ES3035233T3 - P-gp inducers as protectors against chemotherapy-induced side effects, such as peripheral neuropathy (cipn) and hair loss - Google Patents

P-gp inducers as protectors against chemotherapy-induced side effects, such as peripheral neuropathy (cipn) and hair loss

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ES3035233T3
ES3035233T3 ES20764628T ES20764628T ES3035233T3 ES 3035233 T3 ES3035233 T3 ES 3035233T3 ES 20764628 T ES20764628 T ES 20764628T ES 20764628 T ES20764628 T ES 20764628T ES 3035233 T3 ES3035233 T3 ES 3035233T3
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Abstract

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden un inductor de la P-gp, para uso tópico en la prevención de uno o más efectos secundarios de los quimioterapéuticos, los cuales son transportados fuera de las células por la P-gp. En particular, la neuropatía periférica inducida por quimioterapia (NIQI) es un efecto secundario relevante que debe tratarse/evitarse, ya que la NIQI puede ser un efecto secundario limitante de la dosis de la quimioterapia. La invención también se refiere a kits y al tratamiento del cáncer de un subgrupo de pacientes que han recibido pretratamiento tópico con un inductor de la P-gp. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inductores de P-GP como protectores frente a los efectos secundarios inducidos por la quimioterapia, tales como la neuropatía periférica (NPIQ) y la alopecia
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a composiciones que comprenden inductores de P-gp para la utilización en la protección frente a los efectos secundarios de la quimioterapia, tales como la neuropatía periférica inducida por quimioterapia (NPIQ), en donde el inductor se aplica tópicamente. La invención se refiere, además, al tratamiento mejorado de un subgrupo de pacientes de cáncer, quienes han sido pretratados tópicamente con un inductor de P-gp.
Antecedentes de la invención
Un efecto secundario conocido de muchos fármacos anticáncer citotóxicos es el desarrollo de neuropatía periférica inducida por quimioterapia (NPIQ). Entre los signos clínicos de la NPIQ se incluyen pérdida sensorial, parestesia, disestesia, entumecimiento y hormigueo, y frecuentemente conducen a dolor neuropático. Otro efecto secundario conocido es la pérdida de cabello (alopecia).
El paclitaxel es un fármaco anticáncer citotóxico utilizado en el tratamiento de tumores orgánicos sólidos, tales como el cáncer de mama y el cáncer de ovario. El paclitaxel también se utiliza en quimioterapia adyuvante y neoadyuvante. Aunque resulta eficaz, el paclitaxel provoca múltiples efectos secundarios en los pacientes. Una reacción adversa habitual y potencialmente grave al tratamiento con paclitaxel es la neuropatía periférica, que ocurre hasta en el 50 % de los pacientes. La NPIQ puede ser muy grave, pero incluso los síntomas leves a moderados pueden persistir durante varios años después de la interrupción del tratamiento, lo que afecta significativamente la calidad de vida. Debido a que se espera que más del 80 % de los pacientes de cáncer de mama sean sobrevivientes a largo plazo, esta reacción adversa grave y duradera resulta especialmente preocupante y de interés para la salud pública. Además, el éxito del tratamiento con paclitaxel está correlacionado con la dosis y la NPIQ es la principal razón para reducir la dosis; el desarrollo de NPIQ puede influir en las tasas de supervivencia de los pacientes de cáncer.
La pérdida de cabello (alopecia) es otro efecto secundario conocido del paclitaxel. Aunque presenta un impacto menor sobre el éxito del tratamiento, la alopecia supone un problema psicológico considerable para los pacientes y supervivientes de cáncer. La alopecia también es costosa para los profesionales sanitarios, ya que se necesitan pelucas para los pacientes.
Aunque se han descrito en mayor detalle para el paclitaxel, anteriormente, otros fármacos o grupos de fármacos también pueden inducir NPIQ y/o pérdida del cabello (alopecia), tales como otros taxanos (p. ej., el docetaxel), los alcaloides vinca (p. ej., la vincristina), las epotilonas (p. ej., la ixabepilona) y los inhibidores del proteasoma (p. ej., el bortezomib).
El documento n.° WO 2018/106107 A1 da a conocer el tratamiento de la neuropatía periférica inducida por quimioterapia (NPIQ) derivada de vincristina, el etopósido y el bortezomib mediante la aplicación tópica de fenitoína. De esta manera, el documento n.° WO 2018/106107 A1 se refiere al tratamiento de la NPIQ y no a la prevención de efectos secundarios producidos por quimioterapéuticos, tales como la NPIQ.
El documento n.° US 9005 678 B1 informa sobre la carbamazepina en combinación con oxaliplatino para reducir la NPIQ derivada del agente anticáncer. El documento n.° US 9005678 B1 no contiene ninguna enseñanza respecto a la aplicación tópica de un inductor de P-gp previamente a la administración de un quimioterapéutico.
El documento n.° WO 2017/165806 A1 se refiere al tratamiento de la NPIQ y no a la prevención de los efectos secundarios derivados de los quimioterapéuticos tales como la NPIQ. El documento n.° WO 2017/165806 A1 no contiene ninguna enseñanza respecto a la aplicación tópica de un inductor de P-gp previamente a la administración de un quimioterapéutico.
De esta manera, con el fin de aumentar la calidad de vida y mejorar los resultados del tratamiento entre los pacientes tratados con determinados fármacos anticáncer citotóxicos, se necesitan métodos para prevenir o reducir los efectos secundarios.
Por lo tanto, resultaría ventajoso contar con métodos mejorados para prevenir y/o reducir los efectos secundarios de la quimioterapia (tales como la NPIQ), y en particular, resultaría ventajoso un régimen de tratamiento más eficiente y/o fiable para prevenir la NPIQ o la alopecia.
Descripción resumida de la invención
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones no comprendidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención. Cualesquiera referencias en la descripción a métodos de tratamiento se refieren a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para la utilización en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.
La presente invención se refiere al hallazgo de que la aplicación dérmica/tópica de un fármaco que induce la P-gp puede prevenir los efectos secundarios de los quimioterapéuticos que son transportados al exterior de las células por P-gp si se aplica antes de iniciar el tratamiento quimioterapéutico.
Por ejemplo, la presente invención describe que la aplicación tópica (preferentemente en las manos y pies de un sujeto) de un fármaco que induce P-gp en las neuronas sensoriales puede prevenir la NPIQ si se aplica antes de que se inicie un tratamiento quimioterapéutico.
De manera similar, la presente invención da a conocer que la aplicación tópica (preferentemente en el cuero cabelludo, las cejas, etc.) de un fármaco que induce P-gp puede prevenir la alopecia si se aplica antes de que se inicie un tratamiento quimioterapéutico.
La aplicación del inductor de P-gp previene la acumulación de quimioterapéuticos en las células cercanas a la superficie de la piel (tales como las neuronas sensoriales y los folículos pilosos) mediante el incremento del transporte de la quimioterapia al exterior de las células y, por lo tanto, protege frente al daño celular local. Este enfoque se puede utilizar para quimioterapéuticos (p. ej., vincristina, bortezomib e ixabepilona) que son transportados al exterior de las células por P-gp y que pueden causar, p. ej., neurotoxicidad periférica o alopecia.
La inducción sistémica de P-gp no resulta deseable, ya que conduciría a la protección de los tumores frente a los fármacos quimioterapéuticos. Sin embargo, la inducción local (p. ej., mediante aplicación tópica) presenta un nuevo mecanismo para reducir la acumulación de quimioterapéuticos en, p. ej., neuronas sensoriales y folículos pilosos que resultan dañados por la quimioterapia.
El Ejemplo 1 muestra que el quimioterapéutico paclitaxel afecta la morfología neuronal.
El Ejemplo 2 muestra que la inhibición de P-gp aumenta las concentraciones intracelulares de paclitaxel (el efecto contrario al de la presente invención, en la que se utiliza un inductor).
