ES3069680T3 - Methods related to characterizing proviral reservoirs - Google Patents

Abstract

En algunos aspectos, la invención se refiere a métodos para determinar la proporción de provirus intactos, hipermutados, con deleciones o defectuosos en una muestra de ácidos nucleicos, por ejemplo, una muestra obtenida de un sujeto. El sujeto puede ser un ser humano. El virus puede ser el VIH. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Métodos relacionados con la caracterización de reservorios provirales

[0003] Interés gubernamental

[0004] Esta invención se realizó con el apoyo gubernamental a través de las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud R21AI1113147, AI096113, 1U19AI096109 y 43222. El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.

[0005] Antecedentes

[0006] Aunque la terapia antirretroviral combinada suprime la replicación del VIH-1 hasta niveles clínicamente indetectables, el virus persiste en estado quiescente en un subconjunto de linfocitos. Este reservorio latente (RL) del virus que se encuentra en los linfocitos T CD4+ de memoria en reposo es el principal obstáculo para la curación. El VIH-1 infecta preferentemente a los linfocitos T CD4+ activados. Sin embargo, en raras ocasiones, un linfocito T CD4+ total o parcialmente activado que ha sido infectado por el VIH-1 puede volver a un estado de memoria en reposo. Esta transición de célula activada a célula de memoria en reposo forma parte de la fisiología normal de los linfocitos T CD4+ que han encontrado sus antígenos afines, y la transición es esencial para el establecimiento de la memoria inmunitaria. Sin embargo, dado que los linfocitos T CD4+ de memoria en reposo son en gran medida no permisivos para la expresión génica viral, el genoma infectante del VIH-1 persiste en forma de ADN como provirus integrado que no se transcribe activamente. Por esta razón, las células infectadas de forma latente no son el objetivo del sistema inmunitario ni de la TAR. Asimismo, dado que los linfocitos T CD4+ de memoria en reposo son longevos, el RL tiene una semivida extremadamente larga de aproximadamente 44 meses. Cuando se interrumpe la TAR en pacientes infectados por el VIH-1, el VIH-1 resurge del RL y comienza de nuevo la replicación viral descontrolada. La larga semivida del RL y su capacidad para reaparecer tras la interrupción de la TAR hacen necesario un tratamiento continuo y de por vida.

[0007] El reservorio latente (RL) se identificó y caracterizó por primera vez a mediados de los años 90 mediante un ensayo de crecimiento viral (VOA) para medir la frecuencia de linfocitos T CD4+ en reposo que portan provirus competentes para la replicación en estado latente. El VOA implica la activación máxima de los linfocitos T CD4+ en reposo en dilución límite, que reactiva la expresión génica viral en las células infectadas de forma latente e induce la liberación de viriones infecciosos del VIH-1. El virus liberado se cultiva y se expande con linfoblastos de donantes sanos durante 2-3 semanas y se utiliza un ELISA contra la proteína p24 del VIH-1 para cuantificar la expansión viral. A continuación, se puede determinar la frecuencia de la infección latente basándose en el patrón de crecimiento viral en los pocillos de ensayo. Hasta hace poco, se pensaba que este ensayo era la medición definitiva del RL. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que el VOA subestima el verdadero tamaño del RL porque no se observa el crecimiento viral en todos los pocillos del ensayo VOA que contienen células con provirus intactos. Cuando los pocillos negativos para el crecimiento viral se estimularon una segunda vez con PHA, se observó el crecimiento de virus competentes para la replicación. También se ha observado un crecimiento adicional tras tres y cuatro rondas de activación celular. Estos hallazgos indican que el RL es mayor de lo que se pensaba y redefinen el reservorio latente para incluir estos provirus genéticamente intactos que el VOA original pasó por alto. En la actualidad, el campo no tiene forma de medir esta población de provirus intactos que deben eliminarse para conseguir la curación del VIH-1.

[0008] Debido a la naturaleza intensiva en mano de obra del VOA, ha habido un gran interés por desarrollar ensayos alternativos. Los ensayos basados en la PCR que miden el ADN del VIH-1 proviral total se han adelantado como mediciones más sencillas del RL. Los métodos actuales basados en la PCR solo utilizan un único conjunto de cebadores y sondas para medir el RL del VIH-1. Al hacerlo, sobrestiman groseramente el tamaño del RL y detectan principalmente provirus defectuosos que están intactos en la región de unión del cebador, pero defectuosos en cualquier otro sitio del genoma. Sin embargo, estos provirus defectuosos no necesitan ser eliminados para conseguir la curación y pueden no verse afectados por la terapia de erradicación. Aunque se suelen utilizar métodos basados tanto en el cultivo como en la PCR, hay poca correlación entre los dos tipos de ensayos. Según el VOA, aproximadamente 1 por 10<6>linfocitos T CD4+ en reposo contienen virus competentes para la replicación, pero los ensayos basados en la PCR muestran que un promedio de 300 por 10<6>linfocitos T CD4+ en reposo contienen ADN del VIH-1 proviral. Estas discrepancias se atribuyen a las diferencias en los tipos de provirus que mide específicamente cada ensayo e indican que ninguna de las dos clases de ensayo cuantifica con precisión el RL. Se cree que el tamaño real del depósito latente es aproximadamente un orden de magnitud mayor que el medido por el VOA.

[0009] Las mediciones del ARN de los provirus también son bastante frecuentes. En estos ensayos, los linfocitos T CD4+ en reposo del paciente se siembran y se activan al máximo con una dilución límite, de tal manera que haya menos de una célula productora de virus por pocillo. Tras la activación máxima de los linfocitos T, la frecuencia de las células que producen ARN viral se mide directamente mediante una PCR cuantitativa (qPCR) específica del ARNm del VIH en la célula o el ARNm en el sobrenadante del cultivo (que presumiblemente refleja la liberación de viriones). Sin embargo, estos ensayos también implican solo una única ronda de activación de linfocitos T y, por tanto, no detectan provirus intactos que no se inducen tras una única ronda de activación. Adicionalmente, algunos provirus defectuosos pueden ser capaces de producir ARN del VIH-1 e incluso liberar viriones no infecciosos. Estos provirus defectuosos pudieron detectarse mediante estos ensayos. Así, esta clase de ensayos pueden verse confundidos por resultados tanto falsos negativos como falsos positivos y no miden con precisión el tamaño del RL. En consecuencia, se necesita un ensayo fiable y sensible que pueda medir con precisión solo los provirus intactos. HO YA-CHI ET AL: "Replication-Competent Noninduced Proviruses in the Latent Reservoir Increase Barrier to HIV-1 Cure", CELL, vol.155, n.º 3, páginas 540-551, ISSN: 0092-8674, DOI: 10.1016/J.CELL.2013.09.020 divulga la amplificación de virus no inducidos mediante PCR de dilución límite.

