ES3057007T3 - Immune checkpoint inhibitor in combination with sonodynamic therapy - Google Patents

Immune checkpoint inhibitor in combination with sonodynamic therapy

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ES3057007T3
ES3057007T3 ES19820858T ES19820858T ES3057007T3 ES 3057007 T3 ES3057007 T3 ES 3057007T3 ES 19820858 T ES19820858 T ES 19820858T ES 19820858 T ES19820858 T ES 19820858T ES 3057007 T3 ES3057007 T3 ES 3057007T3
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Abstract

La invención se refiere, en general, a la terapia sonodinámica mediante complejos de microburbujas-sonosensibilizadores y, más específicamente, a dicha terapia para el tratamiento de tumores de localización profunda y metástasis asociadas. En particular, la invención se refiere a una terapia combinada en la que el tratamiento sonodinámico de tumores de localización profunda con complejos de microburbujas-sonosensibilizadores se combina con el tratamiento con inhibidores de puntos de control inmunitarios. También se refiere a métodos de terapia sonodinámica en los que una respuesta abscopal inducida por sonodinámica modula la regresión sistémica de la metástasis. En dichos métodos, la respuesta abscopal puede potenciarse mediante la coadministración de un inhibidor de puntos de control inmunitario. La invención es especialmente adecuada para el tratamiento del cáncer de páncreas (p. ej., adenocarcinoma ductal pancreático) y metástasis asociadas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Inhibidor de punto de control inmunitario en combinación con terapia sonodinámica
[0003] Campo de la técnica
[0004] La presente invención se refiere en general a la terapia sonodinámica y, más específicamente, a dicha terapia para el tratamiento de tumores de localización profunda y enfermedad metastásica asociada en combinación con inhibidores de puntos de control inmunitario. En particular, se refiere al tratamiento del cáncer de páncreas (p. ej., adenocarcinoma ductal pancreático) y metástasis asociada.
[0005] Antecedentes de la invención
[0006] El tratamiento convencional de tumores de localización profunda típicamente implica cirugía mayor, quimioterapia, radioterapia o combinaciones de todas ellas. Las tres intervenciones pueden producir diversas complicaciones, incluida la sepsis. Por lo tanto, el desarrollo de enfoques terapéuticos más específicos y menos invasivos con eficacia mejorada para tratar a estos pacientes es muy buscado. El cáncer de páncreas es un ejemplo de un tumor de localización profunda. Sigue siendo uno de los tipos de cáncer más letales que se conocen, y menos de 20% de los diagnosticados son aptos para recibir tratamiento quirúrgico curativo. Representa aproximadamente el 2% de todos los cánceres, con una supervivencia a cinco años de 15-21% en pacientes que se someten a una resección quirúrgica seguida de quimioterapia sistémica.
[0007] Los métodos conocidos para usar en el tratamiento del cáncer incluyen la terapia fotodinámica (PDT). La PDT implica la aplicación de agentes fotosensibilizadores en la zona afectada, seguida de la exposición a luz fotoactivadora para convertirlos en una forma citotóxica. Esto da como resultado la destrucción de células y la vasculatura circundante en un tejido objetivo. Los fotosensibilizadores que actualmente están aprobados para usar en la PDT absorben luz en la región visible (por debajo de 700 nm). Sin embargo, la luz de esta longitud de onda tiene una capacidad limitada para penetrar en la piel; esta penetra hasta una profundidad superficial de solo unos pocos mm. Aunque la PDT se puede usar para tratar células diana localizadas más profundas, esto generalmente implica el uso de un dispositivo, tal como una fibra óptica dirigida por catéter, para la activación del fotosensibilizador. Esto no solo es un procedimiento complicado, sino que impide el acceso a ciertas áreas del cuerpo. También compromete la naturaleza no invasiva del tratamiento. Por lo tanto, aunque es apropiada para el tratamiento de tumores superficiales, el uso de la PDT para tratar células profundamente asentadas, tales como las masas tumorales, y lesiones anatómicamente menos accesibles es limitado. La terapia sonodinámica (SDT) es un concepto más reciente e implica la combinación de ultrasonidos y un fármaco sonosensibilizador (también denominado en el presente documento "sonosensibilizador" o "agente sonosensibilizador"). De manera similar a la PDT, la activación del sonosensibilizador mediante energía acústica da como resultado la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), tales como el oxígeno singlete, en el sitio objetivo de interés. Dichas especies son citotóxicas, destruyendo así las células objetivo o al menos disminuyendo su potencial proliferativo. Muchos agentes fotosensibilizadores conocidos pueden activarse mediante energía acústica y, por lo tanto, son adecuados para usar en SDT. Dado que el ultrasonido se propaga fácilmente a través de varios cm de tejido, la SDT proporciona un medio por el cual se pueden tratar los tumores que se encuentran profundos de los tejidos. Al igual que con la luz, la energía del ultrasonido también se puede enfocar en una masa tumoral para activar el sonosensibilizador, restringiendo así sus efectos al sitio objetivo. La SDT ofrece algunas ventajas importantes sobre la PDT: Los ultrasonidos están ampliamente aceptados como una modalidad de diagnóstico por imágenes clínica rentable y segura y, a diferencia de la luz, se puede enfocar con precisión con una penetración en los tejidos blandos de hasta varias decenas de centímetros, dependiendo de la frecuencia de ultrasonidos utilizada.
[0008] En la publicación internacional WO 2012/143739 los sonosensibilizadores se conjugan con una microburbuja llena de gas (MB) para proporcionar un "complejo" (o "conjugado") de microburbuja-sonosensibilizador para usar en SDT. Estos complejos permiten la administración eficaz del sonosensibilizador activo de una manera específica del sitio mediante una destrucción controlada de la burbuja usando ultrasonidos. La sonoactivación posterior o simultánea del sonosensibilizador dirigido da como resultado la destrucción celular en el sitio diana y la regresión de los tejidos tumorales. La eficacia de la SDT utilizando dichos complejos para el tratamiento del cáncer de páncreas se ha demostrado en un modelo preclínico de ratones que llevan tumores BxPC-3 de xenoinjertos humanos (véase McEwan et al.,J Control Release. 2015; 203, 51-6). En un desarrollo de este trabajo, se propone una terapia combinada de SDT / antimetabolitos en la publicación internacional WO 2017/089800 y también se describe en McEwan et al.,Biomaterials2016; 80, 20-32.
[0009] La administración dirigida de un sonosensibilizador y un antimetabolito (p. ej., 5-fluorouracilo (5-FU) o gemcitabina) usando una microburbuja, ya sea en forma de una sola microburbuja que lleva ambos agentes o microburbujas separadas que llevan los diferentes agentes, permite la administración eficaz de ambos agentes al tumor. La sonoactivación del sonosensibilizador dirigido da como resultado la generación de ROS que destruyen las células tumorales en el sitio diana. Esta acción se complementa con la acción del antimetabolito que ejerce su efecto citotóxico directamente en el sitio diana. Al usar una microburbuja como transportador para ambos agentes, se reduce la absorción no específica de estos por los tejidos diana. Por lo tanto, dicha terapia proporciona un enfoque más dirigido con una eficacia mejorada y efectos secundarios reducidos en comparación con la administración sistémica del fármaco antimetabolito solo.
[0010] Muchos tipos de cáncer siguen siendo en gran medida incurables. Al menos en parte, esto se debe al cambio gradual de la enfermedad de localizada a metastásica en la que las células cancerosas se diseminan por todo el cuerpo. Los tumores también han evolucionado para evadir el propio sistema inmunitario del cuerpo. La inmunoterapia representa un avance emocionante en el tratamiento del cáncer e implica estimular o preparar el sistema inmunitario del paciente para que busque y destruya las células cancerosas. Una clase de inmunoterapia es el uso de inhibidores de puntos de control inmunitario que han mostrado ser eficaces en el tratamiento de ciertos tipos de cáncer, tales como el melanoma y el cáncer de pulmón. Sin embargo, su efecto en el cáncer de páncreas es deficiente.
[0011] En los ensayos clínicos, el bloqueo de puntos de control inmunitario ha mostrado poco beneficio en el tratamiento del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) (véase Morrison et al.,Trends in Cancer(2018) 4: 418-428). Los estudios llevados a cabo por los autores de la invención y documentados en el presente documento confirman este hallazgo. Se han sugerido dos razones principales para el efecto deficiente de los inhibidores de puntos de control inmunitario en el cáncer de páncreas: (i) los tumores pancreáticos se caracterizan por un microambiente tumoral altamente inmunosupresor, lo que significa que se produce una cantidad reducida de células inmunitarias que combaten el cáncer; y (ii) los tumores pancreáticos tienen una capa protectora densa denominada "estroma" que actúa como una barrera de entrada para las células inmunitarias que combaten el cáncer. Por lo tanto, para mejorar la acción de la inmunoterapia en el cáncer de páncreas, puede ser beneficioso aumentar el número de células inmunitarias que combaten el cáncer y/o mejorar su capacidad para infiltrarse en el tumor.
[0012] Se han observado respuestas abscopales en las que un tratamiento quimioterapéutico localizado estimula el sistema inmunitario y modula la regresión sistémica de los cánceres distantes (p. ej., metastásicos), por ejemplo, cuando se lleva a cabo radioterapia. Dichas respuestas pueden desencadenarse de manera más eficaz cuando se combina el tratamiento del cáncer (p. ej., radioterapia) con inmunoterapia. Sin embargo, se sabe relativamente poco sobre la respuesta abscopal en la SDT.
[0013] Se ha investigado el efecto de la SDT con HPD (Hiporfina) en la inducción de una respuesta inmunitaria sistémica en líneas celulares de cáncer de hígado (véase Zhang et al.,Cancer Science2018: 1-16). Sin embargo, no se puede predecir si los efectos abscopales observados en este modelo tumoral se extenderían a otros tumores, especialmente a tumores pancreáticos, debido a los desafíos asociados con su tratamiento, por ejemplo, como lo demuestra la reconocida capacidad de su estroma para proteger las células cancerosas del ataque del sistema inmunitario y el fracaso actual de la inmunoterapia existente en el tratamiento del cáncer de páncreas (véase Sun et al.,Ther. Clin. Risk Manag. (2018) 14: 1691-1700). Además, la generación de "sinergia" entre cualquier tratamiento de quimioterapia e inmunoterapia necesaria para proporcionar un tratamiento local de los tumores e inducir un efecto abscopal es intrínsecamente impredecible debido a los muchos factores diferentes que afectan a la interacción inmunitaria del tumor, p. ej., la inmunosupresión inducida por la quimioterapia.
[0014] Por lo tanto, todavía existe la necesidad de métodos alternativos (p. ej., mejorados) para el tratamiento de tumores inaccesibles y de localización profunda y metástasis derivadas de los mismos. En particular, existe la necesidad de dichos métodos para el tratamiento del cáncer pancreático metastásico.
[0015] Compendio de la invención
[0016] Los autores de la invención proponen ahora que la SDT administrada con microburbujas es capaz de mejorar la infiltración de células T en el microentorno tumoral para sensibilizar el PDAC al bloqueo de los puntos de control, induciendo así una respuesta inmunitaria antitumoral potente y específica. Utilizando un modelo tumoral bilateral que comprende aloinjertos de KPC en ratones inmunocompetentes, los autores de la invención han demostrado que el tratamiento de un tumor objetivo ("tumor primario") con SDT mediada por destrucción de microburbujas dirigida por ultrasonidos (UTMD) produce una respuesta antitumoral en el tumor distante (no tratado o "fuera del objetivo"). El uso de un inhibidor de puntos de control inmunitario, el anti-PDL-1, mejora aún más el efecto antitumoral mediado por la SDT en el tumor fuera del objetivo. También se observa un aumento significativo de las células T citotóxicas en los tumores fuera del objetivo cuando el tumor primario se trata con SDT. Combinados, estos resultados sugieren que la SDT administrada con microburbujas induce un efecto "abscopal" que, cuando se combina con el anti-PDL-1, mejora más la reducción del volumen tumoral observada en el tumor fuera de la diana.
[0017] En vista de estos hallazgos, los autores de la invención proponen varias mejoras en y en relación con la SDT administrada con microburbujas. Específicamente, los autores de la invención proponen que dicha terapia pueda usarse no solo en el tratamiento dirigido de un tumor primario, sino que, en vista del potencial de este tratamiento para iniciar un efecto "abscopal", proponen su uso extendido en el tratamiento de tumores no objetivo, p. ej., en el tratamiento de enfermedades metastásicas o células tumorales circulantes (CTC), y en el tratamiento de otros tumores primarios no objetivo. Los hallazgos de los autores de la invención también ofrecen el potencial de efectos aditivos, o incluso de sinergia, de la SDT administrada con microburbujas con las estrategias basadas en inmunoterapia, y por lo tanto ahora proponen el tratamiento de tumores (tanto tumores primarios como metastásicos) utilizando la SDT administrada con microburbujas en combinación con inhibidores de puntos de control inmunitario.
[0018] Los autores de la invención proponen además que dichos modelos de tratamiento se puedan extender al uso de la quimioterapia-SDT, en la que también se usan microburbujas para administrar un agente quimioterapéutico al tumor objetivo (es decir, el tumor primario). Dado que este tratamiento implica quimioterapia dirigida, se reduce la exposición del tejido normal a los fármacos quimioterapéuticos citotóxicos. Los bajos niveles circulantes del fármaco quimioterapéutico permiten la supervivencia de las células inmunitarias circulantes, ofreciendo así una mejor oportunidad de aprovechar el sistema inmunitario para tratar tanto los tumores primarios como la enfermedad metastásica. El efecto inmunoestimulador de la quimioterapia-SDT y la modulación del estroma debida a la cavitación de MB facilitan más la infiltración de los inhibidores de puntos de control inmunitario y las células T. Por lo tanto, los autores de la invención también proponen el uso de microburbujas para dirigir la administración tanto de quimioterapia como de terapia sonodinámica a los tumores y sensibilizar a las células cancerosas para que sean atacadas mediante inmunoterapia utilizando inhibidores de puntos de control inmunitario. Dado que la quimioterapia puede proporcionar cierto grado de estimulación inmunitaria en el tratamiento del cáncer, esto ofrece la posibilidad de sinergia con estrategias basadas en inmunoterapia, tales como la combinación con inhibidores de puntos de control inmunitario. Se considera que estas propuestas son particularmente beneficiosas en el contexto del tratamiento del cáncer de páncreas. En particular, proporcionan un tratamiento mínimamente invasivo y altamente enfocado con la capacidad de reducir significativamente la carga tumoral en el cáncer de páncreas. También se espera que proporcionen beneficios significativos en términos de mejores tasas de supervivencia para los pacientes con cáncer de páncreas y una mejor calidad de vida durante el tratamiento (debido a la reducción de los efectos secundarios en comparación con los tratamientos actuales basados en fármacos de referencia).
[0019] La invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.
[0020] Cualquier referencia en el presente documento a métodos de tratamiento de un cuerpo humano o animal no humano mediante terapia debe interpretarse como referencia a los compuestos, composiciones y productos de la presente invención para usar en dichos métodos. Los métodos de tratamiento médico no forman parte de la invención.
[0021] Descripción detallada de la invención
[0022] Definiciones
[0023] Como se usa en el presente documento, el término "microburbuja" pretende referirse a una microesfera que comprende una cubierta que tiene una forma aproximadamente esférica y que rodea un hueco interno que comprende un gas o una mezcla de gases. La "cubierta" se refiere a la membrana que rodea el hueco interno de la microburbuja.
[0024] Los términos "sonosensibilizador", "agente sonosensibilizador" y "fármaco sonosensibilizador" se usan indistintamente en el presente documento y pretenden referirse a cualquier compuesto que sea capaz de convertir la energía acústica (p. ej., ultrasonidos) en especies reactivas de oxígeno (ROS), tales como el oxígeno singlete, que dé como resultado toxicidad celular. En el complejo microburbuja-sonosensibilizador para usar en la invención, el sonosensibilizador es Rosa de Bengala.
[0025] Como se usan en el presente documento, las expresiones "terapia sonodinámica" y "tratamiento sonodinámico" pretenden hacer referencia a un método que implica la combinación de ultrasonidos y un agente sonosensibilizador en el que la activación del agente sonosensibilizador por energía acústica da como resultado la generación de especies reactivas de oxígeno, como el oxígeno singlete.
[0026] Los puntos de control inmunitario son conocidos en la técnica y la expresión se entiende bien en el contexto de la terapia del cáncer. Quizás los más conocidos son PD-1 y su ligando PDL-1 y CTLA-4. Otros incluyen OX40, TIM-3, KIR, LAG-3, VISTA y BTLA. Los inhibidores de los puntos de control inmunitario, denominados en el presente documento "inhibidores de puntos de control inmunitario", inhiben su función inmunosupresora normal, por ejemplo, regulando por disminución la expresión de las moléculas del punto de control o uniéndose a las mismas y bloqueando las interacciones normales receptor / ligando. A medida que los puntos de control inmunitario frenan la respuesta del sistema inmunitario a un antígeno, un inhibidor del mismo (es decir, un "inhibidor de punto de control inmunitario") reduce este efecto inmunosupresor y mejora la respuesta inmunitaria. El inhibidor de punto de control inmunitario para usar en la invención es un inhibidor de PDL-1.
