ES3067985T3 - Glycosylation of proteins - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al descubrimiento de métodos para modificar el perfil de glicosilación de las glicoproteínas séricas recombinantes hacia la forma biantenaria predominante presente en el plasma humano. Esto se logra mediante la introducción de una serie de alteraciones genéticas y/o inserciones genéticas en una línea celular de mamíferos, de acuerdo con la invención, que facilitan dicha modificación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Glicosilación de proteínas

[0003] Campo de la invención

[0004] La presente invención se refiere al descubrimiento de métodos para modificar el perfil de glicosilación de las glicoproteínas séricas producidas por vía recombinante, con el fin de que adopten la forma biantenaria predominante que se encuentra en el plasma humano. Esto se consigue proporcionando una línea celular de mamífero de acuerdo con la invención con una serie de inactivaciones y/o inserciones que facilitan este cambio, concretamente una línea celular recombinante de ovario de hámster chino (CHO) que tiene los genes endógenos Mgat4A, Mgat4B, Mgat5, St3Gal4, St3Gal6, SPPL3 y FUT8 inactivados y/o regulados a la baja mediante inactivación génica.

[0005] Antecedentes de la invención

[0006] Las glicoproteínas recombinantes y, particularmente, las proteínas séricas humanas, tal como las glicoproteínas de la familia de las serpinas, se producen para una amplia gama de aplicaciones. Estas incluyen alfa-1-antitripsina (AAT), inhibidor de la proteasa C1 plasmática (C1Inh), antitrombina III (ATIII), inhibidor de la elastasa de monocitos y neutrófilos (Serpina B1), inhibidor I del activador del plasminógeno (PAI1), que se producen para aplicaciones terapéuticas en seres humanos.

[0007] La alfa-1-antitripsina (AAT) se utiliza para el tratamiento de personas con déficit de AAT. Esta deficiencia puede provocar enfermedades pulmonares y hepáticas mortales. Se calcula que más de un millón de personas en todo el mundo padecen deficiencia de AAT. En la actualidad, la AAT se purifica a partir de plasma humano. Este régimen terapéutico resulta caro (52000 dólares al año por paciente) y no es óptimo en cuanto a seguridad, ya que es posible que los posibles patógenos presentes en el plasma no se eliminen de manera eficaz.

[0008] Se han ensayado numerosos métodos para producir AAT humana recombinante. Los intentos de producir AAT en células no mamíferas, tal como E. coli, levaduras y plantas, han dado lugar a AAT no glicosilada o a patrones de glicosilación no humana. También se ha descrito la producción de AAT en animales transgénicos, tales como ovejas. Sin embargo, posteriormente se observó una respuesta inmunitaria a la AAT endógena (de oveja) presente en el producto purificado. Esto pone claramente de manifiesto uno de los principales retos a los que se enfrentan los tratamientos terapéuticos derivados de animales transgénicos. Por último, la AAT también se ha producido en células CHO y en células humanas con un perfil de glicosilación anómalo.

[0009] Por lo tanto, en la técnica existe la necesidad glicoproteínas con un perfil de glicosilación más nativo.

[0010] El documento WO 2017/008982 A1 se refiere a una célula que comprende un gen que codifica un polipéptido de interés, y describe, por ejemplo una célula CHO-GS con inactivación de los genes B3gnt2/mgat4a/4b/5/ST3gal4/6 y una célula CHO-GS con inserción del gen ST6Gal1 en una inactivación de los genes mgat4a/4b/5/ST3gal4/6, así como el inactivación del gen Fut8, que codifica la alfa-6-fucosiltransferasa para la fucosilación del núcleo.

[0011] Yang et al. (NATURE BIOTECHNOLOGY 2015;33(8):842-844) describe ingeniería de células CHO mediante la inactivación génica genómica, con el fin de producir glicoproteínas diversas y homogéneas con la glicosilación deseada, tal como, por ejemplo, protección de ácido siálico unido por enlace α2,6 similar al humano. La inactivación acumulada de mgat4A/4B/5 junto con los genes st3gal4/6 y la inserción adicional de St6Gal1 produjeron N-glicanos biantenarios homogéneos terminados en alfa-2,6-NeuAc.

[0012] Objeto de la invención

[0013] Un objeto de realizaciones de la invención es proporcionar métodos y herramientas para producir proteínas recombinantes con un perfil de glicanos que se encuentra de forma natural en los seres humanos.

[0014] Sumario de la invención

[0015] El(los) presentes inventores han descubierto que mediante una modificación específica de una célula huésped de mamíferos con la regulación a la baja o inactivación de una serie de genes, junto con la inserción de otro u otros genes específicos, dicha célula huésped de mamíferos se transforma en una célula que producirá glicoproteínas con un perfil de glicosilación que se asemeja en mayor medida al perfil de glicosilación encontrado para las mismas glicoproteínas de forma natural en los seres humanos, tal como en el plasma humano.

[0016] La invención es como se establece en las reivindicaciones adjuntas.

[0017] Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una línea celular recombinante de ovario de hámster chino (CHO) que tiene los genes endógenos Mgat4A, Mgat4B, Mgat5, St3Gal4, St3Gal6, SPPL3 y FUT8 inactivados y/o regulados a la baja mediante inactivación génica.

[0018] En algunas realizaciones, los ocho genes endógenos Mgat4A, Mgat4B, Mgat5, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal6, SPPL3 y FUT8 se inactivan y/o se regulan a la baja.

[0019] En algunas realizaciones, los nueve genes endógenos Mgat4A, Mgat4B, Mgat5, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal6, SPPL3, B3GNT2 y FUT8 se inactivan y/o se regulan a la baja.

[0020] En algunas realizaciones, los nueve genes endógenos Mgat4A, Mgat4B, Mgat5, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal6, SPPL3, GLUL y FUT8 se inactivan y/o se regulan a la baja.

[0021] En algunas realizaciones, los diez genes endógenos Mgat4A, Mgat4B, Mgat5, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal6, SPPL3, B3GNT2, GLUL y FUT8 se inactivan y/o se regulan a la baja.

[0022] En algunas realizaciones, se inserta el gen que codifica la beta-galactósido alfa-2,6-sialiltransferasa 1.

[0023] En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de una proteína recombinante de interés, comprendiendo el método las etapas de: a) cultivar una población de células CHO recombinantes, según el primer aspecto, en un medio de cultivo celular adecuado, en donde la célula ha sido modificada adicionalmente para expresar una glicoproteína humana exógena de interés, tal como una proteína humana terapéutica; y b) cosechar dicha proteína humana de interés desde el cultivo celular o desde el medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, la proteína de interés se produce con una estructura de glicanos similar o idéntica al perfil de glicanos de dicha glicoproteína de interés presente en el plasma humano.

[0024] Leyendas de las figuras

[0025] Figura 1. Ilustración del perfil de glicosilación con una estructura biantenaria totalmente sialilada sin fucosilación del núcleo, tal como se encuentra, por ejemplo, en la AAT humana procedente de diversas fuentes, tal como la AAT purificada a partir de plasma.

[0026] Figura 2. Comparación del perfil glicosílico de la AAT purificada a partir de plasma y de la AAT producida en células de CHO. La AAT producida en células CHO de tipo salvaje presenta numerosas estructuras diferentes, siendo la especie más predominante una estructura biantenaria con fucosilación en el núcleo y parcial o totalmente sialilada mientras que la purificada a partir de plasma contiene casi exclusivamente una estructura glucídica biantenaria sin fucosilación en el núcleo y totalmente sialilada. Además, los ácidos siálicos derivados de CHO están unidos por enlaces α2-3, mientras que los ácidos siálicos plasmáticos están unidos por enlaces α2-6.

[0027] Figura 3. El perfil de glicosilación de la AAT humana derivada de las líneas celulares modificadas genéticamente descritas aquí. Las alteraciones génicas y la inserción génica descritas dan lugar a una estructura glucídica biantenaria sin fucosilación en el núcleo y totalmente sialilada con ácidos siálicos con enlaces α2-6 como especie predominante.

[0028] Figura 4. Gel de enfoque isoeléctrico de AAT derivado del plasma (carriles 1 y 2), de las líneas celulares modificadas genéticamente descritas aquí (carriles 3 y 4) y de CHO de tipo salvaje (carriles 5 y 6). Los patrones de migración de los derivados de CHO modificados genéticamente y mediante ingeniería glicídica son idénticos. Figura 5. Ensayo de inhibición de la elastasa para evaluar la actividad de

[0029] Figura 6. Mapa vectorial de St6Gal1

[0030] Figura 7. Mapa vectorial de Serpina A

[0031] Figura 8. Mapa vectorial de Serpina G

[0032] Figura 9. Mapa vectorial de SerpinC1

[0033] Figura 10. Mapa vectorial combinado de St6Gal1/Serpina A

[0034] Figura 11. Mapa vectorial combinado de St6Gal1/Serpina G

[0035] Figura 12. Crecimiento y estructuras de N-glicanos de las líneas celulares CHO-S WT y 10x KO. (A) Densidad de células viables y viabilidad de cultivos discontinuos de CHO-S WT y de dos líneas celulares clonales con inactivación funcional de ocho glicosiltransferasas, así como de GS y SPPL3. Las barras de error indican la desviación estándar de los triplicados. (B) Análisis de N-glicanos de las proteínas secretadas totales procedentes de CHO-S WT y de los clones 10x KO A y B. El tiempo de elución se indica en el eje x y el eje y representa la intensidad de la señal normalizada al pico más alto (C) Proporción de N-glicanos biantenarios no fucosilados con galactosa terminal (A2G2) en las proteínas secretadas totales de CHO-S WT y de los clones 10x KO A y B.