[0011] Breve descripción

[0013] En algunos aspectos, la invención se refiere a métodos para detectar provirus en una muestra de ácidos nucleicos, p. ej., una muestra obtenida de un sujeto. El sujeto puede ser un ser humano.

[0015] Descripción de las figuras

[0017] Figura 1. Esquema del análisis del genoma proviral completo. Los linfocitos T CD4+ en reposo se aíslan de la sangre de pacientes VIH-1 positivos y se extrae el ADN. Se realizan PCR anidadas a dilución límite y se utilizan PCR de gag y env para determinar la clonalidad. Una vez establecida una dilución clonal, todos los pocillos de PCR se someten a 6 PCR internas y se visualizan en un gel. Se extraen las bandas y se secuencian directamente. Se reconstruyen genomas provirales casi completos utilizando las seis PCR internas solapadas y se evalúan las secuencias para detectar defectos.

[0018] Figura 2. Los provirus de los linfocitos T CD4+ en reposo de los pacientes son en su inmensa mayoría defectuosos y, sin embargo, suelen detectarse mediante métodos de PCR que utilizan un único conjunto de cebadores/sondas. Se analizaron las secuencias provirales de nueve individuos infectados por el VIH-1 en tratamiento crónico mediante un método de PCR anidada con dilución límite. Los productos de la PCR se secuenciaron directamente y se analizaron los genomas provirales en busca de diferentes defectos. Se identificaron 133 secuencias en total y la mayoría eran defectuosas. Solo cinco genomas estaban completamente intactos genéticamente, sin defectos perceptibles. Se observaron deleciones de secuencia grandes tanto en el extremo 5' como en el 3' del genoma en 115 provirus y 73 se cartografiaron de forma precisa mediante secuenciación. Se muestran cuatro regiones diferentes que suelen medirse mediante PCR utilizando un único conjunto de cebadores/sondas, e incluye los genes gag (mostrado en B), genes pol (C) y env (D) junto con la región señal de empaquetamiento(A). Estos métodos de PCR detectan principalmente provirus defectuosos. Se muestra un enfoque combinatorio probable(A-D) en el que solo se consideran intactos los provirus que son positivos para todas las PCR A-D. Si también se añaden sondas específicas de hipermutación(A-D sondas específicas hip.) para distinguir las secuencias hipermutadas de las intactas, solo se miden los genomas principalmente intactos y no hay falsos positivos.

[0019] Figura 3. Método para determinar si los ácidos nucleicos de una muestra obtenida de linfocitos T CD4+ comprenden provirus del VIH-1 intactos. La PCR Multiplex se realiza en ADN de linfocitos T CD4+ en reposo purificados (u otra población celular). Se utilizan tres o cuatro conjuntos de cebadores/sondas para amplificar regiones del genoma que suelen ser defectuosas. Para algunos conjuntos de cebadores, se usan dos sondas fluorescentes diferentes, una específica de secuencias no hipermutadas y otra específica de secuencias hipermutadas G→A. Se evalúa la fluorescencia de cada provirus, proporcionando una cuantificación rápida y precisa de la fracción de provirus que están intactos y de la fracción que tiene diversos tipos de defectos.

[0020] Figura 4. Una serie de sondas permite identificar y distinguir provirus intactos e hipermutados. Se diseñan dos sondas para hibridar con la misma región de ADN que suele estar hipermutada en las secuencias de los pacientes. La sonda "intacta" (designada F, una secuencia viral nativa) está diseñada para hibridar con secuencias no hipermutadas (GG), y la sonda "hipermutada" (designada F', una secuencia viral mutada) está diseñada para hibridarse con la versión hipermutada de la misma secuencia (AA). Las dos sondas pueden estar marcadas con distintos fluoróforos y competir por el mismo lugar de unión en el ADN. Cuando se produce una coincidencia exacta, se puede detectar una señal fluorescente. Cuando existen emparejamientos incorrectos de bases (designados con *), la sonda no se une y el fluoróforo se apaga con el inactivador (Q). Dependiendo de la señal fluorescente que se observe (F o F'), la secuencia puede identificarse como hipermutada o intacta.

[0021] Figura 5. La mayoría de las secuencias son defectuosas en pacientes virémicos (A) y en pacientes tratados durante una infección crónica (B) o aguda (C). Se muestran las secuencias de pacientes representativos de cada grupo. Los dos defectos más comunes fueron las deleciones de secuencia grandes y la hipermutación APOBEC3G. Se encontraron deleciones tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' del genoma del VIH y algunas deleciones abarcaban grandes porciones de ambos extremos. En algunos casos, una deleción cartografiada abarcaba los sitios de unión del cebador para otras PCR internas, por lo que no se capturó una región de la secuencia, pero se supone que está presente. Estas regiones se indican mediante una región sombreada de negro (intacta) o gris oscuro (hipermutada). Algunas deleciones abarcaban sitios de unión del cebador directo o inverso, por lo que no se produjo la amplificación por PCR y no fue posible cartografiar directamente la deleción. En estos casos, se estimaron los tamaños máximo (gris medio) y mínimo (gris claro) de estas deleciones utilizando las ubicaciones de los cebadores de las PCR internas que amplificaron y no amplificaron.

[0022] Figura 6. Los provirus defectuosos se detectan fácilmente tras una sola ronda de transcripción inversa. Se infectaron linfocitos T CD4+ activados con el virus BaL y se añadió T20 tras la infección para bloquear rondas adicionales de infección. Se usó el método de la Figura 1 para evaluar la presencia o ausencia de defectos en la secuencia genómica. Los provirus defectuosos se detectaron fácilmente, aunque había una mayor fracción de provirus intactos en comparación con lo que se había observado anteriormente en pacientes en tratamiento crónico. Algunas deleciones abarcaban sitios de unión del cebador directo o inverso, por lo que no se produjo la amplificación por PCR y no fue posible cartografiar directamente la deleción. Los tamaños máximo y mínimo de estas deleciones se estimaron utilizando las ubicaciones del cebador de las PCR internas que amplificaron y no amplificaron.

[0023] Figura 7. La comparación de genomas completos de diferentes grupos de pacientes indica una rápida acumulación de provirus defectuosos. Se muestran tres grupos de pacientes diferentes junto con el número de pacientes y clones provirales estudiados para cada grupo (secuencias representativas que se muestran en la Figura 5). Además, se analizaron los clones provirales de un experimento in vitro, tras una única ronda de replicación (Figura 6). Los provirus defectuosos se identificaron tras una única ronda de replicación y se encontraron en niveles elevados en cada una de las tres poblaciones de pacientes. Las deleciones de secuencia fueron el defecto más común y se identificaron en todos los grupos. Las deleciones que abarcan todo o parte del gen gag se etiquetan como deleciones del extremo 5' y las deleciones que abarcan todo o parte del gen env se etiquetan como deleciones del extremo 3'. Las deleciones que abarcan ambas regiones se etiquetan como deleciones internas muy grandes. Se observó hipermutación en todos los grupos, con niveles significativamente más altos en los pacientes en tratamiento agudo en comparación con los demás grupos. Los datos se resumen en la Tabla 1, más adelante.