[0027] Como se usa en el presente documento, la expresión "agente quimioterapéutico" pretende abarcar ampliamente cualquier compuesto químico o biológico útil en el tratamiento del cáncer. Incluye agentes inhibidores del crecimiento y otros agentes citotóxicos. La expresión "agente inhibidor del crecimiento" se refiere a un compuesto que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula cancerosa.
[0028] Como se usa en el presente documento, el término "cáncer" se refiere a células que experimentan una proliferación anormal. El crecimiento de dichas células típicamente produce la formación de un tumor. Las células cancerosas pueden ser benignas, premalignas o malignas. Dichas células pueden ser invasivas y/o tener la capacidad de metastatizar a otros lugares del cuerpo. El término cáncer, como se usa en el presente documento, incluye crecimientos cancerosos, tumores y sus metástasis.
[0029] El término "tumor", como se usa en el presente documento, se refiere a una masa anormal de tejido que contiene células cancerosas.
[0030] Como se usa en el presente documento, el término "metástasis" se refiere a la diseminación de células tumorales malignas desde un órgano o parte del cuerpo a otro órgano o parte del cuerpo no adyacente. Las células cancerosas pueden desprenderse de un tumor primario, entrar en los sistemas linfático y sanguíneo y circular a otras partes del cuerpo (p. ej., a tejidos normales). Aquí pueden asentarse y crecer dentro de los tejidos normales. Cuando las células tumorales metastatizan, los nuevos tumores pueden denominarse cáncer o tumor "secundario" o metastásico. La expresión "enfermedad metastásica", como se menciona en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad asociada con la metástasis.
[0031] Como se usa en el presente documento, el término "micrometástasis" se refiere a una colección de células cancerosas (también conocidas como micrometástasis o "micromets") que se desprenden de un tumor primario y que se diseminan a otra parte del cuerpo. La expresión "enfermedad micrometastásica" se usa en el presente documento con respecto a cualquier enfermedad asociada con la micrometástasis.
[0032] La expresión "células tumorales circulantes" (CTC) se refiere a las células que se desprenden en la vasculatura o sistema linfático desde un tumor primario y son transportadas por todo el cuerpo en la sangre. Las CTC actúan como semillas para el posterior crecimiento de tumores adicionales (metástasis) en otros órganos o partes del cuerpo.
[0033] La expresión "efecto abscopal" se refiere a un fenómeno en el tratamiento del cáncer metastásico en el que el tratamiento localizado de un tumor produce no solo una reducción del volumen del tumor tratado, sino también un encogimiento de tumores fuera de la zona tratada.
[0034] Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" incluye cualquier aplicación terapéutica que pueda beneficiar a un ser humano o animal no humano (p. ej., un mamífero no humano). Tanto los tratamientos humanos como los veterinarios están dentro del alcance de la presente invención, aunque principalmente la invención se dirige al tratamiento de seres humanos. El tratamiento se refiere a la reducción, alivio o eliminación de una enfermedad, afección o trastorno. Incluye el tratamiento paliativo, es decir, el tratamiento destinado a minimizar o inhibir parcial o completamente el desarrollo de la enfermedad, afección o trastorno. Cuando no se indique explícitamente, el tratamiento también abarca la prevención. Como se usa en el presente documento, "prevención" se refiere a la prevención absoluta, es decir, al mantenimiento de niveles normales con referencia a la extensión o aparición de un síntoma particular de la enfermedad, afección o trastorno, o a la reducción o el alivio de la extensión o el momento (p. ej., el retraso) de la aparición de ese síntoma.
[0035] Por "una composición farmacéutica" se entiende una composición en cualquier forma adecuada para usar con fines médicos.
[0036] Como se usa en el presente documento, una "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que conducirá al efecto farmacológico y/o terapéutico deseado, es decir, una cantidad del agente que es eficaz para lograr su propósito previsto. Aunque las necesidades individuales de los sujetos (p. ej., los pacientes) pueden variar, la determinación de los intervalos óptimos para las cantidades eficaces del(de los) agente(s) activo(s) descrito(s) en el presente documento está dentro de la capacidad de un experto en la técnica. En general, los expertos en la técnica pueden seleccionar la pauta posológica para tratar una enfermedad, afección o trastorno con cualquiera de los agentes descritos en el presente documento de acuerdo con una variedad de factores que incluyen la naturaleza de la afección y su gravedad.
[0037] El término "sujeto" se refiere a cualquier persona que sea el objetivo de la administración o el tratamiento. El sujeto puede ser, por ejemplo, un mamífero. Por lo tanto, el sujeto puede ser un ser humano o animal no humano. El término "paciente" se refiere a un sujeto bajo el tratamiento de un médico. Preferiblemente, el sujeto será un ser humano.
[0038] El complejo microburbuja-sonosensibilizador para usar en la invención comprende una microburbuja unida o asociada de otro modo a al menos un sonosensibilizador, preferiblemente una pluralidad de sonosensibilizadores. Cuando la microburbuja está unida a más de un sonosensibilizador, estos pueden ser iguales o diferentes. Sin embargo, en general, los sonosensibilizadores serán idénticos. En el complejo microburbuja-sonosensibilizador para usar en la invención, la microburbuja está unida o asociada de otro modo al sonosensibilizador rosa de Bengala. En la medida en que dicho complejo está previsto para usar en métodos de SDT, será sensible a los ultrasonidos. Específicamente, se pretende que el componente de microburbuja del complejo pueda romperse mediante la aplicación de ultrasonidos, liberando así el sonosensibilizador en el sitio objetivo deseado. Como se describe en el presente documento, la activación del sonosensibilizador mediante energía acústica también da como resultado la generación de especies reactivas de oxígeno, tales como el oxígeno singlete, que son citotóxicas.
[0040] El sonosensibilizador (o sonosensibilizadores) se puede unir a la microburbuja a través de medios covalentes o no covalentes, p. ej., mediante interacción electrostática, fuerzas de van der Waals y/o enlaces de hidrógeno. En una realización, la microburbuja se une electrostáticamente al sonosensibilizador. En otra realización, se puede unir covalentemente, es decir, el sonosensibilizador se unirá a la microburbuja por uno o más enlaces covalentes. Preferiblemente, sin embargo, la interacción implicará un enlace no covalente fuerte, tal como la interacción biotina-avidina.
[0042] En el caso de que se emplee una interacción biotina-avidina para unir el sonosensibilizador (o sonosensibilizadores) a la microburbuja, un componente del par de unión (p. ej., el sonosensibilizador) se funcionaliza con biotina y el otro (p. ej., la microburbuja) con avidina. Típicamente, la molécula de avidina también se unirá a la microburbuja mediante una interacción biotina-avidina. Por ejemplo, una microburbuja se puede funcionalizar con biotina para formar una microburbuja biotinilada que después se incuba con avidina. Una vez que la avidina se une a la burbuja, esto permite la unión de cualquier resto biotinilado adicional, tal como el sonosensibilizador. La unión resultante entre la microburbuja y el sonosensibilizador puede, por lo tanto, adoptar la forma de una interacción "biotina-avidina-biotina".
[0044] En ciertas realizaciones, el complejo microburbuja-sonosensibilizador se puede usar en combinación con al menos un agente quimioterapéutico (p. ej., una pluralidad de agentes quimioterapéuticos) que también está unido a una microburbuja. El agente (o agentes) quimioterapéutico se puede unir a la misma microburbuja que el agente sonosensibilizador o, alternativamente, se puede unir a una microburbuja separada (en el presente documento, un "complejo microburbuja-agente quimioterapéutico"). El "complejo microburbuja-agente quimioterapéutico" comprende una microburbuja unida o asociada de otro modo a al menos un agente quimioterapéutico. Cuando cualquier microburbuja está unida a más de un agente quimioterapéutico, estos pueden ser iguales o diferentes. Sin embargo, en general, los agentes quimioterapéuticos unidos a una microburbuja particular serán idénticos. En la medida en que el complejo microburbuja-agente quimioterapéutico esté destinado a usarse en métodos de SDT, será sensible a los ultrasonidos. Específicamente, se pretende que el componente de microburbuja del complejo pueda romperse mediante la aplicación de ultrasonidos, liberando así el agente quimioterapéutico en el sitio objetivo deseado.
[0046] El agente (o agentes) quimioterapéutico puede unirse a una microburbuja a través de medios covalentes o no covalentes, p. ej., mediante interacción electrostática, fuerzas de van der Waals y/o enlaces de hidrógeno. En una realización, la microburbuja se une electrostáticamente al agente quimioterapéutico. En otra realización, se puede unir covalentemente, es decir, el agente quimioterapéutico se unirá a la microburbuja por uno o más enlaces covalentes. Preferiblemente, sin embargo, la interacción implicará un enlace no covalente fuerte, tal como la interacción biotina-avidina como se describe anteriormente. En el caso de que se emplee una interacción biotina-avidina para unir el agente (o agentes) quimioterapéutico a la microburbuja, un componente del par de unión (p. ej., el agente quimioterapéutico) se funcionaliza con biotina y el otro (p. ej., la microburbuja) con avidina. Típicamente, la molécula de avidina también se unirá a la microburbuja mediante una interacción biotina-avidina. Por ejemplo, una microburbuja se puede funcionalizar con biotina para formar una microburbuja biotinilada que después se incuba con avidina. Una vez que la avidina se une a la burbuja, esto permite la unión de cualquier resto biotinilado adicional, tal como el agente quimioterapéutico. La unión resultante entre la microburbuja y el agente quimioterapéutico puede, por lo tanto, adoptar la forma de una interacción "biotinaavidina-biotina".
[0048] Cuando el complejo microburbuja-sonosensibilizador para usar en la invención también lleva uno o más agentes quimioterapéuticos, el(los) sonosensibilizador(es) y el(los) agente(s) quimioterapéutico(s) pueden unirse por separado a la microburbuja, o estos pueden unirse mediante un grupo conector común que lleva ambos agentes. Esto permite el tratamiento combinado de quimioterapia/SDT usando una sola microburbuja. En el presente documento se proporciona una descripción de los grupos conectores adecuados.
[0050] En ciertas realizaciones, cualquiera de los complejos de microburbujas descritos en el presente documento puede modificarse adicionalmente para incorporar un agente quimioterapéutico dentro de su estructura de cubierta. Por ejemplo, la microburbuja puede comprender una cubierta que tiene incorporados en la misma uno o más agentes quimioterapéuticos. Cuando la microburbuja está unida a un agente (o agentes) quimioterapéutico, el agente quimioterapéutico en la cubierta de la microburbuja puede ser el mismo o diferente de los que están unidos a ella. En una realización, serán agentes diferentes.
[0052] En una realización, el complejo microburbuja-sonosensibilizador para usar en la invención comprende una microburbuja unida o asociada de otro modo a al menos un agente sonosensibilizador y al menos un agente quimioterapéutico (un "primer agente quimioterapéutico") en donde la microburbuja comprende una cubierta que tiene incorporado en la misma uno o más agentes quimioterapéuticos adicionales (un "segundo agente quimioterapéutico"). En general, el primer y el segundo agentes quimioterapéuticos serán diferentes.
[0054] La elección de cualquiera de los agentes quimioterapéuticos para usar en la invención dependerá de varios factores, tales como su uso previsto, p. ej., la naturaleza del tumor, el paciente a tratar, etc., pero los expertos en la técnica pueden seleccionarlos fácilmente según las necesidades.
[0056] Para usar en la invención, las clases adecuadas de agentes quimioterapéuticos y los ejemplos dentro de esas clases incluyen los siguientes: antifolatos (p. ej., metotrexato); 5-fluoropirimidinas (p. ej., 5-fluorouracilo o 5-FU); análogos de citidina (p. ej., gemcitabina); antimetabolitos de purina (p. ej., mercaptopurina); agentes alquilantes (p. ej., ciclofosfamida); agentes alquilantes no clásicos (p. ej., dacarbazina); análogos del platino (p. ej., cisplatino); antibióticos antitumorales (p. ej., actinomicina D, bleomicina, mitomicina C); fármacos biorreductores (p. ej., mitomicina C, banoxantrona (AQ4N)); antraciclinas (p. ej., doxorrubicina, mitoxantrona); inhibidores de la topoisomerasa I (p. ej., irinotecán); inhibidores de la topoisomeasa II (p. ej., etopósido); agentes antimicrotúbulos tales como alcaloides de la vinca (p. ej., vincristina), taxoles (p. ej., paclitaxel) y epotilones (p. ej., ixabepilina); antiestrógenos (p. ej., tamoxifeno); antiandrógenos (p. ej., biclutamida, acetato de ciproterona); inhibidores de la aromatasa (p. ej., anastrazol, formestano); fármacos antiangiogénicos o dirigidos a la hipoxia (ya sea de origen natural, p. ej., endostatina, o sintéticos, p. ej., gefitinib, lenalidomida); agentes antivasculares (p. ej., cambretastatina); inhibidores de la tirosina quinasa (p. ej., gefitinib, erlotinib, vandetanim, sunitinib); agentes dirigidos a oncogenes o rutas de señalización (p. ej., tipfarnib, lonafarnib, naltrindol, rampamicina); agentes dirigidos a proteínas del estrés (p. ej., geldanamicina y sus análogos); agentes dirigidos a la autofagia (p. ej., cloroquina); agentes dirigidos al proteasoma (p. ej., bortezomib); inhibidores de telomerasa (oligonucleótidos o nucleótidos dirigidos); inhibidores de histona desacetilasa (p. ej., tricostatina A, ácido valproico); inhibidores de la ADN metiltransferasa (p. ej., decitabina); alquilsulfonatos (p. ej., busulfán, improsulfán y piposulfán); aziridinas (p. ej., benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa); etileniminas y metilamelaminas (p. ej., altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina); mostazas nitrogenadas (p. ej., clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de óxido de mecloretamina, melfalán, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo); nitrosureas (p. ej., carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina); análogos de purina (p. ej., fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina); análogos de pirimidina (p. ej. ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina); andrógenos (p. ej., calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona); antisuprarrenales (p. ej., aminoglutetimida, mitotano, trilostano); inhibidores de puntos de control inmunitario (p. ej., inhibidores de la interacción PD-1/PDL-1 BMS-1001 y BMS-1166) y otros modificadores de la respuesta inmunitaria (p. ej., imiquimod). También se pueden usar sales, derivados o análogos farmacéuticamente aceptables de cualquiera de estos compuestos.
[0058] Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento para usar en la invención incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la detención de la fase G1 y la detención de la fase M. Los bloqueadores clásicos de la fase M incluyen las vincas (vincristina y vinblastina); miembros de la familia de los taxanos, que incluyen paclitaxel, docetaxel y sus análogos; y los inhibidores de la topoisomerasa, tales como irinotecán, topotecán, camptotecina, lamelarina D, doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Los agentes que detienen la G1 incluyen, por ejemplo, agentes alquilantes del ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-FU y ara-C.
[0060] En una realización el agente quimioterapéutico puede ser un antimetabolito. Los antimetabolitos que son particularmente adecuados para usar en la invención incluyen las 5-fluoropirimidinas y análogos de citidina. Ejemplos de antimetabolitos que pueden usarse en el tratamiento del cáncer de páncreas son el 5-fluorouracilo (5-FU) y la gemcitabina.
[0062] En una realización, el agente quimioterapéutico es un agente inhibidor del crecimiento. Los que son particularmente adecuados para usar en la invención incluyen los inhibidores de antraciclina topoisomerasa, p. ej., doxorrubicina.
[0064] Para la incorporación dentro de la estructura de cubierta de la microburbuja, se puede elegir cualquiera de los agentes quimioterapéuticos descritos en el presente documento. Preferiblemente, el agente quimioterapéutico debe ser uno capaz de insertarse espontáneamente dentro de las cadenas lipídicas hidrófobas de los lípidos de las microburbujas. Esto puede implicar interacción hidrófoba directa en los casos en que el agente quimioterapéutico es hidrófobo. En una realización, el agente quimioterapéutico para incorporar dentro de la cubierta de la microburbuja puede ser, por lo tanto, hidrófobo. Se puede considerar que los agentes hidrófobos son aquellos que tienen un valor de LogP mayor que aproximadamente 2. Alternativamente, los agentes quimioterapéuticos no polares se pueden modificar adecuadamente (p. ej., funcionalizar) mediante la introducción de uno o más grupos funcionales no polares que les permitan insertarse espontáneamente dentro de la cubierta (p. ej., la cubierta lipídica) de la microburbuja.
[0065] En una realización, el agente quimioterapéutico que se va a incorporar dentro de la cubierta de la microburbuja puede ser un agente antimicrotúbulo. Los ejemplos de dichos agentes incluyen, en particular, taxoles tales como el paclitaxel. El paclitaxel (o "PTX") es hidrófobo. En otra realización, se puede incluir un inhibidor de punto de control inmunitario (p. ej., BMS-1001 o BMS-1166) dentro de la cubierta de la microburbuja.
[0066] En una realización, el complejo microburbuja-sonosensibilizador para usar en la invención es uno en el que el sonosensibilizador es rosa de Bengala y tiene un taxol (p. ej., paclitaxel) insertado dentro de la cubierta de la microburbuja. En otra realización, el complejo microburbuja-sonosensibilizador para usar en la invención tiene un taxol (p. ej., paclitaxel) insertado dentro de la cubierta de la microburbuja y está unido a un agente quimioterapéutico que es un antimetabolito (p. ej., gemcitabina) o un inhibidor de la topoisomerasa (p. ej., doxorrubicina).
