FI111663B - Elektrokemiluminesenssin aikaerotteisen mittaustavan käyttö analyyttisiin tarkoituksiin - Google Patents

Description

111663 t

Elektrokemiluminesenssin aikaerotteisen mittaustavan käyttö analyyttisiin tarkoituksiin 20 Keksintö koskee ns. pitkäkestoista elektrokemiluminesenssia emittoivien leima-aineiden virittämistä käyttäen sähköpulsseja, jotka johdetaan mittausliuokseen tarkoitusta varten erityisesti valmistettujen elektrodien kautta. Virityksen jälkeen leima-aineista lähtevä elektromagneettinen säteily mitataan halutun ajan kuluttua virittämisen jälkeen mittalaitteella.

25

Immunodiagnostiset ja hybridisaatioon perustuvat mittausmenetelmät perustuvat miltei 1 yksinomaan tiettyjen molekyylien merkkaukseen toisilla helposti mitattavilla molekyyleillä, eli leima-aineilla. Tällaiset leima-aineet voivat olla radioisotooppeja, säteilyä absorboivia tai fluoresoivia yhdisteitä, entsyymejä, tai tiettyjä metallikelaatteja, 30 jotka on liitetty kovalenttisesti esimerkiksi vasta-aineeseen. Yleisimmin kiinteään materiaaliin sidotun vasta-aineen avulla määritettävä analyytti (A) valikoidaan 2 111663 äärimmäisen suuresta muiden molekyylien seoksesta. Useimmiten vasta-aineeseen taittuneet molekyylit mitataan toisen, myös selektiivisesti analyyttiin (A) kiinnittyvän leimatun vasta-aineen avulla. Voidaan myös leimata analyytti (A), jolloin sen avulla voidaan kilpailureaktiolla määrittää tuntemattoman näytteen analyytin (A) pitoisuus. Ns. 5 moniparametrianalyysi käyttää hyväksi useampaa erilaista leima-ainetta ja useampia vasta-aineita, jolloin samasta näytteestä voidaan mitata useamman analyytin pitoisuus.

On kehitetty laaja joukko erilaisia kaupallisesti tärkeitä menetelmiä, joissa nimenomaan leimaustekniikka ja leima-aineen mittaus ovat keskeisellä sijalla. Tekniikan tasoa 10 kuvataan esimerkiksi kujassa The Immunoassay Handbook, Edited by David Wild, Stockton Press, New yourk, 1994, sivuilla 1-618.

Monet orgaaniset yhdisteet ja sanotut metallikelaatit emittoivat voimakkaasti säteilyä kun ne on viritetty korkeampaan energiatilaan sopivin tavoin. Luminesenssiin perustuvat 15 menetelmät ovat siten yleensä äärimmäisen herkkiä, joten ne soveltuvat varsin hyvin esimerkiksi diagnostiikan sovellutuksiin. Herkkyyden alarajan määräävät monesti käytettyjen vasta-aineiden ominaisuudet eikä itse mittaus. Myös monet muut fysikaaliset ja kemialliset seikat voivat huonontaa mittaustuloksia.

20 Leima-aineiden virittäminen voidaan saada aikaan monilla eri tavoilla. Yleisimmin käytetään valoa, mutta viritys voidaan myös saada aikaan sähköisesti. Se tehdään yksinkertaisessa kennossa, jossa on ainoastaan sopivat elektrodit, joille johdetaan .· jännitepulsseja. Tarvittava laitteisto on huomattavasti yksinkertaisempi ja halvempi kuin valolla viritettäessä, koska ei tarvita kalliita ja herkkiä optisia komponentteja. Sähköinen 25 viritys voidaan toteuttaa sekä vesiliuoksissa, joissa bioaffmeteettimääritykset lähes aina suoritetaankin, että myöskin vedettömissä liuottimissa.

Vedettömissä liuottimissa sähköiseen viritykseen käytetään tavallisesti aktiivisia metallielektrodeja (esim. Pt ja Au), joita ei varsin pienillä potentiaaleilla esiintyvien 30 hapen- ja vedynkehitysreaktioiden vuoksi voida käytännössä lainkaan käyttää himinoforien virittämiseen vesiliuoksissa. Sensijaan eristepintaiset metallielektrodit (esim. oksidipintainen alumiinielektrodi) soveltuvat tähän tarkoitukseen erinomaisesti, « 3 111663 sillä eristävä oksidikerros antaa mahdollisuuden tuottaa vesiliuokseen samanaikaisesti erittäin hapettavat ja pelkistävät olosuhteet, jolloin energeettisten redox-reaktioiden seurauksena on mahdollista tuottaa virittyneessä tilassa olevia luminoforimolekyylejä, jotka perustilaan palatessaan emittoivat tyypillistä (elektrokemi)luminesenssia (EKL). 5 Tällaisia elektrodeja on kuvattu tarkemmin patenttihakemuksessa Kulmala et ai. FI 970593. Tällöin on mahdollista virittää samanaikaisesti optisilta ja redox-ominaisuuksiltaan hyvinkin erilaisia luminoforga, ja käyttää detektointiin aUonpituusdiskriminaatiota. Näin pystytään sähköisen virityksen jälkeen mittaamaan erilaisia leima-aineita samanaikaisesti, jos ne emittoivat eri aallonpituuksilla. Usein 10 kuitenkin leima-aineiden emissiovyöt ovat suhteellisen leveitä, mikä rajoittaa kovin usean leiman käyttöä.

Tämän keksinnön mukaisesti havaittiin että, jos leima-aineina käytetyt luminoforit valitaan sopivasti, on edelläkuvatuilla eristepintaisilla elektrodeilla mahdollista tuottaa 15 myös näiden luminoforien pitkäikäistä luminesenssia. Tällöin voidaan soveltaa aikaerotteista mittaustapaa, jossa luminoforien emittoima spesifinen, pitkäikäinen luminesenssi rekisteröidään vasta sen jälkeen, kun lyhytikäinen taustaluminesenssi on sammunut. Tällöin saavutetaan yleensä erittäin alhaiset toteamisrajat ja erinomainen signaali/kohina-suhde.