[0025] Descripción detallada

[0027] Visión general

[0029] Muchos provirus contienen deleciones que dificultan la replicación viral, y los ensayos actuales no detectan cada una de las deleciones más comunes. Así, se examinaron las secuencias provirales de una cohorte de 9 individuos con infección crónica por el VIH-1, 7 individuos con infección aguda y 2 individuos virémicos (infectados pero no tratados), usando un método de PCR anidada de dilución límite, como se ha descrito en la sección Ejemplos. Los genomas provirales se secuenciaron directamente a partir de los productos de la PCR y se analizaron en busca de diferentes defectos. De los 133 provirus secuenciados en la cohorte en tratamiento crónico, solo 5 genomas integrados del VIH-1 estaban completamente intactos genéticamente, sin defectos perceptibles. Las deleciones de secuencias grandes fueron el defecto más frecuente identificado. Estas deleciones se observaron en 117 provirus y 73 deleciones se cartografiaron de forma precisa mediante secuenciación. Dado que algunas deleciones abarcaban sitios de unión del cebador directo o inverso para las PCR internas, no se produjo la amplificación por PCR y no fue posible la cartografía exacta de la deleción. En estos casos, el tamaño de la deleción se estimó basándose en las ubicaciones de los sitios de unión del cebador que debían haberse eliminado para impedir la amplificación por PCR. Se encontraron deleciones tanto en el extremo 5' como en el 3' del genoma del VIH y algunas deleciones abarcaban grandes porciones centrales del genoma. Se realizó un análisis similar para la cohorte de pacientes agudos y de las 110 secuencias identificadas, solo 11 genomas integrados del VIH-1 estaban completamente intactos genéticamente, sin defectos perceptibles. Las deleciones de secuencias grandes y la hipermutación fueron los defectos más frecuentes, que comprenden el 90 % de todas las secuencias. Los pacientes virémicos también tenían un porcentaje considerable de provirus defectuosos, conteniendo defectos más del 65 % de todas las secuencias. En todos estos tipos de deleciones, las regiones de homología de secuencia se encontraron comúnmente en ambas uniones de la deleción y son coherentes con el mecanismo propuesto de un salto de polimerasa único por la transcriptasa inversa durante la transcripción inversa que da lugar a la deleción de la secuencia intermedia. Estas deleciones de secuencias generalmente abarcaban más de 3 kb del genoma de 10 kb, por lo que estos provirus son incapaces de fabricar muchas de las proteínas necesarias para la replicación. Para desarrollar un ensayo para medir el RL, se identificaron todos los lugares en los que suelen producirse deleciones grandes de secuencias.

[0031] Adicionalmente, muchos provirus contienen mutaciones que dificultan la replicación viral, y los ensayos actuales no detectan tales mutaciones. Por ejemplo, la APOBEC3G es una proteína de defensa antiviral humana que bloquea la replicación del VIH-1 generando abundantes mutaciones G→A en el genoma infectante del VIH-1. La hipermutación G→A inducida por APOBEC3G fue el segundo defecto más común en los pacientes en tratamiento crónico y se identificaron 21 provirus hipermutados. La hipermutación fue aún más pronunciada en la cohorte de pacientes en tratamiento agudo, conteniendo ~40 % de todas las secuencias defectos de hipermutación. La hipermutación era abundante en todas las secuencias y se encontraba en todo el genoma. Estas sustituciones de nucleótidos G→A dieron lugar a varios codones de terminación dentro del marco, por lo que estos genomas del VIH-1 no son funcionales y no pueden replicarse. Doce de estos genomas hipermutados en los pacientes en tratamiento crónico y 18 en los pacientes en tratamiento agudo también tenían deleciones de secuencia grandes, lo que indica que los procesos de hipermutación y deleción pueden producirse de forma independiente. Un pequeño subconjunto de secuencias (5 provirus en los pacientes en tratamiento crónico y 1 en los pacientes en tratamiento agudo) contenía deleciones pequeñas en la señal de empaquetamiento del genoma. Sin esta región intacta, el genoma del ARN no se empaqueta correctamente en los viriones y el virus no puede replicarse. Así, estos virus también deben considerarse defectuosos.

[0032] Basado en el cribado imparcial de provirus para caracterizar la localización y el tipo de defectos encontrados en los provirus del VIH-1, se desarrolló un método más preciso para medir el RL. Estos resultados indican que los defectos provirales pueden localizarse en todo el genoma del VIH-1, por lo que se requiere una estrategia más compleja para distinguirlos de los provirus intactos. Estos hallazgos amplían la biblioteca de defectos provirales, en particular las deleciones de secuencia grandes que anteriormente solo se había demostrado que ocurrían en el extremo 3' del genoma. Dado que los ensayos actuales de PCR solo miden en una ubicación, antes no era posible determinar si los provirus medidos con tales métodos están realmente intactos o defectuosos. Así, los resultados de los cribados divulgados permiten la cartografía de defectos comunes y la identificación de provirus que contienen tales defectos. Al sondear el genoma del VIH-1 en múltiples regiones que se ha visto que son las más frecuentemente defectuosas, los provirus defectuosos pueden distinguirse de los que están intactos (Figura 2).

[0033] Estrategia de medición del reservorio latente en un sujeto

[0034] Puesto que los provirus intactos solo representan ~4 % de todos los provirus en los pacientes en tratamiento crónico y ~10 % de los pacientes en tratamiento agudo, es importante disponer de métodos precisos para distinguirlos del abrumador número de provirus defectuosos. Las deleciones de secuencia grandes representan más del 80 % de todos los provirus y pueden distinguirse de los provirus intactos mediante el uso de múltiples conjuntos de cebadores/sondas. Estos conjuntos se localizan en regiones conservadas de la señal de empaquetamiento, genes gag, pol y env y minimizan el impacto de la variabilidad de la secuencia del VIH-1 entre pacientes en la precisión de la medición. Realizando mediciones en estas regiones clave, donde se localizan casi todas las deleciones de secuencia, solo se miden como intactos los provirus que dan una señal fluorescente de sonda positiva en todas las ubicaciones.

[0035] La hipermutación G→ A inducida por APOBEC3G es el segundo defecto más frecuente, por tanto, es importante que estos tipos de provirus se distingan de los provirus genéticamente intactos. Aproximadamente la mitad de las secuencias hipermutadas, tanto en las cohortes en tratamiento agudo como crónico, no tienen ninguna deleción y no pueden distinguirse de los provirus intactos con una simple medición en múltiples ubicaciones. Para distinguir específicamente entre secuencias hipermutadas e intactas, desarrollamos sondas nucleotídicas de unión preferente. Las sondas están diseñadas para hibridarse con una región del ADN que suele estar hipermutada en las secuencias de los pacientes. La sonda "intacta" está diseñada para hibridarse con la secuencia no hipermutada (GG), y la sonda "hipermutada" está diseñada para hibridarse con la secuencia hipermutada (AA). Las dos sondas están marcadas con fluoróforos distintos y compiten por el mismo lugar de unión en el ADN. La que coincide con el ADN se une y da una señal fluorescente distinta y la otra no (Figura 4), de forma similar a las sondas de discriminación alélica que se utilizan para detectar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Estas sondas son específicas de diferentes secuencias intactas e hipermutadas, como se ha demostrado in vitro. Estas sondas de hipermutación pueden usarse en una o más de las regiones descritas (A-D) para distinguir las secuencias hipermutadas de las intactas y mejorar la precisión del ensayo (Figura 2).