[0067] Las microburbujas son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, como agentes de contraste para ultrasonidos. Por lo tanto, los expertos en la técnica conocen bien su composición y métodos para su preparación. Los ejemplos de procedimientos para la preparación de microburbujas se describen, por ejemplo, en Christiansen et al.,Ultrasound Med. Biol., 29: 1759-1767, 2003; Farook et al., J. R. Soc.Interface, 6: 271-277, 2009; y Stride y Edirisinghe,Med. Biol. Eng. Comput., 47: 883-892, 2009.
[0068] Las microburbujas comprenden una cubierta que rodea un hueco interno que comprende un gas. En general, estas son de forma aproximadamente esférica, aunque la forma de la microburbuja no es esencial para llevar a cabo la invención y, por lo tanto, no debe considerarse limitante. El tamaño de la microburbuja debe ser tal que permita su paso a través de la circulación sistémica (p. ej., el sistema pulmonar) tras la administración, p. ej., por inyección intravenosa. Las microburbujas tienen típicamente un diámetro menor de aproximadamente 200 µm, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 µm, p. ej., de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 100 µm. Son particularmente adecuadas para usar en la invención las microburbujas que tienen un diámetro de menos de aproximadamente 10 µm, más preferiblemente de 1 a 8 µm, particularmente preferiblemente de hasta 5 µm, p. ej., de 1 a 3 µm o aproximadamente 2 µm. La cubierta de la microburbuja variará de espesor y típicamente en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 nm, p. ej., de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 nm. El espesor preciso no es esencial con la condición de que la cubierta realice la función deseada de retener el núcleo de gas.
[0069] Los materiales que se pueden usar para formar las microburbujas deben ser biocompatibles y los materiales adecuados son bien conocidos en la técnica. Típicamente, la cubierta de la microburbuja comprenderá un tensioactivo o un polímero. Los tensioactivos que se pueden usar incluyen cualquier material que sea capaz de formar y mantener una microburbuja mediante la formación de una capa en la interfase entre el gas dentro del núcleo y un medio externo, p. ej., una solución acuosa que contiene la microburbuja. Se puede usar un tensioactivo o una combinación de tensioactivos. Los que son adecuados incluyen lípidos, en particular fosfolípidos. Los lípidos que pueden usarse incluyen lecitinas (es decir, fosfatidilcolinas), p. ej., lecitinas naturales tales como lecitina de yema de huevo o lecitina de soja y lecitinas sintéticas tales como dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina o diestearoilfosfatidilcolina; ácidos fosfatídicos; fosfatidiletanolaminas; fosfatidilserinas; fosfatidilgliceroles; fosfatidilinositoles; y mezclas de los mismos. En una realización, se pueden usar lípidos tales como la 1,2-dibehenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DBPC) y/o la 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE) para formar la cubierta de las microburbujas. Las combinaciones de DBPC y DSPE son particularmente adecuadas.
[0070] Los lípidos y combinaciones de lípidos adecuados se pueden seleccionar en función de su capacidad para mejorar la estabilidad de las microburbujas con respecto a la retención de oxígeno. La 1,2-dibehenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DBPC) es adecuada para usar en este sentido. En una realización, se puede usar una combinación de lípidos en la que la DBPC está presente en una cantidad de al menos 70, preferiblemente al menos 80, más preferiblemente al menos 80% en moles (basado en la cantidad total de lípidos).
[0071] Los materiales poliméricos que son adecuados para usar en la formación de la cubierta de la microburbuja incluyen proteínas, en particular albúmina, en particular albúmina sérica humana. Otros polímeros biocompatibles que pueden usarse incluyen poli(alcohol vinílico) (PVA), poli(D,L-lactida-co-glicólido) (PLGA), cianoacrilato, poloxámeros (Pluronics), quitosano y derivados de quitosano, o combinaciones de los mismos. Las cubiertas de microburbujas pueden comprender capas únicas o múltiples del mismo o diferentes materiales. Se pueden formar múltiples capas, por ejemplo, en los casos en que el material de cubierta básico (p. ej., un lípido) lleva uno o más polímeros o polisacáridos. Los ejemplos de dichos polímeros incluyen polietilenglicol (PEG) y polivinilpirrolidona. La cubierta de la microburbuja también puede recubrirse con polímeros, tales como poli-L-lisina y PLGA, y/o polisacáridos, tales como alginato, dextrano, hidrocloruro de dietilamino-etil-dextrano (DEAE) o quitosano. Los métodos para unir estos materiales de recubrimiento pueden implicar interacciones electrostáticas o covalentes. Se pueden usar diferentes materiales de recubrimiento (polímeros, polisacáridos, proteínas, etc.) para mejorar las propiedades de la microburbuja, por ejemplo, aumentando la rigidez, la estabilidad en la circulación y/o la capacidad de penetración de tejidos de los reactivos basados en microburbujas, manipulando la carga superficial neta de la microburbuja y, quizás lo más importante, aumentando su capacidad de carga activa. Los lípidos que forman una estructura monocapa, bicapa o multilaminar se pueden usar para formar las microburbujas para usar en la invención. Los ejemplos de estos incluyen liposomas y micelas unilaminares o multilaminares.
[0073] Cualquiera de las capas de las microburbujas descritas en el presente documento puede comprender componentes adicionales que ayudan a la acumulación de las microburbujas en el sitio objetivo. Por ejemplo, estas se pueden funcionalizar de manera que incorporen o tengan unido a las mismas un ligando o agente de direccionamiento que sea capaz de unirse a una célula o tejido objetivo. Los ejemplos de agentes de direccionamiento adecuados incluyen anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, moléculas de adhesión celular y sus receptores, citocinas, factores de crecimiento y ligandos de receptores. Dichos agentes se pueden unir a las microburbujas usando métodos conocidos en la técnica, p. ej., mediante acoplamiento covalente, el uso de espaciadores moleculares (p. ej., PEG) y/o el método del complejo avidina-biotina. Por ejemplo, la incorporación de un conjugado lípido-PEG-biotina en microburbujas basadas en lípidos seguida de la adición de avidina permite la funcionalización de la superficie de la microburbuja con un ligando de direccionamiento biotinilado. La herceptina es un ejemplo de un anticuerpo que se puede conjugar con la cubierta de la microburbuja con fines de direccionamiento.
[0075] La cubierta de microburbujas puede comprender además componentes que ayudan a su unión a uno o más grupos conectores como se describe en el presente documento. En una realización, la cubierta de la microburbuja se puede acoplar covalentemente a biotina o a un resto de biotina mediante un espaciador molecular, tal como el PEG (p. ej., PEG-2000). Esto permite la funcionalización de la superficie de la microburbuja con avidina, que luego se puede conjugar con un grupo conector biotinilado. La incorporación de un conjugado lípido-espaciador y biotina (p. ej., un conjugado lípido-PEG-biotina) en la cubierta de la microburbuja puede lograrse mediante la funcionalización apropiada de uno o más lípidos antes de la formación de la microburbuja.
[0077] El gas dentro del núcleo de la microburbuja debe ser biocompatible. El término "gas" abarca no solo sustancias que son gaseosas a temperatura y presión ambiente, sino también aquellas que están en forma líquida en estas condiciones. Cuando el "gas" es líquido a temperatura ambiente, generalmente sufrirá un cambio de fase a gas o vapor a una temperatura de 38°C o superior. Para cualquier gas que sea un líquido a temperatura ambiente, generalmente se prefiere que sufra un cambio de fase a un gas a una temperatura entre aproximadamente 38 y 45°C, preferiblemente ligeramente por encima de la temperatura corporal. Por ejemplo, puede sufrir un cambio de fase cuando se somete a un estímulo, tal como ultrasonido, que produce un aumento local de la temperatura. Por lo tanto, cualquier referencia en el presente documento a "gas" debe considerarse que abarca no solo gases y líquidos, sino también vapores líquidos y cualquier combinación de los mismos, p. ej., una mezcla de un vapor líquido en un gas.
[0079] Los gases que son adecuados para incorporar dentro de las microburbujas para usar según la invención incluyen aire, nitrógeno, oxígeno, dióxido de carbono, hidrógeno; gases inertes tales como helio, argón, xenón o criptón; fluoruros de azufre tales como hexafluoruro de azufre, decafluoruro de diazufre; hidrocarburos de bajo peso molecular tales como alcanos (p. ej., metano, etano, propano, butano), cicloalcanos (p. ej., ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano), alquenos (p. ej., etileno, propeno); y alquinos (p. ej., acetileno o propino); éteres; ésteres; hidrocarburos de bajo peso molecular halogenados; y mezclas de los mismos.
[0080] Los ejemplos de hidrocarburos halogenados adecuados son aquellos que contienen uno o más átomos de flúor e incluyen, por ejemplo, bromoclorodifluorometano, clorodifluorometano, diclorodifluorometano, bromotrifluorometano, clorotrifluorometano, cloropentafluoroetano, diclorotetrafluoroetano, clorotrifluoroetileno, fluoroetileno, fluoruro de etilo, 1,1-difluoroetano y perfluorocarbonos. Los ejemplos de compuestos fluorocarbonados adecuados incluyen perfluorocarbonos. Los perfluorocarbonos incluyen perfluoroalcanos tales como perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropanos, perfluorobutanos, perfluoropentanos, perfluorohexanos y perfluoroheptanos; perfluoroalquenos tales como perfluoropropeno, perfluorobutenos; y perfluorocicloalcanos tales como perfluorociclobutano. Las microburbujas que contienen gases perfluorados, en particular perfluorocarbonos tales como perfluoropropanos, perfluorobutanos, perfluoropentanos y perfluorohexanos, son adecuadas para usar en la invención debido a su estabilidad en el torrente sanguíneo.
[0081] Las microburbujas que contienen un perfluorocarbono, particularmente un perfluoroalcano, y una cubierta que comprende un fosfolípido pueden usarse en la invención y se describen, por ejemplo, en Nomikou y McHale,Cancer Lett., 296: 133-143, 2010. Un ejemplo de una microburbuja de este tipo es Sonidel SDM202 (disponible en Sonidel Ltd.). El perfluorocarbono puede estar presente como un gas o en forma líquida. Las que contienen un núcleo líquido pueden prepararse a partir de nanoemulsiones que pueden convertirse posteriormente en una microburbuja de gas tras la exposición a ultrasonidos, p. ej., como se describe en Rapoport et al.,BubbleSci. Eng. Technol
.1: 31-39, 2009.
[0082] En una realización, las microburbujas para usar en la invención pueden transportar oxígeno (p. ej., oxígeno gaseoso). Como el oxígeno es un sustrato clave para la SDT y muchos tipos de cáncer son hipóxicos, llenar el núcleo de la burbuja con oxígeno gaseoso mejora el efecto sonodinámico y la cantidad de oxígeno singlete producido. Puesto que el PDAC posee un entorno tumoral hipóxico pronunciado que también puede suprimir el sistema inmunitario, el uso de MB cargadas de oxígeno, como se describe en el presente documento, que suministran simultáneamente oxígeno y sus cargas activas unidas a los tumores pancreáticos es particularmente beneficioso tanto desde una perspectiva terapéutica como inmunológica.
[0083] El sonosensibilizador para usar en la invención es rosa de Bengala.
[0084] Los métodos para la formación de microburbujas son conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen la formación de una suspensión del gas en un medio acuoso en presencia del material de cubierta seleccionado. Las técnicas utilizadas para formar la microburbuja incluyen la sonicación, mezcla a alta velocidad (agitación mecánica), atomización electrohidrodinámica coaxial y procesamiento microfluídico usando una unión en T (véase, p. ej., Stride y Edirisinghe,Med. Biol. Eng. Comput., 47: 883-892, 2009). La sonicación se usa ampliamente y en general se prefiere. Esta técnica se puede llevar a cabo utilizando una sonda de transmisión de ultrasonidos. Más particularmente, una suspensión acuosa de los componentes de la cubierta de la microburbuja se trata con ultrasonidos en presencia del componente gaseoso de la microburbuja relevante, p. ej., oxígeno.
[0085] Otros métodos que se pueden usar para formar las microburbujas incluyen la vaporización de un núcleo de nanogotas en una nanoemulsión (véase, p. ej., Rapoport et al., véase antes). El núcleo de dichas nanogotas típicamente estará formado por un perfluorocompuesto orgánico que está recubierto por una cubierta lipídica o un copolímero de bloques anfifílico biodegradable, tal como poli(óxido de etileno)-co-poli(L-lactida) o poli(óxido de etileno)-co-caprolactona. Alternativamente, las nanoemulsiones se pueden preparar por extrusión a través de membranas de encolado, por ejemplo, usando albúmina como el material de cubierta. La transición de gota a burbuja se puede inducir por medios físicos y/o mecánicos que incluyen calor, ultrasonidos e inyección a través de una aguja de calibre fino. Dichas microburbujas se pueden formar en el punto de administración al paciente (p. ej., durante la etapa de administración usando una aguja de calibre fino) oin vivoen las células o tejidos objetivo deseados (p. ej., sometiendo la nanoemulsión a ultrasonidos).
[0086] La administración de una nanogota que sea capaz de formar el complejo de microburbujas deseado tal como se define en el presente documento, ya sea durante la etapa de administración al paciente o después de la administración (es decir,in vivo),está dentro del alcance de la presente invención. Cuando se desee que la microburbuja resultante contenga oxígeno gaseoso, este se puede proporcionar en forma disuelta en un núcleo de perfluorocarbono líquido de una nanoemulsión con cambio de fase.
[0087] Los complejos de microburbujas descritos en el presente documento se pueden preparar usando métodos y procedimientos conocidos en la técnica. Los métodos que pueden usarse para unir covalentemente el agente sonosensibilizador y/o el agente quimioterapéutico a una microburbuja incluyen técnicas de acoplamiento químico conocidas. El método exacto usado dependerá de la naturaleza exacta de la microburbuja, del agente sonosensibilizador y del agente quimioterapéutico, específicamente de la naturaleza de cualquier grupo funcional colgante. Si es necesario, uno o ambos componentes que se van a unir se pueden funcionalizar, p. ej., para incluir grupos funcionales reactivos que se pueden usar para acoplar las moléculas. Los grupos reactivos adecuados incluyen ácido, hidroxi, carbonilo, haluro de ácido, tiol y/o amina primaria. Los métodos para la introducción de dichos grupos funcionales son bien conocidos en la técnica.
[0088] Los ejemplos de métodos que se pueden usar para unir covalentemente una microburbuja a uno o más agentes sonosensibilizadores y/o agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: a) Métodos de acoplamiento basados en carbodiimida. Estos se pueden usar para acoplar microburbujas que contienen una funcionalidad de amina o de ácido carboxílico a un resto que tiene una funcionalidad de ácido carboxílico o amina. Dichos métodos dan como resultado la formación de enlaces éster o amida; b) la reacción "CLICK" (es decir, la reacción de cicloadición 1,3-dipolar). Esta se puede usar para hacer reaccionar microburbujas funcionalizadas con azida o acetileno con un resto que tenga funcionalidad de acetileno o azida; c) formación de bases de Schiff (es decir, formación de enlace imina). Esta reacción se puede usar para unir microburbujas funcionalizadas con aldehído o amina a un resto que contiene la funcionalidad de amina o aldehído; y d) reacciones de adición de Michael.
[0089] La unión de la microburbuja a uno o más sonosensibilizadores y/o agentes quimioterapéuticos, o a uno o más grupos conectores como se describe en el presente documento, mediante la unión biotina-avidina se puede llevar a cabo por métodos conocidos por los expertos en la técnica. En dichos métodos, ambos restos típicamente se biotinilarán y luego se usará avidina para formar la unión entre las dos. En el esquema 3 del ejemplo 4 se proporciona un ejemplo de un método para producir un complejo de microburbujasonosensibilizador en el que la microburbuja se une a un grupo conector trípode mediante una interacción biotina-avidina-biotina.
[0090] Como alternativa al acoplamiento de cualquiera de los sonosensibilizadores, agentes quimioterapéuticos o grupos conectores descritos en el presente documento a una microburbuja preformada, estos restos se pueden unir alternativamente a un lípido (p. ej., usando cualquiera de los métodos descritos anteriormente) y ese lípido puede incorporarse posteriormente a la capa lipídica de la microburbuja durante su preparación.
[0091] Los sonosensibilizadores y/o agentes quimioterapéuticos cargados pueden unirse electrostáticamente a una microburbuja cargada. Por ejemplo, una burbuja aniónica se puede unir a un sonosensibilizador catiónico o agente quimioterapéutico catiónico y viceversa.
[0092] En la publicación internacional WO 2012/143739 se describen ejemplos de métodos para la preparación de un complejo microburbuja-sonosensibilizador. En la publicación internacional WO 2017/089800 se describen ejemplos de métodos para la preparación de microburbujas que llevan sonosensibilizadores y/o agentes quimioterapéuticos.