[0036] Figura 13. Tinción con lectina FITC-SNA de determinadas líneas celulares policlonales y monoclonales. (A) Imágenes fluorescentes de las líneas celulares CHO-S WT y A1-1. Las células se tiñeron para detectar los enlaces de ácido siálico alfa-2,6 con FITC-SNA (verde) y los núcleos con Hoechst (azul). La barra de la esquina inferior derecha muestra una longitud de 500 µm (B) Comparación de células positivas para FITC-SNA. Tinción con lectina FITC-SNA de CHO-S WT, dos líneas celulares policlonales MSX a 50 µM y cuatro clones seleccionados. Las barras indican la proporción de células con señal positiva de FITC debida a la unión de la lectina SNA a los ácidos siálicos con enlaces alfa-2,6 presentes en la superficie celular. Las barras de error representan la desviación estándar de tres mediciones individuales por muestra.

[0038] Figura 14. Perfiles de crecimiento, títulos de los productos y productividades específicas de determinados clones productores y no productores. Densidades celulares viables y viabilidades celulares de CHO-S WT, 10x KO B, y de las líneas celulares clonales productoras de rhA1AT- (A1-1 y A1-2) y rhC1INH- (C1-1 y C1-2), medidas en cultivos discontinuos. Las barras de error indican el intervalo de los cultivos paralelos duplicados. (B) Títulos de rhA1AT y rhC1INH en los sobrenadantes durante el experimento de cultivo discontinuo. Las barras de error indican la desviación estándar de tres mediciones individuales obtenidas de dos matraces de agitación por clon. (C) Productividades específicas de las líneas celulares clonales productoras de rhA1AT y rhC1INH en el experimento de cultivo discontinuo. La productividad específica promedio se calculó desde los días 2 - 5 y desde los días 6 - 9. Los símbolos de colores representan la productividad específica promedio medida para los duplicados de los frascos de agitación. Las líneas negras muestran la productividad específica promedio sobre la base de tres mediciones de los duplicados de frascos de agitación.

[0040] Figura 15. Caracterización de la rhA1AT y la rhC1INH purificadas. (A) Análisis mediante gel de SDS-PAGE de los productos Cinryze (plC1INH) y Prolastina-C (plA1AT), disponibles en el mercado, así como de rhA1AT y rhC1INH purificados a partir de CHO-S WT policlonal o de líneas celulares monoclonales derivadas de 10x KO B. Se llevó a cabo la eliminación de N-glicanos mediante PNGasaF cuando así se indicaba. La PNGasa F, que migra como una banda de ~40 kDa, se indica con un asterisco y las impurezas de plC1INH se indican con flechas. (B) Análisis en gel IEF de las mismas proteínas descritas en el panel A. Se analizaron 2,5 µg de proteína purificada por muestra, salvo que se indique lo contrario. (C) Estructuras de N-glicanos anotadas en los clones A1-1 y C1-1, respectivamente, así como las proporciones de A2G2S2 de rhA1AT y rhC1INH purificadas en comparación con plA1AT y plC1INH. (D) Panel izquierdo: Ensayo in vitro para la medición de la inhibición de la actividad de la elastasa a diferentes concentraciones de plA1AT y rhA1AT purificadas de los clones A1-1 y A1-2. Las barras de error indican el intervalo de las mediciones por duplicado. La actividad proteolítica máxima de la elastasa porcina se fijó en el 100 %. Panel derecho: Evaluación de la actividad in vitro de plC1INH y rhC1INH purificadas de los clones C1-1 y C1-2. Como se describe en el ensayo, se estableció que 1 UI/ml de actividad de C1INH era el 100 %. Las barras de error indican el intervalo de las mediciones por duplicado.

[0042] Figura 16. Perfiles de N-glicanos: superposición de las líneas celulares CHO-S WT (línea discontinua) y Sppl3 KO (línea continua) que producen EPO y C1inh, respectivamente. El efecto de Sppl3 se puede observar como un cambio hacia N-glicanos de mayor tamaño.

[0044] Divulgación detallada de la invención

[0046] El análisis glicídico de la AAT humana desde diversas fuentes reveló que la AAT purificada a partir de plasma presenta una estructura biantenaria totalmente sialilada sin fucosilación del núcleo (figuras 1 y 2). Por el contrario, la AAT producida por CHO presenta numerosas estructuras diferentes con una estructura biantenaria parcial y totalmente sialilada con fucosilación del núcleo como la especie más predominante (Figura 2).

[0048] Los inventores de la presente invención han descubierto que puede conseguirse un cambio en el perfil de glicosilación de las glicoproteínas séricas producidas recombinantes hacia la forma biantenaria predominante que se encuentra en el plasma humano, mediante inactivación o regulación a la baja, por cualquier otro medio, de un conjunto seleccionado de enzimas glicosilantes. Esto dará lugar a un clon con doble inactivación de 6, 7, 8, 9, 10 u 8-9, en el que se expresan glicoproteínas, tal como las proteínas séricas humanas, tales como AAT humana. Se han seleccionado los siguientes objetivos para esta línea celular:

[0050] 1) Inactivación y/o la regulación a la baja de una serie de enzimas, Mgat4A, Mgat4B y Mgat5, que facilitan una disminución de la ramificación.

[0051] 2) Inactivación y/o regulación a la baja de una serie de enzimas, St3Gal3, St3Gal4 y St3Gal6, que facilitan la eliminación de la alfa-2,3-sialilación específica de CHO.

[0052] 3) Inactivación y/o regulación a la baja de la enzima SPPL3 que facilitan el aumento de la semivida de las glicosiltransferasas en el aparato de Golgi.

[0053] 4) Inactivación y/o regulación a la baja de la enzima FUT8, que facilitan la eliminación de la fucosilación del núcleo.

[0054] 5) Una inactivación y/o regulación a la baja opcional de la enzima B3GNT2 que podría eliminar las antenas alargadas.

[0055] 6) Una inactivación y/o regulación a la baja opcional de la enzima GLUL que podría potenciar el crecimiento celular y que podría utilizarse para la selección.

[0056] 7) La inserción de un gen que codifica para beta-galactósido alfa-2,6-sialiltransferasa 1 (St6gal1), gen que dirige la ramificación de los ácidos siálicos de tipo humano.

[0057] Con estas modificaciones, se lograría modificar el perfil de glicosilación para que predominara la forma biantenaria que se encuentra en el plasma humano de las glicoproteínas séricas producidas recombinantes, tales como proteínas séricas humanas, tales como la AAT humana, tal como ocurre en las células CHO.

[0058] Una célula huésped con estas modificaciones puede modificarse a continuación mediante la inserción de un gen que exprese una glicoproteína humana exógena de interés, tal como una proteína humana terapéutica, tal como una proteína sérica humana, tal como el inhibidor de la proteasa C1 del plasma (C1Inh), la antitrombina III (ATIII) o la alfa-1-antitripsina humana (AAT).

[0059] Las células de mamífero utilizadas de acuerdo con la presente invención son células de ovario de hámster chino (CHO), tal como CHO-K1, o derivadas de cualquiera de estas células.

[0060] En algunas realizaciones, la línea celular de acuerdo con la presente invención se modifica para que exprese un gen que expresa una glicoproteína humana exógena de interés, tal como una proteína sérica humana seleccionada de entre una cualquiera de las serpinas humanas de la tabla 1:

[0061] Tabla 1:

[0064]

[0065] continuación

[0068]

[0070] En particular, los presentes inventores se propusieron producir rhA1AT y rhC1INH en CHO-S con perfiles de N-glicanos similares a los de plA1AT y plC1INH. En primer lugar, el perfil heterogéneo de N-glicanos de las células CHO-S WT se modificó para obtener perfiles más homogéneos en líneas celulares específicas con estructuras de N-glicanos A2G2 predominantes. La inactivación de nueve genes relacionados con la N-glicosilación aumentó la proporción de A2G2 en las proteínas secretadas totales de 3,5 % en las células derivadas de CHO-S WT a aproximadamente el 80 % en las líneas celulares 10x KO. Esto respalda la estrategia de reducir la ramificación de los N-glicanos y la alfa-2,3-sialilación mediante la alteración de MGAT4A, MGAT4B, MGAT5, ST3GAL3, ST3GAL4 y ST3GAL6. Se evaluó el impacto de las alteraciones génicas en el rendimiento de los cultivos celulares mediante cultivos discontinuos. Además, las líneas celulares monoclonales con alteración en los diez genes diana mostraron unas características de crecimiento mejoradas en comparación con las células CHO-S WT. Esto incluyó un refuerzo del crecimiento celular en las líneas celulares 10x KO carentes de GLUL en un medio suplementado con L-glutamina.