20

Aikaerotteisuudella tässä keksinnössä tarkoitetaan sitä että sähköisen virityspulssin jälkeen erilaisista leima-aineista saadaan emissiopulssi eri ajoin ja sen kesto on eri pituinen eri molekyyleillä. Tässä keksinnössä ei oteta kantaa siihen johtuuko viivästynyt emissio hitaasta kemiallisesta reaktiosta vai virittyneen tilan hitaasta purkautumisesta 25 virittyneellä molekyylillä. Ainoastaan jälkimmäinen ilmiö tapahtuu kun luminoforeja viritetään valolla, ja silloinkin hyvin harvinaisissa tapauksissa.

Aikaerotteinen mittaus on sinänsä ennestään tunnettuja käytetty lantanidi-ionien kelaattien yhteydessä käyttäen fotoeksitaatiota (I. Hemmilä, "Applications of 3 0 Fluorescence in Immunoassays", John Wiley & Sons, New York, 1991.

Tällöin päämääränä on ollut alhaisen taustasignaalin saavuttaminen sulkemalla pois epäspesifinen näytteen luminesenssin komponentti. Aiemmin on luultu, että 4 111663 aikaerotteinen detektiotapa soveltuu vain sähköisesti viritettyjen Tb(III) ja Eu(HI) kelaattien määrittämiseen, koska vain lantanidikelaattien lmninesenssin elinikä on teroriassa riittävän pitkä aikaerotteista detektiota varten (Kankare et ai., UK Patent GB 2 217 007 B ). Kuitenkin teorian vastaisesti olemme yllättäen havainneet, että useat 5 orgaaniset luminoforit ja transitiometallien organometalliyhdisteet tuottavat pitkäikäistä luminesenssia sähköisen virityksen tapauksessa, vaikka kyseistä luminoforia valolla viritettäessä pitkäikäistä luminesenssia ei syntyisikään.

Tämän keksinnön mukaisesti, voidaan käyttää muun tyyppisiä kuin edellä mainittuja 10 lantanidikelaatteja luminoforeina aikaerotteisissa mittauksissa sähköisesti viritettäessä.

Keksinnön toisena erittäin merkittävänä etuna on se, että käyttämällä sekä aallonpituusdiskriminaatiota että aikaerotteisuutta, voidaan käyttää noin kaksinkertaista määrää samasta näytteestä mitattavia leima-aineita. Näin ollen esimerkiksi kolmen 15 leiman sijasta voidaan käyttää kuutta erilaista leima-ainetta ja voidaan mitata samasta näytteestä kuutta analyyttiä. Tämä alentaa huomattavasti analyysikustannuksia, mihin nykyisin pyritään terveydenhuollossa. Toisaalta voidaan myös saavutettua etua hyödyntää erilaisilla mittauksen sisäisillä varmistuksilla, niin että esimerkiksi yhtä leima-ainetta käytetään sisäisenä kontrollina. Moniparametrimittauksissa voidaan myös 20 määrittää eri analyyttien suhdetta ja päästä näin huomattavaan mittausvarmuuden kasvuun ja/tai saada mittauksesta laadullisesti uutta tietoa kuten on esitetty esimerkiksi patenttijulkaisussa Katroukha et ai. FI 960167 kahdessa eri muodossa esiintyvän ’ · ‘ troponiini I:n tapauksessa.

25 Sähköistä viritystä käyttämällä keksinnössä kuvatulla tavoin saavutetaan myös huomattavia laiteteknisiä etuja. Keksinnön mukaisesti voidaan helposti virittää yhtäaikaisesti kaikki leima-aineet yksinkertaisella ja halvalla laitteella. Koska viritys ,· tapahtuu sähköisten pulssien avulla, voidaan myös emittoituneen valon mittaus helposti ja tarkasti synkronoida emittoituneen valon mittaukseen. Tämä on tärkeää 30 aikaerotteisessa mittaustavassa, jossa on mitattava tietty tarkalleen määrätty aika sähköisen virityspulssin jälkeen.

i 5 111663 detektointiin perustuviin menetelmiin erityisesti moniparametristen määritysten kyseessä ollessa. Käytettäessä tämän keksinnön mukaista aikaerotteista mittaustapaa, saavutetaan huomattavasti alhaisemmat toteamisrajat ja laajemmat lineaariset vastealueet kuin aiemmin esitetyillä detektointimenetelmillä.

5

Keksinnön tavoitteena on aikaerotteista mittaustapaa hyödyntävä laitteisto, jolla useat erityyppiset leima-aineet voidaan virittää siten, että niitä voidaan hyödyntää bioaffmiteettiin perustuvissa analyyseissä.

10 Tavoitteeseen päästään virittämällä leimamolekyylit ennestään tunnetuilla eristepintaisilla metalli- tai puolijohde-elektrodeilla, mutta siten että hyödynnetään lisäksi aikaerotteista mittaustapaa, jolle on tunnusomaista patenttivaatimusten 1-2 esittämät periaatteet.

