FI117909B

FI117909B - Analysis of the sample by Raman spectroscopy

Info

Publication number: FI117909B
Application number: FI992439A
Authority: FI
Inventors: Jussi Tenhunen; Jouko Vyoerykkae; Mari Halttunen; Hanna Iitti
Original assignee: Teknillinen Korkeakoulu
Priority date: 1999-11-12
Filing date: 1999-11-12
Publication date: 2007-04-13
Also published as: AU1525901A; FI19992439A; WO2001036949A1

Description

'' 1 117909 Näytteen analysoiminen Raman-spektroskopiassa Tämän keksinnön kohde on menetelmä näytteen analysoimiseksi Raman-spektroskopiassa, jossa menetelmässä viritetään näytteen molekyyle-5 jä monokromaattisen valon avulla, kerätään ja analysoidaan näytteestä Ra-man-sironnut valo spektrometrillä. Keksinnön kohteena on edelleen mittausjärjestely Raman-spektroskopian suorittamiseksi, joka mittausjärjestely käsittää näytteen, immersio-objektiivin, spektrometrin ja monokromaattisen valon lähteen.The present invention relates to a method for analyzing a sample by Raman spectroscopy, which involves excitation of the molecules of the sample with monochromatic light, and collection and analysis of a sample scattered on a Ra man spectrometer. The invention further relates to a measuring arrangement for performing Raman spectroscopy comprising a sample, an immersion lens, a spectrometer and a monochromatic light source.

10 Keksintö liittyy suurta tarkkuutta vaativaan näytteen analysoimiseen ja erityisesti syvyyssuuntaisten kartoitusmittausten suorittamiseen. Tällaista näytteen analysoimista suoritetaan tunnetusti Raman-spektroskopiassa. Tällöin saadaan tietoja näytteen molekyylien värähtelyistä, joita voidaan käyttää muun muassa näytteen tunnistamiseen ja kemiallisen koostumuksen selvittä-15 miseen. Näytteestä voidaan rajata tutkittavaksi hyvin pieni tilavuus mikroskoopin avulla. Näytteen molekyylejä viritetään monokromaattisella valolla, josta osa Raman-siroaa tutkittavasta näytteestä siten, että valon aallonpituus muuttuu. Raman-sironnutta valoa kerätään ja analysoidaan spektrometrillä. Tämän Raman-sironneen valon intensiteettiä taajuuden funktiona kutsutaan näytteen 20 Raman-spektriksi. Spektristä saadaan sekä kvantitatiivisia että kvalitatiivisia tuloksia ja spektriä voidaan verrata referenssiluetteloihin tai digitaalisiin tieto-kantoihin.The invention relates to the analysis of a sample which requires high precision and in particular to the performance of depth mapping measurements. Such sample analysis is known to be performed by Raman spectroscopy. This provides information on the vibration of the sample molecules, which can be used, inter alia, to identify the sample and determine its chemical composition. A very small volume of the sample can be limited by microscope. The molecules in the sample are excited with monochromatic light, some of which Raman scatters from the sample so that the wavelength of the light changes. Raman scattered light is collected and analyzed on a spectrometer. The intensity of this Raman scattered light as a function of frequency is called the Raman spectrum of sample 20. The spectrum provides both quantitative and qualitative results and the spectrum can be compared with reference lists or digital databases.