[0071] A diferencia de las plataformas de producción descritas anteriormente, rhA1AT y rhC1INH producidas en las líneas celulares 10x KO descritas en el presente documento no solo superan los niveles de sialilación de plA1AT y plC1INH, sino que también presentan una sialilación alfa-2,6 similar a la humana, en lugar de una sialilación alfa-2,3. El aumento de la sialilación de la rhA1AT no tuvo ningún efecto sobre la actividad in vitro.

[0072] Los presentes inventores describen una estrategia para modificar con éxito el perfil de N-glicosilación heterogéneo de las células CHO-S WT, en particular, con el fin de obtener la estructura específica de N-glicanos A2G2S2, con el objetivo de producir serpinas, tales como rhA1AT y rhC1INH, con perfiles de N-glicanos similares a los de los productos derivados del plasma humano. Por lo tanto, la presente invención muestra las perspectivas y el potencial de sustituir la costosa y posiblemente insegura terapia de reposición derivada del plasma para pacientes con AATD y C1INH-HAE por rhA1AT y rhC1INH producidos en células de CHO. Esta estrategia se ajusta a la recomendación del Consejo Asesor Médico y Científico (MASAC) de sustituir los productos derivados del plasma por productos recombinantes para el tratamiento de enfermedades.

[0073] Definiciones

[0074] La alfa-1-antitripsina (A1AT o AAT) se refiere a la proteína identificada como UniProtKB - P01009 (A1AT_HUMANA).

[0075] El inhibidor de la proteasa C1 plasmática (C1Inh) se refiere a la proteína identificada como UniProtKB - P05155 (IC1_HUMAN)

[0076] La antitrombina III (ATIII) se refiere a la proteína identificada como UniProtKB - P01008 (ANT3_HUMANA) La expresión "inactivado y/o regulado a la baja" se refiere a una modificación de una célula huésped de mamífero en donde algunos genes específicos se han inactivado, regulado a la baja o inactivado total o parcialmente de cualquier otra forma, tal como mediante el silenciamiento postraduccional mediado por miARN. Preferentemente esta inactivación es una inactivación completa, sin signo mensurable de expresión de este gen concreto que se está inactivando. Las técnicas adecuadas para silenciar/inactivar están muy bien descritas en la técnica y son conocidas por el experto en la materia, por ejemplo como se describe en el documento WO2015092737. En una realización específica, la expresión "inactivado y/o regulado a la baja" se refiere a la inactivación del gen relevante.

[0077] El término "MGAT4A", como se utiliza en el presente documento, se refiere al gen que codifica la manosil (alfa-1,3-)-glicoproteína beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa, isoenzima A. Este gen también puede denominarse UDP-N-acetilglucosamina: Alfa-1,3-D-manósido beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa Iva;

[0078] Manosil (alfa-1,3-)-glicoproteína beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa, isoenzima A; N-glicosil-oligosacáridoglicoproteína N-acetilglucosaminiltransferasa Iva; N-acetilglucosaminiltransferasa Iva;

[0079] GlcNAc-T Iva;

[0080] EC 2.4.1.145;

[0081] GNT-IVA 3;

[0082] UDP-N-acetilglucosamina:alfa-1,3-D-manósido beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa; alfa-1,3-manosilglicoproteína 4-beta-N-acetilglucosaminiltransferasa A; alfa-1,3-manosil-glicoproteína beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa; UDP-GlcNAc:A-1,3-D-manósido B-1,4-acetilglucosaminiltransferasa IV;

[0083] GNT-IV; y

[0084] GnT-4a.

[0085] El término "MGAT4B", como se utiliza en el presente documento, se refiere al gen que codifica la manosil (alfa-1,3-)-glicoproteína beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa, isoenzima B. Este gen también puede denominarse UDP-N-acetilglucosamina: Alfa-1,3-D-manósido beta-1,4-N-acetiglucosaminiltransferasa IVb;

[0086] Manosil (alfa-1,3-)-glicoproteína beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa, isoenzima B; N-glicosil-oligosacáridoglicoproteína N-acetilglucosaminiltransferasa Ivb; N-acetilglucosaminiltransferasa Ivb;

[0087] GlcNAc-T IVb;

[0088] EC 2.4.1.145;

[0089] GNT-IVB 3;

[0090] UDP-N-acetilglucosamina: Alfa-1,3-D-manósido beta-1,4-N-acetiglucosaminiltransferasa IV;

[0091] Alfa-1,3-manosil-glicoproteína beta-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa;

[0092] Alfa-1,3-manosil-glicoproteína 4-beta-N-acetilglucosaminiltransferasa B;

[0093] Aminiltransferasa; y

[0094] GNT-IV.

[0095] El término "MGAT5", como se utiliza en el presente documento, se refiere al gen que codifica la manosil (alfa-1,6)-glicoproteína beta-1,6-N-acetilglucosaminiltransferasa. Este gen también puede denominarse

[0096] Alfa-manósido beta-1,6-N-acetilglucosaminiltransferasa;

[0097] Manósido acetilglucosaminiltransferasa;

[0098] N-acetilglucosaminil-transferasa V;

[0099] EC 2.4.1.155;

[0100] GlcNAc-T V;

[0101] GNT-V;

[0102] Alfa-1,6-manosilglicoproteína 6-beta-N-acetilglucosaminiltransferasa A;

[0103] GNT-VA; y

[0104] GGNT5.

[0105] El término "ST3GAL3", como se utiliza en el presente documento, se refiere al gen que codifica la ST3 beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 3. Este gen también puede denominarse

[0106] ST3Gal III;

[0107] Sialiltransferasa 6 (N-acetillacosaminida alfa-2,3-sialiltransferasa);

[0108] Alfa 2,3-ST;

[0109] ST3GalIII;

[0110] SIAT6;

[0111] ST3N;

[0112] CMP-N-acetilneuraminato-beta-1,4-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa;

[0113] Gal beta-1,3(4)-GlcNAc alfa-2,3-sialiltransferasa;

[0114] Gal beta-1,3(4)-GlcNAc alfa-2,3 sialiltransferasa;

[0115] N-acetilactosaminida alfa-2,3-sialiltransferasa;

[0116] Beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa;

[0117] Alfa 2,3-sialiltransferasa III;

[0118] Alfa-2,3-sialiltransferasa II;

[0119] Sialiltransferasa 6;

[0120] EC 2.4.99.6;

[0121] ST3GALII;

[0122] EIEE15; y

[0123] MRT12.

[0124] El término "ST3GAL4", como se utiliza en el presente documento, se refiere al gen que codifica la ST3 beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4. Este gen también puede denominarse

[0126] Sialiltransferasa 4C (beta-galactosidasa alfa-2,3-sialiltransferasa);

[0127] Gal-beta-1,4-GalNAc-alfa-2,3-sialiltransferasa;

[0128] Beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 4;

[0129] Alfa 2,3-sialiltransferasa IV;

[0130] Alfa 2,3-ST 4;

[0131] Gal-NAc6S;

[0132] ST3GalA.2;

[0133] ST3Gal IV;

[0134] ST3GalIV;

[0135] NANTA3;

[0136] SIAT4C;

[0137] CGS23;

[0138] ST-4;

[0139] STZ;

[0140] CMP-N-acetilneuraminato-beta-galactosamida-alfa-2,3-sialiltransferasa;

[0141] Sialiltransferasa 4C beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa);

[0142] Alfa-3-N-acetilneuraminiltransferasa;

[0143] Sialiltransferasa 4C;

[0144] EC 2.4.99.9;

[0145] EC 2.4.99.-;

[0146] EC 2.4.99;

[0147] SIAT4-C;

[0148] SIAT4;

[0149] SAT-3; y

[0150] SAT3.

[0152] El término "ST3GAL6", como se utiliza en el presente documento, se refiere al gen que codifica la ST3 beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa 6. Este gen también puede denominarse

[0154] CMP-NeuAc: Beta-galactósido alfa-2,3-sialiltransferasa VI;

[0155] Sialiltransferasa 10 (alfa-2,3-sialiltransferasa VI);

[0156] ST3GALVI;

[0157] SIAT10;

[0158] Lactosamina alfa-2,3-sialiltransferasa de tipo 2;

[0159] Alfa-2,3-sialiltransferasa ST3Gal VI;

[0160] Sialiltransferasa;

[0161] EC 2.4.99.9;

[0162] EC 2.4.99.-;

[0163] ST3Gal VI; y

[0164] EC 2.4.99.