[0036] Un ensayo que pueda distinguir los provirus intactos de los defectuosos es una de las principales prioridades de la investigación para la curación del VIH-1. Basándose en los resultados del análisis del genoma del VIH-1 proviral, se desarrolló un método nuevo y preciso para medir el RL. En la Figura 3 se muestra el flujo de trabajo del método, que puede aplicarse a diversos tipos de células que se cree que pueden albergar genomas del VIH-1, incluyendo, aunque no de forma limitativa, linfocitos, macrófagos y células progenitoras hematopoyéticas. Los principios descritos en este ensayo también pueden aplicarse a modelos animales de infección por VIH-1, incluidos los del retrovirus de simio estrechamente relacionado SIV o los retrovirus híbridos SIV-HIV. Mediante la medición del genoma del VIH-1 en múltiples regiones y la inclusión de sondas que distinguen específicamente los genomas hipermutados de los intactos, pueden identificarse provirus potencialmente competentes para la replicación, que hay que eliminar para curar el VIH-1.

[0037] Métodos para determinar si un ácido nucleico comprende un virus intacto o un provirus

[0038] En algunos aspectos, la invención se refiere a un método para determinar si un ácido nucleico comprende un virus intacto o un provirus. El método comprende amplificar el ácido nucleico con cebadores de PCR que amplifican una pluralidad de secuencias nucleotídicas conservadas del provirus. El método comprende amplificar el ácido nucleico en una reacción de PCR en donde el cebador o sonda de PCR que comprende una secuencia viral nativa tiene una mayor afinidad de unión por la secuencia viral nativa que por las secuencias virales mutadas. El método comprende amplificar el ácido nucleico en una reacción de PCR que comprende al menos un cebador o sonda de PCR que comprende una secuencia viral mutada, en donde el al menos un cebador o sonda de PCR que comprende una secuencia viral mutada tiene una mayor afinidad de unión por la secuencia viral mutada que por las secuencias virales nativas. En algunas realizaciones, el método comprende cuantificar si cada reacción de PCR produjo un producto de PCR, determinando de este modo si el ácido nucleico comprende un provirus intacto.

[0039] Métodos de medición de un reservorio viral latente

[0040] En algunos aspectos, la invención se refiere a métodos de medición de un reservorio viral latente en un sujeto. El método comprende obtener una muestra de ácidos nucleicos del sujeto; amplificar los ácidos nucleicos de la muestra con cebadores de PCR que amplifiquen una pluralidad de secuencias de nucleótidos conservadas del virus; y cuantificar la frecuencia con la que cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad aparece en el mismo ácido nucleico de la muestra, midiendo de este modo el reservorio viral latente en el sujeto.

[0041] En algunas realizaciones, el método comprende amplificar los ácidos nucleicos en una reacción de PCR que comprende un primer, al menos un, cebador o sonda de PCR que comprende una secuencia viral nativa, en donde el primer, al menos un, cebador o sonda de PCR tiene una mayor afinidad de unión por las secuencias virales nativas que por las secuencias virales mutadas. El primer, al menos un, cebador o sonda de PCR puede comprender un cebador, tal como un cebador utilizado para amplificar la pluralidad de secuencias de nucleótidos conservadas. En algunas realizaciones, el primer, al menos un, cebador o sonda de PCR no es un cebador utilizado para amplificar la pluralidad de secuencias de nucleótidos conservadas. En algunas realizaciones, el primer, al menos un, cebador o sonda de PCR comprende una sonda de qPCR.

[0042] El método comprende amplificar los ácidos nucleicos en una reacción de PCR que comprende una segunda, al menos una. sonda de PCR que comprende una secuencia viral mutada, en donde la segunda, al menos una, sonda de PCR tiene una mayor afinidad de unión por las secuencias virales mutadas que por las secuencias virales nativas. En algunas realizaciones, la segunda, al menos una, sonda de PCR comprende una sonda de qPCR.

[0043] En algunas realizaciones, la segunda, al menos una, sonda PCR se une a una secuencia viral mutada que está relacionada con una secuencia viral nativa a la que se une un primer, al menos un, cebador de PCR, en donde la secuencia viral mutada consiste en la secuencia viral nativa que comprende al menos una mutación. Por ejemplo, la secuencia viral mutada puede consistir en la secuencia viral nativa en las que se han introducido al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mutaciones. Las mutaciones pueden comprender, por ejemplo, una mutación de guanina a adenina. Se utiliza una sonda PCR para detectar una secuencia viral nativa o una secuencia viral mutada. Una sonda de PCR utilizada para detectar una secuencia viral nativa puede utilizarse junto con una sonda de PCR utilizada para detectar una secuencia viral mutada en la misma reacción de PCR, por ejemplo, utilizando sondas unidas a diferentes fluoróforos. Una sonda PCR utilizada para detectar una secuencia viral nativa puede estar relacionada con una sonda PCR utilizada para detectar una secuencia viral mutada por mutaciones de la secuencia viral nativa, p. ej., la secuencia viral nativa puede estar relacionada con la secuencia viral mutada por una o más mutaciones de guanina a adenina. En algunas realizaciones, el método comprende obtener una muestra de ácido nucleico del sujeto; amplificar los ácidos nucleicos en una reacción de PCR que comprende un primer, al menos un, cebador o sonda de PCR que comprende una secuencia viral nativa, en donde el primer, al menos un, cebador o sonda de PCR tiene una mayor afinidad de unión por la secuencia viral nativa que por las secuencias virales mutadas; y cuantificar la frecuencia con la que la secuencia viral nativa aparece en los ácidos nucleicos de la muestra, midiendo de este modo el reservorio viral latente en el sujeto. El método comprende amplificar el ácido nucleico en presencia de una segunda, al menos una, sonda de PCR que comprende una secuencia viral mutada, en donde la segunda, al menos una, sonda de PCR tiene una mayor afinidad de unión por la secuencia viral mutada que por las secuencias virales nativas. El método puede comprender amplificar los ácidos nucleicos de la muestra con cebadores de PCR que amplifican una pluralidad de secuencias de nucleótidos conservadas del virus.