15 Oksidipintaisella alumiinielektrodilla on kokeellisesti todettu saavutettavan samanaikaisesti erittäin voimakkaat hapettavat ja pelkistävät olosuhteet, kun sopivia yhdisteitä on läsnä kohdennettaessa elektrodin kautta voimakkailla katodisia polarisaatiopulsseja. Näitä ilmiöitä on kuvattu mm. S. Kulmalan väitöskirjatyössä (Electrogenerated lanthanide(III) luminescence at oxide-covered aluminum electrodes 20 and closely related studies, Tumn yliopisto, 1995) sekä julkaisuissa J. Kankare, K. Fälden, S. Kulmala and K. Haapakka, Anal. Chim. Acta, 1992, 256, 17 ja S. Kulmala, T. Ala-Kleme, L. Heikkilä, ja L. Väre, J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1997, 93, 3107. Vaikka ensimmäisissä tutkimuksissa luultiinkin itse alumiinimetallin olevan tärkein tekijä luminesenssin syntymisessä, niin myöhemmin selvisi, että metallin pinnalla 25 oleva 2-3 nm paksu oksidikerros mahdollisti energeettisten intermediaattien, kuten hydratoituneiden elektronien ja sulfaattiradikaalin, ja täten luminesenssin syntymisen elektrodin katodisen pulssituksen aikana. Myöhemmin on todettu myös n- ja p-... tyyppisten piielektrodien pinnalle muodostuvan oksidikerroksen toimivan samalla tavoin mahdollistaen luminoforien EKL:n syntymisen myös näillä elektrodeilla, jotka 30 varsinkin elektroniikkateollisuudessa ovat varsin yleisesti käytettyjä ja siksi hyvin tunnettuja. Kaikkien metallien tai puolijohteiden pinnalle muodostuva oksidikerros ei kuitenkaan toimi tällaisena eristävänä kerroksena, jonka läpi ns. kuumien elektronien siirtyminen vesiliuokseen olisi mahdollista. Esimerkiksi tantaalioksidipintaisia 6 111663

Kaikkien metallien tai puolijohteiden pinnalle muodostuva oksidikerros ei kuitenkaan toimi tällaisena eristävänä kerroksena, jonka läpi ns. kuumien elektronien siirtyminen vesiliuokseen olisi mahdollista. Esimerkiksi tantaalioksidipintaisia tantaalielektrodeja ei voida käyttää työelektrodeina tällaisissa sovellutuksissa, vaikka patenttijulkaisussa UK 5 Patent GB 2 217 007 B näin virheellisesti väitetäänkin, koska tantaalioksidi on luokiteltavissa n-tyypin puolijohteeksi ( S. Morrison, Electrochemistry at Semiconductor and Oxidized Metal Electrodes, Plenum Press, New York, 1980, s.183), ja ei siten toimi eriste-elektrodina.

10 Eristepintaisten elektrodien käyttökelpoisuus perustuu pääasiassa siihen, että elektrodin pohjametalli voidaan saattaa hyvin katodiseen tai anodiseen potentiaaliin, jolloin ns. kuumien elektronien tunneloituminen joko suoraan tai epäsuorasti, esim. elektronivyöryn seurauksena, oksidikerroksen johtavuusvyöltä veden johtavuusvyölle, ja tätä seuraava hydratoituneiden elektronien syntyminen on mahdollista. Nämä kuumat 15 ja hydratoituneet elektronit ovat vesiliuoksissa syntyvän katodisen elektrokemiluminesenssin tärkeimmät primaariset intermediaatit (S. Kulmala, A. Kulmala, T. Ala-Kleme ja J. Pihlaja, Anal. Chim. Acta 1998, 367, 17; S. Kulmala, T. Ala-Kleme, M. Latva, K. Loikas ja H. Takalo,. J. Fluores. 1998, 8, 59). Tällaisia energeettisiä redox-reaktioita ei ole mahdollista aikaansaada millään aktiivisella 2 0 metallielektrodilla vesiliuoksessa. Näissä reaktioissa hydratoituneiden elektronien lisäksi keskeisiä intermediaatteja ovat peroksodisulfaatista yksielektronisella pelkistymisellä syntyvä sulfaattiradikaali, vetyperoksidista tai kiinteän tilan elektroluminesenssin : ‘ mekanismilla syntyvä hydroksyyliradikaali 2 5 Sekä sulfaattiradikaali että hydroksyyliradikaali ovat erittäin vahvoja hapettimia, jotka kykenevät hapettamaan monet orgaanisetkin yhdisteet vesiliuoksessa varsin nopeasti. Näistä sulfaattiradikaali on kuitenkin luminoforien virittämiseen käyttökelpoisempi, .; koska sillä ei ole kovin suurta taipumusta sivureaktioihin, kun taas hydroksyyliradikaali osallistuu varsin helposti additio- ja vedynpoistoreaktioihin.

Keksinnössä työelektrodien pohjamateriaaleina käytetään johtavia metalleja tai puolijohteita, kuten Be, Mg, AI, Ga, In, Au, Pt, Cu, Fe, Ru, ruostumaton teräs, Zn, Hg, 30 111663

Ag, Ni, Pd, Hf, Zr tai Si, Ge tai jokin metallioksidi. Työelektrodin pinnalla oleva ohut kalvo voi alumiinioksidin lisäksi olla esim. Si02, MgO, CaO, SrO, BaO, Hfö2 tai jokin muu epäorgaaninen eriste, kuten timantti jokin silikaatti tai nitridi. Myös orgaaniset eristeet, kuten parafiini, teflon, polyeteeni, polystyreeni ja epoksimuovit jne. soveltuvat 5 eristäviksi kalvoiksi johtavan elektrodimateriaalin päälle. Jos elektrodin pinnalla käytetään eristemateriaalina metallioksidia, on luminoforien virityksessä käytettävä pulssimuotoista jännitettä, sillä katodinen tasajännite pilaa oksidikerroksen eristävät ominaisuudet jo muutamassa millisekunnissa.