El Ejemplo 3 muestra que los inhibidores de P-gp causan un riesgo incrementado de neuropatía periférica entre los pacientes tratados con paclitaxel.
El Ejemplo 4 muestra que la inducción de P-gp y MRP1 con rifampicina protege a las células de la NPIQ inducida por el paclitaxel, confirmando de esta manera el efecto deseado de la presente invención.
El Ejemplo 5 muestra que la inhibición del transportador de eflujo MRP1 conduce a una neurotoxicidad sustancialmente incrementada del quimioterapéutico vincristina (efecto contrario al de la presente invención, en la que se utiliza un inductor).
El Ejemplo 6 muestra que la inducción de P-gp y MRP1 con rifampicina protege a las células de la NPIQ inducida por la vincristina, confirmando de esta manera el efecto deseado de la presente invención.
El Ejemplo 7 muestra que el tratamiento con paclitaxel conduce a un aumento en la expresión de receptores del dolor y factores de estrés en las células, y que esta respuesta se alivia en las células pretratadas con rifampicina.
El Ejemplo 8 muestra que el pretratamiento con rifampicina conduce a una menor acumulación intracelular de paclitaxel.
El Ejemplo 9 muestra que los fármacos que se unen y activan PXR (ejemplificados por la carbamazepina y la dexametasona) incrementan la expresión de P-gp en las neuronas sensoriales que se originan a partir de células madre pluripotentes inducidas.
El Ejemplo 10 muestra que la rifampicina también incrementa la expresión de P-gp en otras células del sistema nervioso periférico, es decir, los precursores de células de Schwann derivados de células madre pluripotentes inducidas.
En resumen, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden un inductor de P-gp para uso tópico en la prevención de uno o más efectos secundarios de los quimioterapéuticos, los cuales son transportados al exterior de las células por P-gp.
En particular, la NPIQ es un efecto secundario relevante a tratar/evitar, ya que puede ser un efecto secundario limitante de la dosis de la quimioterapia. La invención se refiere, además, a kits y al tratamiento del cáncer de un subgrupo de pacientes, el cual ha sido pretratado tópicamente con un inductor de P-gp.
De esta manera, un objetivo de la presente invención se refiere a la provisión de un tratamiento/prevención/reducción mejorado de la NPIQ.
Otro objetivo de la presente invención se refiere a la provisión de un tratamiento/prevención/reducción mejorado de la alopecia.
Un objetivo adicional se refiere a un método mejorado para prevenir uno o más efectos secundarios de un quimioterapéutico y/o para reducir el riesgo de que se produzca uno o más efectos secundarios de un quimioterapéutico y/o para reducir la gravedad de uno o más efectos secundarios de un quimioterapéutico y/o para incrementar la tolerabilidad a un quimioterapéutico y/o para eliminar efectos secundarios limitantes de la dosis de un quimioterapéutico en un sujeto.
En particular, es un objetivo de la presente invención proporcionar un régimen de tratamiento/prevención que minimice el riesgo de desarrollar NPIQ o que reduzca los efectos secundarios de la NPIQ.
Un objeto adicional se refiere a la provisión de un tratamiento mejorado para el cáncer.
Otro objetivo es proporcionar un tratamiento para el cáncer en el que el límite de la dosis es más alto en comparación con un tratamiento para el cáncer sin el tratamiento mejorado (adición de un inductor de P-gp y/o de MRP1). Se alcanza un límite de la dosis cuando un efecto secundario de la quimioterapia es lo suficientemente grave como para impedir un incremento de la dosis o del nivel del tratamiento.
De esta manera, un aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende un inductor de P-gp, para la utilización en la prevención de uno o más efectos secundarios de un quimioterapéutico y/o para la reducción del riesgo de que se produzca uno o más efectos secundarios de un quimioterapéutico y/o para la reducción de la gravedad de uno o más efectos secundarios de un quimioterapéutico y/o para el incremento de la tolerabilidad a un quimioterapéutico y/o para la eliminación de los efectos secundarios limitantes de la dosis de un quimioterapéutico en un sujeto,
en donde, dicho quimioterapéutico,in vivo,es transportado al exterior de las células por P-gp;
en el que el inductor de P-gp se selecciona del grupo que consiste en rifampicina, carbamazepina y dexametasona,
en el que el quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en taxanos, alcaloides vinca, epotilonas, antraciclinas, inhibidores del proteasoma e inhibidores de topoisomerasas,
en donde el inductor de P-gp se prepara para la administración por vía tópica al sujeto antes de administrar el quimioterapéutico al mismo, y
en donde dicho efecto o efectos secundarios se seleccionan del grupo que consiste en NPIQ, pérdida de cabello (alopecia) y daño en las uñas, tal como el daño a la matriz ungueal.
En una realización preferente, el efecto secundario es la NPIQ.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit de partes que comprende:
• un primer recipiente que comprende un quimioterapéutico, el cual,in vivo,es transportado al exterior de las células por P-gp, en donde el quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en taxanos, alcaloides vinca, epotilonas, antraciclinas, inhibidores del proteasoma e inhibidores de topoisomerasa,
• un segundo recipiente que comprende un inductor de P-gp, formulado para la aplicación tópica, en donde el inductor de P-gp se selecciona del grupo que consiste en rifampicina, carbamazepina y dexametasona, y
• opcionalmente, instrucciones de utilización,
en el que la composición del segundo recipiente se presenta en forma de crema, espuma, gel, loción o pomada, o
en donde la composición del segundo recipiente comprende uno o más potenciadores que potencian que el inductor de P-gp alcance la dermis de las célula,
en donde uno o más potenciadores se seleccionan del grupo que consiste en etanol, acetona, glicoles, tales como el polipropilenglicol, la fosfatidilcolina y el laurilsulfato sódico.
Preferentemente, la aplicación tópica es por lo menos en las manos y los pies en relación con la NPIQ y por lo menos en el cuero cabelludo en lo que respecta a la alopecia.
Todavía otro aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende un quimioterapéutico, que,in vivo, estransportado al exterior de las células por P-gp, para la utilización en el tratamiento del cáncer,
en donde dicho sujeto ha sido pretratado tópicamente con un inductor de P-gp,
en el que el inductor de P-gp se selecciona del grupo que consiste en rifampicina, carbamazepina y dexametasona, y
en el que el quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en taxanos, alcaloides vinca, epotilonas, antraciclinas, inhibidores del proteasoma e inhibidores de topoisomerasas.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra que el paclitaxel reduce la longitud y el número de neuritas en neuronas derivadas de SH-SY5Y y que este efecto es exacerbado por la inhibición de la glucoproteína P (p<0,001, ANOVA). Las células SH-SY5Y completamente diferenciadas fueron tratadas con las concentraciones indicadas de paclitaxel durante 24 horas en ausencia y presencia de valspodar 4 pM. Las células fueron teñidas para p-tubulina y DAPI. El número de células con más de dos neuritas (A) y la longitud de las neuritas (B) se cuantificaron utilizando ImageJ. Se evaluaron por lo menos cinco imágenes de tres diferenciaciones separadas. Eje X: concentración de paclitaxel. La figura 2 muestra que la inhibición de la glucoproteína P potencia el daño de las neuritas inducido por el paclitaxel. Las células SH-SY5Y completamente diferenciadas fueron tratadas durante 24 horas con DMSO al 0,2 % (A), valspodar 4 pM (B), paclitaxel 0,5 pM en ausencia (C) y en presencia de valspodar 4 pM (D). Las células fueron teñidas con p-tubulina y DAPI, y se muestran imágenes representativas. La exposición a bajas concentraciones de paclitaxel causa efectos mínimos en las redes neuronales en comparación con el control de DMSO al 0,2 %, pero el tratamiento concomitante con el inhibidor de P-gp valspodar 4 pM provoca una toxicidad neuronal incrementada del paclitaxel.