• · ' Immersio-objektiiveja käytetään tunnetusti erotuskyvyn parantami- *"*. seksi. Tämä päämäärä saavutetaan käyttämällä immersio-objektiivin kanssa • · * i_ 25 ainetta, jolla on suurempi taitekerroin kuin ilmalla. Immersio-objektiiveja käyte- • · · *·" * tään yleisesti valomikroskopiassa, mutta Raman-spektroskopiassa niitä käyte tään vain joissakin erikoissovelluksissa. Esimerkiksi biologisten näytteiden analysoimisessa Raman-spektroskopialla käytetään joskus vesi-immersio- • · : *·· objektiiveja, lähinnä näytteen liiallisen lämpenemisen estämiseksi. , 30 Ongelmia yllä kuvatuissa mittausjärjestelyissä on näytteen pinnalla ' tapahtuvat virittävän valon ja näytteestä Raman-sironneen valon heijastumi- • · ... nen, hajavalo ja kuvausvirhe. Nämä ilmiöt johtuvat valonsäteiden kohtaamista • · *·;** suurista taitekertoimen eroista ja estävät virittävän valon tunkeutumista ja fo- <; : kusointia näytteeseen. Hajavalo on näytteen pinnalla tapahtuvaa satunnaista ·:·· 35 heijastumista, joka johtuu taitekertoimen vaihteluista huokosten ja partikkeli- * 2 117909 muotojen aiheuttamalla karhealla pinnalla. Hajavalo heikentää x-y tason resoluutiota. Kuvausvirhe eli näyteaberraatio aiheutuu valon taittumisesta näytteen pinnalla. Eri tulokulmilla tulleet valonsäteet taittuvat erilailla ja yhteinen fokus-piste menetetään. Tämän vuoksi syvyysresoluutio heikkenee ja keräystehok-5 kuus laskee jopa puoleen.Immersion lenses are known to be used to improve resolution. This goal is achieved by using an immersion lens with a higher refractive index than air. Immersion lenses are used by • · · * · " * are commonly used in light microscopy, but are only used in some special applications in Raman spectroscopy. For example, when analyzing biological samples by Raman spectroscopy, water-immersion lenses are sometimes used, mainly to prevent excessive warming of the sample. , 30 Problems with the measurement arrangements described above include reflection of excitation light and Raman scattered light from the sample, scattered light, and imaging error. These phenomena are due to the large differences in refractive index encountered by the light rays and prevent the penetration of the excitation light and the photo- <; : cauterization to sample. Scattered light is a random ·: ·· 35 reflection of the sample surface due to variations in refractive index over a rough surface caused by pores and particle * 2 117909. Diffuse light reduces x-y resolution. The imaging error, or sample aberration, is due to the refraction of light on the sample surface. The rays of light coming from different angles of refraction are refracted and the common focus point is lost. As a result, depth resolution is reduced and collection efficiency is reduced by up to half.

Tämän keksinnön tarkoitus on ratkaista edellä mainitut ongelmat ja tarjota käyttöön menetelmä Raman-spektroskopian suorittamiseksi entistä tehokkaammin ja tarkemmin. Tämä päämäärä saavutetaan itsenäisten patenttivaatimusten 1 ja 2 mukaisella menetelmällä sekä itsenäisten patenttivaatimus-10 ten 6 ja 7 mukaisella mittausjärjestelyllä.The purpose of the present invention is to solve the above problems and to provide a method for performing Raman spectroscopy more efficiently and accurately. This object is achieved by the method according to the independent claims 1 and 2 and by the measuring arrangement according to the independent claims 6 and 7.

Keksintö perustuu siihen ajatukseen, että poistetaan objektiivin ja näytteen välissä olevat suuret taitekerroinerot, jotka aiheuttavat analysoinnin kannalta haitallista valon taittumista ja heijastumista. Kun objektiivin ja näytteen välinen tila täytetään immersionesteellä, joka valitaan niin, että sen taite- ^ 15 kerroin on hyvin lähellä näytteen taitekerrointa, voi valo kulkea koko matkan objektiivilta näytteen sisälle ja kerätty Raman-sironta takaisin objektiiville ilman suuria taitekerroinvaihteluja. Tällä saavutetaan monta etua. Tärkeimmät edut ovat, että enemmän valoa tunkeutuu näytteeseen, kun näytteen pinta tasoittuu ja taitekerroinvaihtelut poistuvat immersionesteen täyttäessä näytteen pinnalla 20 olevat huokoset, ja että valo fokusoituu paremmin yhteen pisteeseen, kun mainittua kuvausvirhettä ei synny. Tällöin Raman-sironneen valon keräyste-hokkuus kasvaa ja syvyysresoluutio paranee. Keräystehokkuuden mittana voi- * * * ^ daan käyttää numeerista apertuuria eli NA-arvoa, joka märitellään kaavalla * · « * • · *· *· 25 NA =nsina, ··· ' • · · • · · • ·· : jossa n on väliaineen taitekerroin ja a on valon säteen tulokulma näytteeseen.The invention is based on the idea of eliminating the large refractive index differences between the lens and the sample, which cause refraction and reflection of light which is detrimental to the analysis. When the space between the lens and the sample is filled with immersion fluid selected so that its refractive index is very close to the refractive index of the sample, the light can travel all the way from the lens to the sample and the collected Raman scattering back to the lens without major refractive index variations. There are many benefits to this. The main advantages are that more light penetrates into the sample as the surface of the sample is leveled and refractive index variations are removed as the immersion liquid fills the pores on the surface of the sample 20, and that light is more focused at one point when said imaging error does not occur. As a result, the Raman scattered light's gain-of-gain increases and depth resolution improves. As a measure of collection efficiency, * * * ^ can be a numerical aperture, or NA, which is defined by the formula * · * * 25 * NA = nsina, ··· ' n is the refractive index of the medium and a is the incident angle of the light beam to the sample.