[0093] En el caso donde se incorpora un agente quimioterapéutico (p. ej., paclitaxel, PTX) dentro de la cubierta de la microburbuja, este se puede, por ejemplo, disolver en un disolvente orgánico y añadir a una solución que contiene los lípidos antes de la formación de la microburbuja. La evaporación del disolvente proporciona una película lipídica seca que incorpora el agente quimioterapéutico (p. ej., PTX) que se puede reconstituir y tratar con ultrasonidos para proporcionar la microburbuja cargada. La película de lípido-agente quimioterapéutico (p. ej., película de lípido-PTX) se puede reconstituir en un disolvente adecuado, calentar por encima de la temperatura de transición lipídica y tratar con ultrasonidos suavemente para asegurar la incorporación completa del agente quimioterapéutico en las cadenas lipídicas. La solución después se puede burbujear con un gas adecuado (p. ej., perfluorobutano, PFB) mientras se trata con ultrasonidos para preparar la suspensión final de microburbujas.
[0094] Cuando la cubierta comprende materiales poliméricos, tales como albúmina, se puede incorporar un agente quimioterapéutico (p. ej., paclitaxel) (p. ej., insertado) dentro de la cubierta de la microburbuja usando un método de doble emulsión (p. ej., agua en aceite en agua). Usando este método, el agente quimioterapéutico se puede disolver en la fase oleosa de la emulsión junto con el polímero. Tras la eliminación de un disolvente de la emulsión, la fase oleosa se convierte en una cubierta de polímero que tiene el agente quimioterapéutico insertado en la misma.
[0095] En ciertas realizaciones, el complejo microburbuja-sonosensibilizador para usar en la invención puede administrar simultáneamente tanto el sonosensibilizador como un agente quimioterapéutico. En estas realizaciones, la microburbuja se usa como portador para ambos agentes. Cuando ambos agentes están unidos a una sola microburbuja, estos pueden unirse mediante grupos conectores separados, como se describe en la publicación internacional WO 2017/089800, por ejemplo. Alternativamente, se puede usar un ligando (denominado en el presente documento "grupo conector") para unir tanto el sonosensibilizador como el agente quimioterapéutico a la superficie de una sola microburbuja (p. ej., mediante la interacción "biotina-avidina"). Esto permite el tratamiento combinado de quimioterapia/SDT usando una sola microburbuja. Uniendo ambos agentes a la misma microburbuja en lugar de a microburbujas separadas, se puede lograr un aumento en la carga del fármaco. El ligando también se puede modificar para llevar dos o más agentes quimioterapéuticos y/o dos o más sonosensibilizadores para mejorar más la carga del fármaco.
[0096] Los complejos microburbuja-sonosensibilizador para usar según la invención pueden comprender, por lo tanto, una microburbuja unida o asociada de otro modo con al menos un agente sonosensibilizador y al menos un agente quimioterapéutico. En una realización, estos agentes se pueden unir o asociar de otro modo con la microburbuja mediante uno o más grupos conectores, cada uno de los cuales lleva al menos un agente sonosensibilizador y al menos un agente quimioterapéutico.
[0097] En una realización, el complejo microburbuja-sonosensibilizador para usar según la invención comprende una microburbuja unida o asociada de otro modo con una pluralidad de agentes sonosensibilizadores y una pluralidad de agentes quimioterapéuticos. Cuando la microburbuja está unida a más de un agente sonosensibilizador, estos pueden ser iguales o diferentes, y los puede llevar un único grupo conector o dos o más grupos conectores. En general, los agentes sonosensibilizadores unidos a una microburbuja particular serán idénticos. En el complejo microburbuja-sonosensibilizador para usar en la invención, la microburbuja está unida o asociada de otro modo al agente sonosensibilizador rosa de Bengala. Cuando la microburbuja está unida a más de un agente quimioterapéutico, estos pueden ser iguales o diferentes, y los puede llevar un único grupo conector o dos o más grupos conectores. En general, los agentes quimioterapéuticos unidos a una microburbuja particular mediante un grupo (o grupos) de unión como se describe en el presente documento serán idénticos.
[0098] El(los) agente(s) quimioterapéutico(s) y agente(s) sonosensibilizador(es) se pueden unir a la microburbuja mediante uno o más grupos conectores. Cada grupo conector se puede unir o asociar de otro modo a la microburbuja y al(a los) agente(s) quimioterapéutico(s) y agente(s) sonosensibilizador(es) a través de medios covalentes o no covalentes, p. ej., mediante interacción electrostática, interacciones hidrófobas, fuerzas de van der Waals, enlaces de hidrógeno o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la interacción entre el(los) grupo(s) conector(es) y la microburbuja puede implicar enlaces no covalentes fuertes, tal como la interacción biotina-avidina. En esta realización, un componente del par de unión (p. ej., el grupo conector) se funcionaliza con biotina y el otro (p. ej., la microburbuja) con avidina. Puesto que la avidina contiene múltiples sitios de unión para la biotina, ésta normalmente también se unirá a la microburbuja mediante una interacción biotina-avidina. Por ejemplo, una microburbuja se puede funcionalizar con biotina para formar una microburbuja biotinilada que después se incuba con avidina. Una vez que la avidina está unida a la microburbuja, esto permite la unión de cualquier resto biotinilado adicional, tal como un grupo conector que incorpore biotina (o un resto de biotina). La unión resultante entre la microburbuja y el grupo conector puede, por lo tanto, tener la forma de una interacción "biotina-avidina-biotina".
[0099] En una realización, el(los) agente(s) quimioterapéutico(s) y/o agente(s) sonosensibilizador(es) se unen covalentemente al(a los) grupo(s) conector(es), es decir, el(los) agente(s) quimioterapéutico(s) y/o agente(s) sonosensibilizador(es) se unen al(a los) grupo(s) conector(es) mediante uno o más enlaces covalentes. Como se entenderá, la naturaleza precisa del(de los) grupo(s) conector(es) no es crítica siempre que sean capaces de unir al menos un agente quimioterapéutico y al menos un agente sonosensibilizador a la microburbuja (o a una microburbuja adecuadamente "funcionalizada" como se describe en el presente documento, p. ej., una microburbuja que lleva una o más funcionalidades de biotina-avidina). Como se apreciará, cualquier grupo conector debe ser biocompatible.
[0100] Cualquiera de las microburbujas descritas en el presente documento se puede unir o asociar de otro modo a una pluralidad de grupos conectores para aumentar más la carga de agentes sonosensibilizadores y quimioterapéuticos. En esta realización, los grupos conectores no necesitan ser idénticos entre sí, aunque generalmente serán los mismos.
[0101] Los expertos en la técnica pueden seleccionar fácilmente los grupos conectores adecuados. Típicamente, cada grupo conector comprenderá un grupo orgánico que comprende una cadena de hasta aproximadamente 200 átomos, p. ej., hasta aproximadamente 100 átomos, entre sus puntos de unión a la microburbuja (o microburbuja "funcionalizada") y al agente quimioterapéutico y al agente sonosensibilizador. La cadena orgánica puede comprender grupos alifáticos, alicíclicos o aromáticos, o cualquier combinación de los mismos. En una realización, puede comprender grupos alifáticos, alicíclicos y aromáticos. En otra realización, puede comprender grupos alifáticos y alicíclicos. Los grupos conectores adecuados pueden tener un peso molecular de hasta aproximadamente 3000 Da, p. ej., hasta aproximadamente 1500 Da.
[0102] Los grupos conectores adecuados pueden ser lineales o ramificados. En una realización, el grupo conector puede ser ramificado. Se pueden proporcionar diversos grados de ramificación y se pueden seleccionar dependiendo del número de agentes que debe llevar el grupo conector. Por ejemplo, el grupo conector puede comprender hasta seis ramificaciones, p. ej., una, dos, tres o cuatro ramificaciones, que permiten su unión a la microburbuja (o microburbuja "funcionalizada") y al(a los) agente(s) quimioterapéutico(s) y agente(s) sonosensibilizador(es). La unión del grupo conector a la microburbuja y a los agentes quimioterapéuticos y sonosensibilizadores se realizará generalmente a través de grupos terminales de la estructura ramificada. En una realización, el grupo conector puede comprender tres ramificaciones, es decir, es "trípode". En esta realización, una primera ramificación del grupo conector se podrá unir a la microburbuja (p. ej., mediante una interacción no covalente tal como "avidina-biotina"), una segunda ramificación se podrá unir al agente quimioterapéutico (p. ej., covalentemente) y una tercera ramificación se podrá unir al agente sonosensibilizador (p. ej., covalentemente).
[0103] Los grupos conectores adecuados pueden comprender una cadena de alquileno C<30-50>de cadena lineal o ramificada (preferiblemente ramificada) (preferiblemente una cadena de alquileno C<30-40>) opcionalmente sustituida por uno o más grupos seleccionados de alquilo C<1-3>, -Oalquilo(C<1-3>) y -OR' (donde R' es H o alquilo C<1-6>, preferiblemente alquilo C<1-3>, p. ej. metilo); y en los que uno o más (preferiblemente hasta 10, p. ej., de 4 a 9, o de 6 a 8) grupos -CH<2>- de la cadena de alquileno pueden sustituirse por un grupo seleccionado independientemente de -O-, -CO-, -C(O)O-, -NR"- y -NR"CO- (donde cada R" es independientemente H o alquilo C<1-6>, preferiblemente alquilo C<1-3>, p. ej. metilo). En una realización, el grupo conector también puede estar sustituido (p. ej., sustituido terminalmente) con biotina o un resto de biotina como se describe en el presente documento.
[0104] En una realización, el grupo conector puede comprender uno o más aminoácidos. Por ejemplo, puede comprender un péptido, un resto o fragmento peptídico.
[0105] Los grupos conectores trípodes adecuados para usar en la invención incluyen aquellos en los que las ramificaciones están unidas a un átomo de N o C central. Se prefieren los que tienen un átomo de nitrógeno central para usar en la invención. Dichos grupos conectores incluyen aquellos que tienen la siguiente estructura:
[0108]
[0111] en donde L<1>, L<2>y L<3>son cada uno independientemente - (CH<2>)<q>- en el que q es un número entero de 1 a 4, preferiblemente 2; cada R es independientemente H o alquilo C<1-6>(preferiblemente alquilo C<1-3>, p. ej., CH<3>), preferiblemente H; n es un número entero de 2 a 10, preferiblemente de 4 a 8, más preferiblemente de 5 a 7, p. ej.6; p es un número entero de 2 a 10, preferiblemente de 4 a 8, más preferiblemente de 5 a 7, p. ej., 6; X es un grupo funcional capaz de unirse a una microburbuja o a una microburbuja "funcionalizada" como se describe en el presente documento; * indica el punto de unión del grupo conector a un agente sonosensibilizador, un agente sonosensibilizador "funcionalizado" o un resto de un agente sonosensibilizador como se describe en el presente documento; y ** indica el punto de unión del grupo conector a un agente quimioterapéutico, un agente quimioterapéutico "funcionalizado" o un resto de un agente quimioterapéutico como se describe en el presente documento.
[0113] Como se entenderá, la unión de los diversos componentes para formar los complejos de microburbujas según la invención puede requerir, en algunos casos, que uno o más de los componentes estén adecuadamente "funcionalizados", por ejemplo, mediante la incorporación de uno o más grupos reactivos que permitan su unión o asociación entre sí (p. ej., mediante la formación de un enlace covalente o cualquier otro tipo de enlace descrito en el presente documento). Cualquier referencia en el presente documento a un componente "funcionalizado" de los complejos debe interpretarse en consecuencia. Por ejemplo, una microburbuja "funcionalizada" puede llevar un grupo funcional "biotina-avidina" con el fin de que pueda unirse a un grupo conector biotinilado. Los agentes sonosensibilizadores "funcionalizados" y los agentes quimioterapéuticos "funcionalizados" pueden, por ejemplo, llevar uno o más grupos reactivos (tales como amina, p. ej. amina primaria, carboxilo, hidroxilo, ácido, haluro de ácido, tiol, carbonilo, etc.) que permiten su unión al grupo conector elegido. Se puede usar cualquier grupo funcional adecuado y los expertos en la técnica pueden seleccionarlos fácilmente dependiendo de la naturaleza de los componentes que se van a unir entre sí.
[0115] La "funcionalización" de cualquier componente (p. ej., el agente sonosensibilizador o el agente quimioterapéutico) implicará típicamente la reacción con uno o más compuestos que son capaces de proporcionar el componente "funcionalizado" deseado. Los compuestos adecuados pueden ser determinados fácilmente por cualquier químico experto y pueden incluir, por ejemplo, restos que contienen un grupo amina o ácido carboxílico. Tras la reacción con el agente, estos pueden proporcionar, por ejemplo, una funcionalidad terminal de amina o ácido carboxílico que es capaz de reaccionar con el grupo conector elegido. Los ejemplos de compuestos que se pueden usar para la funcionalización de un agente sonosensibilizador o un agente quimioterapéutico se ilustran en el presente documento en los esquemas 3 y 5. En el esquema 3, se usa Br-CH<2>-CH<2>-NH<2>para funcionalizar el agente sonosensibilizador rosa de Bengala para producir "rosa de Bengalaamina". En el esquema 6, el rosa de bengala se hace reaccionar con ácido 8-bromooctanoico para producir "rosa de bengala-ácido octanoico", y el agente quimioterapéutico gemcitabina se hace reaccionar con HO-(CH<2>)<11>-CO<2>H y cloroformiato de 4-nitrofenilo para producir una gemcitabina funcionalizada con ácido carboxílico.
[0117] De manera similar, se entenderá que tras la unión de los diversos componentes (p. ej., mediante una reacción química) para formar los complejos de microburbujas para usar según la invención, es posible que algunos o todos los componentes ya no conserven su estructura original, sino que pueden "perder" uno o más grupos o átomos terminales (p. ej., un átomo de H) como resultado de la reacción implicada en su unión o asociación entre sí (p. ej., mediante la formación de un enlace covalente, o cualquier otro tipo de enlace descrito en el presente documento). Estos componentes pueden considerarse un "resto" del componente original y cualquier referencia a un "resto" de un componente de los complejos debe interpretarse en consecuencia. Los esquemas 3 y 6 se proporcionan en el presente documento como ejemplos de métodos que se pueden usar en la preparación de un grupo conector trípode que incorpora biotina. En estos ejemplos, el grupo carboxilo terminal de la biotina se usa para unirla al grupo conector trípode, típicamente mediante un enlace amina o éster. En la estructura final, la biotina está presente como un "resto" de biotina.
[0118] En la fórmula (I), L<1>, L<2>y L<3>pueden ser idénticos. En una realización, L<1>, L<2>y L<3>son cada uno -(CH<2>)<2>-. En la fórmula (I), cada R puede ser idéntico. En una realización, cada R es H. En la fórmula (I), n y p pueden ser idénticos. En una realización, n y p son ambos un número entero de 4 a 8, p. ej., 6. En una realización de la fórmula (I), X es biotina o un resto de biotina que es capaz de unirse a una microburbuja funcionalizada con avidina.
[0119] Un ejemplo de un grupo conector trípode dentro de la fórmula general (I) para usar en la invención es el siguiente:
[0122]
[0124] en donde X es un grupo funcional capaz de unirse a una microburbuja o a una microburbuja "funcionalizada" como se describe en el presente documento; * indica el punto de unión del grupo conector a un agente sonosensibilizador, un agente sonosensibilizador "funcionalizado" o un resto de un agente sonosensibilizador como se describe en el presente documento; y ** indica el punto de unión del grupo conector a un agente quimioterapéutico, un agente quimioterapéutico "funcionalizado", o un resto de un agente quimioterapéutico como se describe en el presente documento. En una realización de la fórmula (II), X es biotina o un resto de biotina que es capaz de unirse a una microburbuja funcionalizada con avidina.
[0125] Otros grupos conectores trípode que pueden usarse en la invención son los que tienen la siguiente estructura general:
[0126]
[0128] en donde L<4>, L<5>y L<6>son cada uno independientemente -(CH<2>)<t>- en el que t es un número entero de 1 a 4, preferiblemente 2; cada R' es independientemente H o alquilo C<1-6>(preferiblemente alquilo C<1-3>, p. ej., CH<3>), preferiblemente H; r es un número entero de 2 a 10, preferiblemente de 4 a 8, más preferiblemente de 5 a 7, p. ej.6; s es un número entero de 2 a 10, preferiblemente de 4 a 8, más preferiblemente de 5 a 7, p. ej., 6 o 7; X' es un grupo funcional capaz de unirse a una microburbuja o a una microburbuja "funcionalizada" como se describe en el presente documento; * indica el punto de unión del grupo conector a un agente sonosensibilizador, un agente sonosensibilizador "funcionalizado" o un resto de un agente sonosensibilizador como se describe en el presente documento; y ** indica el punto de unión del grupo conector a un agente quimioterapéutico, un agente quimioterapéutico "funcionalizado" o un resto de un agente quimioterapéutico como se describe en el presente documento.
[0129] En una realización alternativa de fórmula (III): * indica el punto de unión del grupo conector a un agente quimioterapéutico, un agente quimioterapéutico “funcionalizado” o un resto de un agente quimioterapéutico como se describe en el presente documento; y ** indica el punto de unión del grupo conector a un agente sonosensibilizador, un agente sonosensibilizador “funcionalizado” o un resto de un agente sonosensibilizador como se describe en el presente documento.