La figura 3 muestra que la inhibición de P-gp causa un incremento en la acumulación de paclitaxel en las neuronas derivadas de SH-SY5Y (A) y que la inducción causa una reducción en la acumulación del paclitaxel en las neuronas sensoriales derivadas de células madre pluripotentes inducidas (CMPi) (B). Las células SH-SY5Y completamente diferenciadas o las neuronas sensoriales derivadas de CMPi se trataron con las concentraciones indicadas de paclitaxel durante 1 hora en ausencia y en presencia de valspodar 4 pM o un tratamiento previo de 48 horas con rifampicina. Los valores mostrados son de réplicas por triplicado de una diferenciación.
La figura 4 muestra que un tratamiento de 48 horas con rifampicina conduce a un incremento de la expresión de P-gp en las neuronas sensoriales derivadas de células madre pluripotentes inducidas.
La figura 5 muestra que el paclitaxel provoca un daño marcado y que la rifampicina puede proteger frente a este daño en neuronas sensoriales derivadas de células madre pluripotentes inducidas. Las células se trataron con paclitaxel durante 24 horas y se marcaron inmunitariamente utilizando un anticuerpo para la periferina.
La figura 6 muestra que la vincristina (VCR) provoca una neurotoxicidad marcada a concentraciones bajas. A) Número de neuritas que se extienden desde una agrupación de neuronas sensoriales. B) Longitud de las neuritas. La figura 7 muestra que el inhibidor de MRP1 MK-571 (MK) exacerba notablemente la neurotoxicidad de la vincristina (VCR).
La figura 8 muestra que el pretratamiento con rifampicina (RIF) alivia sustancialmente la neurotoxicidad inducida por la vincristina (VCR).
La figura 9 muestra que el paclitaxel (PTX) causa un incremento dependiente de la dosis en la expresión de TRPV1 y ATF-3. El pretratamiento con rifampicina (RIF) protege frente a esta respuesta transcripcional, subrayando que la rifampicina protege frente a la neurotoxicidad inducida por el paclitaxel.
La figura 10 muestra que la carbamazepina y el dexametasona aumentan la expresión de P-gp hasta en un 50 % a diferentes concentraciones.
La figura 11 muestra que la expresión de P-gp incrementa de manera dependiente de la dosis los precursores de células de Schwann derivados de células madre pluripotentes inducidas cuando se tratan con rifampicina.
La presente invención se describirá a continuación en mayor detalle.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Antes de comentar la presente invención en mayor detalle, primero se definirán los siguientes términos y convenciones:
Neuropatía periférica inducida por quimioterapia (NPIQ)
En el contexto actual, la expresión "neuropatía periférica inducida por quimioterapia", o "NPIQ", se refiere a una afección progresiva y duradera que presenta dolor, entumecimiento, hormigueo y sensibilidad al frío en las manos y los pies (que en ocasiones progresa a los brazos y piernas) y que afecta a muchos pacientes sometidos a quimioterapia. La neuropatía periférica inducida por quimioterapia (NPIQ) es causada por muchos fármacos quimioterapéuticos, tales como los taxanos, los alcaloides vinca, los platinos, el bortezomib, la ixabepilona y la talidomida.
Alopecia
El término "alopecia" se refiere a la ausencia parcial o completa de cabello en cualquier zona del cuerpo donde normalmente crece. La alopecia inducida por quimioterapia es más destacada en el cuero cabelludo. La alopecia es un efecto secundario transitorio y generalmente reversible de muchos tratamientos de quimioterapia para el cáncer que puede ser psicológicamente devastador. El trauma emocional puede ser tan grave que lleve a rechazar o retrasar el tratamiento que de otro modo podría resultar beneficioso. La recuperación generalmente requiere un período de varios meses a un año, amplificando el impacto psicológico de la enfermedad y su tratamiento.
Se conocen diversos quimioterapéuticos que inducen alopecia inducida por quimioterapia.
Paclitaxel
El paclitaxel es un fármaco anticáncer citotóxico utilizado en el tratamiento de tumores orgánicos sólidos, tales como el cáncer de mama y el cáncer de ovario. El paclitaxel también se utiliza en quimioterapia adyuvante y neoadyuvante. Aunque resulta eficaz, el paclitaxel provoca múltiples efectos secundarios en los pacientes. Una reacción adversa habitual y potencialmente grave al tratamiento con paclitaxel es la neuropatía periférica, que ocurre hasta en el 50 % de los pacientes. Entre los signos clínicos de la neuropatía periférica inducida por paclitaxel (NPIP) se incluyen pérdida sensorial, parestesia, disestesia, entumecimiento y hormigueo, y a menudo conducen a dolor neuropático. La NPIP puede ser muy grave, pero incluso los síntomas leves a moderados pueden persistir durante varios años después de la interrupción del tratamiento, lo que afecta significativamente la calidad de vida. Debido a que se espera que más del 80 % de los pacientes de cáncer de mama sean sobrevivientes a largo plazo, esta reacción adversa grave y duradera resulta especialmente preocupante y de interés para la salud pública. Además, el éxito del tratamiento con paclitaxel está correlacionado con la dosis y la NPIP es la principal razón para reducir la dosis; el desarrollo de NPIP puede influir en las tasas de supervivencia de los pacientes de cáncer. El paclitaxel pertenece a la clase de quimioterapéuticos denominados "taxanos", que es conocido que son transportados al exterior de las células por P-gp (Brooks TA et al. Mol. Cancer Ther. nov. de 2003;2(11):1195-205).
Bortezomib
El bortezomib se utiliza en el tratamiento del mieloma múltiple (MM) y el linfoma de células del manto, y actualmente se está sometiendo a ensayo en 235 ensayos clínicos a nivel mundial en indicaciones tales como el M<m>, el cáncer hemático y los linfomas.
El bortezomib pertenece a la clase de los quimioterapéuticos denominados "inhibidores del proteasoma", que se sabe que son transportados al exterior de las células por P-gp (O'Connor R. et al., Cancer Chemother. Pharmacol. mayo de 2013;71(5):1357-68).
Vincristina
La vincristina se utiliza en el tratamiento de muchos cánceres, incluyendo la leucemia, el linfoma no Hodgkin, el cáncer de tiroides y los tumores cerebrales. La vincristina se utiliza ampliamente para el tratamiento de cánceres pediátricos y actualmente se está sometiendo a ensayo en 439 ensayos clínicos a nivel mundial dentro de indicaciones tales como el cáncer hemático, el cáncer del sistema nervioso central (SNC) y diversos linfomas. La vincristina pertenece a la clase de los quimioterapéuticos denominados "alcaloides vinca", que es conocido que son transportados al exterior de las células por P-gp (Horio M. et al., J. Biol. Chem. 9 de mayo de 1989;264(25):14880-4).
Ixabepilona
La ixabepilona es un estabilizador de los microtúbulos, tal como el paclitaxel, utilizado en el tratamiento del cáncer de mama metastásico agresivo o localmente avanzado. La ixabepilona es un sustrato para la P-gp (Shen H. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. mayo de 2011;337(2):423-32).
Glucoproteína P (P-gp)
"La glucoproteína P" o "P-gp" o "Pgp", también conocida como proteína de resistencia a múltiples fármacos 1 (MDR1, por sus siglas en inglés) o miembro 1 de la subfamilia B del casete de unión de ATP (ABCB1) o agregado de diferenciación 243 (CD243, por sus siglas en inglés) es una proteína importante de la membrana celular que bombea muchas sustancias foráneas hacia el exterior de las células. Es una bomba de eflujo dependiente de ATP con amplia especificidad de sustrato. Existe en animales, hongos y bacterias, y probablemente evolucionó como un mecanismo de defensa contra sustancias nocivas.
MRP1
La "proteína asociada a la resistencia a múltiples fármacos 1", o "MRP1", es una proteína que en seres humanos está codificada por el genABCC1.MRP1 es un miembro de la superfamilia de transportadores del casete de unión a ATP (ABC, por sus siglas en inglés) y se expresa en prácticamente todas las membranas en seres humanos. Las proteínas ABC transportan diversas moléculas a través de las membranas extracelulares e intracelulares. La MRP1 participa en la resistencia a múltiples fármacos.