Käytännössä kuivalla objektiivilla numeerisen apertuurin maksimiarvo on 0,95, mutta immersio-objektiivilla päästään huomattavasti suurempiin NA-ar- ;**’· 30 voihin. Kun näytteen taitekerroin on 1,5, niin kuivan objektiivin NA-arvoksi tu- * · · * . lee yllä mainitun kaavan avulla 0,63. Keräystehokkuuden kasvun ansiosta mit- tausaikoja voidaan lyhentää jopa puoleen, jolloin näyte ei lämpene liikaa. Li- • · *··♦* säetuna voidaan mainita, että immersioneste jäähdyttää näytettä, jolloin voi- • :*· daan käyttää suurempaa virittävän valon tehoa vahingoittamatta näytettä.In practice, with a dry lens, the numerical aperture has a maximum value of 0.95, but the immersion lens achieves significantly higher NA-values ** ** · 30. When the refractive index of the sample is 1.5, the NA of the dry lens becomes * · · *. lee using the above formula 0.63. Due to the increase in collection efficiency, the measurement times can be reduced by up to half, so that the sample does not overheat. In addition, when immersed, it can be mentioned that the immersion liquid cools the sample, allowing for a higher power of excitation light without damaging the sample.

··· · *····- ...··· · * ···· - ...

• ♦ 3 117909• ♦ 3,117,909

Eräässä keksinnön mukaisen menetelmän edullisessa suoritusmuodossa immersionestettä lisätään sekä näytteen päälle että sen alle. Tällöin ei myöskään näytteen alle voi jäädä ilmaa, josta voisi seurata yllä mainittuja tai-tekertoimen epäjatkuvuuksista johtuvia ongelmia.In a preferred embodiment of the method of the invention, immersion liquid is added both on and below the sample. In this case, too, no air may remain under the sample, which could result in the above problems due to discontinuities in the or factor.

5 Keksinnön mukaisessa menetelmässä valitaan näytteen pinnalla käytettäväksi immersionesteeksi sellainen neste, joka ei ole oleellisesti Ra-man-aktiivinen. Tällä tarkoitetaan, että karsitaan pois sellaiset immersiones-teet, joilla on voimakas Raman-spektri, joka voisi muodostua päällekkäiseksi tutkittavan näytteen spektrin kanssa ja häiritä analyysin suorittamista.In the method of the invention, a liquid which is not substantially Ra-mana is selected as the immersion liquid to be used on the sample surface. By this is meant to eliminate those immersion fluids having a strong Raman spectrum which could overlap with the sample of the sample and interfere with the analysis.

10 Keksinnön mukaisen menetelmän ja mittausjärjestelyn edulliset suoritusmuodot ilmenevät oheisista epäitsenäisistä patenttivaatimuksista 3-5 ja 8-12.Preferred embodiments of the method and measurement arrangement of the invention are disclosed in the dependent claims 3-5 and 8-12.

Keksintöä selostetaan seuraavassa esimerkinomaisesti lähemmin viittaamalla oheisiin kuvioihin, joista: 15 kuvio 1 esittää vuokaaviota keksinnön mukaisesta menetelmästä, ja kuviot 2A ja 2B havainnollistavat keksinnön mukaista mittausjärjestelyä.The invention will now be described in more detail by way of example with reference to the accompanying figures, of which: Figure 1 shows a flow diagram of the method according to the invention, and Figures 2A and 2B illustrate a measuring arrangement according to the invention.

Kuvio 1 esittää vuokaaviota keksinnön mukaisesta menetelmästä. Oletetaan esimerkinomaisesti, että tutkitaan paperinpäällystettä tekemällä sy- 20 vyyssuuntaisia mittauksia Raman-spektroskopian avulla. Mikroskoopilla rajani*· taan tutkittavaksi hyvin pieni näytteen tilavuus ja mittauksessa käytetään im- mersio-objektiivia, peitinlasia ja kahta eri immersionestettä.Figure 1 shows a flow chart of a method according to the invention. It is assumed, by way of example, that paper coating is investigated by making deep measurements by Raman spectroscopy. Using a microscope, we limit the sample to a very small sample volume by measuring an immersion lens, a cover glass and two different immersion fluids.