[0044] En algunas realizaciones, el método comprende aislar cada ácido nucleico de la muestra antes de amplificar los ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el método comprende incorporar un código de barras de cada ácido nucleico de la muestra antes de amplificar los ácidos nucleicos, p. ej., añadiendo una secuencia de nucleótidos única a cada ácido nucleico. El método puede comprender amplificar los ácidos nucleicos con cebadores de PCR que amplifican el genoma proviral, p. ej., después de aislar cada ácido nucleico y/o antes de amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos conservados o antes de amplificar una secuencia viral nativa o mutada. El genoma proviral puede amplificarse, por ejemplo, con cebadores de PCR que se unen a los extremos 3' y 5' del genoma, tal como las regiones no traducidas 3' y 5'.

[0045] En algunas realizaciones, el método comprende cuantificar el número de ácidos nucleicos celulares de la muestra que se analizan. Se puede cuantificar el número de ácidos nucleicos de la muestra que se analizan, por ejemplo, mediante la amplificación de una secuencia nucleotídica celular, p. ej., una secuencia genómica de nucleótidos que no forma parte del virus o provirus. La secuencia de nucleótidos celular puede ser, por ejemplo, un gen celular, tal como el ARNasa P.

[0046] La frecuencia con la que cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad aparece en el mismo ácido nucleico (p. ej., por número total de ácidos nucleicos virales o celulares) puede determinarse determinando si cada ácido nucleico comprende un provirus intacto y dividiendo el número de ácidos nucleicos que comprenden un provirus intacto por el número total de ácidos nucleicos analizados (p. ej., número total de ácidos nucleicos virales o celulares). Se puede determinar la frecuencia, por ejemplo, calculando el número de ácidos nucleicos que comprende cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad y dividiendo dicho número por el número de ácidos nucleicos que se analizaron (por ej., el número total de ácidos nucleicos virales o celulares). Puede determinarse la frecuencia de virus intactos respecto a todas las secuencias virales de la muestra, por ejemplo, dividiendo el número de virus intactos por el número total de ácidos nucleicos que contienen ADN viral. Puede determinarse la frecuencia de virus intactos respecto al número de células analizadas por la sonda, por ejemplo, dividiendo el número de virus intactos por el número total de ácidos nucleicos que contienen una secuencia de nucleótidos celular, tal como un gen celular (p. ej. ARNasa P).

[0047] En algunas realizaciones, la invención se refiere a métodos de medición de la frecuencia de provirus incompetentes para la replicación en un reservorio viral de un sujeto. Se puede determinar la frecuencia, por ejemplo, calculando el número de ácidos nucleicos que no comprenden cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad y dividiendo dicho número por el número de ácidos nucleicos que se analizaron (p. ej., el número total de ácidos nucleicos virales o el número total de ácidos nucleicos celulares).

[0048] Determinación de si un ácido nucleico comprende un provirus intacto

[0049] Puede considerarse que un ácido nucleico comprende un provirus intacto si cada reacción de PCR que amplifica una secuencia de nucleótidos conservada del provirus, si se produjera alguna reacción de este tipo, indica que el ácido nucleico comprende cada secuencia de nucleótidos conservada. De forma similar, puede considerarse que el ácido nucleico comprende un provirus intacto si cada reacción de PCR realizada con un cebador o sonda de PCR que comprende una secuencia viral nativa indica que el ácido nucleico comprende la secuencia viral nativa. De forma similar, puede comprobarse que el ácido nucleico comprende un provirus intacto (p. ej., un provirus no mutado) si cada reacción de PCR realizada con un cebador o sonda de PCR que comprende una secuencia viral mutada indica que el ácido nucleico carece de la secuencia viral mutada.

[0050] Se puede analizar con una reacción de PCR, por ejemplo, realizando qPCR o ddPCR y analizando una lectura fluorescente. De forma similar, una reacción de PCR puede analizarse cuantificando la cantidad de un producto de PCR, por ejemplo, por espectroscopia UV-Vis, cuantificando la cantidad de producto de la PCR mediante electroforesis/densitometría, o secuenciando el producto de la PCR.

[0051] Determinar la proporción de provirus intactos, hipermutados, eliminados o defectuosos en una muestra

[0052] En algunos aspectos, la invención se refiere a un método para determinar la proporción de provirus intactos, hipermutados, eliminados y/o defectuosos en una muestra de ácidos nucleicos. La muestra puede obtenerse de un sujeto (p. ej., un sujeto humano) directamente (p. ej., extrayendo sangre o haciendo una biopsia) o indirectamente (p. ej., de un profesional sanitario o de un archivo).

[0053] El método comprende amplificar los ácidos nucleicos con cebadores y sondas de PCR que comprenden una secuencia viral nativa, en donde cada uno del al menos uno o varios cebador(es) o sonda(s) de PCR que comprende una secuencia viral nativa tiene una mayor afinidad de unión por la secuencia viral nativa que por las secuencias virales mutadas. El método puede comprender, por ejemplo, amplificar los ácidos nucleicos con cebadores de PCR que comprenden 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más secuencias virales nativas. Para los retrovirus, tales como el VIH, una secuencia viral nativa comprende, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica total o parcialmente una señal de empaquetamiento viral, Gag, Pol, Env, y opcionalmente Tat, Nef, Rev, Vif, Vpr, Vpu, y/o una o más repeticiones terminales largas (LTR). Así, las 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más secuencias virales nativas comprenden secuencias de nucleótidos que codifican total o parcialmente una señal de empaquetamiento viral, Gag, Pol, Env, y opcionalmente Tat, Nef, Rev, Vif, Vpr, Vpu, y/o uno o más LTR, incluyendo las secuencias de nucleótidos que se solapan con las secuencias de nucleótidos de otros cebadores o sondas de PCR.

[0054] El método comprende amplificar los ácidos nucleicos con al menos una sonda que comprende una secuencia viral hipermutada, en donde la sonda es específica de una secuencia Env del VIH-1 proviral hipermutada, y en donde cada uno del al menos uno o varios cebador(es) o sonda(s) de PCR que comprende una secuencia viral hipermutada tiene una mayor afinidad de unión por la secuencia viral hipermutada que por las secuencias virales nativas. El método puede comprender, por ejemplo, amplificar los ácidos nucleicos con cebadores o sondas de PCR que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más secuencias virales hipermutadas. Para los retrovirus, tales como el VIH, una secuencia viral hipermutada puede comprender, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos con menos del 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos que codifica total o parcialmente una señal de empaquetamiento viral, Gag, Pol, Env, Tat, Nef, Rev, Vif, Vpr, Vpu, y/o uno o más LTR, pero más del 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con una de las secuencias mencionadas anteriormente y/o que se produce en un lugar del genoma del provirus que corresponde a una de las secuencias mencionadas anteriormente (véase, p. ej., figuras 1, 2 y 5 para los mapas del provirus del VIH-1). Por ejemplo, una secuencia viral hipermutada puede variar respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica total o parcialmente una señal de empaquetamiento viral, Gag, Pol, Env, Tat, Nef, Rev, Vif, Vpr, Vpu, y/o una LTR por una serie de mutaciones de guanina a adenina.