[0130] En la fórmula (III), L<4>, L<5>y L<6>pueden ser idénticos. En una realización, L<4>, L<5>y L<6>son cada uno -(CH<2>)<2>-. En la fórmula (III), cada R' puede ser igual. En una realización, cada R' es H. En la fórmula (III), r y s pueden ser iguales o diferentes. En una realización, r y s son ambos un número entero de 4 a 8, p. ej., 6 o 7. En una realización, r es 6 y s es 7. En una realización de la fórmula (III), X' es biotina o un resto de biotina que es capaz de unirse a una microburbuja funcionalizada con avidina.
[0131] Un ejemplo de un grupo conector trípode según la fórmula (III) que se puede usar en la invención es el siguiente:
[0132]
[0135] en donde X' es un grupo funcional capaz de unirse a una microburbuja o a una microburbuja "funcionalizada" como se describe en el presente documento; * indica el punto de unión del grupo conector a un agente sonosensibilizador, un agente sonosensibilizador "funcionalizado" o un resto de un agente sonosensibilizador como se describe en el presente documento; y ** indica el punto de unión del grupo conector a un agente quimioterapéutico, un agente quimioterapéutico "funcionalizado", o un resto de un agente quimioterapéutico como se describe en el presente documento.
[0137] En una realización de la fórmula (IV), X' es biotina o un resto de biotina que es capaz de unirse a una microburbuja funcionalizada con avidina.
[0139] Otros grupos conectores trípode que se pueden usar en la invención son los que tienen la siguiente estructura general:
[0142]
[0145] en donde L<7>, L<8>y L<9>son cada uno independientemente -(CH<2>)<u>- en el que u es un número entero de 1 a 4, preferiblemente 2; cada R" es independientemente H o alquilo C<1-6>(preferiblemente alquilo C<1-3>, p. ej., CH<3>), preferiblemente H; X" es un grupo funcional capaz de unirse a una microburbuja o a una microburbuja "funcionalizada" como se describe en el presente documento; * indica el punto de unión del grupo conector a un agente sonosensibilizador, un agente sonosensibilizador "funcionalizado" o un resto de un agente sonosensibilizador como se describe en el presente documento; y ** indica el punto de unión del grupo conector a un agente quimioterapéutico, un agente quimioterapéutico "funcionalizado" o un resto de un agente quimioterapéutico como se describe en el presente documento.
[0146] En la fórmula (V), L<7>, L<8>y L<9>pueden ser iguales. En una realización, L<7>, L<8>y L<9>son cada uno -(CH<2>)<2>-. En la fórmula (V), cada R" puede ser igual. En una realización, cada R" es H. En una realización de la fórmula (V), X" es biotina o un resto de biotina que es capaz de unirse a una microburbuja funcionalizada con avidina. Un ejemplo de un grupo conector trípode según la fórmula (V) que se puede usar en la invención es el siguiente:
[0149]
[0151] en donde X" es un grupo funcional capaz de unirse a una microburbuja o a una microburbuja "funcionalizada" como se describe en el presente documento; * indica el punto de unión del grupo conector a un agente sonosensibilizador, un agente sonosensibilizador "funcionalizado" o un resto de un agente sonosensibilizador como se describe en el presente documento; y ** indica el punto de unión del grupo conector a un agente quimioterapéutico, un agente quimioterapéutico "funcionalizado", o un resto de un agente quimioterapéutico como se describe en el presente documento.
[0152] Los complejos de microburbuja-sonosensibilizador descritos en el presente documento se usan en un método de terapia combinada en el que se administran a un sujeto (p. ej., a un paciente) en combinación con un inhibidor de punto de control inmunitario separado. El inhibidor de punto de control inmunitario para usar en la terapia combinada según la invención es un inhibidor de PDL-1.
[0153] Por lo tanto, la invención proporciona, en un aspecto, un complejo microburbuja-sonosensibilizador para usar en el tratamiento de la enfermedad metastásica mediante terapia sonodinámica, en donde dicha terapia sonodinámica comprende el uso simultáneo, separado o secuencial de un inhibidor de punto de control inmunitario; y además, en donde dicho sonosensibilizador es el rosa de Bengala y dicho inhibidor de punto de control inmunitario es un inhibidor de PDL-1.
[0154] También se describe en el presente documento, pero no se reivindica, un método de terapia sonodinámica que comprende al menos las siguientes etapas:
[0155] (a) administrar un complejo de microburbuja-sonosensibilizador como se describe en el presente documento a las células o tejidos afectados de un sujeto que lo necesite (p. ej., un paciente) y someter dichas células o tejidos a irradiación de ultrasonidos para activar dicho complejo; y
[0156] (b) administrar simultáneamente, por separado o secuencialmente a dicho sujeto (p. ej., dicho paciente) una cantidad farmacéuticamente eficaz de un inhibidor de punto de control inmunitario que es un inhibidor de PDL-1.
[0157] Cuando se usan en terapia combinada, el complejo microburbuja-sonosensibilizador y el inhibidor de punto de control inmunitario se pueden administrar al sujeto por separado, simultánea o secuencialmente. Cuando se administran secuencialmente, se pueden administrar en cualquier orden. En una realización, el inhibidor de punto de control inmunitario se administra antes del complejo microburbuja-sonosensibilizador. Por ejemplo, se puede administrar hasta varias horas o incluso varios días antes de la administración del complejo microburbuja-sonosensibilizador. En particular, el inhibidor de punto de control inmunitario se puede administrar de 1 hora a 5 días, p. ej., de 2 horas a 3 días antes de que se administre el complejo microburbujasonosensibilizador y se lleve a cabo la SDT.
[0158] En una realización de la invención, el complejo microburbuja-sonosensibilizador y el inhibidor de punto de control inmunitario se administrarán separados uno de otro, preferiblemente de forma secuencial.
[0159] También forma parte de la invención un producto que comprende un complejo de microburbujasonosensibilizador como se describe en el presente documento y un inhibidor de punto de control inmunitario que es un inhibidor de PDL-1 para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de la enfermedad metastásica mediante terapia sonodinámica.
[0160] También se describe en el presente documento, pero no se reivindica, un kit (o paquete farmacéutico) que comprende los siguientes componentes: (i) un complejo microburbuja-sonosensibilizador como se describe en el presente documento; y por separado (ii) un inhibidor de punto de control inmunitario que es un inhibidor de PDL-1; opcionalmente junto con (iii) instrucciones para el uso de dichos componentes en un método de terapia sonodinámica.
[0161] Para la administración simultánea, el complejo microburbuja-sonosensibilizador y el inhibidor de punto de control inmunitario se pueden proporcionar juntos en una única formulación. En otro aspecto, la invención proporciona así una composición farmacéutica que comprende un complejo microburbuja-sonosensibilizador como se describe en el presente documento y un inhibidor de punto de control inmunitario que es un inhibidor de PDL-1, junto con al menos un vehículo o excipiente farmacéutico.
[0162] El inhibidor de punto de control inmunitario para usar en la invención es un inhibidor de PDL-1. Los ejemplos de dichos fármacos son conocidos y se usan en la técnica y cualquiera puede ser adecuado para usar en la invención.
[0163] Los ejemplos de inhibidores de PDL-1 que se pueden usar en la invención incluyen, pero no se limitan a, atezolizumab (MPDL3280A), avelumab y duravlumab.
[0164] Cuando se usan en una terapia combinada con el inhibidor de punto de control inmunitario, los complejos microburbuja-sonosensibilizador descritos en el presente documento son adecuados para el tratamiento de crecimientos o tumores cancerosos y sus metástasis.
[0165] Se pueden tratar los siguientes tumores y enfermedades metastásicas asociadas: cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de próstata, glioma, carcinoma pulmonar no microcítico, cánceres de cabeza y cuello, cánceres del tracto urinario, riñón o vejiga, melanoma avanzado, cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer hepático y linfoma. La enfermedad metastásica que surge de cualquiera de estos tumores se puede tratar usando cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. El tratamiento del cáncer pancreático metastásico forma un aspecto preferido de la invención.
[0166] Los métodos descritos en el presente documento encuentran uso particular en el tratamiento de pacientes que se han sometido a inmunoterapia convencional (p. ej., tratamiento con un inhibidor de punto de control inmunitario) sola o en combinación con otros procedimientos quimioterapéuticos, radioterapéuticos y/o ablativos, sin éxito. Los tratamientos ablativos del cáncer implican el uso de calor o frío para destruir o extirpar los tumores sin necesidad de una cirugía invasiva. Los ejemplos de terapia ablativa incluyen la ablación térmica, ablación por radiofrecuencia, ablación por microondas y ablación por ultrasonido focalizado de alta intensidad. Para usar en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, los complejos de microburbujas se proporcionarán generalmente en una composición farmacéutica junto con al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones farmacéuticas se pueden formular usando técnicas bien conocidas en la materia. La vía de administración dependerá del uso previsto. Típicamente, estos se administrarán por vía sistémica y, por lo tanto, se pueden proporcionar en una forma adaptada para la administración parenteral, p. ej., por inyección intradérmica, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa. Las formas farmacéuticas adecuadas incluyen suspensiones y soluciones que contienen los complejos de microburbujas activos junto con uno o más vehículos o excipientes inertes. Los vehículos adecuados incluyen solución salina, agua estéril, solución salina tamponada con fosfato y mezclas de los mismos. Las composiciones pueden incluir adicionalmente otros agentes tales como emulsionantes, agentes de suspensión, agentes dispersantes, solubilizantes, estabilizantes, agentes de tamponamiento, agentes humectantes, agentes conservantes, etc. Las composiciones se pueden esterilizar por técnicas de esterilización convencionales. Las soluciones que contienen los complejos se pueden estabilizar, por ejemplo, mediante la adición de agentes tales como modificadores de la viscosidad, emulsionantes, agentes solubilizantes, etc. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas para usar en la invención se usarán en forma de una suspensión acuosa de los complejos de microburbujas en agua o una solución salina, p. ej., solución salina tamponada con fosfato. Los complejos se pueden suministrar en forma de un polvo liofilizado para reconstituir en el punto de uso, p. ej., para reconstituir en agua, solución salina o PBS.
[0167] Los métodos descritos en el presente documento implican la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de la composición que contiene los complejos de microburbujas. A continuación, se puede dejar que los complejos de microburbujas se distribuyan en la parte deseada o zona objetivo del cuerpo antes de la activación. Una vez administrada al cuerpo, la zona objetivo se expone a ultrasonidos con una frecuencia e intensidad para lograr el efecto terapéutico deseado. Un procedimiento de activación típico puede implicar un procedimiento de dos etapas en el que las microburbujas se rompen primero mediante ultrasonidos enfocados, liberando así el sonosensibilizador, que luego puede penetrar en el tejido objetivo deseado (p. ej., tumor). La subsiguiente sonoactivación del sonosensibilizador dentro de las células objetivo da como resultado la producción de oxígeno singlete que puede oxidar varios componentes celulares tales como proteínas, lípidos, aminoácidos y nucleótidos, destruyendo así las células objetivo. Aunque se prevé que la activación del sonosensibilizador típicamente tendrá lugar después de su administración (es decir, después de la explosión de las microburbujas para liberar el sonosensibilizador), la administración del complejo y la activación del sonosensibilizador pueden, no obstante, ser simultáneas.
[0168] Alternativamente, cualquiera de los métodos descritos en el presente documento puede implicar la exposición de la zona objetivo del cuerpo a ultrasonidos durante la administración de la composición que contiene los complejos de microburbujas, es decir, la administración de los complejos de microburbujas y el suministro de ultrasonidos pueden llevarse a cabo simultáneamente. Cuando la semivida del complejo de microburbujas es baja, esto puede evitar la situación en la que puede ser eliminada una proporción significativa antes de que la zona objetivo reciba el ultrasonido.
[0169] La dosis eficaz de cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento dependerá de la naturaleza del complejo, el modo de administración, la afección a tratar, el paciente, etc. y puede ajustarse en consecuencia.
[0170] La frecuencia e intensidad del ultrasonido que se puede usar se pueden seleccionar basado de la necesidad de lograr la destrucción selectiva de la microburbuja en el sitio objetivo y, por ejemplo, se pueden adaptar a la frecuencia de resonancia de la microburbuja. Las frecuencias de ultrasonidos estarán típicamente en el intervalo de 20 kHz a 10 MHz, preferiblemente de 0,1 a 2 MHz. El ultrasonido se puede administrar como una frecuencia única o como una combinación de diferentes frecuencias. La intensidad (es decir, la densidad de potencia) del ultrasonido puede variar de aproximadamente 0,1 W/cm<2>a aproximadamente 1 kW/cm<2>, preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 W/cm<2>. Los tiempos de tratamiento típicamente estarán en el intervalo de 1 ms a 20 minutos y esto dependerá de la intensidad elegida, es decir, para una intensidad de ultrasonido baja, el tiempo de tratamiento se prolongará y para una intensidad de ultrasonido más alta, el tiempo de tratamiento será menor. El ultrasonido se puede aplicar en modo continuo o pulsado y se puede enfocar o administrar como un haz columnar.
[0171] Se puede usar cualquier fuente de radiación capaz de producir energía acústica (p. ej., ultrasonidos) en los métodos descritos en el presente documento. La fuente debe ser capaz de dirigir la energía al sitio objetivo y puede incluir, por ejemplo, una sonda o dispositivo capaz de dirigir la energía al tejido objetivo desde la superficie del cuerpo.
[0172] En los casos donde las frecuencias y/o intensidades de los ultrasonidos que se necesitan para lograr la cavitación (o destrucción de las microburbujas) y las necesarias para producir la activación del sonosensibilizador son diferentes, estos diferentes conjuntos de parámetros de ultrasonidos (frecuencia/intensidad) pueden aplicarse simultáneamente o en un procedimiento de dos (o múltiples) etapas. Aunque los diversos métodos y usos según la invención se describen principalmente en el presente documento en el contexto de la administración de un complejo de microburbujas "listo para usar", en una realización alternativa se puede administrar un precursor del complejo. El término "precursor", como se usa en el presente documento, pretende referirse a un precursor para el complejo de microburbujas que se conviertein vivoen él y, por lo tanto, es esencialmente equivalente al mismo. Así, por ejemplo, el término "precursor" abarca nanoemulsiones o formulaciones de nanogotas que son capaces de convertirse en el complejo de microburbujas deseadoin vivoo durante la administración. En una realización, dichos precursores son capaces de convertirse en el complejo deseado tras la acumulación en el tejido objetivo (p. ej., tejido tumoral). Tras la distribución al tejido o las células objetivo, la transición de gota a burbuja puede desencadenarse mediante métodos que incluyen ultrasonidos. Alternativamente, la etapa de administración de un precursor del complejo puede inducir por sí misma la formación de un complejo de microburbujas según la invención. Por ejemplo, cuando el precursor tiene la forma de una nanoemulsión, la transición de gota a burbuja se puede inducir mediante inyección a través de una aguja de calibre fino o sometiendo la preparación a un estímulo de transición de fase apropiado, p. ej., calor. La inyección directa de las nanoemulsiones adecuadas en las células o tejidos objetivo, por ejemplo, en los tumores, y la transición de fase en el sitio constituyen un aspecto adicional de la invención.
[0173] Como se apreciará, en cualquiera de las composiciones, métodos o usos descritos en el presente documento, cualquier referencia a un complejo de microburbujas según la invención puede reemplazarse por un "precursor" adecuado como se define en el presente documento.
[0174] Las nanoemulsiones o formulaciones de nanogotas para usar como precursores de complejos de microburbujas según la invención se pueden producir por la modificación apropiada de los métodos y procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos por Rapoport et al. (véase antes). En dichas formulaciones, los núcleos de las gotas de nanoemulsión, que pueden estar formadas por un perfluorocarbono líquido (p. ej., un perfluoroalcano), están envueltos por paredes de materiales de cubierta poliméricos, proteicos o lipídicos adecuados (p. ej., cualquiera de los polímeros descritos en el presente documento en relación con los complejos de microburbujas). La unión de las cubiertas de las nanogotas a un sonosensibilizador(es), un agente(s) quimioterapéutico(s) y/o un grupo(s) conector(es), como se describe en el presente documento, puede lograrse usando métodos convencionales e incluyen cualquiera de los descritos anteriormente para unir dichos restos a una microburbuja preformada. El método exacto usado dependerá de la naturaleza exacta del material de la cubierta, el sonosensibilizador, el agente quimioterapéutico y/o el grupo conector, específicamente de la naturaleza de cualquier grupo funcional colgante. Si es necesario, la cubierta y/o el sonosensibilizador, el agente quimioterapéutico y/o el grupo conector se pueden funcionalizar, p. ej., para incluir grupos funcionales reactivos que pueden usarse para acoplar los restos. Los grupos reactivos adecuados incluyen ácido, hidroxi, carbonilo, haluro de ácido, tiol y/o amina primaria. En una realización, la cubierta se puede funcionalizar con biotina y luego unirse a avidina para facilitar posteriormente la unión de un grupo conector biotinilado. Cuando se desea que la microburbuja formada contenga oxígeno gaseoso, el perfluorocarbono puede actuar como vehículo del oxígeno en forma líquida. Tras la formación del complejo, el líquido de perfluorocarbono se satura con oxígeno que posteriormente se vaporiza para formar oxígeno gaseoso.