♦ *♦ *

Vaiheessa 1A asetetaan objektiivin alle peitinlasi ja peitinlasin alle T*. preparaattilasin päälle tutkittava näyte, eli esimerkiksi päällystetty paperi. Esi- **./ 25 merkin paperinpäällysteen taitekerroin nN on noin 1,55. Se koostuu pigmentis- ® · · tä, joka voi olla esimerkiksi kalsiumkarbonaattia, jonka taitekerroin on noin • · · *·* * 1,56, sekä sideaineesta, joka voi olla styreenibutadieenilateksia, jonka taite kerroin on noin 1,5. Paperinpäällyste voi myös olla osaksi tai kokonaan kaolii- ·♦ • *·♦ nipigmenttiä, jonka taitekerroin on noin 1,55. Vaiheessa 1B täytetään objektii- :***: 30 vin ja peitinlasin välinen tila ensimmäisellä immersionesteellä, joka on immer- sioöljyä, jonka taitekerroin ni on noin 1,5. Tämä immersioöljy on valittu siten, • · että sen taitekerroin on hyvin lähellä peitinlasin taitekerrointa, joka myös on **;* noin 1,5. Käytännössä immersio-objetiivin valmistaja toimittaa usein objektiivin ·.· · mukana myös immersioöljyn. Objektiivin valmistaja ilmoittaa myös minkälaisen ·:··: 35 peitinlasin kansa immersio-objektiivi on tarkoitettu käytettäväksi. Peitinlasi on 4 117909 irrallinen osa ja immersio-objektiivia voidaan erikoistapauksissa käyttää myös ilman peitinlasia. Vaiheessa 1C valitaan toiseksi immersionesteeksi sellainen neste, jonka taitekerroin on mahdollisimman lähellä näytteen taitekerrointa. Tässä esimerkissä etsitään siis toiseksi immersionesteeksi nestettä, jonka tai-5 tekerroin on lähellä 1,55. Valitaan toiseksi immersionesteeksi silikoniöljy, jonka taitekerroin n2 on noin 1,5. Tällä toisella immersionesteellä täytetään peitinla-sin ja näytteen välinen tila sekä näytteen ja preparaattilasin välinen tila. Vaiheessa 1D alkaa itse analysoiminen. Viritetään näytteen molekyylejä monokromaattisella valolla, eli laserilla. Valon aallonpituus on tässä esimerkissä 785 10 nm, mutta myös muita aallonpituuksia voidaan ajatella käytettäväksi. Toisen immersionesteen Raman-spektri ei saa olla liian voimakas tai päällekkäinen näytteen Raman-spektrin kanssa. Silikoniöljy ja paperinpäällyste toimivat tässäkin suhteessa hyvin yhdessä. Vaiheessa 1E kerätään ja analysoidaan näytteestä Raman-sironnut valo spektrometrillä. Analyysin tuloksena spektrometri 15 antaa Raman-spektrin, joka kuvaa Raman-sironneen valon intensiteettiä suhteessa taajuuteen. Raman-spektrissä esiintyvät juovat kertovat näytteen kemiallisista ominaisuuksista mitatussa syvyyskohdassa. Vaiheessa 1F muutetaan objektiivin ja näytteen välistä etäisyyttä esimerkiksi nostamalla näytetasoa 1 μηη ja suoritetaan analyysi tässä syvyyskohdassa. Etäisyyttä voidaan muuttaa 20 toistuvasti, jolloin Raman-spektrin muutoksia seuraamalla voidaan selvittää .... esimerkiksi jonkin tietyn aineen jakautumineen näytteen eri syvyyksille. Näytet- II* . tä voidaan myös liikuttaa x-y tasossa. Vaiheessa 1G suoritetaan dekonvoluu- • * · • ;* tio. Tämä tarkoittaa, että lasketaan Raman-instrumentin vastefunktion ja mit- • · · ·*·ί. taustuloksen, eli Raman-intensiteetin funktion, perusteella näytteelle konsent- ·.**: 25 raatioprofiili, jonka avulla päästään tarkempaan tulosten käsittelyyn. Raman- • · · v : intensiteetin syvyyden funktion kaavassa • · · • * * « · · oo i(z) = \ f (z - x)s(z)dx • * J' • · - oo • • * · • · » · * * * ·. 