[0055] El método comprende preferentemente cuantificar la cantidad de cada producto de PCR producido, p. ej., mediante PCR cuantitativa ("qPCR"), PCR digital en gotitas ("ddPCR"), o por electroforesis.

[0056] El método puede comprender calcular la proporción de provirus intactos en la muestra, p. ej., dividiendo el número de ácidos nucleicos de la muestra que comprenden cada secuencia viral nativa, pero que no comprenden ninguna secuencia viral hipermutada, por el número de ácidos nucleicos de la muestra que comprenden cualquier secuencia viral.

[0057] El método puede comprender calcular la proporción de provirus hipermutados en la muestra, p. ej., dividiendo el número de ácidos nucleicos de la muestra que comprenden cualquier secuencia viral hipermutada por el número de ácidos nucleicos de la muestra que comprenden cualquier secuencia viral.

[0058] El método puede comprender calcular la proporción de provirus eliminados en la muestra, p. ej., dividiendo el número de ácidos nucleicos de la muestra que comprenden cualquier secuencia viral, pero que comprenden menos de cada secuencia viral nativa, por el número de ácidos nucleicos de la muestra que comprenden cualquier secuencia viral. El método puede comprender calcular la proporción de provirus defectuosos en la muestra, p. ej., dividiendo el número de ácidos nucleicos de la muestra que comprenden cualquier secuencia viral hipermutada y/o menos de cada secuencia viral nativa por el número de ácidos nucleicos de la muestra que comprenden cualquier secuencia viral. En realizaciones preferidas, el método comprende además aislar cada ácido nucleico de la muestra antes de amplificar los ácidos nucleicos, p. ej., mediante ddPCR. No obstante, algunas realizaciones de la invención no requieren el aislamiento de cada ácido nucleico.

[0059] Tipos de virus y mutaciones

[0060] El virus es el VIH-1. La pluralidad de secuencias de nucleótidos virales conservadas son secuencias de nucleótidos que codifican una señal de empaquetamiento viral, Gag, Pol, Env, y opcionalmente Tat, Nef, Rev, Vif, Vpr, Vpu, y/o una o más repeticiones terminales largas (LTR).

[0061] Una secuencia viral mutada puede comprender al menos una mutación de guanina a adenina, tal como al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o incluso 10 mutaciones de guanina a adenina. Un provirus hipermutado puede comprender al menos 10, 50, 100, 200 o más mutaciones y, por tanto, un provirus hipermutado puede comprender muchas secuencias virales mutadas diferentes que pueden analizarse con diferentes cebadores y sondas de PCR.

[0062] Sujetos y muestras

[0063] El sujeto puede ser un organismo pluricelular, tal como una planta o un animal. El sujeto puede ser un vertebrado, tal como un pez, anfibio, reptil, ave o mamífero. El sujeto puede ser un murino, canino, felino, ovino, porcino, bovino, equino o primate. Por ejemplo, el sujeto puede ser un ser humano.

[0064] La muestra puede obtenerse directamente de un sujeto, tal como mediante la extracción de sangre del sujeto o la realización de una biopsia. La muestra puede obtenerse indirectamente, por ejemplo, del médico del sujeto o de un archivo. Los ácidos nucleicos de la muestra pueden obtenerse a partir de células mononucleares de sangre periférica, tales como linfocitos. Los ácidos nucleicos de la muestra pueden obtenerse de linfocitos T, tal como los linfocitos T en reposo. Los ácidos nucleicos de la muestra pueden obtenerse de linfocitos T CD4+, tal como los linfocitos T CD4+ en reposo.

[0065] La muestra puede proceder de un sujeto humano con VIH. El sujeto puede ser virémico, en tratamiento agudo o crónico. En algunas realizaciones, el sujeto está en tratamiento agudo o crónico con terapia antirretroviral ("TAR"), terapia antirretroviral combinada ("TARc"), o terapia antirretroviral de gran actividad ("TARGA"). En algunas realizaciones, la muestra procede de un sujeto (p. ej., un sujeto humano), y el sujeto no tiene el VIH.

[0066] Kits para determinar si un ácido nucleico comprende un provirus intacto

[0067] Se divulga, pero fuera del alcance de las reivindicaciones, un kit para determinar la proporción de provirus intactos, hipermutados, eliminados y/o defectuosos en una muestra de ácidos nucleicos, que comprende al menos un cebador o sonda de PCR que comprende una secuencia viral nativa, en donde cada uno del al menos uno o varios cebador(es) o sonda(s) de PCR que comprende una secuencia viral nativa tiene una mayor afinidad de unión por la secuencia viral nativa que por las secuencias virales mutadas; y al menos un cebador o sonda de PCR que comprende una secuencia viral hipermutada, en donde cada uno del al menos uno o varios cebador(es) o sonda(s) de PCR que comprende una secuencia viral hipermutada tiene una mayor afinidad de unión por la secuencia viral hipermutada que por las secuencias virales nativas. El provirus puede ser un lentivirus, tal como el provirus del VIH. Las secuencias virales nativas pueden seleccionarse de secuencias de nucleótidos que codifican total o parcialmente una señal de empaquetamiento viral, Gag, Pol, Env, Tat, Nef, Rev, Vif, Vpr, Vpu, y/o una o más repeticiones terminales largas (LTR). Las secuencias virales hipermutadas pueden seleccionarse de secuencias de nucleótidos que varían de las secuencias de nucleótidos que codifican total o parcialmente una señal de empaquetamiento viral, Gag, Pol, Env, Tat, Nef, Rev, Vif, Vpr, Vpu, y/o una o más repeticiones terminales largas (LTR) por una o más mutaciones, tal como las mutaciones de guanina a adenina. El kit puede comprender además cebadores de PCR que amplifican sustancialmente todo el provirus; por ejemplo, el kit puede comprender cebadores de PCR que se unen a los extremos 3' y 5' del provirus.

[0068] Esta divulgación se comprenderá mejor a partir de los Detalles experimentales que siguen. Sin embargo, un experto en la materia apreciará fácilmente que los métodos y resultados específicos que se describen son meramente ilustrativos de la divulgación como se describe más detalladamente en las realizaciones que siguen a continuación.

[0069] Ejemplos

[0070] Ejemplo 1 - Análisis de reservorios virales latentes en sujetos humanos con un nivel de ARN del VIH-1 en plasma indetectable durante al menos 1 año

[0071] Sujetos de estudio

[0072] Los individuos infectados por el VIH-1 se incluyeron en el estudio basándose en los criterios de TAR supresiva y nivel indetectable de ARN del VIH-1 en plasma (<50 copias por ml) durante un mínimo de 1 año.