10 Vaikka esimerkiksi alumiinin tapauksessa jo ilmassa itsestään muodostuva, noin 2-3 nm paksu oksidikerros riittääkin sellaisenaan lukuisten erityyppisten leima-aineiden perustana olevien luminoforien virittämiseen, kun elektrodille johdetaan voimakas katodinen polarisaatio, niin tällaisten eristekalvojen laatua voidaan parantaa ja tehdä paksumpiakin kalvoja useilla eri tekniikoilla. Tehokkaita menetelmiä ovat mm. anodinen 15 oksidointi (jos pohjametalli on anodisesti oksidoituva), ALE (Atomic Layer Epitaxy), CVD (Chemical Vapor Deposition), MBE (Molecular Beam Epitaxy), Langmuir-Blodgett-päällystys sekä erilaiset suihkutus- ym. tekniikat. Edellä kuvatut epäorgaaniset kalvot voidaan korvata myös kokonaan orgaanisilla eristekalvoilla, kunhan edellä esitettyjen, EKL:n syntymisen kannalta keskeisten, radikaalien 20 syntyminen varmistetaan. Tämä voidaan tehdä lisäämällä liuokseen peroksodisulfaattia, peroksodifosfaattia, vetyperoksidia tai muuta yhdistettä, joka yksielektronisella pelkistymisellä tuottaa reaktiivisia intermediaatteja.

• · *

Aikaerotteista mittaustapaa on sovellettu immunoanalytiikkaan pitkäikäistä 25 luminesenssia tuottavien tiettyjen Tb(III) ja Eu(III)-kelaattien yhteydessä, mutta tässä keksinnössä sitä sovelletaan orgaanisten luminoforien ja transitiometallikelaattien detektointiin. Tällöin luminoforin emittoima luminesenssi rekisteröidään vasta, kun .! potentiaalipulssin loppumisesta on kulunut tietty viiveaika. Tällöin lyhytikäinen taustaluminesenssi on ehtinyt sammua, jolloin se ei vaikuta häiritsevästi analyytti-30 spesifiseen luminesenssiin. Tällöin saavutetaan tavallisesti erittäin alhaiset toteamisrajat useille luminoforeille.

8 111663

Periaatteessa käyttökelpoisia vaihtoehtoisia menettelytapoja bioaffiniteettimääritysten tekemiseksi on määritysten tekeminen kertakäyttöisten elektrodien pinnalla tai muun kiinteän kantajan, kuten magneettisten lateksipartikkelien pinnalla, joka vasta leimojen detektiovaiheessa tai juuri ennen sitä tuodaan elektrokemiluminesenssia tuottavan 5 elektrodin pinnalle.

Keksinnössä käytettävistä käyttökelpoisista leima-aineista ovat esimerkiksi seuraavien orgaanisien luminoforien johdannaiset: luminoli (emissio 420 nm), eosiini ja fluoreskeiini (emissio 516 nm), eräiden transitiometallikelaattien johdannaiset, kuten 10 esim. rutenium(II) ja osmium(II) -trisbipyridyyli ja trispyratsyylikompleksien (emissio alueella 550 - 650 nm) johdannaiset, Pt- ja Pd-porfyriinit ja niiden johdannaiset, salisyylaattijohdannaiset (emissioi alueella 400-450 nm), aminonaftaleenisulfonaattien johdannaiset (emissio alueella 400-500 nm) ja kumariinit (emissio alueella 450 nm - 550 nm), luminoivat proteiinit jne.

15

Katodisen viritystavan ollessa kyseessä työelektrodin tulee olla edellä kuvatut vaatimukset täyttävä, jolloin se voi johtavan materiaalin optisista ominaisuuksista ja paksuudesta riippuen olla joko optisesti läpinäkyvä tai läpinäkymätön. Yleensä riittävän ohuiden pohjamateriaalina olevien metallikalvojen transmittanssi on tarpeeksi suuri 20 halutulla optisella alueella. Läpinäkyvä työelektrodi mahdollistaa sähköisesti viritetyn luminesenssin mittaamisen työelektrodin läpi. 1

Vastaelektrodin materiaalin valinta menetelmässä ei ole kriittistä. Perinteiset inertit elektrodimateriaalit (Pt, Au) toimivat hyvin. Usein voidaan käyttää myös metalleja, 25 jotka liukenevat lievästi anodisesti, koska mittaukset yleensä tehdään aikaskaalassa, jossa anodiset tuotteet vasta- tai apuelektrodilta eivät ehdi diffimtoitua työelektrodille. Myös eräät metallioksidikalvot, kuten indiumtinaoksidi, sopivat hyvin anodimateriaaliksi. Tällöin anodimateriaali saadaan optisesti läpinäkyväksi. Ruostumaton teräs on myös edullinen elektrodimateriaali. Jos vastalektrodina käytetään 30 läpinäkymätöntä metallielektrodia, sen muoto voidaan valita siten, että luminesenssi voidaan mitata vastaelektrodin takaa. Tällöin käytetään esimerkiksi lankaelektrodia, joka peittää vain hyvin pienen osan työelektrodin pinnasta tai anodimateriaaliin on s 111663 porattu sopivan kokoinen/kokoiset reikä/reiät. Optisesti läpinäkyvä vastaelektrodi voidaan myös valmistaa riittävän ohuesta metallikalvosta tai johtavasta metallioksidikalvosta kuten esimerkiksi pinnoittamalla muovi- tai lasilevy ohuella Au-tai indiumtinaoksidikalvolla.

5

Jos työelektrodin eristekerroksen paksuus on sopiva, leiman detektiovaiheessa virittäminen voidaan suorittaa katodisella jännitepulssijonolla, mutta jos pohjamateriaali on anodisesti oksidoituvaa materiaalia kuten Si, AI, Be tai Mg voidaan oksidikerrosta vahvistaa ennen kutakin katodista virityspulssia anodisesti oksidoivalla anodisella 10 pulssilla.

Analyytin määritysalueen herkkyydestä riippuen elektrokemiluminometrissä voidaan käyttää valon detektointiin joko halpaa puolijohdedetektoria tai äärimmäistä herkkyyttä vaativien analyyttien kyseessä ollen valomonistinputkea. Oleellista kuitenkin on, että 15 detektorin vaste on riittävän nopea aikaerotteisia mittauksia varten.