[0166] El término "B3GNT2", como se utiliza en el presente documento, se refiere al gen que codifica la UDP-GlcNAc:BetaGal Beta-1,3-N-acetilglucosaminiltransferasa 2. Este gen también puede denominarse

[0168] UDP-GlcNAc:BetaGal Beta-1,3-N-Acetilglucosaminiltransferasa;

[0169] Beta3Gn-T1;

[0170] Beta3Gn-T2;

[0171] B3GNT1;

[0172] BGnT-2;

[0173] UDP-galactosa:Beta-N-acetilglucosamina Beta-1,3-galactosiltransferasa 7;

[0174] N-acetillactosaminida Beta-1,3-N-acetilglucosaminiltransferasa;

[0175] UDP-Gal:Beta-GlcNAc Beta-1,3-Galactosiltransferasa 7;

[0176] Beta-1,3-N-Acetilglucosaminiltransferasa BGnT-1;

[0177] Beta-1,3-N-Acetilglucosaminiltransferasa BGnT-2;

[0178] Beta-1,3-N-Acetilglucosaminiltransferasa 1;

[0179] Beta-1,3-N-Acetilglucosaminiltransferasa 2;

[0180] Beta-1,3-Galactosiltransferasa 7;

[0181] Beta-1,3-GalTasa 7;

[0182] Beta-1,3-Gn-T1;

[0183] Beta-1,3-Gn-T2;

[0184] Beta-3-Gx-T7;

[0185] EC 2.4.1.149;

[0186] Beta3Gal-T7;

[0187] Beta3GalT7;

[0188] BETA3GNT;

[0189] B3Gal-T7;

[0190] 3-Gn-T1;

[0191] 3-Gn-T2;

[0192] B3GN-T2;

[0193] B3GNT-2;

[0194] B3GALT7;

[0195] Beta-1;

[0196] BGnT-1;

[0197] B3GNT; y

[0198] BGNT2.

[0199] El término "GLUL", como se utiliza en el presente documento, se refiere al gen que codifica la glutamato-amoníaco ligasa, también conocida como:

[0200] Glutamato-amoniaco ligasa;

[0201] Glutamato descarboxilasa;

[0202] Glutamina sintetasa;

[0203] EC 6.3.1.2;

[0204] GLNS;

[0205] GS;

[0206] Glutamato-amoniaco ligasa (glutamina sintasa);

[0207] Proteína inductora de proliferación celular 59;

[0208] Proteína inductora de proliferación 43;

[0209] Glutamato-amoníaco ligasa;

[0210] Glutamina sintasa;

[0211] EC 4.1.1.15;

[0212] PIG43; y

[0213] PIG59.

[0214] El término "SPPL3", como se utiliza en el presente documento, se refiere al gen que codifica la peptidasa similar a la peptidasa de péptido señal 3. Este gen también puede denominarse

[0215] Proteína similar a la presenilina 4;

[0216] Proteasa intramembrana 2;

[0217] Proteína homóloga a la presenilina 1;

[0218] SPP-Like 3;

[0219] IMP2;

[0220] PSH1;

[0221] PSL4;

[0222] Peptidasa similar a la peptidasa de péptido señal 3;

[0223] EC 3.4.23.-;

[0224] MDHV1887;

[0225] PRO4332; y

[0226] IMP-2.

[0227] El término "FUT8", como se utiliza en el presente documento, se refiere al gen que codifica la fucosiltransferasa 8. Este gen también puede denominarse

[0228] GDP-L-Fuc: N-acetil-beta-D-glucosaminida alfa-1,6-fucosiltransferasa;

[0229] Fucosiltransferasa 8 (alfa (1,6) fucosiltransferasa);

[0230] GDP-fucosa-glicoproteína fucosiltransferasa;

[0231] Glicoproteína 6-alfa-L-fucosiltransferasa;

[0232] Alpha1-6FucT;

[0233] EC 2.4.1.684;

[0234] Alfa (1,6) fucosiltransferasa;

[0235] Alfa-(1,6)-fucosiltransferasa

[0236] El término "ST6Gal1", como se utiliza en el presente documento, se refiere al gen que codifica la ST6 beta-galactósido alfa-2,6-sialiltransferasa 1. Este gen también puede denominarse ST6Gal I;

[0237] CMP-N-acetilneuraminato-beta-galactosamida-alfa-2,6-sialiltransferasa 1:

[0238] ST6 N-acetilgalactosaminida alfa-2,6-sialiltransferasa 1;

[0239] ST6 beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa 1;

[0240] Antígeno CD75 de linfocitos B;

[0241] Alfa 2,6-ST 1;

[0242] EC 2.4.99.1;

[0243] ST6GalI;

[0244] SIAT1;

[0245] CMP-N-acetilneuraminato beta-galactosamida alfa-2,6-sialiltransferasa;

[0246] Sialiltransferasa 1 (beta-galactósido alfa-2,6-sialiltransferasa);

[0247] Sialiltransferasa 1 (beta-galactósido alfa-2,6-sialiltransferasa);

[0248] Beta-galactósido alfa-2,6-sialiltransferasa 1;

[0249] Sialiltransferasa 1; y

[0250] ST6N.

[0251] Realizaciones específicas de la invención

[0252] Como se ha detallado anteriormente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una línea celular CHO recombinante que tiene: a) los genes endógenos Mgat4A, Mgat4B, Mgat5, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal6, SPPL3 y FUT8 inactivados y/o regulados a la baja mediante inactivación génica; y b) opcionalmente, un gen que codifica la betagalactósido alfa-2,6-sialiltransferasa 1 insertado.

[0253] En algunas realizaciones de la célula CHO de acuerdo con la presente invención, los genes endógenos Mgat4A, Mgat4B, Mgat5, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal6, SPPL3 y FUT8 se inactivan y/o se regulan a la baja mediante inactivación génica; y se inserta el gen que codifica ST6Gal1.

[0254] En algunas realizaciones, la célula CHO de acuerdo con la presente invención tiene los genes endógenos Mgat4A, Mgat4B, Mgat5, St3Gal4, St3Gal6, SPPL3 y FUT8 inactivados y/o regulados a la baja mediante inactivación génica. En algunas realizaciones de la célula CHO de acuerdo con la presente invención, está presente el gen endógeno B3GNT2.

[0255] En algunas realizaciones, la célula CHO de acuerdo con la presente invención tiene además el gen B3GNT2 endógeno inactivado y/o regulado a la baja mediante inactivación génica. Debe entenderse que esto puede sumarse a cualquier combinación de otros genes que se inactiven y/o se regulen a la baja.

[0256] En algunas realizaciones, la célula CHO de acuerdo con la presente invención tiene además el gen GLUL endógeno inactivado y/o regulado a la baja mediante inactivación génica. Debe entenderse que esto puede sumarse a cualquier combinación de otros genes que se inactiven y/o se regulen a la baja.

[0257] En algunas realizaciones, la célula de mamífero de acuerdo con la presente invención es una línea celular CHO in vitro, tal como CHO-K1, CHO-S o DG44; o derivados de cualquiera de estas células.

[0258] En algunas realizaciones, la célula CHO de acuerdo con la presente invención se ha modificado adicionalmente para expresar una glicoproteína humana exógena de interés, tal como una proteína humana terapéutica. En algunas realizaciones, dicha glicoproteína humana exógena de interés es una proteína sérica humana, tal como una serpina humana, por ejemplo, una serpina humana seleccionada entre la lista que consiste en SERPINA1, SERPINA2, SERPINA3, SERPINA4, SERPINA5, SERPINA6, SERPINA7, SERPINA8, SERPINA9, SERPINA10, SERPINA11, SERPINA12, SERPINA13, SERPINAB1, SERPINAB2, SERPINAB3, SERPINAB4, SERPINAB5, SERPINAB6, SERPINAB7, SERPINAB8, SERPINAB9, SERPINAB10, SERPINAB11, SERPINAB12, SERPINAB13, SERPINAC1, SERPINAD1, SERPINAE1, SERPINAE2, SERPINAE3, SERPINAF1, SERPINAF2, SERPINAG1, SERPINAH1, SERPINAI1 y SERPINAI2.

[0259] En algunas realizaciones, la célula CHO de acuerdo con la presente invención es una línea celular que produce dicha glicoproteína de interés con una estructura de n-glicanos primaria que es una estructura biantenaria totalmente sialilada sin fucosilación del núcleo, tal como en más del 80 %, tal como el 82 %, el 84 %, el 86 %, el 88 %, el 90 % de las glicoproteínas de interés producidas están en una estructura biantenaria totalmente sialilada sin fucosilación del núcleo.