[0073] Aislamiento de linfocitos T CD4+ en reposo

[0074] Las PBMC de sangre total se aislaron mediante centrifugación de densidad en un gradiente Ficoll-Hypaque. Se aislaron linfocitos T CD4+ de PBMC utilizando un método de selección negativa (Kit de aislamiento de linfocitos T CD4+ II, Miltenyi Biotec). Los linfocitos CD4+ en reposo (CD4+, CD69-, CD25- y HLA-DR-) se enriquecieron adicionalmente mediante una segunda depleción negativa (CD25-Biotin, Miltenyi Biotec; Anti-Biotin MicroBeads, Miltenyi Biotec; CD69 MicroBead Kit II, Miltenyi Biotec; Anti-HLA-DR MicroBeads, Miltenyi Biotec). Se congelaron de forma viable alícuotas de 2 x 10<6>células CD4+ en reposo se congelaron a -80 °C hasta el momento de la extracción del ADN. La pureza de las células CD4+ en reposo se verificó mediante citometría de flujo.

[0075] Extracción de ADN y PCR de dilución límite

[0076] El ADN se extrajo de 2 x 10<6>células CD4+ en reposo utilizando el Qiagen Gentra Purgene Cell Kit A y se sometió a PCR anidada de dilución límite. La PCR externa era casi de longitud completa de U5 a U5, seguido de la amplificación anidada de gag y env para determinar la clonalidad. Alícuotas de cada pocillo de PCR externa clonal (p > 0,85), independientemente de que fueran positivos o negativos para gag y env, se sometieron a seis PCR internas. Los productos de la PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1 % y los productos se secuenciaron directamente para obtener secuencias del genoma casi completo. Se realizaron experimentos de control utilizando el genoma de referencia NL4-3 y no se observaron defectos (deleciones o hipermutación). Los cebadores se usaron como se describe en Ho, Y.-C. et al. (Cell 155:540-551 (2013).

[0077] Análisis

[0078] Todas las secuencias se alinearon y compararon con el genoma de referencia HXB2 para determinar defectos tales como deleciones de secuencia grandes. La hipermutación se determinó utilizando el algoritmo Hypermut2 de Los Álamos (Rose, P.P. y Korber, B.T., Bioinformatics 16:400-401(2000)).

[0079] Los linfocitos T CD4+ en reposo se aíslan de la sangre de pacientes VIH-1 positivos y se extrae el ADN. Se realizan PCR anidadas a dilución límite y se utilizan PCR de gag y env para determinar la clonalidad. Una vez establecida una dilución clonal, los pocillos de PCR se someten a 6 PCR internas y se visualizan en un gel (Figura 1). Se extraen las bandas y se secuencian directamente. Se reconstruyen genomas provirales completos utilizando las seis PCR internas solapadas y se evalúan las secuencias en busca de deleciones de secuencia grandes e hipermutación.

[0080] Nueve pacientes en tratamiento crónico, siete pacientes en tratamiento agudo y dos pacientes virémicos (infectados, pero no tratados) se analizaron en este estudio y se encontraron deleciones de secuencia grandes mediante secuenciación directa de los productos de PCR (Figura 2). Se encontraron deleciones tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' del genoma del VIH en todos los grupos de pacientes y algunas deleciones abarcaban grandes porciones de ambos extremos. De las 133 secuencias identificadas y secuenciadas en el grupo en tratamiento crónico, las deleciones se cartografiaron directamente en 73 secuencias provirales. Dado que algunas deleciones abarcaban sitios de unión del cebador directo o inverso, no se produjo la amplificación por PCR y no fue posible la cartografía directa de la deleción. Se realizó un análisis similar para la cohorte de pacientes agudos y las deleciones de secuencia grandes y la hipermutación fueron los defectos más comunes, que comprenden el 90 % de todas las secuencias. Los pacientes virémicos también tenían un porcentaje considerable de provirus defectuosos, conteniendo defectos más del 65 % de todas las secuencias. Solo se identificaron 5 secuencias genéticamente intactas (< 5 % del total de secuencias) en los pacientes en tratamiento crónico y 11 secuencias (10 %) en los pacientes en tratamiento agudo.

[0081] Ejemplo 2 - Detección de provirus defectuosos tras una única ronda de transcripción inversa

[0082] Se infectaron linfocitos T CD4+ activados con el virus BaL y se añadió T20 tras la infección para bloquear rondas adicionales de infección. El método anterior se usó para evaluar la presencia o ausencia de defectos en la secuencia genómica. Los provirus defectuosos se detectaron fácilmente (Figura 6). Algunas deleciones abarcaban sitios de unión del cebador directo o inverso, por lo que no se produjo la amplificación por PCR y no fue posible cartografiar directamente la deleción. Los tamaños máximo y mínimo de estas deleciones se estimaron utilizando las ubicaciones del cebador de las PCR internas que amplificaron y no amplificaron.

[0083] Ejemplo 3 - Proporción de provirus intactos, hipermutados y eliminados en los reservorios provirales latentes de varios subgrupos de pacientes

[0084] Los reservorios provirales latentes de tres subgrupos de pacientes se evaluaron como se describe en el ejemplo 1, citado anteriormente, incluidos dos pacientes virémicos, siete pacientes en tratamiento agudo y nueve pacientes en tratamiento crónico. En la Figura 5 se muestran secuencias representativas de cada subgrupo de pacientes. Los dos defectos más comunes fueron las deleciones de secuencia grandes y la hipermutación APOBEC3G. Se encontraron deleciones tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' del genoma del VIH y algunas deleciones abarcaban grandes porciones de ambos extremos. En algunos casos, una deleción cartografiada abarcaba los sitios de unión del cebador para otras PCR internas, por lo que no se capturó una región de secuencia aunque se presumió que estaba presente. Algunas deleciones abarcaban sitios de unión del cebador directo o inverso, por lo que no se produjo la amplificación por PCR y no fue posible la cartografía directa de la deleción.

[0085] Se encontraron defectos en niveles elevados en cada una de las tres poblaciones de pacientes. Las deleciones de secuencia fueron el defecto más común y se identificaron en todos los grupos (Tabla 1; Figura 7). Las deleciones que abarcan todo o parte del gen gag se etiquetaron como deleciones del extremo 5' y las deleciones que abarcan todo o parte del gen env se etiquetaron como deleciones del extremo 3'. Las deleciones que abarcan ambas regiones se etiquetaron como deleciones internas muy grandes. Se observó hipermutación en todos los grupos, con niveles significativamente más altos en los pacientes en tratamiento agudo en comparación con los demás grupos.

[0086] Los provirus de los pacientes en tratamiento crónico eran en su inmensa mayoría defectuosos, con menos del 5 % de secuencias genéticamente intactas. Los provirus de los pacientes en tratamiento agudo mostraron más hipermutación que los de los pacientes en tratamiento crónico, probablemente por una elevada actividad APOBEC durante la infección aguda. El elevado porcentaje de provirus defectuosos en pacientes en tratamiento agudo sugiere que los provirus defectuosos se acumulan rápidamente, al principio de la infección. Los pacientes virémicos, en los que la mayoría de las células están recién infectadas, tenían una fracción significativamente mayor de provirus intactos. Adicionalmente, clones provirales analizados en el experimento in vitro descrito en el Ejemplo 2, se compararon con los tres subgrupos de pacientes (Tabla 1; Figura 7).