[0175] La invención se describirá ahora con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes y los dibujos adjuntos en los que:
[0176] La figura 1 es una representación esquemática del conjugado MB-RB y el modelo tumoral bilateral usado en el ejemplo 3. Los animales recibieron una inyección en la vena de la cola del conjugado MB-RB con ultrasonidos aplicados al tumor tratado (+) usando los parámetros descritos en el ejemplo 3. Para el experimento de SDT/inhibidor de PDL-1 combinados, el inhibidor de PDL-1 se administró por vía IP 2 horas antes del tratamiento con MB-RB US.
[0177] La figura 2 muestra un gráfico del % de crecimiento tumoral frente al tiempo para ratones que llevan tumores pancreáticos KPC bilaterales donde el tumor del lado derecho se trató con el conjugado MB-RB US (tumor primario) mientras que el tumor del lado izquierdo permaneció sin tratar (tumor fuera del objetivo). [MB] = 1,6 x 10<9>; [RB] = 2,15 ± 0,42 mg/kg. n = 5; *p ≤ 0,05, **p ≤0,01 para la comparación con animales no tratados La figura 3 muestra un gráfico del % de crecimiento tumoral para el tumor fuera del objetivo en ratones que llevan tumores pancreáticos KPC bilaterales que (i) no recibieron tratamiento; recibieron (ii) una inyección IP de inhibidor de PDL-1; (iii) conjugado de MB-RB US en el tumor primario (SDT); y (iv) una inyección IP de inhibidor de PDL-12 horas antes del tratamiento del tumor primario con el conjugado MB-RB US (PDL-1 SDT). [MB] = 1,6 x 10<9>; [RB] = 2,15 ± 0,42 mg/kg; [PDL-1] = 10 mg/kg. Animales tratados los días 0, 4 y 7. *p ≤ 0,05, **p < 0,01 para PDL-1 SDT vs. SDT.
[0178] La figura 4 muestra un gráfico del peso tumoral promedio para tumores extraídos de animales el día 11 después del tratamiento inicial.
[0179] La figura 5 muestra el factor de cambio en la expresión de células T citotóxicas (CD45+vo, CD3+vo, CD8a+vo) extraídas de tumores el día 11 después del tratamiento inicial.
[0180] La figura 6 muestra una representación esquemática de PTX/GEM/RB-MB.
[0181] La figura 7 es una representación esquemática de a) O<2>MB-PTX/DOX y b) O<2>MB- PTX/RB.
[0182] Ejemplos
[0183] Ejemplo 1 - Síntesis de biotina-rosa de Bengala
[0184]
[0187] Esquema 1: Síntesis de biotina-rosa de Bengala
[0188] El rosa de Bengala funcionalizada con biotina (4) se preparó como se describe en McEwan et al. (J Control Release.2015; 203, 51 -6).
[0189] Ejemplo 2 - Síntesis del conjugado O<2>MB-rosa de Bengala
[0190] Las microburbujas (MB) estabilizadas con lípidos funcionalizadas con avidina se prepararon disolviendo primero la 1,2-dibehenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DBPC) (4,0 mg, 4,44 µmol), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG (2000)) (1,35 mg, 481 µmol) y DSPE-PEG (2000)-biotina (1,45 mg, 0,481 µmol) en cloroformo para lograr una relación molar de 82:9:9. El disolvente se separó al vacío a temperatura ambiente para dar una película translúcida. La película lipídica seca se reconstituyó en 3 ml de mezcla de PBS (pH 7,4 ± 0,1):propilenglicol:glicerol (8:1:1 v/v) y se calentó en un baño de agua a 80°C con agitación magnética durante 30 min. La suspensión luego se trató con ultrasonidos usando un disruptor celular ultrasónico Microson a una amplitud del 22% durante 30 segundos. El espacio de cabeza del recipiente se llenó entonces con gas perfluorobutano (PFB) y la solución se trató con ultrasonidos a una amplitud del 90% durante 30 segundos para formar las MB. Las MB se pusieron inmediatamente en hielo durante 10 minutos, seguido de centrifugación a 700 rpm durante 5 minutos y separación del líquido subnadante. Se añadieron 2 ml adicionales de mezcla de PBS (pH 7,4 ± 0,1):propilenglicol:glicerol (8:1:1 v/v) a la torta de MB seguida de una solución acuosa de avidina (500 µl, 5 mg/ml). La suspensión de MB después se agitó durante 5 min en un agitador rotatorio (150 rpm, 0°C) seguido de centrifugación (700 rpm) para eliminar el exceso de avidina.
[0191] Para preparar las O<2>MB funcionalizados con rosa de bengala (RB) (como se muestra en la figura 1), se añadió una solución saturada de biotina-RB (4) (1 ml, 5 mg/ml) en PBS (DMSO al 5%) a las MB funcionalizadas con avidina. La suspensión se mezcló durante 5 min en un agitador rotatorio (150 rpm, 0°C). El líquido subnadante se separó y se sustituyó por 2 ml de mezcla de PBS (pH 7,4 ± 0,1):propilenglicol:glicerol (8:1:1 v/v). Este procedimiento de lavado se repitió 3 veces para eliminar cualquier material no unido. Las MB después se burbujearon con oxígeno gaseoso de calidad médica antes de su uso.
[0192] El número de MB se determinó extrayendo muestras de 10 μl del conjugado de MB y diluyéndolos en 90 μl de PBS (pH 7,4 ± 0,1), seguido de análisis con un hemocitómetro (Bright-Line, Hausser Scientific, Horsham, PA, EE. UU.).
[0193] Ejemplo 3 - Estudiosin vivo
[0194] General:
[0195] Una línea celular de cáncer de páncreas en ratones (T110299), derivada de un tumor pancreático primario de un modelo de ratón KPC modificado genéticamente (Duewell et al.,Oncoimmunology(2015) 14; 4 (10)): e1029698) se usó para establecer tumores bilaterales en el dorso de ratones BALB/C inmunocompetentes con el fin de vigilar los efectos tanto en los tumores tratados como en los no tratados. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño determinado (por encima de 100 mm<3>), los ratones se trataron con una suspensión de O<2>MB-RB administrada por inyección en la vena de la cola. El tumor del lado derecho se designó el tumor tratado (o "tumor primario") y el tumor del lado izquierdo "tumor fuera del objetivo". Durante la inyección, se dirigió ultrasonidos de baja intensidad al tumor objetivo para romper las burbujas y activar la SDT. Se administró un segundo tratamiento de ultrasonidos 30 min después de la inyección para activar el rosa de Bengala. Estos parámetros inducen la cavitación inercial de las microburbujas y maximizan la generación de ROS mediada por SDT. El crecimiento del tumor se midió cada 2 días y se tomaron muestras de sangre antes y 1, 3 y 24 horas después del tratamiento para determinar cualquier cambio en la respuesta inmunitaria. Utilizando el mismo modelo animal, los ratones se trataron inicialmente con una inyección IP de un inhibidor de PDL-1. Dos horas más tarde, los ratones se trataron con SDT mediada por UTMD y se vigilaron para determinar el beneficio terapéutico del tratamiento combinado.
[0197] Tratamiento de SDT mediado por UTMD utilizando el conjugado O<2>MB-RB:
[0199] Todos los animales empleados en este estudio se trataron según los procedimientos autorizados en virtud de la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) del Reino Unido de 1986. Células KPC se mantuvieron en D-MEM con alto contenido de glucosa, suero bovino fetal al 10%, L-glutamina al 1% y aminoácidos no esenciales al 1%. Las células KPC (5x10<5>por tumor) se inyectaron por vía subcutánea en una suspensión de 100 µl de Matrigel y medio 1:1 en el flanco derecho e izquierdo de ratones C57BL/6JO1aHsd. Se formaron tumores bilaterales y eran palpables en 1 semana y se midieron usando calibres Vernier. El volumen del tumor se calculó mediante (ancho x ancho x largo)/2. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 119 mm<3>± 11,5, los animales se dividieron en 2 grupos (n = 5). El grupo 1 no recibió tratamiento y el grupo 2 recibió una inyección intravenosa de 100 µl en la cola del conjugado O<2>MB-RB preparado en el ejemplo 2 (MB = 1,6 x 10<9>; RB = 2,15 ± 0,42 mg/kg) y se administró ultrasonidos al tumor del lado derecho (SDT; tumor primario) durante la inyección y durante un período de 3,5 minutos. Los ultrasonidos se administraron utilizando un Sonidel SP100 sonoporator (3,5 W cm<-2>, 1 MHz, ciclo de trabajo de 30% y PRF = 100 Hz; PNP = 0,48 MPa; MI = 0,48; 3,5 minutos) (véase la figura 1). El tumor del lado izquierdo del grupo 2 se designó como el SDT; Tumor fuera del objetivo. Los tratamientos se repitieron los días 4 y 7. Los resultados se presentan en la Figura 2.
[0201] Tratamiento con SDT mediado por UTMD usando el conjugado O<2>MB-RB en combinación con inhibidores de puntos de control inmunitario:
[0203] Inhibidor de PDL-1:In vivoMab anti-PDL-1 de ratón (B7-H1) - Clon: 10F.9G2; número de catálogo BE0101 (proveedor 2BScientific).
[0205] Para el tratamiento con SDT+ anti-PDL-1 mediado por MB, se establecieron tumores bilaterales en otros cuatro grupos (n = 5) de animales, como se describe anteriormente. Cuando los tumores alcanzaron un promedio de 150 mm<3>± 11,8, los animales se trataron como sigue: el grupo 1 no recibió tratamiento; el grupo 2 recibió una inyección intraperitoneal de un inhibidor de PDL-1 (10 mg/kg), el grupo 3 recibió una inyección intravenosa en la cola de 100 µl de conjugado O<2>MB-RB (MB = 1,6 x 10<9>; RB = 2,15 ± 0,42 mg/kg) y se administró ultrasonidos al tumor primario durante la inyección y durante un período de 3,5 minutos como se describe anteriormente. El grupo 4 recibió una inyección intraperitoneal de inhibidor de PDL-1 (10 mg/kg) y 2 horas después los animales se trataron con una inyección intravenosa en la cola de 100 µl de conjugado O<2>MB-RB (MB = 1,6 x 10<9>; RB = 2,15 ± 0,42 mg/kg) y se administró ultrasonidos al tumor primario durante la inyección y durante un período de 3,5 minutos. Los tumores se midieron diariamente durante 11 días. Los resultados se presentan en la Figura 3. Los tratamientos se repitieron los días 4 y 7. El día 11, los animales se sacrificaron, se extirparon los tumores y se registraron los pesos de los tumores. Los resultados se presentan en la Figura 4.
[0207] Se obtuvo una suspensión de células individuales de los tumores homogeneizando el tumor, añadiendo 5 ml de FCS al 4% en RPMI y 160 µl (30 mg/ml) de colagenasa tipo II (Gibco, 17101-015) y 50 µl (2 µg/ml) de ADNasa y agitando durante 15 minutos. Se añadieron 160 µl (30 mg/ml) adicionales de colagenasa y se agitó durante 15 minutos más a temperatura ambiente. La suspensión se filtró a través de un filtro de 100 µm, se centrifugó a 1700 rpm durante 5 minutos, se resuspendió en 1 ml de tampón de lisis rojo y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células restantes se centrifugaron, el líquido sobrenadante se separó y se lavó dos veces en PBS enfriado con hielo. Las células se incubaron en anticuerpos conjugados con fluorocromo específicos para CD45 (0,125 µg/ensayo, eBioscience), CD3 (0,5 µg/ensayo, eBioscience), CD8a (0,25 µg/ensayo, eBioscience). Los glóbulos rojos se separaron utilizando tampón de lisis de RBC multiespecie según las instrucciones del fabricante (eBioscience). Las células T citotóxicas se identificaron como células CD45+CD3+CD8a+. Los datos de las células se adquirieron usando un Gallios (Beckman Coulter) y se analizaron usando el software Flow Jo. Los resultados se presentan en la Figura 5.
[0208] Ejemplo 4 - Síntesis de conjugados de biotina-gemcitabina (Biotina-Gem) y biotina-gemcitabina-rosa de Bengala (Biotina-Gem-RB)
[0209] 4.1 Síntesis de gemcitabina biotinilada (Biotina-GEM):
[0210] La gemcitabina biotinilada se sintetizó según el esquema 2. El protocolo se proporciona a continuación.
[0213]
[0215] Esquema 2: Esquema sintético para la preparación de Biotina-Gem
[0216] Síntesis de carbonato de (2R,3R,5R)-5- (4-amino-2-oxopirimidin-1(2H)-il) -4,4-difluoro-3 hidroxitetrahidrofuran-2-il)metilo y (2-(5-(2-oxohexahidro-1H-tieno [3,4-d] imidazol-4-il)pentanamido)etilo) (4):
[0217] El compuesto2se preparó siguiendo un procedimiento de la bibliografía (véase McEwan et al.Biomaterials.
[0218] 2016: 80, 20-32). A una solución en DCM (10 ml) de2(0,28 g, 0,9 mmol), se añadieron cloroformiato de 4-nitrofenilo (0,59 g, 2,9 mmol), DIPEA (0,50 g, 3,9 mmol) y una cantidad catalítica de piridina a 0°C y se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. Después, la mezcla de reacción se concentró a sequedad al vacío. El residuo bruto que contenía3se disolvió en 20 ml de DMF. A esta solución, se añadieron gemcitabina (0,88 g, 2,9 mmol) en DMF (5 ml) y TEA (1 ml) y la mezcla se agitó durante 24 h más. Una vez completada la reacción (vigilada por TLC), se añadió éter dietílico en exceso (200 ml) a la mezcla de reacción y se agitó durante 45 min. El aceite amarillento así obtenido se separó y se lavó tres veces con éter dietílico frío (50 ml x 3). El compuesto bruto se purificó por PTLC usando DCM/MeOH (9:1) como eluyente para proporcionar el compuesto objetivo4(0,12 g, 22% de rendimiento).
[0219] RMN<1>H (DMSO-d<6>): δ 7,99-7,91 (m, 3H, CH, NH<2>), 6,41-6,33 (m, 1H, CH), 6,12-6,01 (m, 3H, CH, NH X 2), 4,30-4,16 (m, 1H, CH), 4,19-4,12 (m, 3H, CH, CH<2>), 3,90-3,75 (m, 2H, CH<2>), 3,69-3,58 (m, 2H, CH<2>), 3,12-3,09 (m, 1H, CH), 2,93-2,88 (m, 2H, CH<2>), 2,83 (brs, 1H, OH), 2,82-2,77 (m, 2H, CH X2), 2,72 (brs, 1H, NH), 2,49-2,04 (m, 2H, CH<2>), 1,49-1,28 (m, 6H, CH<2>X 3).
[0220] RMN<13>C (DMSO-d<6>): 175,0 (C=O), 166,3 (C), 165,5 (C=O), 156,3 (C=O), 156,1 (C=O), 141,3 (CH), 125,3 (C), 95,2 (CH), 79,2 (CH), 67,2 (CH), 61,9(CH), 60,2 (OCH<2>), 55,5 (OCH<2>), 39,6 (CH), 37,8 (CH<2>), 35,2 (CH), 28,3 (CH<2>), 28,0 (CH<2>),
[0221] 25,3 (CH<2>). ESI-MS: calculado para C<22>H<30>F<2>N<6>O<8>S, 576,18; encontrado 577,2 (M H).
[0222] 4.2 Síntesis de biotina-Gem-RB:
[0223] La biotina-Gem-RB se sintetizó según el esquema 3. Los protocolos para cada compuesto intermedio se proporcionan a continuación.
[0226]
[0228] Esquema 3: Esquema sintético para la preparación de Biotina-Gem-RB
[0229] Síntesis de N-(2-(bis(2-aminoetil)amino)etil)-5-(2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamida(3):
[0230] A una solución agitada de biotina-NHS (0,5 g, 1,5 mmol) y TEA (cantidad catalítica) en DMF anhidra (10 ml), se añadió una solución de tris(2-aminoetil)amina (0,22 g, 1,5 mmol) en 5 ml de DMF. La mezcla de reacción se agitó a 0°C en atmósfera de argón. Después de 2 h de agitación, se añadió otro volumen de TEA (cantidad catalítica) y la mezcla de reacción se dejó agitar durante una noche a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción (por TLC), se separó el exceso de DMF a presión reducida manteniendo la temperatura por debajo de 45°C y el líquido gomoso blanco así obtenido se vertió en éter dietílico en exceso (200 ml) y se filtró. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice básica (TEA) (MeOH: DCM 1:9 a 3:7) para dar3(0,33 g, rendimiento de 61%) en forma de un semisólido blanco.
[0231] RMN<1>H (DMSO-d<6>): δ 7,94 (brs, 1H, NH), 6,42 (brs, 1H, NH), 6,35 (brs, 1H, NH), 4,49 (brs, 4H, NH<2>X 2), 4,29 (s, 1H, CH), 4,12 (s, 1H, CH), 3,07-3,02 (m, 6H, CH<2>X 3), 2,88-2,82 (m, 1H, CH), 2,44-2,06 (m, 10H, CH<2>X 5), 1,59-1,48 (m, 4H, CH<2>X 2), 1,47-1,29 (m, 2H, CH<2>).
[0232] ESI-MS: calculado para C<16>H<32>N<6>O<2>S, 372,23; encontrado 373,31 (M H).