Inductor de glucoproteína P (P-gp)
En el presente contexto, la expresión "inductor de glucoproteína (P-gp)" se refiere a un agente que incrementa la expresión de P-gp o incrementa la función de la bomba de eflujo dependiente de ATP de P-gp. Son ejemplos de inductores de P-gp, la rifampicina, la carbamazepina y la dexametasona. La expresión de P-gp está regulada por el receptor X de pregnano (PXR, por sus siglas en inglés) y muchos inductores de P-gp son agonistas de PXR.
Inductor de MRP1
En el presente contexto, la expresión "inductor de MRP1" se refiere a un agente que incrementa la expresión de MRP1 o que incrementa la función de transporte de MRP1. Son ejemplos de inductores de P-gp, la rifampicina, la carbamazepina y la dexametasona. La expresión de P-gp está regulada por el receptor X de pregnano (PXR, por sus siglas en inglés) y muchos inductores de MRP1 son agonistas de PXR.
Composición que comprende un inductor de P-gp
Tal como se ha mencionado anteriormente, se ha encontrado que la aplicación tópica de un inductor de P-gp puede ayudar a proteger las células (localmente) contra el daño causado por los quimioterapéuticos. Tal protección es especialmente relevante clínicamente cuando se trata de NPIQ, ya que afecta gravemente a la salud del paciente y puede incluso ser un factor limitativo de la dosis del quimioterapéutico. Sin embargo, la protección local también puede ayudar a proteger contra efectos secundarios menos graves, tales como la alopecia y el daño en las uñas. De esta manera, un aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende un inductor de P-gp, para la utilización en la prevención de uno o más efectos secundarios de un quimioterapéutico y/o para la reducción del riesgo de que se produzca uno o más efectos secundarios de un quimioterapéutico y/o para la reducción de la gravedad de uno o más efectos secundarios de un quimioterapéutico y/o para el incremento de la tolerabilidad a un quimioterapéutico y/o para la eliminación de los efectos secundarios limitativos de la dosis de un quimioterapéutico en un sujeto,
en donde, dicho quimioterapéutico,in vivo,es transportado al exterior de las células por P-gp;
en el que el inductor de P-gp se selecciona del grupo que consiste en rifampicina, carbamazepina y dexametasona, en el que el quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en taxanos, alcaloides vinca, epotilonas, antraciclinas, inhibidores del proteasoma e inhibidores de topoisomerasas,
en donde el inductor de P-gp se prepara para la administración por vía tópica al sujeto antes de administrar el quimioterapéutico al mismo, y
en donde dicho efecto o efectos secundarios se seleccionan del grupo que consiste en NPIQ, pérdida de cabello (alopecia) y daño en las uñas, tal como el daño a la matriz ungueal.
Tal como se describe en la sección de ejemplos (ver los Ejemplos 4 y 6), la adición de un inductor de P-gp previene el daño en las células. Lo anterior puede explorarse, p. ej., para proteger, por ejemplo, frente a la NPIQ. Preferentemente, el inductor se aplica tópicamente sobre la piel, por lo que en una realización, dicho inductor de P-gp se prepara para la aplicación tópica en el sujeto. En el presente contexto, la expresión "administración tópica" se refiere a la aplicación sobre superficies del cuerpo, tales como la piel, el cuero cabelludo y la matriz ungueal. En una realización, la composición se presenta en forma de cremas, espumas, geles, lociones y pomadas. En otra realización, la aplicación tópica es epicutánea, es decir, se aplica directamente sobre la piel.
La NPIQ se describe en la sección de ejemplos, en la que se identifica la presencia de P-gp en las neuronas sensoriales. Se ha constatado que este efecto puede extrapolarse a la alopecia y daño en la matriz ungueal inducidas por quimioterapia, que a menudo es la consecuencia de la quimioterapia.
En una realización, dicho inductor de P-gp es para aplicación tópica por lo menos en las manos y/o pies y/o brazos y/o piernas, preferentemente por lo menos en las manos y los pies. La NPIQ se localiza más frecuentemente en manos y pies, aunque también puede localizarse en brazos y piernas. Por lo tanto, estas son las zonas más relevantes del cuerpo a proteger utilizando la aplicación tópica del inductor. En caso de daño en las uñas, deberían protegerse las zonas circundantes a las uñas.
En una realización, la composición es para la prevención de la NPIQ y/o la reducción del riesgo de desarrollar NPIQ y/o la reducción de la gravedad de la NPIQ en un sujeto.
La composición que comprende el inductor de P-gp puede mejorarse adicionalmente para llegar a la ubicación correcta bajo la piel. De esta manera, en una realización, la composición comprende adicionalmente uno o más potenciadores que mejoran que el inductor de P-gp alcance la dermis de las células.
En una realización, los potenciadores se seleccionan del grupo que consiste en etanol, acetona, glicoles (p. ej., polipropilenglicol), fosfatidilcolina y laurilsulfato sódico. Estos potenciadores pueden mejorar que el P-gp llegue a la dermis de las células. Además, el encapsulado de la P-gp, tal como en liposomas, niosomas, emulsionantes, nanopartículas sólidas lipídicas o transportadores lipídicos nanoestructurados, puede mejorar el alcance a la dermis de las células. De esta manera, en una realización, los inductores de P-gp están encapsulados, tal como en liposomas, niosomas, emulsionantes, nanopartículas sólidas lipídicas y transportadores lipídicos nanoestructurados.
En una realización, la composición comprende un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable en la composición es un portador farmacéuticamente aceptable para uso tópico.
En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable para uso tópico en la composición es un portador farmacéuticamente aceptable para uso tópico en la piel.
De esta manera, en una realización, la composición comprende adicionalmente uno o más potenciadores que potencian que el inductor de P-gp alcance la dermis de las células.
En otra realización, dicho inductor de P-gp se prepara para la aplicación tópica en el sujeto, por lo menos en el cuero cabelludo, cejas y/o pestañas. La alopecia se refiere a la pérdida de cabello, por lo que, para proteger las zonas propensas a la alopecia, se deben proteger las zonas con cabello, tales como el cabello de la cabeza (tal como el cuero cabelludo), las cejas y las pestañas. Si bien la protección contra la alopecia puede parecer, a primera vista, de menor importancia clínica en comparación con la NPIQ, sigue siendo un daño a las células y puede ser psicológicamente devastador para el paciente. El trauma emocional puede ser tan grave que lleve a rechazar o retrasar el tratamiento que de otro modo podría resultar beneficioso.
Los inductores pueden funcionar, p. ej., mediante la inducción de la actividad de los transportadores o el incremento de la expresión. De esta manera, en una realización, la P-gp induce una expresión incrementada y/o una mayor actividad de P-gp, preferentemente induce una expresión incrementada. P-gp y MRP1 están regulados por el receptor X de pregnano (PXR). De esta manera, los agonistas de PXR, tales como la rifampicina y la carbamazepina, incrementarán la expresión y, de esta manera, la actividad de ambos transportadores de eflujo.
La adición de inductores solo es clínicamente relevante si los quimioterapéuticos utilizados posteriormente son transportados hacia el exterior de las células por la P-gp.
Los taxanos, alcaloides de vinca, epotilonas, antraciclinas, inhibidores del proteasoma e inhibidores de la topoisomerasa son todos quimioterapéuticos, los cuales son transportados al exterior de las células por P-gp.
Los Ejemplos 5 y 8 muestran que el método de la invención funciona para un taxano (paclitaxel) y para un alcaloide vinca (vincristina).