Eräissä tilanteissa, kuten sisäisen standardoinnin yhteydessä, on edullista seurata kahta leima-ainetta, jotka emittoivat samalla aallonpituudella, mutta niin, että toisen luminesenssi on hyvin lyhyt- ja toisen hyvin pitkäkestoista. Tällöin parametrit valitaan 20 niin, että lyhytkestoisella luminesenssilla seurataan parametria, josta aiheutuva virityspulssin aikainen signaali on niin suuri, ettei pitkäkestoisen luminesenssin signaalilla ole merkittävää osuutta kokonaissignaalista virityspulssin aikana. Tällöin parametri, josta aiheutuva signaali on pieni, voidaan tarkasti määrittää aikaerotteisen luminesenssin mittauksen perusteella.

25

Keksinnön mukaisesti konstruoidulla laitteella voidaan mitata kahta analyyttiä samasta näytteestä tai yhtä näytettä ja yhtä sisäistä standardia. On kuitenkin helppo konstruoida laitteita, joissa on useampi ilmaisin ja missä jonkin dispersiivisen elementin kuten prisman tai nykyaikaisin epälineaarisen optiikan keinoin eri aallonpituusalueet ohjataan 3 0 eri detektoreille.

10 111663

Seuraavassa keksintöä havainnollistetaan edelleen kaaviokuvin sekä ei-rajoittavin esimerkein ja niihin liittyvin kuvin.

Kuva 1. esittää keksinnössä käytettäviä elektrodeja ja luminesenssinmittauslaitteistoa 5 yleisesti. Työelektrodi koostuu johtavasta pohjamateriaalista, P, ja sen pinnalla olevasta ohuesta eristekerroksesta E katodisen viritystavan ollessa kyseessä. Se voi koostua yhdestä tai useammasta samaa tai eri eristemateriaalia olevasta kerroksesta E}, E2 ....En. Työelektrodi voi olla valoa läpäisemätön tai valoa läpäisevä. Valoa läpäiseviä työelektrodeja käytettäessä valon mittaus voi tapahtua työelektrodin läpi detektorilla 10 ΐ>2· Menetelmässä kaksielektrodikenno on yleensä riittävä, mutta myös perinteistä kolmielektrodikennoa voidaan käyttää, joka koostuu edellä kuvatusta työelektrodista ja johtavasta apuelektrodista ja vertailuelektrodista kuten Ag/AgCl-elektrodista. Työelektrodi (tai apuelektrodi) voidaan aina valita geometrialtaan sellaiseksi, että valonmittaus tapahtuu vastaelektrodin suunnasta (detektori Dj) riippumatta siitä onko 15 vastaelektrodi (tai apuelektrodi) valoa läpäisevä tai valoa läpäisemätön. Kun työelektrodi ja vastaelektrodi ovat molemmat valoa riittävästi läpäiseviä, kaksoisleimaus ja valon mittaus kahdella eri aallonpituudella (suotimet S] ja S2) voi tapahtua äärimmäisen yksinkertaisesti ilman kallista optiikkaa tai säteenjakajaa. Valodetektorit Dj ja D2 voivat olla valomonistinputkia, mutta myös muut epäherkemmät detektrorit 20 ovat käyttökelpoisia, kun analyyttipitoisuudet ovat riittävän suuria.

Valonmittauslaitteisto koostuu sovellutuksesta riippuen joko yksi- tai useampikanavaisesta portitetusta integraattorista tai fotonilaskurista oleellista kuitenkin : on, että kullakin detektorilla voidaan mitata valoa halutussa aikaikkunassa virityspulssin loppumiseen nähden.

25

Kuva 2. Kaaviokuva kertakäyttöisestä ohutkerroskennosta sivulta päin. Kenno on valmistettu kahdesta optisesti läpinäkyvästä osasta, jotka sisältävät nesteensiirto- putket ,!t ja jätetilan muodostavat urat. Toinen kennon puolikkaista sisältää työelektrodin ja toinen vastaelektrodin. (1) Johdekalvo, joka toimii biopinnoitettuna työelektrodina; (2) 30 työelektrodin sähköinen kontakti; (3) näytteen ja puskurin syöttöputki; (4) putki jäteillään; (5) jätetila; (6) ilman poistoputki; (7) ruostumattomasta teräksestä valmistettu vastaelektrodi; (8) aukko vastaelektrodissa valonmittausta varten; (9) sähköinen u 111663 kontakti vastaeiektrodiin. Työelektrodi (1) voi myös olla optisesti läpinäkyvä mahdollistaen valonmittauksen työelektrodin läpi, jolloin vastaelektrodi voi olla mm ruostumatonta terästä eikä siinä tarvita aukkoa (8) valonmittausta varten. Työelektrodi on tyypillisesti eristepintainen, pii-, alumiini-, tai magnesiumelektrodi.

5

Kuva 3. Ru(bpy)32+ -kelaatin kalibraatiokäyrä perustuen elektrokemiluminesenssin aikaerotteiseen mittausmenetelmään.

10 Kuva 4. Eosiinin kalibraatiokäyrä perustuen elektrokemiluminesenssin aikaerotteiseen mittausmenetelmään

Kuva 5. Luminolin kalibraatiokäyrä perustuen elektrokemiluminesenssin aikaerotteiseen mittausmenetelmään.

15

Kuva 6. PtCP:n kalibraatiokäyrä perustuen elektrokemiluminesenssin aikaerotteiseen mittausmenetelmään oksidipintaisilla magnesiumelektrodeilla.

Kuva 7. PtCP:n kalibraatiokäyrä perustuen elektrokemiluminesenssin aikaerotteiseen 2 0 mittausmenetelmään oksidipintaisilla alumiinielektrodeilla

Kuva 8. PtCP.n kalibraatiokäyrä perustuen elektrokemiluminesenssin aikaerotteiseen : ’ mittausmenetelmään oksidipintaisilla piielektrodeilla 2 5 Kuva 9. B2-mikroglobuliinin immunometrisen määrityksen kalibraatiokäyrä.

Kuva 10. hTSH:n immunometrisen määrityksen kalibraatiokäyrä.