30 f(z) on Raman-instrumentin vastefunktio, joka on muodossa f(z-x) kun sitä in- tegroidaan näytepaksuuden yli, ja s(z) on konsentraatioprofiili, jota ei vielä tun- * · '··** neta. Konvoluutioteoreeman mukaan pätee • · • * · • · · i(z)=f(z)s(2), • * 5 117909 jossa isot kirjaimet kuvaavat vastaavien funktioiden Fourier-muunnoksia. Kon-sentraatioprofiilia kuvaava funktio s(z) lasketaan kaavasta 5 /,,,· josta käänteisellä Fourier-muunnoksella saadaan lopulta konsentraatiota kuvaava funktio s(z).In step 1A, a cover glass is placed under the lens and T * is placed under the cover glass. sample to be examined on the preparation glass, for example, coated paper. The pre-** / 25-character paper coating has a refractive index nN of about 1.55. It consists of pigment ®, for example calcium carbonate with a refractive index of about 1.56 and a binder which may be styrene-butadiene latex with a refractive index of about 1.5. The paper coating may also be partially or completely coated with a kaolin-n • · pigment having a refractive index of about 1.55. In Step 1B, the space between the slide: *** and the cover glass is filled with a first immersion liquid, an immersion oil having a refractive index ni of about 1.5. This immersion oil is selected so that its refractive index is very close to that of the cover glass, which is also **; * about 1.5. In practice, the manufacturer of an immersion lens often supplies the lens with an immersion oil. The lens manufacturer also states what kind of ·: ··: 35 cover glass nation immersion lens is intended for use. The cover glass is a 4 117909 detachable part and, in special cases, the immersion lens can also be used without the cover glass. In step 1C, a second immersion fluid is selected which has a refractive index as close as possible to the refractive index of the sample. Thus, in this example, a second immersion fluid is searched for a fluid having a factor of -5 close to 1.55. The second immersion fluid is selected from a silicone oil having a refractive index n2 of about 1.5. This second immersion liquid is used to fill the space between the cover glass and the sample and between the sample and the preparation glass. In step 1D, self-analysis begins. The molecules of the sample are excited with a monochromatic light, i.e. a laser. The wavelength of light in this example is 785 to 10 nm, but other wavelengths may be contemplated. The Raman spectrum of the second immersion liquid must not be too strong or overlap with the Raman spectrum of the sample. The silicone oil and the paper coating work well together in this regard. In step 1E, Raman scattered light from the sample is collected and analyzed on a spectrometer. As a result of the analysis, spectrometer 15 gives a Raman spectrum which depicts the intensity of Raman scattered light with respect to frequency. The lines in the Raman spectrum indicate the chemical properties of the sample at the measured depth. In step 1F, the distance between the lens and the sample is changed, for example, by increasing the sample level by 1 μηη and the analysis is performed at this depth. The distance can be varied 20 times so that changes in the Raman spectrum can be observed .... for example, the distribution of a given substance to different depths of the sample. Sample- II *. it can also be moved in the x-y plane. In step 1G, a deconvolution is performed. This means that the response function of the Raman instrument and the measure of · · · · * · ί are calculated. **: 25 radius profile, which provides a more accurate treatment of the results. Raman- • · · v: Intensity Depth Function In Formula • · · • * * «· · oo i (z) = \ f (z - x) s (z) dx • * J '• · - oo • • * · • · »· * * * ·. F (z) is the response function of the Raman instrument, which is in the form f (z-x) when integrated over the sample thickness, and s (z) is a concentration profile not yet known * · '·· **. According to the convolution theorem, the following holds: i (z) = f (z) s (2), • * 5 117909, where capital letters represent Fourier transforms of corresponding functions. The function s (z) describing the concentration profile is calculated from the formula 5 / ,,, · which, by the inverse Fourier transform, finally yields the function s (z) representing the concentration.