En una realización adicional, el quimioterapéutico se selecciona de:
- Taxanos, tales como docetaxel y/o paclitaxel,
- Alcaloides vinca, tales como vincristina y/o vinorelbine,
- Epotilonas, tales como la ixabepilona,
- Las antraciclinas, tales como la doxorrubicina, la daunorrubicina, la epirubicina y/o la idarubicina,
- Los inhibidores de topoisomerasa, tales como el etopósido, el irinotecán y/o el topotecán, y
- Los inhibidores del proteasoma, tales como el bortezomib.
En todavía otra realización, el quimioterapéutico se selecciona de docetaxel, paclitaxel, vincristine, vinorelbine, ixabepilona, doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, etopósido, irinotecán y topotecán; con la salvedad de que la composición es para prevenir la alopecia y/o reducir el riesgo de desarrollar alopecia y/o reducir la gravedad de la alopecia en un sujeto. Estos quimioterapéuticos se conocen porque todos comportan alopecia inducida por quimioterapia.
En una realización todavía adicional, el quimioterapéutico se selecciona de docetaxel, paclitaxel, vincristina, ixabepilona y bortezomib; con la condición de que la composición sea para la prevención de la NPIQ y/o la reducción del riesgo de desarrollar NPIQ y/o la reducción de la gravedad de la NPIQ en un sujeto. Es conocido que todos estos quimioterapéuticos inducen NPIQ.
En una realización todavía adicional, el quimioterapéutico se selecciona de paclitaxel, docetaxel y doxorrubicina. Se conoce que la totalidad de dichos quimioterápicos inducen daño en las uñas (daño en la matriz ungueal).
Se conocen diferentes compuestos que funcionan como inductores de P-gp y/o MRP1.
De esta manera, en una realización, dicho inductor de P-gp se selecciona del grupo que consiste en rifampicina, carbamazepina y dexametasona. En, p. ej., los Ejemplos 5 y 8, el inductor de P-gp/MRP1, rifampicina, ha sido sometido a ensayo para diferentes tipos de terapia quimioterapéutica.
Los inductores de P-gp son carbamazepina, dexametasona, doxorrubicina, nefazodona, fenobarbital, fenitoína, prazosina, rifampicina, hipérico, tenofovir, tipranavir, trazodona y vinblastina. Dicha lista de compuestos incluye inductores farmacológicos comúnmente conocidos de la glucoproteína P.
En todavía otra realización, dicho sujeto está programado para el tratamiento con un quimioterapéutico seleccionado del grupo que consiste en taxanos, alcaloides vinca, epotilonas, antraciclinas, inhibidores del proteasoma e inhibidores de topoisomerasas.
En una realización más específica referida a la composición para su uso,
- el inductor de P-gp es la rifampicina,
- el quimioterapéutico es el paclitaxel,
- y el uso es para la prevención de la NPIQ y/o la reducción del riesgo de contraer NPIQ y/o reducir la gravedad de la NPIQ y/o aumentar la tolerabilidad a la NPIQ y/o eliminar la NPIQ como efecto secundario limitativo de la dosis de paclitaxel en un sujeto, y
- en el que la rifampicina se formula para aplicación tópica, preferentemente en manos y pies.
El Ejemplo 5 muestra el efecto del pretratamiento con rifampicina en relación con el tratamiento con paclitaxel.
En otra realización más específica referida a la composición para su uso,
- el inductor de P-gp es la rifampicina,
- el quimioterapéutico es la vincristina,
- y el uso es para la prevención de la NPIQ y/o la reducción del riesgo de contraer NPIQ y/o la reducción de la gravedad de la NPIQ y/o el aumento de la tolerabilidad a la vincristina y/o la eliminación de la NPIQ como efecto secundario limitativo de la dosis de vincristina en un sujeto, y
- en el que la rifampicina se formula para aplicación tópica, preferentemente en manos y pies. El Ejemplo 8 muestra el efecto del pretratamiento con rifampicina en comparación con el tratamiento con vincristina.
En todavía otra realización más específica referida a la composición para su uso,
- el inductor de P-gp es la rifampicina,
- el quimioterapéutico es el paclitaxel o la vincristina,
- y el uso es para la prevención de la alopecia y/o la reducción del riesgo de contraer NPIQ y/o la reducción de la gravedad de la alopecia y/o el aumento de la tolerabilidad al paclitaxel y la vincristina y/o la eliminación de la alopecia como efecto secundario limitativo de la dosis de paclitaxel y/o vincristina en un sujeto, y
- en el que la rifampicina se formula para la aplicación tópica, preferentemente por lo menos en el cuero cabelludo, las cejas y/o las pestañas.
Se cree que debería haber un cierto período de tiempo entre la aplicación (tópica) del inductor de P-gp y el quimioterapéutico. De esta manera, en una realización, el inductor de P-gp se prepara para la administración al sujeto antes de administrar el quimioterapéutico al sujeto, tal como preparado para la administración más de 1 día antes de administrar el quimioterapéutico al sujeto, tal como más de 3 días, tal como 1 a 7 días. El período puede variar; por lo tanto (sin respaldo teórico) al dejar, p. ej., por lo menos 1 día (24 horas) entre la administración de las dos composiciones, hay tiempo para que el inductor llegue a las células, active la P-gp y sea eliminado del cuerpo.
En una realización, el sujeto es un mamífero, preferentemente un ser humano, y más preferentemente un ser humano que sufre de cáncer.
En una realización, el cáncer es un cáncer de tumor de órgano sólido, tal como el cáncer de mama y el cáncer de ovario. El paclitaxel (un taxano) y las epotilonas se utilizan para el tratamiento de tales cánceres.
En otra realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer hemático, mieloma múltiple (MM), linfoma de células del manto y linfomas. El bortezomib (un inhibidor del proteasoma) se utiliza para el tratamiento de dichos cánceres.
En todavía otra realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en leucemia, linfoma no Hodgkin, cáncer de tiroides, leucemia infantil y tumores cerebrales. La vincristina (un alcaloide vinca) se utiliza para el tratamiento de dichos cánceres.
En una realización, el cáncer no es cáncer de piel en las manos y/o pies. En otra realización, el cáncer no es cáncer del sistema nervioso periférico (SNP). Se debe entender que el cáncer no es un cáncer que se localiza principalmente donde se aplica el inductor.
Kit
Debido a que la presente invención puede involucrar tanto un inductor de P-gp como un quimioterapéutico capaz de ser transportado por estas bombas de eflujo, podría ser relevante disponer de un kit que comprenda estos componentes. De esta manera, un aspecto de la invención se refiere a un kit de partes que comprende
• un primer recipiente que comprende un quimioterapéutico, el cual,in vivo,es transportado al exterior de las células por P-gp, en donde el quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en taxanos, alcaloides vinca, epotilonas, antraciclinas, inhibidores del proteasoma e inhibidores de topoisomerasa,
• un segundo recipiente que comprende un inductor de P-gp, formulado para la aplicación tópica, en donde el inductor de P-gp se selecciona del grupo que consiste en rifampicina, carbamazepina y dexametasona, y
• opcionalmente, instrucciones de utilización,
en el que la composición del segundo recipiente se presenta en forma de crema, espuma, gel, loción o pomada, o
en donde la composición del segundo recipiente comprende uno o más potenciadores que potencian que el inductor de P-gp alcance la dermis de las célula,
en donde uno o más potenciadores se seleccionan del grupo que consiste en etanol, acetona, glicoles, tales como el polipropilenglicol, la fosfatidilcolina y el laurilsulfato sódico.
Las instrucciones pueden comprender instrucciones en relación a cómo y dónde administrar los compuestos, concentraciones y/o el tiempo entre la administración de los componentes.
En un aspecto, la invención se refiere además al kit de partes según la invención, para su uso como medicamento. Tal como se ha mencionado anteriormente, el kit puede ser relevante en relación con los efectos secundarios de la quimioterapia, tales como la NPIQ, la pérdida de cabello (alopecia) y el daño a las uñas, tal como el daño a la matriz ungueal.