[0260] En algunas realizaciones, la estructura del glicano es de acuerdo a la estructura A2G2S2, con las siguientes representaciones gráficas:

[0261]

[0264] tal como, de acuerdo con la estructura:

[0267]

[0269] En algunas realizaciones, la célula CHO de acuerdo con la presente invención se ha modificado adicionalmente para expresar una glicoproteína humana exógena de interés, glicoproteína exógena humana de interés que se selecciona entre inhibidor de la proteasa plasmática C1 (C1Inh) glicosilado en una o más posiciones seleccionadas entre Asn3, Asn47, Asn59, Asn216, Asn231, Asn250 y Asn330; antitrombina III (ATIII) glicosilada en una o más posiciones seleccionadas entre Asn96, Asn135, Asn155 y Asn192; y alfa-1-antitripsina humana (AAT) glicosilada en una o más, tal como dos o tres, de las posiciones Asn46, Asn83 y Asn247.

[0270] EJEMPLO 1

[0271] Los inventores han inactivado 9 genes en la línea celular CHO-S mediante CRISPR/Cas9: FUT8, MGAT4a, MGAT4b, MGAT5, ST3GAL3, ST3GAL4, ST3GAL6, B3gnt2, Sppl3. Además, han introducido el gen humano ST6GAL1 para introducir la ramificación de los ácidos siálicos de tipo humano. A continuación, se introdujeron los genes humanos SERPINAG o SERPINAA en esta línea celular huésped para lograr la expresión de las proteínas séricas humanas inhibidor de la proteasa plasmática C1 (C1Inh) o alfa-1-antitripsina humana (AAT), respectivamente. Con estas modificaciones, se consigue modificar el perfil de glicosilación hacia la forma de ácido siálico biantenario, sin fucosilación en el núcleo y con enlaces α2-6, tal y como se encuentra en el plasma humano de las glicoproteínas séricas producidas recombinantes (figura 3). Los patrones de migración del IEF son idénticos entre AAT derivada del plasma y la línea celular modificada genéticamente descrita en el presente documento (figura 4). La actividad de la AAT no se ve afectada (figura 5).

[0272] Los plásmidos 2632 (GFP_2A_Cas9) y 5920 (FUT8_681494) se describen en Grav, L. M., Lee, J. S., Gerling, S., Kallehauge, T. B., Hansen, A. H., Kol, S., Lee, G. M., Pedersen, L. E. y Kildegaard, H. F. (2015), One-step generation of triple knockout CHO cell lines using CRISPR/Cas9 and fluorescent enrichment. Biotechnology Journal, 10: 1446-1456. doi:10.1002/biot.201500027.

[0273] Los plásmidos 2928 (MGAT4A_411545), 2933 (MGAT4B_1280368), 2937 (MGAT5_327084), 2940 (ST3GAL4_964386), 2943 (ST3GAL6_1812502), 4408 (B3gnt2_NW_003613880.1_1273293), 4412 (St3gal3_NW_003613906.1_244730) y 4424 (Sppl3_NW_003613978.1_213040) se construyeron como se describe en Ronda, C., Pedersen, L. E., Hansen, H. G., Kallehauge, T. B. et al., Accelerating genome editing in CHO cells using CRISPR/Cas9 and CRISPy, a web-based target finding tool. Biotechnol. Bioeng. 2014, 111, 1604-1616, con la siguiente modificación: se utilizó el plásmido de sgRNA sgRNA1_C descrito en Ronda et al. como molde en la reacción de PCR para generar la estructura básica de los plásmidos de gRNA.

[0274] El mapa vectorial de St6Gal1 se muestra en la figura 6.

[0275] El mapa vectorial de SerpinaA se muestra en la figura 7.

[0276] El mapa vectorial de SerpinaG se muestra en la figura 8.

[0277] El mapa vectorial de SerpinC1 se muestra en la figura 9.

[0278] EJEMPLO 2

[0279] Los inventores han inactivado 10 genes en la línea celular CHO-S mediante CRISPR/Cas9: FUT8, MGAT4a, MGAT4b, MGAT5, ST3GAL3, ST3GAL4, ST3GAL6, B3gnt2, Sppl3 y GLUL. Los inventores han construido plásmidos que contienen tanto el gen ST6GAL1 humano como los genes de SERPINAG o SERPINAA para introducir simultáneamente la ramificación de los ácidos siálicos de tipo humano y lograr la expresión del inhibidor de la proteasa C1 plasmática (C1Inh) o de la alfa-1-antitripsina humana (AAT), respectivamente.

[0280] En la figura 10 se muestra el mapa vectorial combinado de St6Gal1/SerpinaA.

[0281] En la figura 11 se muestra el mapa vectorial combinado de St6Gal1/SerpinaG.

[0282] EJEMPLO 3

[0283] El análisis de N-glicanos se llevó a cabo con el kit GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan (Waters, Milford, MA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En este caso, se utilizaron 12 µl de una muestra de secretoma o de proteína purificada concentrada 10 veces (filtrada por MWCO, Amicon Ultra-15, Merck, Darmstadt, Alemania) para cada una. Los N-glicanos marcados se analizaron mediante un sistema de LC-MS que utilizaba un HPLC Thermo Ultimate 3000 con detector de fluorescencia acoplado en línea a un MS Thermo Velos Pro Iontrap. Se utilizó un gradiente de separación con un tampón del 30 % al 43 %, y la MS se realizó en modo positivo.

[0284] EJEMPLO 4

[0285] Diseño de los plásmidos de sgRNA, GFP_2A_Cas9 y A1AT/C1INH_St6gal1_GLUL. Los plásmidos GFP_2A_Cas9 y de ARN guía único (sgRNA) se construyeron como se ha descrito anteriormente (Grav, L.M. et al., One-step generation of triple knockout CHO cell lines using CRISPR/Cas9 and fluorescent enrichment. Biotechnol. J.2015, 10, 1446-1456). El diseño de los objetivos de sgRNA para MGAT4A, MGAT4B, MGAT5, ST3GAL3, ST3GAL4, ST3GAL6, B3GNT2, FUT8, SPPL3 y GLUL se llevó a cabo utilizando "CRISPy" (Ronda, C. et al., Accelerating genome editing in CHO cells using CRISPR Cas9 and CRISPy, a web-based target finding tool. Biotechnol. Bioeng. 2014, 111, 1604-1616). Los sitios diana de los genes mencionados y los oligonucleótidos para la clonación de sgRNA se enumeran en la Tabla 2 y la Tabla 3, respectivamente.

[0286] Tabla 2: Secuencias diana de s RNA. Las bases en ne rita marcan el sitio PAM

[0289]

[0291] Tabla 3: Oli onucleótidos ara la clonación de vectores de ex resión de s RNA.

[0294]

[0295] continuación

[0298]

[0301] Se construyeron plásmidos para la coexpresión de A1AT/C1INH y St6gal1 mediante el método de clonación con reactivo de escisión específico de uracilo, como se ha descrito anteriormente (Pristovšek, N. et al., Using Titer and Titer Normalized to Confluence Are Complementary Strategies for Obtaining Chinese Hamster Ovary Cell Lines with High Volumetric Productivity of Etanercept. Biotechnol. J. 2018, 13; y Lund, A.M. et al., A Versatile System for USER Cloning-Based Assembly of Expression Vectors for Mammalian Cell Engineering. PLOS ONE 2014, 9(5): e96693). Las secuencias de ADN de los plásmidos se enumeran en la tabla 4.

[0302] Tabla 4: Secuencias de nucleótidos para vectores de sobreexpresión.

[0304]

[0305] (continuación)

[0306]

[0307] (continuación)

[0308]

[0309] (continuación)

[0310]

[0311] Cultivo celular y transfección para la edición del genoma.

[0312] Las células en suspensión CHO-S se incubaron en una incubadora humidificada a 120 rpm, 37 °C y 5 % de CO₂, se repicaron hasta alcanzar una densidad de 2-3 × 10⁵ células/ml cada 2-3 días y se transfectaron en placas de 6 pocillos (BD Biosciences, San José, CA) como se ha descrito anteriormente (Grav, L.M. et al., One-step generation of triple knockout CHO cell lines using CRISPR/Cas9 and fluorescent enrichment. Biotechnol. J. 2015, 10, 1446-1456). La proporción entre el plásmido GFP_2A_Cas9/sgRNA en cada transfección fue de 1:1, dividiéndose la carga de sgRNA del plásmido a partes iguales entre la cantidad de los distintos sgRNA utilizados en cada transfección (Tabla 5). Para la medición de la eficiencia de la clasificación por FACS, también se llevó a cabo la transfección del vector pmaxGFP<®>(Lonza, Basilea, Suiza). Las células se recogieron para su clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) 48 horas después de la transfección.

[0313] Tabla 5: Indeles enerados en diez enes diana mediante multi lexación con CRISPR/Cas9.

[0315]

[0317] Clonación de células individuales editadas genómicamente usando FACS.

[0318] Antes del FACS, las células se filtraron a través de un filtro celular de 40 µm y se transfirieron a un tubo compatible con FACS.