[0233] Síntesis de 8,8'-(((2-(5-(2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamido)etil)azanodiil)bis(etano-2,1-diil))bis(azanodiil))bis(8-oxooctanoato) de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ilo)(5):
[0234] El compuesto3(0,5 g, 1,3 mmol) se disolvió en 10 ml de DMF anhidra en presencia de TEA (cantidad catalítica) y se añadió octanodioato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ilo) (4, 1 g, 2,7 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 h en atmósfera de argón. Una vez completada la reacción (por TLC), se añadió éter dietílico en exceso (200 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado blanco así obtenido se filtró y se lavó tres veces con éter dietílico frío (50 ml x 3). El producto bruto se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice básica (TEA) (MeOH: CHCl<3>2:8 a 5:5 v/v) para dar5(0,83 g, rendimiento de 71%) en forma de un sólido blanco de bajo punto de fusión.
[0235] RMN<1>H (DMSO-d<6>): δ 7,94 (brs, 2H, NH X 2), 7,67 (brs, 1H, NH), 6,41 (brs, 1H, NH), 6,34 (brs, 1H, NH), 4,29 (s, 1H, CH), 4,12 (s, 1H, CH), 3,06-3,04 (m, 3H, CH y CH<2>), 2,88-2,72 (m, 6H, CH<2>X 3), 2,71-2,63 (m, 8H, CH<2>X 4), 2,45-2,34 (m, 6H, CH<2>X 3), 2,20-2,06 (m, 10H, CH<2>X 5), 1,60-1,21 (m, 22H, CH<2>X 11).
[0236] RMN<13>C (DMSO-d<6>): 172,5 (C=O), 170,7 (C=O), 163,1 (C=O), 162,7 (C=O), 61,4 (CH), 59,6 (CH), 55,8 (CH<2>), 53,9 (NCH<2>), 39,9 (CH<2>), 39,8 (CH<2>), 39,6 (CH<2>), 37,3 (CH<2>), 36,2 (CH<2>), 35,6 (CH<2>), 31,2 (CH<2>), 28,7 (CH<2>), 28,5 (CH<2>), 25,8 (CH<2>), 25,7 (CH<2>), 25,6 (CH<2>).
[0237] ESI-MS: calculado para C<40>H<62>N<8>O<12>S, 878,4; encontrado 901,3 (sal M Na).
[0238] Síntesis de 4,11,19-trioxo-15-(2-(5-(2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamido)etil)-1-((2,3,4,5-tetracloro-6-(6-hidroxi-2,4,5,7-tetrayodo-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoil)oxi)-3,12,15,18-tetraazahexacosan-26-oato de ((2R, 3R, 5R)-5-(4-amino-2-oxopirimidin-1(2H)-il)-4,4-difluoro-3-hidroxitetrahidrofuran-2-il)metilo (9): A una solución en DMF (anhidra, 10 ml) de5(0,4 g, 0,45 mmol) se añadieron hidrocloruro de GMC (8, 0,136 g, 0,45 mmol) y TEA (0,5 ml) a 0°C y se agitó durante 24 h a temperatura ambiente en atmósfera de argón. Una vez completada la reacción (vigilada por GC-MS), se añadieron la amina rosa de Bengala7(preparada según McEwan et al.J. Control Release. 2015; 203, 51-56), (0,43 g, 0,45 mmol en DMF (5 ml)) y TEA (0,5 ml) a la mezcla de reacción y se continuó agitando durante 24 h. El progreso de la reacción se vigiló por análisis de espectrometría de masas de la mezcla de reacción bruta. Una vez completada la reacción, se añadió éter dietílico en exceso (200 ml) a la solución y se agitó durante 30 min. El precipitado rojo rosado así obtenido se filtró y se lavó varias veces con éter dietílico frío (100 ml), acetato de etilo (100 ml), mezcla de acetona-agua (10%, v/v, 100 ml) y finalmente con una mezcla de acetato de etilo-hexano (50%, v/v, 100 ml) respectivamente para proporcionar un polvo rojo rosado del compuesto9(0,26 g, rendimiento de 30%).
[0239] RMN<1>H (DMSO-d<6>): δ 7,95 (brs, 2H, NH<2>), 7,69 (s, 1H, CH, protón aromático), 7,68 (s, 1H, CH, protón aromático), 7,37 (s, 1H, CH), 7,32 (brs, 4H, NH X 4), 6,89 (s, 1H, CH), 6,42 (brs, 1H, NH), 6,35 (brs, 1H, NH), 6,22 (d,J=5,5 Hz, 1H, CH), 6,13 (brs, 1H, NH), 5,78-5,77 (m, 1H, CH), 5,19 (s, 1H, CH X 2), 4,9 (brs, 1H, OH), 4,30 (s, 2H, -OCH<2>), 4,13 (s, 2H, -OCH<2>), 3,79-3,60 (m, 3H, CH, CH<2>), 3,39-3,32 (m, 2H, CH<2>), 3,07 (brs, 6H, N-NHCH2X 3), 2,94-2,84 (m, 6H, NCH<2>X 3), 2,81 (brs, 1H, OH), 2,45-2,46 (m, 3H, CH, CH<2>), 2,17-2,06 (m, 10H, CH<2>X 5), 1,60-1,10 (m, 22H, CH<2>X 11).
[0240] RMN<13>C (DMSO-d<6>): 171,8 (C=O, C), 165,98 (C=O), 163,2 (C=O), 162,7 (C=O), 159,3 (CH), 155,0 (C=O), 150,5 (C), 145,8 (C), 141,2 (CH), 131,0 (C), 128,7 (C), 123,5 (C), 116,2 (C), 95,0 (CH), 80,9 (C), 69,3 (CH), 61,5 (C), 59,6 (CH<2>), 59,4 (CH), 55,8 (CH), 51,7 (CH<2>), 45,8 (CH<2>), 40,2 (CH<2>), 37,3 (CH<2>), 37,05 (CH<2>), 36,2 (CH<2>), 35,5 (CH<2>), 31,0 (CH<2>), 28,7 (CH<2>), 28,5 (CH<2>), 28,2 (CH<2>), 25,6 (CH<2>). ESI-MS: calculado para C<63>H<72>Cl<4>F<2>I<4>N<10>O<15>S, 1925.98; encontrado 1925.90 (M -H).
[0241] Ejemplo 5 - Preparación de microburbujas (MB) cargadas con paclitaxel (PTX) funcionalizadas con avidina 5.1 Preparación de MB estabilizadas con lípidos con PTX incorporado en la cubierta (PTX-MB):
[0242] Las microburbujas estabilizadas con lípidos funcionalizadas con avidina con PTX incorporado hidrofóbicamente en la cubierta se prepararon disolviendo primero los lípidos 1,2-dibehenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DBPC) (4,0 mg, 4,43 μmol), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG(2000)) (1,35 mg, 0,481 µmol) y DSPE-PEG (2000)-biotina (1,45 mg, 0,481 µmol) en cloroformo para lograr una relación molar de 82:9:9. A esta solución se añadió paclitaxel (5 mg, 5,86 µmol) disuelto en cloroformo. La solución se calentó a 40°C durante 30 minutos hasta que el cloroformo se había evaporado. La película lipídica seca se reconstituyó en 3 ml de solución de Ungers (PBS, glicerol, propilenglicol (relación en volumen 8:1:1)) y se calentó en un baño de agua a 75°C durante 30 minutos. La suspensión luego se trató con ultrasonidos usando un disruptor celular ultrasónico Microson a una amplitud de 22% durante 1 minuto para incorporar completamente los lípidos con paclitaxel. La suspensión después se burbujeó con PFB gaseoso mientras se trataba con ultrasonidos la suspensión a una amplitud de 89% durante 1 min para formar la suspensión de microburbujas. Después las MB se enfriaron en hielo durante 10 minutos seguido de centrifugación a 700 rpm durante 5 min para eliminar el exceso de lípidos/paclitaxel presente en el líquido por debajo de la torta de burbujas. La torta después se lavó con 2 ml de solución de Ungers, seguido de la adición de una solución acuosa de avidina (500 µl, 2,5 mg/ml). La suspensión después se agitó durante 5 min seguido de centrifugación (700 rpm) para eliminar el exceso de avidina. La torta de MB después se lavó de nuevo con 2 ml de solución de Ungers, se centrifugó (700 rpm) y se aislaron las MB.
[0243] 5.2 Carga de biotina-RB, Biotina-Gem y biotina-Gem-RB en la superficie de PTX-MB funcionalizadas con avidina:
[0244] Una solución que contenía biotina-RB, Biotina-Gem o biotina-Gem-RB (500 µl, 5 mg/ml), preparada en DMSO: solución de Ungers (10:90 v/v) se añadió a 2 ml de PTX-MB (2,0 x 10<8>MB/ml). La suspensión después se mezcló durante 5 min usando un agitador rotatorio seguido de centrifugación (700 rpm) durante 5 min para eliminar el exceso de ligando. Este procedimiento de acoplamiento se repitió una vez más. La torta de microburbujas final se suspendió en 2 ml de solución de Ungers. Las microburbujas se usaron directamente o se oxigenaron burbujeando la suspensión con oxígeno gaseoso durante 2 min inmediatamente antes de usar. Ejemplo 6 - Preparación de PTX-MB funcionalizadas con avidina que llevan biotina-RB, biotina-Gem y biotina-Gem-RB
[0245] 6.1. Carga de biotina-RB, Biotina-Gem y biotina-Gem-RB en la superficie de PTX-MB funcionalizadas con avidina:
[0246] Se añadió una solución acuosa saturada que contenía biotina-RB, biotina-Gem o biotina-Gem-RB (1 ml, 5 mg/ml) a 2 ml de PTX-MB o MB sin PTX (6,72 x 10<8>MB/ml). La suspensión se mezcló durante 5 minutos (0°C) seguido de centrifugación (700 rpm) durante 3 min para eliminar el exceso de ligando. La torta de MB después se lavó 3 veces más con solución de PBS. La torta de microburbujas final se suspendió en 2 ml de solución de PBS. Las microburbujas se usaron directamente o se oxigenaron burbujeando la suspensión con oxígeno gaseoso durante 2 min inmediatamente antes de usar. El número final de microburbujas se determinó en un hemocitómetro usando un microscopio óptico. En la figura 6 se muestra una representación esquemática del PTX/GEM/RB-MB.
[0247] Ejemplo 7 - Preparación de microburbujas (MB) cargadas con paclitaxel (PTX) que llevan conjugados de biotina-doxorrubicina (Biotina-Dox) o biotina-rosa de Bengala (biotina-RB)
[0248] 7.1 Reactivos y materiales:
[0249] La 1,2-dibehenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DBPC) y la 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG(2000)) y DSPE-PEG(2000)-biotina se adquirieron de Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, EE. UU.). El oxígeno gaseoso se adquirió de BOC Industrial Gases Reino Unido y el perfluorobutano (PFB) se adquirió de Apollo Scientific Ltd. La solución salina tamponada con fosfato (PBS) se adquirió de Gibco, Life Technologies, Reino Unido. El glicerol y el propilenglicol (1 kg, hidrolizado) se adquirieron de Sigma Aldrich (Reino Unido). Las imágenes del microscopio óptico se obtuvieron usando un microscopio óptico Leica DM500. La sal sódica de rosa de Bengala, NHS-biotina, gemcitabina, kit de ensayo MTT, avidina, ácido cloroacético, 4-dimetilaminopiridina (DMAP), hidroxibenzotriazol (HOBt),N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), dimetilformamida anhidra (DMF) y etanol se adquirieron de Sigma Aldrich (Reino Unido) en la calidad más alta posible. La biotina, el carbonato de di(N-succinimidilo) y el 2-aminoetanol se adquirieron de Tokyo Chemical Industry UK Ltd.
[0250] 7.2 Síntesis de Biotina-Dox:
[0251] La doxorrubicina biotinilada (Biotina-Dox)(3)se sintetizó según el esquema 4. El protocolo se proporciona a continuación.
[0252]
[0255] Esquema 4: Esquema sintético para la síntesis de Biotina-Dox
[0256] A una solución enfriada con hielo de éster N-hidroxisuccinimida de biotina (1, 0,14 g, 0,41 mmmol) en DMF (10 ml) se añadió doxorrubicina (2, 0,3 g, 0,41 mmol) en atmósfera de nitrógeno. Después de agitar durante 30 min, se añadió trietilamina (0,5 ml, 2 mmol) a esta mezcla de reacción y se dejó agitar durante otras 12 h a temperatura ambiente. La reacción se vigiló por TLC (Merck Silica 60, HF 254, metanol/diclorometano 20: 80 v/v). Una vez completada la reacción, se añadió éter dietílico en exceso (100 ml) a la mezcla de reacción. El sólido rojo así obtenido se filtró y se lavó tres veces con éter dietílico (50 ml X 3). Este sólido rojo se sometió después a purificación por PTLC usando metanol-diclorometano (20:80, v/v) como eluyente para obtener 0,25 g (rendimiento = 78%) de3. Se obtuvo una muestra analítica de una recristalización de este producto en etanol. RMN<1>H (DMSO-d<6>) δ :7,84 (d, J = 7,5 Hz, 2H, aromático), 7,58 (d, J = 7,5 Hz, 1H, aromático), 6,36 (s, 1H, NH), 6,29 (s, 1H, NH), 5,37 (brs, 1H, OH), 5,22 (brs, 1H, OH), 4,87 (s, 2H, -CH<2>-OH), 4,51 (brs, 2H, OH X 2), 4,36-4,33 (m, 1H, CH), 4,25-4,22 (m, 1H, CH), 4,16-4,13 (m, 1H, CH), 3,99 (s, 3H, OCH<3>), 3,60-3,58 (m, 1H, CH), 3,55 (brs, 2H, OH X2), 3,10-3,00 (m, 4H, CH<2>X1, CH X 2), 2,88-2,54 (m, 3H, CH<2>X 1, CH), 2,20-2,00 (m, 1H, CH), 1,63-1,50 (m, 4H, CH<2>X 2), 1,42-1,22 (m, 11H, CH<3>X 1, CH<2>X 4). RMN<13>C (DMSO-d<6>): 177,6, 176,9, 174,8, 166,4, 163,0, 161,2, 153,7, 152,7, 137,4, 132,4, 120,4, 119,4, 99,5, 97,8, 80,15, 75,1, 72,7, 66,4, 61,4, 59,5, 55,7, 47,8, 33,8, 31,9, 28,9, 28,8, 28,5, 28,4, 24,9, 19,8, 17,6, 17,1. ESMS (M-H]: calculado para C<37>H<43>I<2>N<3>O<13>S = 769,25, encontrado = 767,9.
[0257] 7.3 Preparación de microburbujas que llevan oxígeno cargadas con PTX en la cubierta y con biotina-DOX o biotina-RB unida a la superficie de la MB:
[0258] Se prepararon microburbujas estabilizadas con lípidos funcionalizadas con avidina con PTX incorporado hidrofóbicamente en la cubierta disolviendo 1,2-dibehenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DBPC) (4,0 mg, 4,44 umol), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DSPE-PEG(2000)) (1,35 mg, 0,481 umol) y DSPE-PEG (2000)-biotina (1,45 mg, 0,481 umol) en cloroformo para lograr una relación molar de 82:9:9. A esta solución se añadió paclitaxel (5 mg, 5,86 µmol) disuelto en cloroformo (100 ul). El disolvente se separó al vacío a temperatura ambiente dando una película translúcida. La película lipídica seca se reconstituyó en 2 ml de una solución que contenía PBS, glicerol y propilenglicol (relación en volumen 8:1:1) y se calentó en un baño de agua a 80°C durante 30 minutos. La suspensión después se trató con ultrasonidos usando un disruptor celular ultrasónico Microson a una amplitud de 22% durante 30 segundos para suspender completamente el paclitaxel. La suspensión después se burbujeó con PFB gaseoso mientras se trataba con ultrasonidos la suspensión a una amplitud de 89% durante 1 minuto para formar las microburbujas. Después las MB se enfriaron en hielo durante 10 minutos, seguido de centrifugación a 700 rpm durante 3 min y eliminación del líquido subnadante para eliminar el exceso de lípidos/paclitaxel. La torta después se lavó 2 veces más antes de añadir una solución acuosa de avidina (10 mg/ml). La suspensión después se agitó durante 5 min (0ºC) seguido de centrifugación (700 rpm) para eliminar la avidina no unida. La torta de MB después se lavó de nuevo y se suspendió en solución de PBS. Se añadió una solución acuosa saturada que contenía biotina-Dox o biotina-RB (1 ml, 5 mg/ml) a 2 ml de PTX-MB (7,52 x 10<8>MB/ml). La suspensión se mezcló durante 5 minutos (0°C) seguido de centrifugación (700 rpm) durante 3 minutos para eliminar el exceso de ligando. La torta de MB después se lavó 3 veces más con solución de PBS. La torta de microburbujas final se suspendió en 2 ml de solución de PBS. Las microburbujas se oxigenaron burbujeando la suspensión con oxígeno gaseoso durante 2 min inmediatamente antes de usar. El número final de microburbujas se determinó en un hemocitómetro usando un microscopio óptico. La figura 7 es una representación esquemática de a) O<2>MB-PTX/DOX y b) O<2>MB- PTX/RB.