En otro aspecto, el kit de partes según la invención es para la utilización en el tratamiento o alivio de un cáncer en un sujeto. Si bien la invención se refiere a evitar efectos secundarios de determinadas quimioterapias, el objetivo general es el tratamiento/alivio del cáncer. De esta manera, en una realización, la invención se refiere a un tratamiento mejorado, es decir, con menos efectos secundarios. También podría permitir al médico clínico utilizar concentraciones más altas del quimioterapéutico, mejorando de esta manera el tratamiento del cáncer, al mismo tiempo que presenta la misma cantidad de efectos secundarios que el tratamiento sin el uso del inductor.
De esta manera, en una realización, el kit de partes es para la utilización en la prevención de uno o más efectos secundarios de la quimioterapia y/o la reducción del riesgo de presentar uno o más efectos secundarios de la quimioterapia y/o la reducción de la gravedad de uno o más efectos secundarios de la quimioterapia, y/o el incremento de la tolerabilidad a la quimioterapia y/o la eliminación de los efectos secundarios limitativos de la dosis de la quimioterapia, en un sujeto,
en donde dicho efecto o efectos secundarios son causados por un quimioterapéutico que,in vivo,es transportado al exterior de las células por P-gp.
En todavía otra realización, dicho efecto o efectos secundarios se seleccionan del grupo que consiste en NPIQ, pérdida de cabello (alopecia) y daño en las uñas, tal como el daño a la matriz ungueal.
En todavía otra realización, dicho sujeto se considera en riesgo de desarrollar NPIQ, alopecia y/o daño en las uñas. Tal como se ha descrito anteriormente, se considera que los inductores se aplican de manera tópica, preferentemente sobre la piel. De esta manera, en una realización, dicho inductor de P-gp se prepara para la aplicación tópica en el sujeto, preferentemente en por lo menos las manos y/o pies y/o brazos y/o piernas, preferentemente por lo menos en las manos y los pies. Estas zonas son particularmente relevantes en relación con la NPIQ y el daño en las uñas. En una realización relacionada, dicho inductor de P-gp está preparado para ser aplicado tópicamente en el sujeto, preferentemente por lo menos en el cuero cabelludo, las cejas y/o las pestañas. Estas zonas son particularmente relevantes en relación con la pérdida de cabello.
El quimioterapéutico puede administrarse por cualquier vía estándar para el fármaco específico. De esta manera, en una realización, el quimioterapéutico se prepara para ser administrado por una vía seleccionada del grupo que consiste en oralmente, intravenosamente, subcutáneamente, intramuscularmente, intratecalmente e intraventricularmente.Una composición que comprende un quimioterapéutico
La enseñanza de la presente invención permite, además, utilizar quimioterapéuticos conocidos para tratar un nuevo subgrupo de pacientes. De esta manera, un aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende un quimioterapéutico, que,in vivo,es transportado al exterior de las células por P-gp, para la utilización en el tratamiento del cáncer,
en donde dicho sujeto ha sido pretratado tópicamente con un inductor de P-gp,
en el que el inductor de P-gp se selecciona del grupo que consiste en rifampicina, carbamazepina y dexametasona, y
en el que el quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en taxanos, alcaloides vinca, epotilonas, antraciclinas, inhibidores del proteasoma e inhibidores de topoisomerasas.
El tratamiento tópico se describe con más detalle para los demás aspectos de la invención. De esta manera, en una realización, el pretratamiento es un tratamiento tópico por lo menos en las manos y los pies con el inductor de P-gp y/o el inductor de MRP1.
En otra realización, el pretratamiento es un tratamiento tópico por lo menos en el cuero cabelludo con el inductor de P-gp y/o el inductor de MRP1.
En una realización preferente, hay por lo menos 24 horas entre la administración de los inductores de P-gp y/o los inductores de MRP1 y la administración del quimioterapéutico.
En una realización, el quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en taxanos, alcaloides vinca, epotilonas, antraciclinas, inhibidores del proteasoma e inhibidores de topoisomerasas. Estos son quimioterapéuticos que,in vivo,son transportados al exterior de las células por P-gp y/o MRP1.
En todavía otra realización, el pretratamiento con el inductor de P-gp y/o el inductor de MRP1 es para prevenir uno o más efectos secundarios de la quimioterapia y/o reducir el riesgo de experimentar uno o más efectos secundarios de la quimioterapia y/o reducir la gravedad de uno o más efectos secundarios de la quimioterapia y/o incrementar la tolerabilidad al quimioterapéutico y/o eliminar los efectos secundarios limitativos de dosis del quimioterapéutico en el sujeto.
En una realización adicional, dicho efecto o efectos secundarios se seleccionan del grupo que consiste en NPIQ, pérdida de cabello (alopecia) y daño en las uñas, tal como el daño a la matriz ungueal.
La composición se puede administrar en diferentes ubicaciones del cuerpo,
dependiendo de qué efecto secundario se deba evitar/minimizar durante el tratamiento quimioterapéutico. De esta manera, en una realización, el pretratamiento con un inductor de P-gp y/o un inductor de MRP1 es
- el tratamiento tópico, tal como en las manos y/o pies y/o brazos y/o piernas, preferentemente por lo menos en las manos y pies (relevante especialmente para NPIQ y el daño en las uñas);
y/o
- tratamiento tópico, preferentemente por lo menos en el cuero cabelludo, cejas y/o pestañas (alopecia).
Tal como se ha descrito anteriormente, existen diferentes inductores de P-gp. De esta manera, en una realización, dicho inductor de P-gp se selecciona del grupo que consiste en rifampicina, carbamazepina y dexametasona.
Se considera importante que se introduzca un determinado periodo de tiempo entre el pretratamiento y la administración del quimioterapéutico. El período puede variar; por lo tanto (sin respaldo teórico) al dejar, p. ej., por lo menos 1 día (24 horas) entre la administración de las dos composiciones, hay tiempo para que el inductor llegue a las células, active la P-gp y sea eliminado del cuerpo.
Debe señalarse que realizaciones y características descritas en el contexto de uno de los aspectos de la presente invención también se aplican a los demás aspectos de la invención.,
A continuación, se describirá la invención en mayor detalle en los ejemplos siguientes.
Ejemplos
Ejemplo 1: el paclitaxel afecta a la morfología neuronal
Objetivo del estudio
Evaluar cómo el paclitaxel afecta a la morfología neuronal.
Materiales y métodos
Cultivo celular
Las células SH-SY5Y (94030304, Sigma-Aldrich) se mantuvieron en DMEM/F: 12 (11320074, ThermoFisher) con suero bovino fetal inactivado por calor al 15 % (hiFBS, F9665 Sigma-Aldrich), penicilina/estreptomicina al 1 % (p/s) y glutamina 2 mM. Las células se dividieron 1:10-1:20 usando tripsina al 0,05 %-EDTA (10779413, Fisher Scientific) a una confluencia de 70 % a 80 %. Cuando el número de pases es elevado, el tipo de célula epitelial domina el cultivo y causa una drástica reducción de la eficiencia de la diferenciación. De esta manera, solo se utilizaron células de número de pase inferior a 15.
Reactivos y anticuerpos
El paclitaxel (T7402, Sigma-Aldrich) se diluyó en serie en DMSO (D2650, Sigma-Aldrich) y estas soluciones madre se diluyeron 1:500 para garantizar 0,2 % de DMSO en todas las muestras. Estas concentraciones se seleccionaron en función del perfil farmacocinético clínico del paclitaxel. Se utilizó el valspodar (SML0572, Sigma-Aldrich) a una concentración final de 4 pM. El anticuerpo contra TUBB3 (MA1-118, ThermoFisher Scientific) se utilizó en una proporción 1:1000. El ARN de ganglio de la raíz dorsal humana para el análisis de qPCR fue adquirido de Clontech Laboratories (636150, Clontech laboratories, Inc, Mountain View, California, EE.<u>U.). El ganglio de la raíz dorsal humana para la cuantificación de proteínas de ABCB1 fue obtenido de National Disease Research Interchange (Philadelphia, PA, EE. UU.).