Kuva 11. Luminolin kalibraatioköyrä liuoksessa, joka sisältää 7-hydroksi-4- 3 0 metyylikumariinia.

12 111663

Esimerkki 1. Ruteniuin(II)tris(2,2'-bipyridiinin) määritys vesiliuoksesta

Ru(bpy)3+ (bpy = 2,2 '-bipyridiini) määritettiin aikaerotteisesti Arcus-luminometrillä 0,05 M Na2B407-puskurissa (pH on 9,2), johon oli lisätty 0,1 M natriumsulfaattia sekä 5 10'3 M peroksodisulfaattia. Työelektrodeina käytettiin 12-hampaisia alumiiniharavia, joihin oli tehty tyhjiöhöyrystämällä tasainen oksidikerros. Määrityksissä harava asennettiin erityiseen muovikennoon, jonka kuhunkin näytepaikkaan pipetoitiin 250 μΐ tutkittavaa liuosta. Määrityksissä elektrokemiluminesenssin rekisteröitiin käytettiin 1,5 ms:n aikaikkunaa, kun virityspulssin jälkeinen viiveaika oli 1 ps. Tällä määritystavalla 10 saadaan Ru(bpy) ]+ :lle noin kuuden kertaluvun alueella lineaarinen log-log kalibraatiokäyrä toteamisrajan ollessa noin 10'10 M (kuva 3).

Esimerkki 2. Eosiinin aikaerotteinen määritys vesiliuoksesta 15 Eosiini (2',4',5',7'-tetrabromifluoreskeiini) määritettiin aikaerotteisesti 0,05 M natriumtetraboraattipuskurissa, jonka pH 7,8 (säädetty 0,1 M H2S04:lla), ja johon lisätty 0,1 % natriumatsidia. Määritys tehtiin Arcus-elektroluminometrillä tyhjiöhöyrystetyn alumiiniharavan ollessa työelektrodina ja platinakamman vastaelektrodina. Luminesenssin rekisteröintiin käytettiin 1,5 ms:n aikaikkunaa 2 0 virityspulssin jälkeisen viiveajan ollessa 1 ps. Kalibraatiokäyrä on esitetty kuvassa 4.

Esimerkki 3. Luminolin aikaerotteinen määritys 25 Luminoli määritettiin aikaerotteisella mittausperiaatteella 0,05 M natriumtetraboraatin vesiliuoksesta (pH 7,8; säädetty 0,1 M H2S04:lla), johon oli lisätty 0,1 % natriumatsidia. Määritys tehtiin siten, että työelektrodina oli tyhjiöhöyiystekniikalla « · valmistettu alumiiniharava ja vastaelektrodina oli platinalankakampa. Laitteena oli Wallac Oyj:n (Suomi) valmistamasta Arcus luminometristä modifioitu 30 elektroluminometri, jossa luminesenssin mittaukseen käytetty aikaikkuna oli 1,5 ms ja virityspulssin jälkeinen viive 1 ps. Kalibraatiokäyrä on esitetty kuvassa 6.

13 111663

Esimerkki 4. Platinakoproporfyriinin aikaerotteinen määritys vesiliuoksesta magnesi-umelektrodilla

Platinakoproporfyriini (PtCP) määritettiin aikaerotteisesti 0,05M natriumtetraboraatti-5 puskurissa (pH 9,2), jossa oli 1x10'3M K2S2O8. Työelektrodina käytettiin magnesium-nauhaa ja apuelektrodina mittausjäqetelyissä toimi platinalanka. Sähköisenä virityslahteenä käytettiin coulostaattista pulssigeneraattoria, jolla tuotettiin liuokseen -50V pulssipolarisaatio 40Hz taajuudella sähkömäärän ollessa noin 120pC/pulssi. Liuostilavuutena kupissa käytettiin 350pl:aa. Valomonistimen ja näyteliuoksen väliin 10 asetettiin interferenssisuodin, joka läpäisi 580nm:ä pidemmät aallonpituudet Mittauksissa käytettiin 500ps aikaikkunaa ja 20ps viivettä sähköpulssin jälkeen. Kalibraatiokäyrä on esitetty kuvassa 6.

Esimerkki 5. Platinakoproporfyriinin aikaerotteinen määritys vesiliuoksesta alumiini-15 elektrodilla

Platinakoproporfyriini (PtCP) määritettiin aikaerotteisesti 0,05M natriumtetraboraatti-puskurissa (pH 9,2), jossa oli 1x10'3M K2S208. Työelektrodina käytettiin alumiinista valmistettua kuppia ja apuelektrodina mittausjäijetelyissä toimi platinalanka. Sähköisenä 20 virityslahteenä käytettiin coulostaattista pulssigeneraattoria, jolla tuotettiin liuokseen -50V pulssipolarisaatio 40Hz taajuudella sähkömäärän ollessa noin ΠΟμΟρηΙββΐ. Liuostilavuutena kupissa käytettiin 350pl:aa. Valomonistimen ja näytelioksen väliin • · : asetettiin interferenssisuodin, joka läpäisi 580nm:ä pidemmät aallonpituudet.

Mittauksissa käytettiin 500ps aikaikkunaa ja 20ps viivettä sähköpulssin jälkeen. 2 5 Kalibraatiokäyrä on esitetty kuvassa 7.