Kuvio 2A havainnollistaa keksinnön mukaista mittausjärjestelystä.Figure 2A illustrates a measuring arrangement according to the invention.

10 Esitetty mittausjärjestely käsittää mikroskoopin 23, immersio-objektiivin 24, ja Raman-spektrometrin 25, jossa on virittävän valon lähteenä laser 26, analyysin suorittamiseksi. Lisäksi mittausjärjestely käsittää preparaattilasin 29, jonka päälle näyte 21 asetetaan, peitinlasin 22, sekä ensimmäisen 28 ja toisen 27 immersionesteen. Kuviossa on myös esitetty Raman-spektri 30, joka saadaan 15 spektrometrin analyysin tuloksena ja jonka juovista saadaan tietoa näytteen kemiallisista ominaisuuksista. Preparaattilasin 29 ja objektiivin 24 väliin muodostuvaa pinoa puristetaan tiukasti yhteen ennen analysointia, jotta kerrosten väliin ei jäisi taitekertoimen epäjatkuvuuksia aiheuttavaa ilmaa. Mainittua pinoa voidaan liikuttaa pystysuunnassa haluttaessa fokusoida näytteen 21 eri sy-20 vyyskohtiin. Tätä varten mittausjärjestelyyn voi kuulua säätö, jolla objektiivin 24 • · * ja näytteen 21 välistä etäisyyttä säädetään. Objektiivissa 24 voi olla esimerkik-: .* si pietsosähköiseen ilmiöön perustuva säätömahdollisuus, jolloin etäisyyttä voidaan säätää tietokoneen avulla ja säätövara voi olla esimerkiksi 100 pm.The measuring arrangement shown comprises a microscope 23, an immersion lens 24, and a Raman spectrometer 25 with laser 26 as the source of excitation light. Further, the measuring arrangement comprises a preparation glass 29 on which sample 21 is placed, a cover glass 22, and a first immersion liquid 28 and 27. The figure also shows the Raman spectrum 30, which is the result of an analysis of 15 spectrometers, the bands of which provide information on the chemical properties of the sample. The stack formed between the preparation glass 29 and the lens 24 is tightly pressed together prior to analysis to avoid trapping air refractive index intermittent air. Said stack may be moved vertically if desired to focus on different depths of sample 21. To this end, the metering arrangement may include an adjustment to adjust the distance between the lens 24 • · * and sample 21. The lens 24 may have, for example: * a piezoelectric adjustment capability, whereby the distance can be controlled by a computer and the adjustment margin may be, for example, 100 µm.

* · :.*·· Etäisyyden säätö voi myös olla mekaaninen ja järjestetty mikroskooppiin. X-y 25 tason säätö voi tapahtua mikrometriruuvien avulla. Säädettäessä objektiivin 24 :*·*: ja näytteen 21 välistä etäisyyttä, objektiivin 24 ja peitinlasin 22 välisen immer- sionestekerroksen 28 paksuus muuttuu.* ·:. * ·· The distance adjustment can also be mechanical and arranged in a microscope. The X-y 25 level can be adjusted using micrometer screws. By adjusting the distance between the lens 24: * · *: and the sample 21, the thickness of the layer of impregnation fluid 28 between the lens 24 and the cover glass 22 changes.

:·. Kuvion 2A esittämällä mittausjärjestelyllä voidaan tutkia esimerkiksi • · · paperinpäällystettä jopa 30 pm syvyyteen asti. Kuivalla näytteellä eli valon kul- • · *" 30 kiessa ilmassa objektiivin ja näytteen välissä päästään vastaavasti vain noin 4 * pm syvyyteen. Raman-spektrometri 25 voi olla esimerkiksi konfokaali-Raman- • · · spektrometri, jossa neulanreikärakenne parantaa paikkaresoluutiota eli rajoit- : *·. taa fokuspisteen ulkopuolella tapahtuneesta Raman-sironnasta syntyneiden « · · * ”*/. fotonien pääsyä detektorille. Immersio-objektiivin 24 kanssa voidaan käyttää * * 6 117909 esimerkiksi objektiivivalmistajan toimittamaa immersioöljyä 28, jonka taitekerroin on hyvin lähellä peitinlasin 22 taitekerrointa. Toinen immersioneste 27, jonka valinta on tämän keksinnön kannalta keskeisessä asemassa, voi käytettävän näytteen taitekertoimesta, Raman-spektristä, virittävän valon aallonpi-5 tuudesta ja fluoresenssista riippuen olla esimerkiksi silikoniöljyä, glyseriiniä, ksyleeniä, tolueenia, nestemäistä teflonia tai vettä. Toiseksi immersionesteeksi 27 ei voi valita nestettä, joka aiheuttaa muutoksia näytteen 21 koostumukseen. Siksi esimerkiksi näytettä liuottavia aineita ei voi käyttää. Immersio-obkektiivin 24 valmistajan toimittama immersioöljy 28 toimii hyvin myös mitta- f 10 usjärjestelyn toisena immersionesteenä 27, mikäli näytteen 21 taitekerroin on lähellä immersioöljyn 28 taitekerrointa mutta näytteen Raman-spektri ei ole immersioöljyn 28 kanssa päällekkäinen. Hyvän paikkaresoluution vuoksi ensimmäisen immersionesteen 28 ja peitinlasin 22 Raman-sironta eivät vaikuta häiritsevästi fokuspisteestä mitattuun Raman-spektriin. Tyypillisiä näytteitä 21, 15 joita voidaan analysoida keksinnön mukaisella mittausjärjestelyllä, ovat muun muassa monikerrospolymeerikalvot, paperinpäällysteet sekä valoa sirottavat pinnoitteet ja maalit.·. The measuring arrangement shown in Fig. 2A can be used to examine, for example, • · · paper coatings up to a depth of 30 µm. The dry specimen, i.e., the light angle of 30 · air in the air between the lens and the specimen, respectively, reaches only about 4 * pm. The Raman spectrometer 25 may be, for example, a confocal Raman spectrometer with a pinhole structure for improved * · Ensures access to the detector of photons from Raman scattering outside the focal point * * 6 117909 can be used with an immersion lens 24, for example, an immersion oil 28 supplied by a lens manufacturer with a refractive index very close to the refractive index of the cover 22. Depending on the refractive index, Raman spectrum, excitation light wavelength, and fluorescence of the sample used, the immersion liquid 27, the selection of which is central to the invention, may be, for example, silicone oil, glycerin, xylene, toluene, liquid teflon or water. i select the liquid that causes changes in the composition of sample 21. Therefore, for example, sample dissolving agents cannot be used. The immersion oil 28 supplied by the manufacturer of the immersion lens 24 also functions well as a second immersion fluid 27 of the measuring arrangement if the refractive index of sample 21 is close to that of immersion oil 28 but the Raman spectrum of the sample does not overlap. Due to the good position resolution, the Raman scattering of the first immersion liquid 28 and the cover glass 22 does not interfere with the Raman spectrum measured from the focal point. Typical samples 21 which can be analyzed by the measuring arrangement according to the invention include, inter alia, multilayer polymer films, paper coatings, and light scattering coatings and paints.