[0087] Tabla 1. Pro orción de rovirus intactos hi ermutados eliminados en varios sub ru os de acientes

[0089]

[0091] En determinadas realizaciones, pueden usarse sondas y cebadores de PCR conocidos para ensayar y/o amplificar una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la memoria descriptiva. Los diversos métodos de la invención pueden realizarse con cualquier número de sondas y/o cebadores de PCR diferentes que reconozcan secuencias de nucleótidos virales nativas y/o secuencias de nucleótidos virales mutadas.

[0092] Cebadores y sondas de PCR utilizados para detectar una señal de empaquetamiento del VIH-1:

[0093] Cebador directo 5PackF1

[0094] SEQ ID NO:1 TCT CTC GAC GCA GGA CTC

[0095] Cebador inverso 3PackR1

[0096] SEQ ID NO:2 TCT AGC CTC CGC TAG TCA AA

[0097] Sonda Pack1(IDT's Zen/3'IBFQ)

[0098] SEQ ID NO:35TET-TTT GGC GTA CTC ACC AGT CGC C

[0099] Cebadores y sondas de PCR utilizados para detectar mutaciones en el VIH-1

[0100] Cebador directo F7

[0101] SEQ ID NO:4 AGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGC

[0102] Cebador inverso R7

[0103] SEQ ID NO:5 GTCTGGCCTGTACCGTCAGC

[0104] Sonda hipermutada hypermut4 (secuencia viral mutada)

[0105] SEQ ID NO:66FAM-TTCCTTAAGTTCTTAGGAGC-MGB

[0106] Sonda intacta normal 4 (secuencia viral nativa)

[0107] SEQ ID NO:7 VIC-CCTTGGGTTCTTGGGA-MGB

[0108] Cebadores y sondas de PCR utilizados para detectar un Gag del VIH-1:

[0109] Cebador directo

[0110] SEQ ID NO:8 CAT GTT TTC AGC ATT ATC AGA AGG A

[0111] Cebador inverso

[0112] SEQ ID NO:9 TGC TTG ATG TCC CCC CAC T

[0113] Sonda

[0114] SEQ ID NO:10 CCA CCC CAC AAG ATT TAA ACA CCA TGC TAA Cebadores y sondas de PCR utilizados para detectar un Pol del VIH-1:

[0115] Cebador directo

[0116] SEQ ID NO:11 GCA CTT TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA

[0117] Cebador inverso

[0118] SEQ ID NO:12 CAA ATT TCT ACT AAT GCT TTT ATT TTT TC

[0119] Sonda

[0120] SEQ ID NO:13 VIC-AAG CCA GGA ATG GAT GGC C-MGB

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar provirus del VIH-1 en una muestra de ácidos nucleicos, que comprende: amplificar los ácidos nucleicos con al menos un cebador de PCR que hibrida con al menos una parte de una secuencia nativa del VIH-1 proviral que codifica una secuencia de señal de empaquetamiento del VIH-1 proviral en presencia de al menos una primera sonda que es específica de una parte de la secuencia de señal de empaquetamiento nativa del VIH-1 proviral; y detectar la unión de la primera sonda a una parte de la secuencia de señal de empaquetamiento nativa del VIH-1 proviral;

amplificar los ácidos nucleicos con al menos un cebador de PCR que hibrida con al menos una parte de una secuencia nativa del VIH-1 proviral que codifica Env en presencia de al menos una segunda sonda que es específica de una secuencia hipermutada de Env del VIH-1 proviral en presencia de al menos una tercera sonda que es específica de la secuencia nativa de Env del VIH-1 proviral; en donde la tercera sonda es específica del complemento de SEQ ID NO: 7; y detectar la unión de la tercera sonda a una parte de una secuencia nativa de Env del VIH-1 proviral; y

amplificar los ácidos nucleicos con al menos un cebador de PCR que hibrida con al menos una parte de una secuencia nativa del VIH-1 proviral que codifica Gag en presencia de al menos una cuarta sonda que es específica de la secuencia de Gag nativa del VIH-1 proviral; o

amplificar los ácidos nucleicos con al menos un cebador de PCR que hibrida con al menos una parte de una secuencia nativa del VIH-1 proviral que codifica Pol en presencia de al menos una quinta sonda que es específica de la secuencia Pol nativa del VIH-1 proviral.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra de ácidos nucleicos procede de un sujeto humano.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la secuencia de Env hipermutada del VIH-1 proviral comprende una hipermutación de guanina a adenina.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra de ácidos nucleicos consiste en ácidos nucleicos obtenidos de células sanguíneas.

5. El método de la reivindicación 4, en donde las células sanguíneas son linfocitos.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra procede de un sujeto humano con VIH, y el sujeto es virémico, está en tratamiento agudo o en tratamiento crónico.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el sujeto está en tratamiento agudo o en tratamiento crónico con terapia antirretroviral ("TAR").

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la muestra procede de un sujeto humano, y el sujeto no tiene el VIH.

9. El método de la reivindicación 1, en donde dicha amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una PCR cuantitativa, una PCR digital de gotitas, o cualquier combinación de las mismas.

10. Una terapia antirretroviral (TAR), una terapia antirretroviral combinada (TARc), o una terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA) para usar en un método de tratamiento de un sujeto humano que tiene una infección por VIH-1, comprendiendo el método;

detectar provirus del VIH-1 en una muestra de ácidos nucleicos obtenida de un sujeto humano mediante un método de acuerdo con la reivindicación 1 y

administrar la terapia antirretroviral (TAR), la terapia antirretroviral combinada (TARc), o la terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA) a dicho sujeto.

11. El método de la reivindicación 1, en donde la secuencia de Env hipermutada del VIH-1 proviral comprende al menos 2 hipermutaciones de guanina a adenina.

12. El método de la reivindicación 1, en donde la unión de la tercera sonda compite con la unión de la segunda sonda en presencia de la secuencia Env nativa del VIH-1 proviral.

13. El método de la reivindicación 1, en donde la secuencia de Env hipermutada del VIH-1 proviral comprende una o más hipermutaciones APOBEC3G.

14. El método de la reivindicación 13, en donde la segunda sonda es específica de una o más hipermutaciones APOBEC3G en la secuencia Env hipermutada del VIH-1 proviral.

15. El método de la reivindicación 1, en donde la secuencia de Env hipermutada del VIH-1 proviral es el complemento

de SEQ ID NO: 7 y comprende una o más hipermutaciones APOBEC3G.

16. El método de la reivindicación 1, en donde la segunda sonda es específica del complemento de SEQ ID NO: 7, en donde el complemento de SEQ ID NO: 7 comprende una o más hipermutaciones APOBEC3G.