Esimerkki 6. Platinakoproporfyriinin aikaerotteinen määritys vesiliuoksesta pii-elektrodilla 1 30 Platinakoproporfyriini (PtCP) määritettiin aikaerotteisesti 0,05M natriumtetraboraatti- puskurissa (pH 9,2), jossa oli 1x10'3M K2S2O8. Työelektrodina käytettiin anodisesti oksidoituja n-tyypin piielekttodeja ja apuelektrodina mittausjäqetelyissä toimi teräs- i4 111663 sylinteri. Anodisointi tehtiin 0,5M H3BO3 liuoksessa, jonka pH säädettiin noin 7,l:ksi 25% ammoniakilla. Anodisointijännitteeksi säädettiin 5,69V, jolloin piin pinalle saatu oksidikerros oli noin 2,2nm. Sähköisenä virityslähteenä käytettiin coulostaattista pulssigeneraattoria, jolla tuotettiin liuokseen -50V pulssipolarisaatio 40Hz taajuudella 5 sähkömäärän ollessa noin 120pC. Liuostilavuutena kupissa käytettiin 350pl:aa. Valomonistimen ja näytelioksen väliin asetettiin interferenssisuodin, joka läpäisi 580nm:ä pidemmät aallonpituudet. Mittauksissa käytettiin 300ps aikaikkunaa ja 20μβ viivettä sähköpulssin jälkeen. Kalibraatiokäyrä on esitetty kuvassa 8.

10 Esimerkki 7. fi2-mikroglobuliinin immunokemiallinen määritys käyttäen liposomeja luminolin sitomiseen vasta-aineeseen ja eriste-elektrodeina anodisoitujapiielektrodeja.

Piielektrodit valmistettiin antimonilla seostetusta n-Si levyistä, joiden orientaaatio oli (111) ja resistiivisyys 0,008-0,015 Ω cm (Okmetic Oyj, Suomi). Elektrodit leikattiin 15 8,0 x 55 mm suuruisiksi ennen pintakäsittelyjä.

Piielektrodin anodisointi. Piielektrodit oksidoitiin aluksi galvanostaattisesti virtatiheydellä 2 mA/cm 0,5 M boorihappoliuoksessa, joka oli neutraloitu ammoniakilla, kunnes saavutettiin 5,2 V anodisointijännite. Tämän jälkeen anodisointia 2 20 jatkettiin potentiostaattisesti kunnes virtatieys laski alle 10 μΑ/cm . Anodisoinnin jälkeen elektrodi huuhdottiin kvartsitislatulla vedellä. 1 )

Miktotiitterilevyn kuoppien pinnoittaminen vasta-aineella. Mikrotiitterilevyn kuopat pinnoitettiin hiiren anti^-mikroglobuliini vasta-aineella (klooni 6G12, Labmaster Oy, 25 Suomi) inkuboimalla yli yön 0,2 molaarisessa NaH2P04-liuoksessa, jossa vasta-aineen pitoisuus oli 10 pg/mL. Seuraavana päivänä kuopar pestiin kuusi kertaa pesuliuoksella ( 0,01 molaarinen Tris-HCl, pH 7,75, 0,9 % NaCl ja 0,02 % Tween 20) ja

··- tasapainoitettiin yli yön saturointiliuoksessa, joka oli 0,05 molaarinen Tris-HCl, pH

7,75, jossa oli yhtä litraa kohti 1 g naudan seerumin albumiinia, 60 g sorbitolia ja 1 3 0 mmol CaCl2.

15 111663 fi2-mikroglobuliinistandardi. Ihmisen askitesnesteestä puhdistetusta β2-mikroglobuliinista (75,5 mg/mL, Labmaster Oy, Turku) valmistettiin standardit ( 0,4, 1,6, 4,0, 8,0 ja 16 mg/L) TSA-puskuriin, johon on lisätty 7,5 % naudan seerumin albumiinia.

5

Leimatun vasta-aineen valmistaminen. Valmistettiin liposomeja, jotka sisälsivät luminolia ja jotka sitten sidottiin vasta-aineeseen (anti-fi2-mikroglobuliini, (klooni 1F10, Labmaster Oy, Turku)) (GP. Vonk, B. Wagner, Clin. Chem., 1991,37,1519).

10 Immunokemiallinen määritys. Immunokemiallinen reaktio tehtiin seuraavasti. Standardit laimennettiin 1:50 TSA-puskuriin, johon on lisätty 7,5 % naudan seerumin albumiinia. 20 pL standardia ja 80 pL liposomeilla leimattua vasta-ainetta (100 ng). Seosta inkuboitiin 1 h kevyesti ravistellen. Pesun jälkeen kuoppaan lisättiin 230 pL 0,1 % Triton X-100 liuosta pH 3,2:n 0,1 M glysiinipuskurissa ja inkuboitiin 10 min. 15 Liuosta otettiin kyvettiin 200 pL ja lisättiin 60 pL 0,5 mol/L Na2CC>3 liuosta. Ryvettiin lisättiin 240 pL mittauspuskuria ja elektroluminesenssi mitattiin käyttäen 5,2 voltin tasajännitteellä anodisoituja piielektrodeja.

Elektroluminesenssin mittaus. Elektroluminesenssi mitattiin elektroluminometrilla 20 erityisesti tätä tarkoitusta varten valmistetussa määrityskennossa, jossa on kierteillä kiristettävä teräsputkianodi ja kertakäyttöisten piielektrodien ja teräsputkianodin vlisenä tiivisteenä on teflonia. Mittauspuskurina (350 pL) käytettiin 0,2 mol/L : 1 boraattipuskuria, pH 7,75, jossa oli 10 mmol/L natriumatsidia.

2 5 Mittauksista saatu standardikuvaaja on esitetty kuvassa 10. 2 2

Esimerkki 8. Immunomääritys oksidipintaisilla kertakäyttöisillä piielektrodeilla.

. 30 Elektrodin pinnoittaminen vasta-aineella, anodisoituja piielektrodeja valmistettiin kuten esimerkissä 7 (60 x 6,0 mm). Piielektrodeista toinen pää pinnoitettiin vasta-aineella kertakäyttöisessä spektrofotometrin kyveteissä (Plastibrand, Cat. no. 7590 15, i6 111663

Brand, Wertheim, Saksa). Ennen pinnoitusta vasta-aine käsiteltiin 0,1 M sitraatilla (pH 2,5) 15 min ajan. Elektrodit pinnoitettiin monoklonaalisella vasta-aineella inkuboimalla elektrodia 4 h pinnoituspuskuriliuoksessa (0,1 M MES, 0,3 M H3B03, pH 6,5, 0,1 % 25-prosenttisesti esipolymeroitua glutaraldehydiä, 0,005 % naudan gammaglobuliinia, 5 johon oli lisätty monoklonaalista vasta-ainetta 10 μg/mL (anti-TSH, Medix, Suomi).