Kuvio 2B havainnollistaa keksinnön mukaisen mittausjärjestelyn toista edullista suoritusmuotoa, jossa mikroskoopin 23 objektiivin 24 kanssa ei 20 käytetä peitinlasia, vaan objektiivin 24 ja näytteen 21 sekä myös 21 näytteen ja preparaattilasin 29 välinen tila täytetään yhdellä immersionesteellä 27’. Muil-Figure 2B illustrates another preferred embodiment of the measuring arrangement according to the invention, in which the lens 24 of the microscope 23 is not covered with a cover glass but the space between the lens 24 and sample 21 as well as 21 samples and preparation glass 29 is filled with one immersion liquid 27 '. directed to other

t * It * I

.! . ta osin kuvion 2B suoritusmuoto vastaa kuvion 2A suoritusmuotoa..! . in part, the embodiment of Figure 2B corresponds to the embodiment of Figure 2A.

* · · • · * I Immersionesteen 27’ valintaan pätevät samat periaatteet kuin kuvi- ··» on 2A toisen immersionesteen valintaan. Tärkein ehto on, että immersiones- φ * · '· *: 25 teen 27’ taitekerroin on mahdollisimman lähellä näytteen 21 taitekerrointa.* The same principles for selecting the immersion liquid 27 'apply as in FIG. 2A for selecting the second immersion liquid. The most important condition is that the refractive index of the immersion φ * · '· *: 25 tea 27' is as close as possible to the refractive index of the sample 21.

: Immersionesteen 27’ Raman-spektri ei saa olla liian voimakas tai näytteen 21 * * * v : Raman-spektrin kanssa päällekkäinen eikä immersioneste 27’ saa aiheuttaa muutoksia näytteen 21 ominaisuuksiin.: The Raman spectrum of the immersion liquid 27 'must not be too strong or overlap with the Raman spectrum of the sample 21 * * * v and the immersion liquid 27' must not cause any change in the properties of the sample 21.

·*·.. On ymmärrettävä, että edellä oleva selitys ja siihen liittyvät kuviot ;***; 30 on ainoastaan tarkoitettu havainnollistamaan esillä olevaa keksintöä. Alan am- * · * * , mattimiehelle tulevat olemaan ilmeisiä erilaiset keksinnön variaatiot ja muun- [ ’ nelmat ilman että poiketaan oheisissa patenttivaatimuksissa esitetyn keksin- • · *···* nön suojapiiristä ja hengestä.· * · .. It is to be understood that the above description and the accompanying figures; ***; 30 is merely intended to illustrate the present invention. Various variations and modifications of the invention will be apparent to those skilled in the art without departing from the scope and spirit of the invention as set forth in the appended claims.