[0319] Las células con una sola señal fluorescente positiva (GFP) se clasificaron en placas de 384 pocillos (Corning, Nueva York, NY) que contenían 30 µl de medio CD CHO suplementado con 8 mM de L-glutamina, un tampón HEPES al 1,5 % y un 1 % de antibiótico-antimicótico (Gibco, Waltham, MA) por pocillo, como se ha descrito anteriormente (Hansen, H.G. et al, Case study on human alpha1-antitrypsin: Recombinant protein titers obtained by commercial ELISA kits are inaccurate. Biotechnol. J.2016, 11, 1648-1656). Para la clasificación celular, las poblaciones de células positivas a la fluorescencia se seleccionaron tomando como referencia las células CHO-S WT no transfectadas. Dos semanas después de la clasificación celular, las colonias de células se trasladaron a placas de 96 pocillos de fondo plano (BD Biosciences) y se cultivaron para su análisis mediante secuenciación profunda y su cultivo en lotes. Análisis de secuenciación profunda.

[0320] Se recogieron las colonias confluentes de placas de réplicas de 96 pocillos de fondo plano para la extracción de ADN genómico. La extracción de ADN se llevó a cabo utilizando la solución de extracción de ADN QuickExtract (Epicentre, Illumina, Madison, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La preparación de la biblioteca se basó en el protocolo de preparación de bibliotecas para la secuenciación metagenómica 16S de Illumina, y la secuenciación profunda se llevó a cabo en un secuenciador de sobremesa MiSeq (Illumina, San Diego, CA). El protocolo para la amplificación de las secuencias genómicas específicas, la purificación de los amplicones, la PCR con adaptadores y el posterior análisis de calidad se basó en trabajos publicados anteriormente (Grav, L.M. et al., One-step generation of triple knockout CHO cell lines using CRISPR/Cas9 and fluorescent enrichment. Biotechnol. J.2015, 10, 1446-1456). Los cebadores de PCR se recogen en la tabla 6.

[0321]

[0324] 

[0325] Transfección y expresión en líneas celulares policlonales mediante la aplicación de la selección MSX Las células se sembraron en matraces de agitación con caperuza de ventilación Corning de 250 ml (Sigma-Aldrich) por duplicado, con densidades celulares de aproximadamente 1 × 10⁶ células/ml, en 60 ml de medio CD CHO suplementado con 8 mM de L-glutamina (Life Technologies) y se transfectaron con 75 µg del plásmido A1AT-GLUL-St6gal o 75 µg del plásmido C1INH-GLUL-St6gal1 utilizando el reactivo FreeStyleTM MAX junto con medio OptiPRO SFM (Life Technologies) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se añadió 1 µl/ml de agente antiaglomerante 24 horas después de la transfección. Se llevó a cabo la transfección con el vector pmaxGFP<®>(Lonza) para realizar la medición de la eficiencia de la transfección. Dos días después de la transfección, las células se transfirieron a 60 ml de medio CD CHO sin L-glutamina (Life Technologies) y suplementado con 1 µl/ml de agente antiaglomerante y 0 µM, 10 µM, 30 µM o 50 µM de MSX (EMD Millipore, Billerica, MA).

[0326] Las densidades celulares y la viabilidad se determinaron una vez al día utilizando el contador celular NucleoCounter NC-250 (ChemoMetec). Las células se repicaron en medio de selección fresco cada 2-3 días hasta que la viabilidad y el tiempo de duplicación alcanzaron valores estables. Las líneas celulares policlonales (conjuntos) se sembraron por duplicado a una concentración de aproximadamente 1 x 10⁶ células/ml con las concentraciones correspondientes de MSX. Las densidades celulares y la viabilidad se determinaron una vez al día, y los sobrenadantes de las muestras agrupadas se recogieron tres días después de la siembra y se agruparon dentro de duplicados para la purificación de rhA1AT y rhC1INH.

[0327] Clonación de células individuales desde conjuntos celulares policlonales mediante FACS

[0328] Las células individuales no teñidas se separaron de los conjuntos tal y como se ha descrito anteriormente. Para la clasificación celular, se seleccionaron todas las células viables para clasificarlas en placas de 384 pocillos con medio sin L-glutamina. Dos semanas después de la clasificación celular, los clones se trasladaron a placas de 96 pocillos de fondo plano (BD Biosciences) y se cultivaron en matraces de agitación en medio CD CHO suplementado con 1 µl/ml de agente antiaglomerante, 25 µM de MSX y sin L-glutamina.

[0329] Cribado de conjuntos de células y clones de células individuales para detectar la formación de enlaces de ácido siálico α-2,6 similares a los humanos mediante tinción con lectina.

[0330] Para la tinción con lectina de las células, se diluyeron tres series de 10000 células por muestra en 200 µl de medio CD CHO filtrado con un tamaño de poro de 0,22 µm (Life Technologies), suplementado con 5 µg/ml de Hoechst 33342 (Merck, Darmstadt, Alemania) y 1 µg/ml de lectina de aglutinina de Sambucus nigra (SNA) marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Biomol, Hamburgo, Alemania). Tras 60 minutos de incubación en oscuridad a 37 °C y con un 5 % de CO₂, las células se lavaron con 200 µl de medio CD CHO y, a continuación, se lavaron dos veces con 200 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (300 g, 5 minutos, a temperatura ambiente). Las muestras se resuspendieron en 200 µl de PBS y se transfirieron a una placa de 96 pocillos para someterlas a una centrifugación final a 300 g durante un minuto. El porcentaje de células positivas para FITC SNA se determinó en una microplaca de 96 pocillos con fondo óptico (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) utilizando un citómetro de imágenes Celigo (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). Las células se identificaron mediante el canal azul (células positivas para Hoechst), y se utilizó el canal verde (células positivas para FITC SNA) para detectar células con enlaces de ácido alfa-2,6-siálico. Se aplicó un filtro a una muestra de CHO-S WT teñida con SNA de Hoechst/FITC para distinguir entre las células FITC-positivas y las FITC-negativas.

[0331] Cultivo discontinuo: análisis del crecimiento celular y perfil de N-glicosilación.

[0332] Para el cultivo discontinuo y el análisis de N-glicanos, se sembraron las células a una concentración de 0,4 × 10⁶ células/ml en matraces de agitación con caperuza de ventilación Corning de 250 ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI), en duplicado, en 60 ml de medio CD CHO suplementado con 1 µl/ml de agente antiaglomerante (Life Technologies). Las líneas celulares CHO-S WT y las líneas parentales 10x KO no productoras se suplementaron adicionalmente con 8 mM de L-glutamina. Los clones productores de rhA1AT/rhC1INH se cultivaron en medio sin L-glutamina en todo momento y se pasaron a medio que contenía 25 µM de MSX hasta que se inició el cultivo por lotes. Las densidades celulares y la viabilidad se determinaron una vez al día utilizando el contador celular NucleoCounter NC-250 (ChemoMetec) hasta que la viabilidad fue <70 %, momento en el que se dio por finalizado el cultivo. Se tomaron muestras de sobrenadante con proteína secretada total (secretoma) de las líneas celulares CHO-S WT y de las líneas celulares parentales 10x KO no productoras cinco días después de la siembra, y se agruparon dentro de réplicas biológicas. Se calculó que el volumen de las muestras de secretoma contenía 20 x 10⁶ células. En todos los matraces de agitación, se obtuvieron muestras adicionales de sobrenadante centrifugando 1 ml de suspensión celular durante 5 minutos a 1000 g y almacenando el sobrenadante a -80 °C hasta su posterior análisis.

[0333] Purificación de rhA1AT y rhC1INH

[0334] Las proteínas rhA1AT y rhC1INH se purificaron utilizando resinas de afinidad CaptureSelect (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante. La proteína rhA1AT se purificó posteriormente mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una columna de incremento Superdex 20010/300GL (GE Healthcare) equilibrada en PBS.

[0335] Evaluación de los títulos de los clones productores de rhA1AT/rhC1INH

[0336] Los títulos de rhA1AT y rhC1INH se determinaron mediante interferometría de biocapa en un Octet RED96 (Pall, Menlo Park, CA, EE. UU.), como se ha descrito anteriormente para la A1AT (Noh, S.M. et al., Reduction of ammonia and lactate through the coupling of glutamine synthetase selection and downregulation of lactate dehydrogenase-A in CHO cells. Appl. Microbiol. Biotechnol.2017, 101, 1035-1045). Tras la hidratación en PBS, los biosensores de estreptavidina (18-5021, Fortebio, Pall) se funcionalizaron con el conjugado CaptureSelect de biotina anti-A1AT o el conjugado CaptureSelect de biotina anti-C1INH (Thermo Fisher Scientific) a 5 µg/ml en PBS y se bloquearon en PBS que contenía 1 µg/ml de biotina (etapas de incubación de 600 y 300 s, respectivamente). Se prepararon soluciones patrón en medio CHO-S usado utilizando A1AT derivada del plasma (Athens Research & Technology) a concentraciones de 100, 50, 25, 12,5, 6,3, 3,1 y 1,6 µg/ml, o C1INH (R&D Systems) a concentraciones de 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25 y 0,625 µg/ml. Las muestras y los patrones se diluyeron al doble y contenían 0,1 % de BSA (p/v), 0,1 % de Tween-20 (v/v) y 500 mM de NaCl. Cuando fue necesario, las muestras se diluyeron aún más para que quedaran dentro del intervalo de la serie de diluciones estándar. Tras el equilibrio en medio CHO-S usado (120 s), se realizaron mediciones de las muestras y los patrones durante 300 s a una velocidad de agitación de 1000 rpm y a 30 °C. La regeneración se llevó a cabo con TRIS 50 mM, MgCl₂ 2 M y pH 7,5. Los ensayos se llevaron a cabo en microplacas negras de 96 pocillos (Greiner Bio-One, Kremsmünster, Austria). Se utilizó el software Octet System Data Analysis 7.1 para calcular las tasas de unión y las concentraciones absolutas de A1AT y C1INH.