Diferenciación de células SH-SY5Y
Las células SH-SY5Y se diferenciaron tal como se ha descrito anteriormente en detalle en Shipley et al. (JoVE J. Vis. Exp. 17 de feb. de 2016;(108):e53193-e53193). En resumen, las células SH-SY5Y por debajo del pase 15 se sembraron a una densidad de 5-6 x103 células/cm2 en placas de 6 pocillos sin recubrimiento (día 0 (D0)) y se dejaron en medio de cultivo durante la noche. Al día siguiente (D1) se inició la diferenciación utilizando medio DMEm /F:12 con hiFBS al 2,5 %, p/s al 1 %, glutamina 2 mM y ácido retinoico 10 pM (RA, R2625 Sigma-Aldrich) y el medio se sustituyó en D3 y D5. En D7, las células se dividieron 1:1 utilizando tripsina al 0,05 %-EDTA en placas sin recubrimiento y en D8, se redujo el contenido de hiFBS a 1 %. En D10, las células se dividieron 1:1 en placas con recubrimiento de matriz extracelular (E0282, Sigma-Aldrich). En D11, el medio fue sustituido por el medio de diferenciación final que contenía medio neurobasal (21103049, ThermoFisher) con 1X suplemento B27 (17504044, ThermoFisher), KCI 20 mM (10697623, Fisher Scientific), p/s al 1 %, 1X Glutamax, 50 ng/ml de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, CST-3897S, Peprotech), dibutilril-AMP cíclico 2 mM (db-AMPc, D0627 Sigma-Aldrich) y RA 10 pM. Se reemplazó el medio en D14 y D17, y las células se sometieron a ensayo y se confirmaron como completamente diferenciadas en D18 y se utilizaron para aplicaciones posteriores tal como se describe posteriormente.
Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR, por sus siglas en inglés)
Se aisló el ARN total de las líneas celulares SH-SY5Y utilizando un kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA). Se transcribió inversamente el ARN total (1 pg) a ADNc utilizando un kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO (Life Technologies, CA). La PCR cuantitativa en tiempo real se llevó a cabo en placas de reacción de 384 pocillos utilizando la mezcla maestra universal 2X Taqman Fast Universal (Applied Biosystems, Foster City, CA), sondas de expresión génica específicas de Taqman 20X para cada transportador y 10 ng del molde de ADNc. Las reacciones se llevaron a cabo en un sistema de PCR en tiempo real rápido Applied Biosystems 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). El nivel de expresión relativa de cada transcrito de ARNm se calculó mediante el método comparativo (método ACt), normalizado respecto al gen de mantenimiento, hipoxantina fosforibosiltransferasa (HPRT, por sus siglas en inglés).
Inmunomarcaje
Tanto las células SH-SY5Y diferenciadas como no diferenciadas se fijaron utilizando paraformaldehído al 4 %. Las células se permeabilizaron utilizando Triton X-100 al 0,25 % y se bloqueó la unión inespecífica utilizando albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés). Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 °C y los anticuerpos secundarios se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Los núcleos se tiñeron utilizando DAPI 1,5 |jM durante 5 minutos. Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio Leica DMI4000B. Se evaluó la morfología de las neuritas utilizando los módulos CellCounter y Simple Neurite Tracer de ImageJ. Para determinar el número de neuritas por célula, se utilizó CellCounter para contar el número de células con 0, 1, 2... n neuritas. Se determinó la longitud de las neuritas utilizando Simple Neurite Tracer. Para ambos puntos finales, se utilizaron por lo menos cinco imágenes de cada condición de tres diferenciaciones separadas. El análisis con ImageJse realizó de forma enmascarada para la persona que evaluaba la longitud y el número de neuritas a fin de garantizar la ausencia de sesgos.
Método LC-MS/MS para determinar las concentraciones intracelulares de paclitaxel
Las células SH-SY5Y completamente diferenciadas se expusieron a paclitaxel 1-10<j>M durante 1 hora, con y sin 1 hora de preincubación con inhibidores de transportadores de eflujo. Después de lo anterior, se aspiró el medio y se lisaron las células utilizando un tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA, por sus siglas en inglés) con 4 % de inhibidor de proteasa durante 10 minutos sobre hielo. Las células se recogieron utilizando un raspador de células, se sometieron a agitación con vórtex y se sonicaron (1 seguno x2), se centrifugaron y el sobrenadante se almacenó a -80 °C hasta el análisis de LC-MS/MS. La concentración de paclitaxel en el lisado celular se determinó en el Departamento de Farmacología Clínica y Farmacia, Instituto de Salud Pública, University of South Denmark, mediante el uso de cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). El sistema LC-MS/MS consistió en un sistema UHPLC Ultimate 3000 conectado a un espectrómetro de masas triple cuadrupolo TSQ Quantiva con ionización por electropulverización en caliente (H-ESI, por sus siglas en inglés) (Thermo Scientific, San José, CA). La ionización se llevó a cabo en modo positivo con un voltaje de pulverización de 3000 V, gas de envoltura 40 (U.A.), gas auxiliar 9 (U.A.), gas de barrido 1 (U.A.) y una temperatura del vaporizador de 400 °C. La temperatura del tubo de transferencia de iones era de 350 °C. La adquisición de datos se realizó en modo de monitorización de reacción única (SRM, por sus siglas en inglés). El paclitaxel se cuantificó en la transición de(m/z)de 876,18 a 308,00, y con(m/z)876,18 a 591,11 y(m/z)876,19 a 531,11 como trazas cualificadoras. La separación analítica se realizó mediante el uso de una columna Hypersil GOLD (C18) de 50x2,1 mm (1,9 jm ) (Thermo Scientific, San José, CA) con una fase móvil de acetonitrilo: ácido fórmico 0,1 M (40:60 v/v) a un caudal de 0,4 ml/min. La preparación de la muestra de lisado celular consistió en una única etapa de dilución. Se pipetearon 100 j l de lisado celular y 100 j l de acetonitrilo en un microtubo de polipropileno de 1,5 ml (Sarsted, Nürnbrecht, Alemania). La muestra se sometió a agitación con vórtex durante 5 minutos y seguidamente se centrifugó a 15.000gdurante 15 minutos. Se inyectaron 10 j l del sobrenadante en el sistema de LC-MS/MS. Se prepararon curvas de calibración que iban desde 25 nM hasta 3000 nM, así como muestras de control de calidad, que se incluyeron en cada lote de análisis. La variabilidad intra e interdiaria inferior al 8 %. El límite de detección (LdD) para el método era de 1 ng/ml y el límite de cuantificación (LdC) era de 10 ng/ml. Finalmente, las concentraciones de paclitaxel se ajustaron según la concentración de proteína en cada pocillo, evaluada utilizando un kit de ensayo de proteínas Pierce BCA.
LC-MS/MS para determinar la expresión de transportadores
Los niveles de expresión de proteínas transportadoras se analizaron mediante un análisis proteómico con diana en TXP, que se ha descrito anteriormente. En resumen, los pellets celulares se incubaron durante una hora con tampón de lisis que contenía NP-40 al 1 % (Thermo Fisher), SDS al 0,01 % (ThermoFisher), NaCl 0,15 M (Merck), hidrogenofosfato disódico dihidratado 0,01 M (Merck), EDTA 2 mM y 2,5 unidades/ml de benzonasa (Novagen). La concentración de proteínas en el lisado se determinó mediante ensayo BCA (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con el manual del fabricante. A continuación, se sometieron a proteólisis 70 jg de proteína utilizando tripsina durante la noche. Se añadieron péptidos marcados con isótopos estables y anticuerpos<t>X<p>(producidos a medida por Pineda) a 20 o 40 jg del digerido y se incubaron durante una hora. Los complejos de péptidos y anticuerpos fueron precipitados, lavados y desnaturalizados utilizando perlas magnéticas recubiertas con proteína G (ThermoFisher) y un procesador de partículas magnéticas (KingFisher 96, ThermoFisher). Los péptidos precipitados se cuantificaron posteriormente utilizando el método de cromatografía líquida-espectrometría de masas (lC-MS, por sus siglas en inglés) de 10 minutos previamente descrito (UltiMate 3000 RSLCnano y tSIM - QExactive Plus™ Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.) (Weiss F. et al., Drug Metab Dispos. 18 de enero de 2018). Los gradientes de cromatografía líquida (LC) fueron optimizados para cada multiplex. Los datos en bruto se procesaron con Skyline v4.1. Las superficies de pico de los péptidos marcados isotópicamente que representan cantidades de péptidos conocidas y las señales endógenas se compararon entre sí respecto al nivel de los iones precursores.