• · ·*· • · · ··· · t• · · * · • · · ··· · t

Claims

A method of analyzing a sample (21) at Raman spectroscopy, in which method an immersion liquid (27 ') is selected such that a refractive coefficient of the immersion liquid (27') is substantially the same as a refractive coefficient of the sample (21). ) being examined, a space between an objective (24) and the sample (21) is filled with the immersion liquid (27 '), the molecules of the sample (21) are excited by monochromatic light,

A method of analyzing a sample (21) at Raman spectroscopy, in which method: a cover glass (22) is used under a lens (24), ··· v: a space between the lens (24) and the cover glass (22) is filled with a "· *: first immersion liquid, ♦ · · · ·: * The molecules (21) of the sample (21) are excited by monochromatic light, Raman scattered light is collected and analyzed from the sample (21) by a" ♦ 25 spectrometer ( 25), characterized in that in the process a space is filled between the cover glass (22) and the sample (21) with a second immersion liquid (27), said second immersion liquid (27) being selected such that a refractive index: # j "efficiency of the second immersion fluid (27) is essentially the same as a refractive coefficient for the sample (21) being analyzed, ·: · *: as other immersion fluid (27), such a fluid which is substantially non-Raman is selected. active, the molecules of the sample (21) are excited by monochromatic noise is propagated from said lens (24) to the sample, and ♦ Raman scattered light is collected from the sample (21) with said lens (24) for further transmission to the spectrometer.

3. A method according to claim 1 or 2, characterized by a reduced immersion liquid (27, 27 ') is also applied during the sample (21). 5

Method according to any of claims 1-3, characterized in that the same liquid is selected as the first (28) and second (27) immersion liquid.

Method according to any of claims 1-4, characterized in that the sample (21) is analyzed at different depth points by adjusting the distance between the objective (24) and the sample (21).

A measurement arrangement for performing Raman spectroscopy, comprising a sample (21), an immersion lens (24), a spectrometer (25), a monochromatic light cold (26), and an immersion liquid (27 '), whose refractive coefficient is substantially the same as the refractive coefficient of the sample (21) to fill a space between the objective (24) and the sample (21), characterized in that the immersion liquid on the surface (27 ') is such a liquid that is not substantially is Raman-active, that the monochromatic light generated by the cold (26) for monochromatic light is arranged to propagate to the sample (21) via said immersion objective (24), and that the immersion lens (24) is arranged to collect the Raman light scattered from the sample (21) for relaying to the spectrometer (25).

Measurement arrangement for performing Raman spectroscopy, which measurement arrangement comprises a sample (21), an immersion lens (24), a spectrometer: (25), a monochromatic light cold (26) , a cover glass (22), and a first immersion liquid (28) between the lens (24) and the cover glass (22), characterized in that the measuring arrangement comprises a second immersion liquid (27) • ·· * ... 30 between the cover glass (22) and the sample (21), which other immersion liquid has a coefficient of refraction which is substantially the same as the refractive coefficient of the sample (21) analyzed,: ***: other immersion liquid (27) is such a liquid that is not substantially Raman-active, with the cold (26) for monochromatic light generated the monocro-1 & mathematical light is arranged to propagate to the sample (21) via said immersion lens (24), and the immersion lens (24) is arranged to collect Raman scattered light from the sample (21) for forwarding to the spectrometer (25).

Measurement arrangement according to claim 7, characterized in that the first (28) and the second (27) immersion liquid are the same liquid.

Measurement arrangement according to any of claims 6-8, characterized in that immersion liquid (27, 27 ') is also used during the test (21). 10. Measurement arrangement according to any of claims 6 - 9, characterized in that the measuring arrangement comprises means for controlling a distance between the objective (24) and the sample (21) for analyzing the sample at different depth points.

Raman scattered light is collected and analyzed from the sample with a spectrometer (25), characterized in that in the method selected for use on the surface of the sample is such an immersion liquid (27 ') which is not substantially Raman-active, the sample (21) is excited by monochromatic light propagating from said lens (24) to the sample, and is collected from sample (21) Raman scattered light with said lens (24) for further transmission to the spectrometer.

Measurement arrangement according to any of claims 6-10, characterized in that the sample being analyzed (21) is a polymer film and the immersion liquid (27, 27 ') is silicone oil.

Measurement arrangement according to any of claims 6-11, characterized in that the sample (21) being analyzed is a paper coating and the immersion liquid (27, 27 ') is silicone oil. ·· »•« · · 1 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 1 ·· • «· · ·« * · • 1 ·· 1 • '• · • · · * · • «... ··· • · · · · 1 · ··· · · · · 1 • ·