[0337] SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico y tratamiento con PNGasa

[0338] Se llevó a cabo la SDS-PAGE en minigeles Novex de Tris-glicina al 4-12 % y la focalización isoeléctrica (IEF) en geles Novex IEF de pH 3-10 (Thermo Fisher Scientific), siguiendo las instrucciones del fabricante. La desglucosilación con PNGasa F se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante (New England Biolabs, Ipswich, MA).

[0339] Ensayos de actividad

[0340] La actividad inhibidora de la A1AT se determinó utilizando el kit de ensayo EnzChek Elastase (Molecular Probes, Eugene, Oregón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se incubó A1AT (8,0; 4,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,25; 0,13 y 0,06 µM) con elastasa pancreática porcina activa purificada y sustrato marcado con fluorescencia (DQ-elastina). La medición de la fluorescencia se realizó tras 45 minutos a temperatura ambiente (Excitación: 485 nm, ancho de ranura 9,0 nm; Emisión: 530 nm, anchura de la ranura: 13,5 nm).

[0341] La actividad inhibidora de C1INH se determinó utilizando el kit de ensayo Technochrom C1INH (TechnoClone, Viena, Austria). En resumen, se incubaron plasma con actividad C1INH (120 %, 60 %, 30 %) y muestras (~0,25 µM) con una mezcla de sustrato y tampón durante 3 minutos a temperatura ambiente, tras lo cual se añadió ácido acético al 50 %. La extinción se midió a 405 nm.

[0342] Análisis de N-glicanos

[0343] Los N-glicanos se obtuvieron con el kit GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan (Waters, Milford, MA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen: para cada muestra se utilizaron 12 µg de proteína purificada o 12 µl de una muestra de secretoma concentrada 10 veces (Amicon Ultra-15, Merck). Los N-glicanos marcados se analizaron mediante LC-MS como se ha descrito anteriormente (Grav, L.M. et al., One-step generation of triple knockout CHO cell lines using CRISPR/Cas9 and fluorescent enrichment. Biotechnol. J.2015, 10, 1446-1456) Se utilizó un gradiente de separación del 30 % al 43 % en un tampón de formiato de amonio 50 mM y se realizaron los análisis de MS en modo positivo. La cantidad de N-glicanos se midió mediante la integración de los picos con el software Thermo Xcalibur (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), lo que permitió obtener la cantidad relativa normalizada de los glicanos. Resultados

[0344] Perfil de crecimiento y perfil de N-glicanos de las líneas celulares clonales 10x KO

[0345] El objetivo de nuestro estudio era producir rhA1AT y rhC1INH en células CHO con perfiles de N-glicanos similares a los de la plA1AT y la plC1INH humanas. Nuestro enfoque consistió en modificar el perfil heterogéneo de N-glicanos de las células CHO-S WT para obtener una estructura de N-glicanos A2G2S2 de forma homogénea, que es el N-glicano predominante en plA1AT/plC1INH. Con este fin, generamos inserciones o deleciones fuera de marco (indeles) en ocho glicosiltransferasas (MGAT4A, MGAT4B, MGAT5, ST3GAL3, ST3GAL4, ST3GAL6, B3GNT2, FUT8), así como en los genes SPPL3 y GLUL (Tabla 5), a lo largo de cuatro rondas sucesivas de edición génica multiplexada con CRISPR/Cas9. Se sometieron a análisis de crecimiento y a la elaboración de perfiles de N-glicanos dos clones con inserciones y deleciones en los genes diana.

[0346] Se obtuvieron dos clones (10x KO A y 10x KO B) con inserciones y deleciones fuera del marco de lectura en los diez genes diana, y ambos mostraron un aumento notable de la longevidad en cultivos en lote en comparación con la línea celular parental CHO-S WT (figura 12A).

[0347] La línea CHO-S WT alcanzó una densidad celular viable máxima de ~6 × 10⁶ células/ml el quinto día y la viabilidad celular disminuyó rápidamente hasta <50 % el día 6. Por el contrario, los clones 10x KO A y 10x KO B mantuvieron una viabilidad celular >75 % hasta el día 10 del cultivo discontinuo y alcanzaron una densidad celular viable máxima superior a la de CHO-S WT.

[0348] El análisis de los N-glicanos del secretoma de CHO-S WT reveló más de 25 estructuras de N-glicanos (figura. 12B), entre las cuales no se detectó la estructura A2G2S2 con ácidos siálicos unidos por enlaces alfa-2,6, presente predominantemente en plA1AT y plC1INH. La mayoría de los N-glicanos de CHO-S WT contenían fucosilación del núcleo. Los N-glicanos producidos por las células CHO-S WT tienen un aspecto diverso y comprenden estructuras con alto contenido en manosa, así como estructuras di-, tri- y tetraantenarias no galactosiladas, total y parcialmente sialiladas (todas ellas con ácidos siálicos unidos mediante enlaces alfa-2,3). Se identificó A2FG2S2 como el principal N-glicano en el conjunto de proteínas secretadas por CHO-S WT. Por el contrario, los perfiles de N-glicanos de 10x KO A y 10x KO B son más homogéneos (figura. 12B), y todas las estructuras carecen de fucosilación del núcleo. Además, solo eran presentes cantidades relativamente pequeñas de sialilación específica de CHO con enlaces alfa-2,3.

[0349] Tras la alteración de los genes diana, la proporción de A2G2 dentro de las estructuras de N-glicanos de las proteínas totales secretadas aumentó desde el 3,5 % (CHO-S WT) hasta el 79 % en ambos clones 10x KO (figura 12C). Los inventores llegaron a la conclusión de que los clones 10x KO A y B eran líneas celulares huéspedes adecuadas para nuestro proyecto de generación de N-glicanos humanizados.

[0350] Introducción de sialilación de tipo humano en líneas celulares 10x KO

[0351] A partir de las estructuras de N-glicanos del secretoma A2G2 del clon 10x KO B, los inventores se propusieron desarrollar líneas celulares clonales que expresaran St6gal1 y rhC1INH y/o St6gal1 y rhA1AT. Los inventores previeron que dichas líneas celulares son capaces de producir rhA1AT o rhC1INH con estructuras de N-glicanos A2G2S2 predominantes, tal y como se observan en plA1AT y plC1INH. El sistema de selección funcional GLUL-KO quedó confirmado por los tiempos de recuperación de la viabilidad celular, dependientes de la dosis de MSX, observados en los grupos de células transfectadas. Se realizaron sucesivos pases de los distintos grupos de transfección hasta que la viabilidad y los tiempos de duplicación se mantuvieron estables. A continuación, los inventores llevaron a cabo una clonación de células individuales mediante FACS con las células seleccionadas con MSX a 50 µM. Durante la multiplicación de los clones generados, solo se seleccionaron aquellos que presentan una tinción predominante con FITC-SNA y niveles detectables de rhA1AT/rhC1INH en los sobrenadantes de los geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie. A partir de estos criterios, se seleccionaron dos clones productores de rhA1AT (A1-1 y A1-2) y dos clones productores de rhC1INH (C1-1 y C1-2) para su caracterización posterior.

[0352] Se ha descrito que las lectinas del SNA se unen predominantemente a los ácidos siálicos de los N-glicanos unidos al residuo de galactosa mediante una sialilación alfa-2,6 similar a la humana. Al analizar las células CHO-S WT teñidas con FITC-SNA, se observaron niveles relativamente bajos de alfa-2,6-sialilación (figura 13A). Para determinar la proporción de células con sialilación similar a la humana, se utilizaron muestras de CHO-S WT teñidas con FITC-SNA para establecer un filtro entre las células positivas para FITC y negativas para FITC. Dentro de las dos líneas celulares policlonales seleccionadas mediante MSX a 50 µM, se observó que menos < 30 % de las células comprendían ácidos siálicos con enlaces alfa-2,6 en los N-glicanos de las proteínas de la superficie celular (figura 13B). En comparación, el 82-90 % de las células de las poblaciones de los cuatro clones seleccionados (A1-1, A1-2, C1-1 y C1-2) tenían en sus N-glicanos los ácidos siálicos deseados con enlaces alfa-2,6.