[0260] Ejemplo 8 - Preparación del conjugado de biotina-doxorrubicina-rosa de Bengala
[0262] Se sintetizó un conjugado trípode de biotina-doxorrubicina-rosa de Bengala (biotina-Dox-RB) según el esquema 5:
[0263]
[0265] Esquema 5: Esquema sintético para la preparación de Biotina-Dox-RB
[0266] 8.1 Síntesis de N-(2-(bis(2-aminoetil)amino)etil)-5-(2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamida (3):
[0267] A una solución agitada de biotina-NHS (0,5 g, 1,5 mmol) y TEA (cantidad catalítica) en DMF anhidra (10 ml), se añadió una solución de tris(2-aminoetil)amina (0,22 g, 1,5 mmol) en 5 ml de DMF. La mezcla de reacción se agitó a 0°C en atmósfera de argón. Después de 2 h de agitación, se añadió otro volumen de TEA (cantidad catalítica) y la mezcla de reacción se dejó agitar durante una noche a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción (por TLC), se separó el exceso de DMF a presión reducida manteniendo la temperatura por debajo de 45°C y el líquido gomoso blanco así obtenido se vertió en éter dietílico en exceso (200 ml) y se filtró. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice básica (TEA) (MeOH: DCM 1:9 a 3:7) para dar3(0,33 g, rendimiento del 61%) en forma de un semisólido blanco.
[0268] RMN<1>H (DMSO-d<6>): δ 7,94 (brs, 1H, NH), 6,42 (brs, 1H, NH), 6,35 (brs, 1H, NH), 4,49 (brs, 4H, NH<2>X 2), 4,29 (s, 1H, CH), 4,12 (s, 1H, CH), 3,07-3,02 (m, 6H, CH<2>X 3), 2,88-2,82 (m, 1H, CH), 2,44-2,06 (m, 10H, CH<2>X 5), 1,59-1,48 (m, 4H, CH<2>X 2), 1,47-1,29 (m, 2H, CH<2>), ESI-MS: calculado para C<16>H<32>N<6>O<2>S, 372,23; encontrado 373,31 (M H).
[0269] 8.2 Síntesis de 8,8'-((((2-(5-(2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamido)etil)azanodiil)bis(etano-2,1-diil))bis(azanodiil))bis(8-oxooctanoato) de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ilo)(5):
[0270] El compuesto3(0,5 g, 1,3 mmol) se disolvió en 10 ml de DMF anhidra en presencia de TEA (cantidad catalítica) y se le añadió octanodioato de bis(2,5-dioxopirrolidin-1-ilo) (4, 1 g, 2,7 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 h en atmósfera de argón. Una vez completada la reacción (por TLC), se añadió éter dietílico en exceso (200 ml) a la mezcla de reacción. El precipitado blanco así obtenido se filtró y se lavó tres veces con éter dietílico frío (50 ml x 3). El producto bruto se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice básica (TEA) (MeOH: CHCl<3>2:8 a 5:5 v/v) para dar5(0,83 g, rendimiento de 71%) en forma de un sólido blanco de bajo punto de fusión.
[0271] RMN<1>H (DMSO-d<6>): δ 7,94 (brs, 2H, NH X 2), 7,67 (brs, 1H, NH), 6,41 (brs, 1H, NH), 6,34 (brs, 1H, NH), 4,29 (s, 1H, CH), 4,12 (s, 1H, CH), 3,06-3,04 (m, 3H, CH y CH<2>), 2,88-2,72 (m, 6H, CH<2>X 3), 2,71-2,63 (m, 8H, CH<2>X 4), 2,45-2,34 (m, 6H, CH<2>X 3), 2,20-2,06 (m, 10H, CH<2>X 5), 1,60-1,21 (m, 22H, CH<2>X 11). RMN<13>C (DMSO-d<6>): 172,5 (C=O), 170,7 (C=O), 163,1 (C=O), 162,7 (C=O), 61,4 (CH), 59,6 (CH), 55,8 (CH<2>), 53,9 (NCH<2>), 39,9 (CH<2>), 39,8 (CH<2>), 39,6 (CH<2>), 37,3 (CH<2>), 36,2 (CH<2>), 35,6 (CH<2>), 31,2 (CH<2>), 28,7 (CH<2>), 28,5 (CH<2>), 25,8 (CH<2>), 25,7 (CH<2>), 25,6 (CH<2>). ESI-MS: calculado para C<40>H<62>N<8>O<12>S, 878,4; encontrado 901,3 (Sal M Na).
[0272] 8.3 Síntesis de 2,3,4,5-tetracloro-6-(6-hidroxi-2,4,5,7-tetrayodo-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato de 26-(((2S,3S,4S,6R)-3-hidroxi-2-metil-6-(((1S,3S)-3,5,12-trihidroxi-3-(2-hidroxiacetil)-10-metoxi-6,11-dioxo-1,2,3,4,6,11-hexahidrotetracen-1-il)oxi)tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4,11,19,26-tetraoxo-15-(2-(5-(2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamido)etil)-3,12,15,18-tetraazahexacosilo(9):
[0273] A una solución en DMF (anhidra, 10 ml) de5(0,4 g, 0,45 mmol) se añadieron hidrocloruro de doxorrubicina (8, 0,26 g, 0,45 mmol) y TEA (0,5 ml) a 0°C y se agitó durante 24 h a temperatura ambiente en atmósfera de argón. Una vez completada la reacción (vigilada por GC-MS), se añadieron la amina de rosa de Bengala7(preparada por separado según el procedimiento de la bibliografía), 0,46 g, 0,45 mmol} en DMF (5 ml) y TEA (0,5 ml) a la mezcla de reacción y se continuó agitando durante 24 h. El progreso de la reacción se vigiló por análisis de GC-MS de la mezcla de reacción bruta. Una vez completada la reacción, se añadió éter dietílico en exceso (200 ml) a la solución y se agitó durante 30 min. El precipitado rojo oscuro así obtenido se filtró y se lavó varias veces con éter dietílico frío (100 ml), acetato de etilo (100 ml), mezcla de acetona-agua (10%, v/v, 100 ml) y finalmente con mezcla de acetato de etilo-hexano (50%, v/v, 100 ml) respectivamente para proporcionar un polvo rojo del compuesto9(0,28 g, rendimiento de 28%).
[0274] RMN<1>H (DMSO-d<6>): 7,93 (s, 2H, Ar-CH), 7,90-7,85 (m, 2H, Ar-CH), 7,66 (brs, 5H, NH), 7,45 (s, 1H, 6,39 (brs, 1H, NH), 6,33 (brs, 1H, NH), 5,41-5,39 (m, 1H, CH), 5,19-5,18 (m, 4H, -CH<2>X 2), 4,93-4,71 (m, 3H, CH X 3), 4,55 (s, 3H, -OCH<3>), 4,27-3,90 (m, 4H, CH X 4), 3,04-2,97 (m, 8H, CH<2>X 4), 2,80-2,77 (m, 2H, CH<2>), 2,48-2,43 (m, 8H, CH<2>X 4), 2,03 (brs, 12H, CH<2>X 6), 1,43 (brs, 12H, CH<2>X 6), 1,14-1,11 (m, 13H, CH<2>X 5, CH<3>X 1). RMN<13>C (DMSO-d<6>): 220,1, 177,3, 172,5, 172,2, 171,5, 168,9, 163,2, 162,7, 157,3, 156,6, 154,6, 153,7, 150,3, 138,5, 136,5, 135,6, 133,0, 110,7, 101,9, 97,6, 96,3, 89,2, 79,3, 76,7, 66,8, 63,5, 61,4, 60,5, 59,6, 57,5, 55,8, 53,9, 51,9, 40,4, 40,2, 37,4, 36,5, 36,2, 35,6, 31,2, 28,7, 28,4, 28,3, 25,7.
[0275] ESI-MS: calculado para C<81>H<90>Cl<4>I<4>N<8>O<22>S, 2209,12; encontrado 2208,02 (M -H).
[0276] Ejemplo 9 - Método alternativo para la síntesis del conjugado de Biotina-Gemcitabina-Rosa de bengala Se sintetizó un conjugado de biotina-gemcitabina-rosa de Bengala (Biotina-Gem-RB) según el esquema 6:
[0277]
[0280] Esquema 6: Esquema sintético para la preparación de Biotina-Gem-RB
[0281] 9.1 Síntesis de N-(2-(bis(2-aminoetil)amino)etil)-5-(2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamida (3):
[0282] El compuesto3se sintetizó según el procedimiento descrito en el ejemplo 1.
[0283] 9.2 Síntesis del ácido 7-(((((2R,3R,5R)-5-(4-amino-2-oxopirimidin-1(2H)-il)-4,4-difluoro-3-hidroxitetrahidrofuran-2-il)metoxi)carbonil)oxi)heptanoico (6):
[0284] A una solución en DCM (10 ml) de4(1 g, 4,6 mmol), se añadieron cloroformiato de 4-nitrofenilo (2,79 g, 13,8 mmol), DIPEA (2,38 g, 18,4 mmol) y una cantidad catalítica de piridina a 0°C y se agitó durante 5 h a temperatura ambiente. Después, la mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo bruto se disolvió en DMF (10 ml). A esta solución, se añadieron hidrocloruro de GMC (4,1 g, 13,8 mmol) en DMF (5 ml) y TEA (2 ml) y se continuó agitando durante 24 h. El progreso de la reacción se vigiló por análisis de GC-MS de la mezcla de reacción bruta. Una vez completada la reacción, se añadió éter dietílico en exceso (200 ml) a la mezcla de reacción. El aceite amarillento así obtenido se separó y se purificó por cromatografía ultrarrápida usando MeOH/CHCl<3>(5%, v/v) como eluyente. El compuesto6se aisló en forma de un líquido amarillo pegajoso. (1,5 g, rendimiento = 64,3%).
[0285] RMN<1>H (DMSO-d<6>): δ 10,5 (brs, 1H, -COOH), 7,63 (d, J = 7,5 Hz, 1H, -CH), 7,41 (brs, 2H, -NH<2>), 6,20 (d, J = 7,5 Hz, 1H, -CH), 5,18 (brs, 1H, -CH), 3,71-3,55 (m, 5H, -CH<2>X2, -CHX1), 2,36 (brs, 2H, -CH<2>), 1,23-1,17 (m, 18H, -CH<2>X 9). RMN<13>C (DMSO-d<6>): 172,1, 166,0, 155,1, 154,9, 153,6, 123,5, 95,2, 95,0, 80,8, 69,1, 68,8, 33,6, 29,4, 29,3, 29,2, 28,9, 28,8, 25,5, 25,4,
[0286] ESI-MS: calculado para C<22>H<33>F<2>N<3>O<8>, 504,2; encontrado 527,0 (Sal M Na).
[0287] 9.3 Síntesis de 2,3,4,5-tetracloro-6-(6-hidroxi-2,4,5,7-tetrayodo-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato de 1-((2R,3R,5R)-5-(4-amino-2-oxopirimidin-1(2H)-il)-4,4-difluoro-3-hidroxitetrahidrofuran-2-il)-3,16,24-trioxo-20-(2-(5-(2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamido)etil)-2,4-dioxa-17,20,23-triazahentriacontan-31-ilo(9):
[0288] Se añadieron EDCl, HCl (0,4 g, 2,0 mmol) y DIPEA (0,45 g, 3,5 mmol) a una solución del ácido6(0,34 g, 0,6 mmol), el compuesto3(0,25 g, 0,6 mmol) y HOBt (0,27 g, 2,0 mmol) en DMF anhidra (50 ml) y se agitó durante 24 h a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. El progreso de la reacción se vigiló por análisis de GC-MS de la mezcla de reacción bruta. Una vez completada la reacción, se añadió RB-ácido octanoico8(preparado según el procedimiento de la bibliografía, 0,8 g, 0,7 mmol) en 5 ml de DMF a la mezcla de reacción, seguido de una cantidad catalítica de DIPEA y se continuó agitando durante 24 h a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción, se añadió éter dietílico en exceso (200 ml) a la mezcla de reacción y se agitó durante 30 min. El precipitado rojo rosado así obtenido se filtró y se lavó varias veces con éter dietílico frío (100 ml), acetato de etilo (100 ml), mezcla de acetona-agua (10%, v/v, 100 ml) y finalmente con mezcla de acetato de etilo-hexano (50%, v/v, 100 ml) respectivamente para proporcionar un polvo rojo rosado del compuesto9(0,63 g, rendimiento de 45%).
[0289] RMN<1>H (DMSO-d<6>): δ 7,86 (s, 2H, Ar-CH), 7,73 (d, J = 7,0 Hz, 1H, CH), 7,39 (brs, 3H, NH X 3), 6,40-6,34 (m, 2H, NH X2), 6,03 (s, 1H, CH), 5,72 (d, J = 7,0 Hz, 1H, CH), 4,22 (s, 1H, CH), 4,05 (brs, 3H, CH<2>, CH X2), 3,86 (brs, 1H, OH), 3,81-3,50 (m, 6H, CH X 2, CH<2>X 2), 3,02-2,86 (m, 8H, CH<2>X 4), 2,80-2,00 (m, 12H, CH<2>X 6), 1,52-0,81 (m, 32H, CH<2>X 16).
[0290] RMN<13>C (DMSO-d<6>): 172,6, 171,6, 169,9, 168,9, 166,0, 163,2, 162,7, 155,1, 141,5, 141,1, 123,5, 98,9, 96,4, 95,0, 83,9, 80,8, 70,2, 69,1, 68,9, 68,7, 61,4, 59,6, 59,2, 54,2, 54,0, 48,9, 46,0, 38,0, 37,3, 36,1, 35,5, 31,1, 28,9, 28,6, 28,3, 25,7.
[0291] ESI-MS: calculado para C<66>H<79>Cl<4>F<2>I<4>N<9>O<15>S, 1955,03; encontrado 1956,5 (M+H).

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES
1. Un complejo microburbuja-sonosensibilizador para usar en el tratamiento de la enfermedad metastásica mediante terapia sonodinámica, en donde dicha terapia sonodinámica comprende el uso simultáneo, separado o secuencial de un inhibidor de punto de control inmunitario; y además, en donde dicho sonosensibilizador es el rosa de Bengala y dicho inhibidor de punto de control inmunitario es un inhibidor de PDL-1.
2. Un complejo para uso según la reivindicación 1, en donde dicho complejo microburbuja-sonosensibilizador comprende una microburbuja unida o asociada de otro modo a dicho sonosensibilizador mediante un enlace no covalente, p. ej., mediante una interacción biotina-avidina.
3. Un complejo para uso según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde dicho complejo microburbujasonosensibilizador comprende además al menos un agente quimioterapéutico, preferiblemente en donde el agente quimioterapéutico es un antimetabolito, p. ej., 5-fluorouracilo o gemcitabina.
4. Un complejo para uso según la reivindicación 3, en donde dicho complejo microburbuja-sonosensibilizador está unido o asociado de otro modo a dicho al menos un agente quimioterapéutico, preferiblemente mediante un enlace no covalente, p. ej., mediante una interacción biotina-avidina, y/o en donde la microburbuja comprende una cubierta que tiene incorporado en la misma un agente quimioterapéutico.
5. Un complejo para uso según la reivindicación 3 o reivindicación 4, en donde la microburbuja comprende una cubierta que tiene incorporado en la misma un agente quimioterapéutico adicional, preferiblemente en donde dicho agente quimioterapéutico adicional es un agente antimicrotúbulo, p. ej., un taxol tal como paclitaxel.
6. Un complejo para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha terapia sonodinámica comprende además el uso simultáneo, separado o secuencial de un complejo microburbujaagente quimioterapéutico, preferiblemente en donde dicho complejo microburbuja-agente quimioterapéutico comprende una microburbuja unida o asociada de otro modo a al menos un agente quimioterapéutico mediante un enlace no covalente, p. ej., mediante una interacción biotina-avidina, más preferiblemente en donde dicho agente quimioterapéutico es un antimetabolito, p. ej., 5-fluorouracilo o gemcitabina.
7. Un complejo para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la microburbuja comprende una cubierta que retiene un gas, preferiblemente oxígeno gaseoso; y/o en donde la microburbuja tiene un diámetro en el intervalo de 0,1 a 100 µm.
8. Un complejo para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la microburbuja tiene una cubierta que comprende uno o más fosfolípidos, cada uno unido opcionalmente a uno o más polímeros, p. ej., polietilenglicol (PEG).
9. Un complejo para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho inhibidor de punto de control inmunitario se selecciona del grupo que consiste en atezolizumab, avelumab, duravlumab y cualquier combinación de los mismos.
10. Un complejo para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho complejo se pone en contacto con células o tejidos de un sujeto (p. ej., un paciente humano) y, de forma simultánea o secuencial, dichas células o tejidos se someten a irradiación con ultrasonidos.
11. Un complejo para uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el tratamiento de metástasis derivadas de cáncer de mama, próstata o páncreas.
12. Un complejo para uso según la reivindicación 11, en el tratamiento del cáncer de páncreas metastásico.
13. Un producto que comprende un complejo microburbuja-sonosensibilizador como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y un inhibidor de punto de control inmunitario como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 9, para uso simultáneo, separado o secuencial en el tratamiento de la enfermedad metastásica mediante terapia sonodinámica.
14. Una composición farmacéutica que comprende un complejo microburbuja-sonosensibilizador como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un inhibidor de punto de control inmunitario como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 9, junto con al menos un vehículo o excipiente farmacéutico.
15. Una composición según la reivindicación 14, para usar en el tratamiento de la enfermedad metastásica mediante terapia sonodinámica.
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