Pinnoitetut elektrodit pestiin kerran pesuliuoksella ( 0,01 M Tris-HCl, pH 7,75, 0,9 %

NaCl ja 0,02 % Tween 20), ja saturoitiin naudan seerumin albumiinilla (BSA) inkuboimalla tunnin Tris-puskurissa (0,1 % BSA, 0,05 M Tris-H2S04, pH 7,5, 0,1 %

Tween 20, 0,1 % NaN3), minkä jälkeen elektrodeja inkuboitiin 2 minuutin ajan 5 % 10 sorbitoliliuoksessa. Elektrodit kuivattiin ja elektrodeihin liimattiin teippi, joka jätti 10,0 mm korkean alueen elektrodin alapäästä aktiiviseksi.

Immunokemiallinen määritys. Leimattuna vasta-aineena käytettiin kaupallista Boehringer-Mannheimin preparaattia Elecsys® TSH Immunoassay -testisaijasta ja TSH-15 standardit (0, 0,25, 1,5, 9, 54, 324 μυ/mL) valmistettiin laimentamalla kantastandardia (Scripps Laboratories, Inc., San Diego, USA) inkubointipuskuriin (0,05 mol/L Tris-HCl, pH 7,75, 0,9 % NaCl, 0,05 % NaN3, 0,5 % naudan seerumin albumiini, 0,05% naudan seerumin gammaglobuliini ja 0,01 % Tween 20). Immunokemiallinen määritys tehtiin kertakäyttöisissä 1,5 mL:n polystyreenista valmistetuissa spektrofotometrin 20 kyveteissä. Kyvetin pohjalle pipetoitiin 125 μί standardia, 250 μι Ru-leimattua anti-TSH vasta-aineliuosta (Elecsys® TSH Immunoassay -testisaqa) ja 525 μί em. inkubointipuskuria. Kuoppiin asetettiin vedellä huuhdellut elektrodit ja inkuboitiin ravistellen 1 h, jonka jälkeen elektrodit pestiin juoksevan pesuliuoksen avulla. Elektroluminesenssi mitattiin kertakäyttöisessä muovisessa fluorometrin kyvetissä 0,05 25 M Na2B407-puskurissa (pH on 9,2), johon oli lisätty 0,1 M natriumsulfaattia sekä 10'3 M peroksodisulfaattia. Vastaelektrodina oli indiumtinaoksidilla päällystetty lasilevy, ja EKL mitattiin vastaelektrodin läpi. Sähköinen kontakti piielektrodiin otettiin • kuparilevyllä toteutetulla puristusliitoksella joka oli sivelty In-Ga eutektisella seoksella.

Mittausaikaikkuna oli 0,500 ms ja viive oli 1 μβ. Kuvassa 10 on esitetty hTSH-3 0 määrityksen standardikuvaaja. 1 i7 111663

Esimerkki 9. Luminolin ja 7-hydroksi4-metyylikumariinin samanaikainen toteaminen yhtä detektoria käyttäen. 7-Hy droksi-4-metyylikumariini tuottaa elektrokemiluminesenssia vain katodisen pulssin aikana ja siten sen johdannaisia voidaan käyttää elektrodin vastapinnoituksen onnistumisen mittana, kun varsinaisen analyytin 5 määrä voidaan mitata samalla aallonpituudella luminolin pitkäikäiseen luminesenssiin perustuen.

Valmistettiin saija liuoksia, joissa kaikissa 7-hydroksi-4-metyylikumariinin konsentraatio oh 1 x 10'7 mol/L, ja luminolin konsentraatiota vaihdeltiin. 10 Mittauselektrolyyttinä oh 0,05 M natriumtetraboraatin vesiliuos (pH 7,8; säädetty 0,1 M H2S04:lla), johon oh lisätty 0,1 % natriumatsidia. Kuvassa 11 on esitetty katodisen pulssin aikainen luminesenssi ja aikaikkunassa 1 - 9 ms katodisen pulssin jälkeen aallonpituudella 450 nm. Kuten kuvasta havaitaan luminolin konsentraation muuttaminen ei muuta katodisen pulssin aikaista signaalia, mutta viivästyneen 15 luminesenssin intensiteetti seuraa luminolin konsentraatiota.

20 • · 25 < · 30

Claims (2)

1. Menetelmä käytettäväksi bioaffiniteettimäärityksissä, tunnettu siitä, että yksi tai useampi erityyppinen leima-aine viritetään sähköisesti erityisessä mittauskennossa 5 eristepinnoitetulla työelektrodilla sähköpulsseilla ja emittoituva elektromagneettinen säteily mitataan pulssien kanssa synkronoidussa yhteydessä olevalla mittalaitteella siten, että pitkäikäistä luminesenssia tuottavana leima-aineena käytetään joko luminolia, isoluminolia, eosiinia, fluoreskeiinia, rutenium(II)-kompleksia, platina- tai palladiumporfyriiniä tai luminoivaa proteiinia ja leima-aineiden emittoima valo 10 mitataan aikaerotteisesti emissiopulssin halutulta aikaväliltä ja mittauksen seurauksena voidaan määrittää yhden tai useamman analyytin pitoisuus samasta näytteestä.

2. Patenttivaatimusten 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että samasta näytteestä mitataan useampaa kuin yhtä analyyttiä käyttäen hyväksi eri leima-aineiden 15 erilaista emittoituvan valon aikaviivettä ja/tai mittaamalla eri aallonpituudella esiintyvää valoa. 20 « 19 111663