[0353] El análisis mediante gel de SDS-PAGE reveló que la rhA1AT y la rhC1INH purificadas, producidas en los cuatro clones, parecen tener volúmenes hidrodinámicos (peso molecular) similares a los de la plA1AT y la plC1INH, sin impurezas detectables como las observadas en la plC1INH (Figura 15A). La rhA1AT y la rhC1INH producidas en el fondo CHO-S WT no co-migraron con la plA1AT y la plC1INH, respectivamente. Sin embargo, tras la desglucosilación con PNGaseF, todas las proteínas producidas por recombinación se alinearon con las bandas correspondientes de plA1AT y plC1INH; sin embargo, la rhC1INH producida en un fondo CHO-S WT mostró una banda proteica adicional de ~65 kDa.

[0354] Para caracterizar con mayor detalle las proteínas rhA1AT y rhC1INH producidas en células CHO, realizamos un análisis en gel de electroforesis isoeléctrica (IEF) (figura 15B). La rhA1AT procedente de los clones A1-1 y A1-2 se manifestó en dos bandas con puntos isoeléctricos (pI) en torno a pH 4,5, similares a los de la plA1AT. Por el contrario, la rhA1AT producida en un fondo CHO-S WT presentó más de nueve isoformas detectables con un pI comprendido entre pH 4 y 5.

[0355] El análisis mediante gel IEF de la rhC1INH producida en un fondo CHO-S WT dio como resultado isoformas con un pI comprendido entre pH ~4 y 5. También se observó un alto grado de heterogeneidad en la proteína rhC1INH purificada producida en el clon C1-1. Sin embargo, la rhC1INH producida en el clon C1-2 era menos heterogénea y presentaba un pI a un pH de aproximadamente 3,5, similar al de la plC1INH.

[0356] En el análisis de los N-glicanos de la rhA1AT y la rhC1INH purificadas a partir de células CHO-S WT, detectamos un mayor grado de heterogeneidad en comparación con las estructuras de los N-glicanos de la rhA1AT y la rhC1INH procedentes de conjuntos de células 10x KO policlonales. Las líneas celulares policlonales revelaron dos estructuras de azúcares predominantes en ambas proteínas (N-glicanos A2G2 y A2G2S2), mientras que no pudimos detectar la estructura A2G2S2 en los productos derivados de CHO-S WT. Además, el número de estructuras de N-glicanos predominantes en rhA1AT y rhC1INH se redujo de dos (conjuntos policlonales) a una (productores monoclonales), identificada como N-glicano A2G2S2.

[0357] Las cuatro líneas celulares monoclonales derivadas de 10x KO produjeron rhA1AT y rhC1INH con una mayor proporción de estructuras A2G2S2 que plA1AT y plC1INH (figura 15C). La proporción de A2G2S2 en rhA1AT y rhC1INH fue de aproximadamente el 88-92 % y el 84 %, respectivamente, mientras que en plA1AT fue del 82 % y en plC1INH del 66 %.

[0358] Por último, los inventores analizaron la actividad de la rhA1AT y la rhC1INH purificadas. La actividad de la rhA1AT se determinó mediante su función inhibidora de la actividad de la elastasa (figura 15D). Al igual que con la plA1AT, se observó una disminución de la actividad elastasa a concentraciones de A1AT > 0,1 µM en el caso de la rhA1AT procedente de los clones A1-1 y A1-2. Además, se alcanzó una inhibición del 50 % de la elastasa con una concentración de aproximadamente 0,3 µM de A1AT, tanto en el caso de la plA1AT como de la rhA1AT. La actividad in vitro de la rhC1INH purificada producida por los clones C1-1 y C1-2 fue similar o superior a la de la plC1INH. Ejemplo 5

[0359] Se transfectaron de forma transitoria, mediante transfección química, tanto 1 línea celular CHO modificada con KO del gen Sppl3 como células CHO-S wt, utilizando plásmidos que codificaban el gen de la eritropoyetina o el gen del inhibidor C1 fusionados con un marcador de purificación por afinidad HPC4. Las células transfectadas se cultivaron durante 72 horas en medio CD CHO 8 mM de L-gln en condiciones estándar, como se describe anteriormente; a continuación, se recogió el sobrenadante, se filtró de forma estéril y se conservó a -80 °C.

[0360] Para la purificación de las proteínas, se descongelaron los sobrenadantes y se purificaron mediante cromatografía de afinidad utilizando una columna de afinidad anti-proteína C de 1 ml para la EPO y el inhibidor de C1, y se combinaron las fracciones que contenían la EPO y el inhibidor de C1, respectivamente.

[0361] El análisis de N-glicanos se llevó a cabo en las muestras purificadas, con el kit GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan (Waters, Milford, MA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En este caso, se utilizaron 12 µl de muestra de proteína purificada en cada caso. Los N-glicanos marcados se analizaron mediante un sistema de LC-MS que utilizaba un HPLC Thermo Ultimate 3000 con detector de fluorescencia acoplado en línea a un MS Thermo Velos Pro Iontrap. Se utilizó un gradiente de separación con un tampón del 30 % al 43 %, y la MS se realizó en modo positivo.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

1. Una línea celular recombinante de ovario de hámster chino (CHO) que tiene los genes endógenos Mgat4A, Mgat4B, Mgat5, St3Gal4, St3Gal6, SPPL3 y FUT8 inactivados y/o regulados a la baja mediante la técnica de inactivación génica.

2. La línea celular CHO recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los genes endógenos Mgat4A, Mgat4B, Mgat5, St3Gal3, St3Gal4, St3Gal6, SPPL3 y FUT8 están inactivados y/o regulados a la baja mediante inactivación génica; y se ha insertado el gen ST6Gal1.

3. La línea celular CHO recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde está presente el gen endógeno B3GNT2.

4. La línea celular CHO recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el gen endógeno B3GNT2 está inactivado y/o regulado a la baja mediante inactivación génica.

5. La línea celular CHO recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el gen endógeno GLUL está inactivado y/o regulado a la baja mediante inactivación génica.

6. La línea celular CHO recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que es una línea celular CHO-K1 o CHO-S; o derivados de cualquiera de estas células.

7. La línea celular CHO recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la célula ha sido modificada adicionalmente para expresar una glicoproteína humana exógena de interés, tal como una proteína humana terapéutica.

8. La línea celular CHO recombinante de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha glicoproteína humana exógena de interés es una proteína sérica humana, tal como una serpina humana, tal como serpina humana seleccionada entre la lista que consiste en SERPINA1, SERPINA2, SERPINA3, SERPINA4, SERPINA5, SERPINA6, SERPINA7, SERPINA8, SERPINA9, SERPINA10, SERPINA11, SERPINA12, SERPINA13, SERPINAB1, SERPINAB2, SERPINAB3, SERPINAB4, SERPINAB5, SERPINAB6, SERPINAB7, SERPINAB8, SERPINAB9, SERPINAB10, SERPINAB11, SERPINAB12, SERPINAB13, SERPINAC1, SERPINAD1, SERPINAE1, SERPINAE2, SERPINAE3, SERPINAF1, SERPINAF2, SERPINAG1, SERPINAH1, SERPINAI1 y SERPINAI2.

9. La línea celular CHO recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-8, línea celular que produce dicha glicoproteína de interés con una estructura de N-glicanos primaria que es una estructura biantenaria totalmente sialilada sin fucosilación del núcleo, tal como con más del 80 %, tal como el 82 %, tal como el 84 %, tal como el 86 %, tal como el 88 %, tal como el 90 % de las glicoproteínas de interés producidas presentan una estructura biantenaria totalmente sialilada sin fucosilación del núcleo.

10. La línea celular CHO recombinante de acuerdo con la reivindicación 9, cuya estructura de glicanos es conforme a la estructura A2G2S2 con las siguientes representaciones gráficas:

11. La línea celular CHO recombinante de acuerdo con la reivindicación 10, cuya estructura de glicanos es conforme a la estructura:

12. La línea celular CHO recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en donde la glicoproteína humana exógena de interés se selecciona entre inhibidor de la proteasa C1 plasmática (C1Inh) glicosilado en una o más posiciones seleccionadas entre Asn3, Asn47, Asn59, Asn216, Asn231, Asn250 y Asn330; antitrombina III (ATIII) glicosilada en una o más posiciones seleccionadas entre Asn96, Asn135, Asn155 y Asn192; y alfa-1-antitripsina humana (AAT) glicosilada en una o más, tal como dos o tres, de las posiciones Asn46, Asn83 y Asn247.

13. Un método para la producción de una proteína recombinante de interés, comprendiendo el método las etapas de:

a) cultivar una población de células CHO recombinantes, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-12, en un medio de cultivo celular adecuado; y

b) cosechar dicha proteína humana de interés a partir del cultivo celular o del medio de cultivo celular.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicha proteína de interés se produce con una estructura de glicanos similar o idéntica al perfil de glicanos de dicha glicoproteína de interés presente en el plasma humano.