-4906, 2000.

Suzuki, K., Ogura, T., Yokose, T., Nagai, K., Mukai, K., Kodama, T., Nishiwaki, Y., and Esumi, H. Loss of heterozygosity in the tuberous sclerosis gene associated regions in adenocarcinoma of the lung accompanied by multiple atypical adenomatous hyperplasia. Int J Cancer, 79: 384-389, 1998.

Larramendy, M., El-Rifai, W., and Knuutila, S. Comparison of fluorescein isothiocyanate-and Texas red-conjugated nucleotides for direct labeling in comparative genomic hybridization. Cytometry, 31: 174-179, 1998.

Dano, L. and Guilly, M. M., M. Morlier, JP. Altmeyer, S. Vielh, P. El-Naggar, AK. Monchaux, G. Dutrillaux, B. Chevillard, S. CGH analysis of radon-induced rat lung tumors indicates similarities with human lung cancers. Genes Chromosomes Cancer, 29: 1-8, 2000.

61

Hsieh, W. N. C, Hwang JJ, Fang JS, Lin SP, Lin YA, Huang TW, Chang WP. Evaluation of the frequencies of chromosomal aberrations in a population exposed to prolonged low dose-rate 60Co gamma-irradiation. Int J Radiat Biol, 78: 625-633, 2002.

Leach, J. K., Van Tuyle, G., Lin, P.-S., Schmidt-Ullrich, R., and Mikkelsen, R. B. Ionizing Radiation-induced, Mitochondria-dependent Generation of Reactive Oxygen/Nitrogen. Cancer Res, 61: 3894-3901, 2001.

Dopp, E. and Schiffmann, D. Analysis of chromosomal alterations induced by asbestos and ceramic fibers. Toxicol Lett, 96-97: 155-162, 1998.

Lohani, M., Dopp, E., Becker, H.-H., Seth, K., Schiffmann, D., and Rahman, Q. Smoking enhances asbestos-induced genotoxicity, relative involvement of chromosome 1: a study using multicolor FISH with tandem labeling. Toxicol Lett, 136: 55-63, 2002.

De Rienzo, A. T., JR. Recent advances in the molecular analysis of human malignant mesothelioma. Clin Ter., 151: 433-438, 2000.

Shukla, A., Flanders, T., Lounsbury, K. M., and Mossman, B. T. The {gamma}-Glutamylcysteine Synthetase and Glutathione Regulate Asbestos-induced Expression of Activator Protein-1 Family Members and Activity. Cancer Res, 64: 7780-7786, 2004.

Glover, T. Instability at chromosomal fragile sites. Recent Results Cancer Res., 154: 185-199, 1998.

Finnis, M., Dayan, S., Hobson, L., Chenevix-Trench, G., Friend, K., Ried, K., Venter, D., Woollatt, E., Baker, E., and Richards, R. I. Common chromosomal fragile site FRA16D mutation in cancer cells. Hum Mol Genet, 14: 1341-1349, 2005.

Zainabadi, K., Benyamini, P., Chakrabarti, R., Veena, M. S., Chandrasekharappa, S. C., Gatti, R. A., and Srivatsan, E. S. A 700-kb physical and transcription map of the cervical cancer tumor suppressor gene locus on chromosome llql3. Genomics, 85: 704-714, 2005.

Claims (13)

62 Patentti vaati mu kset

1. Menetelmä asbestialtistukseen liittyvien keuhkosyöpien tunnistamiseksi tunnettu siitä, että menetelmässä havainnoidaan keuhkosyöpäpotilaasta peräisin olevasta 5 keuhkosyöpäsolunäytteestä alleeliepätasapainoa (AI) keuhkosyöpäsolujen kromosomaalisesta alueesta 19p 13.3-p 13.1 ja mahdollisesti vähintään yhdestä seuraavista keuhkosyöpäsolujen kromosomaalisista lisäalueista: a) 9q32-34.3; 10 b) 2p21-pl6.3; c) 16pl3.3; ja d) 22ql2.3-q 13.1.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin AI:n läsnäolo alueessa 19pl3.3- 15 p 13.1 osoittaa, että keuhkosyöpäsolun pahanlaatuisuus on yhteydessä asbestialtistukseen.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, jolloin AI:n läsnäolo myös vähintään yhdessä mainituista lisäalueista vahvistaa, että keuhkosyöpäsolun pahanlaatuisuus on yhteydessä asbestialtistukseen. 20

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin kromosomaalinen lisäalue on 9q33.1.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin kromosomaalinen lisäalue on 25 2p21 -p 16.3.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin AI:n läsnäolo kromosomaalisessa alueessa 19pl3.3-pl3.1 määritetään vähintään yhden mikrosatelliittimarkkerin käytöllä seuraavista: 19s814, 19S883, 19S878, 19S424, 19S894, 19S216, 1955177, 19S1034, 30 19S873, 19S884, 19S916, 19S583, 19S535, 19S906, 19S221, 19S840, 19S917, 19S895 ja 19S568. 63

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin AI:n läsnäolo määritetään heterotsygoottisuuden menetys (LOIT) -analyysillä.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin AI:n läsnäolo määritetään valmistamalla geeninilmentämisprofiili, joka käsittää kromosomaalisella alueella 19pl 3.3-pl3.1 sijaitsevien geenien ilmentämistuloksia.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, jolloin geeninilmentämisprofiili käsittää 10 vähintään yhden taulukossa 5 luetellun geenin ilmentämistuloksia, jotka geenit valitaan joukosta: FBXL12, PRKACA, SIRT6, ja PRKCSH.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin AI:n läsnäolo määritetään fluoresenssi in situ -hybridisaatio (FISH) -teknologian käytöllä. 15

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa tutldttava keuhkosyöpäsolunäyte on saatu lasermikrodissektioteknologialla.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin kromosomaalinen lisäalue on 20 9q32-34.3.

13. Reagenssipakkaulcsen käyttö asbestiin liittyvän keuhkosyövän havainnoinnissa tunnettu siitä, että reagenssipakkaus käsittää välineet patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän toteuttamiseksi. 25 64