Estadísticas
Se utilizó el análisis de varianza (ANOVA, por sus siglas en inglés) para evaluar los efectos dependientes de la dosis de paclitaxel sobre el número y la longitud de las neuritas y la acumulación intracelular del paclitaxel. Los datos se transformaron logarítmicamente para garantizar la normalidad de los datos. Se utilizó la versión 15 del software STATA para realizar los análisis estadísticos. La regresión logística para evaluar el riesgo de modificación de dosis de paclitaxel debido a inhibidores de P-gp se ajustó por edad, superficie corporal, tipo de tumor, estadio del cáncer, programa de tratamiento y quimioterapia previa. Se utilizó la versión 19 del software SPSS para realizar el análisis de regresión logística.
Resultados
Las células SH-SY5Y se diferenciaron efectivamente en neuronas utilizando el protocolo de Shipley et al. (JoVE J. Vis. Exp. 17 de feb. de 2016;(108):e53193-e53193). Después de 18 días de diferenciación, las células forman una compleja red neuronal con alta expresión de TUBB3 y la mayoría de las células (>97,5 %) fueron negativas para el marcador de proliferación Ki67, lo que indica que las células son postmitóticas (datos no mostrados).
Se evaluó la morfología neuronal mediante la medición de la longitud de las neuritas y el número de neuritas/célula en células SH-SY5Y completamente diferenciadas con 24 horas de tratamiento con paclitaxel. El paclitaxel indujo una neurotoxicidad dependiente de la dosis en las células SH-SY5Y diferenciadas y redujo significativamente tanto el número de neuritas (p<0,001) como su longitud (p<0,001) (figura 1).
Se evaluaron la expresión de ARNm y proteínas de los transportadores de fármacos relevantes mediante qPCR y LC-MS/MS, y señaló a la expresión de los transportadores de eflujo P-gp y MRP1 tanto en células SH-SY5Y como en ganglios de las raíces dorsales humanos (datos no mostrados). Para evaluar el papel de P-gp en la acumulación neuronal y la neurotoxicidad del paclitaxel, se inhibió P-gp con valspodar 4 pM. La inhibición de P-gp con valspodar exacerbó sustancialmente la toxicidad neuronal del paclitaxel, tal como indica una reducción en el número y la longitud de las neuritas (ANOVA p<0,001, figuras 1 y 2). El valspodar no afectó a la morfología neuronal en ausencia de paclitaxel (figura 2).
Conclusión
La inhibición de P-gp incrementó la toxicidad neuronal del paclitaxel en células neuronales SH-SY5Y. Estos datos también sugieren que la estimulación de P-gp presentaría el efecto contrario y, de esta manera, que también podría prevenirse la NPIQ mediante la aplicación de tales inductores de P-gp en la piel.
Ejemplo 2: concentraciones intracelulares de paclitaxel
Objetivo del estudio
Con el fin de confirmar que el efecto nocivo incrementado del paclitaxel sobre la morfología neuronal bajo condiciones de inhibición de P-gp está relacionado con una mayor exposición, se cuantificaron las concentraciones intracelulares de paclitaxel.
Materiales y métodos
Las células fueron tratadas con paclitaxel con y sin inhibición concomitante de P-gp por valspodar y se midieron los niveles intracelulares 1 hora después del tratamiento.
Para más detalles, consulte también la sección de materiales y métodos en el Ejemplo 1.
Resultados
La inhibición de P-gp causó un aumento de más de 3 veces en la acumulación intracelular de paclitaxel a 10 pM (p<0,001, figura 3).
Conclusión
La inhibición de P-gp causó un incremento en la acumulación de paclitaxel en neuronas derivadas de SH-SY5Y. Nuevamente, estos datos también sugieren que la estimulación de P-gp presentaría el efecto contrario y, de esta manera, que también podría prevenirse la NPIQ mediante la aplicación de tales inductores de P-gp en la piel.
Ejemplo 3: inhibidores de P-gp y neuropatía periférica inducida por paclitaxel en pacientes
Objetivo del estudio
Evaluar si la ingestión concomitante de inhibidores de P-gp causa un mayor riesgo de neuropatía periférica en pacientes tratados con paclitaxel.
Materiales y métodos
Inhibidores de P-gp y neuropatía periférica inducida por paclitaxel en pacientes
Con el fin de evaluar si la inhibición de P-gp conduce a un riesgo incrementado de neuropatía periférica, los presentes inventores utilizaron una base de datos previamente descrita de 503 pacientes tratados con paclitaxel con cáncer de mama u ovario (Sánchez-Barroso L. et al. The Oncologist. 23 de nov. de 2018). En resumen, se recopilaron modificaciones de la dosis debido a neuropatía periférica de los registros médicos y se realizó una regresión logística multivariante para evaluar si los usuarios de inhibidores de P-gp presentaban un mayor riesgo de modificaciones de la dosis debido a neuropatía. Se seleccionaron inhibidores de P-gp basándose en dos revisiones de la literatura (ver comentarios bajo la Tabla 1). A partir de estas revisiones, los presentes inventores identificaron medicamentos listados como inhibidores de P-gp (medicamentos clasificados como inhibidores en cualquiera de las revisiones) y, dentro de estos, inhibidores fuertes de P-gp (medicamentos clasificados como inhibidores en ambas revisiones).
Según los análisis univariante y multivariante, la asociación entre la modificación de la dosis de paclitaxel debido a neuropatía periférica y el uso concomitante de inhibidores de P-gp se muestra en la Tabla 1.
Resultados
Los pacientes tratados con cualquier inhibidor de P-gp presentaron un incremento de 2,4 veces (intervalo de confianza (IC) al 95 %: 1,3-4,3) del riesgo de modificación de la dosis debido a neuropatía periférica; los pacientes tratados con inhibidores fuertes mostraron un riesgo 4,7 veces mayor (IC al 95 %: 1,9-11,9) y los pacientes tratados con atorvastatina presentaron un incremento de 7,0 veces (IC al 95 %: 2,3-21,5) del riesgo, mientras que los usuarios de simvastatina no presentaron ningún incremento del riesgo.
Tabla 1. Los pacientes tratados con paclitaxel que tomaron inhibidores de P-gp presentaron un mayor riesgo de modificación de dosis debido a neuropatía periférica.
Conclusión
Estos datos ponen claramente de manifiesto que los inhibidores de P-gp administrados sistemáticamente incrementan el riesgo de NPIQ en pacientes tratados con paclitaxel. Nuevamente, estos datos también sugieren que la estimulación de P-gp presentaría el efecto contrario y que también podría prevenirse la NPIQ mediante la aplicación de tales inductores de P-gp en la piel.
Ejemplo 4: la inducción de P-gp con rifampicina protege a las neuronas de la toxicidad neuronal inducida por paclitaxel
Objetivo del estudio
Verificar que la inducción de P-gp con rifampicina protege a las neuronas de la neuropatía periférica inducida por paclitaxel.
Materiales y métodos
Las células fueron pretratadas durante 48 horas con rifampicina 25 pM antes de la adición del tratamiento con paclitaxel.
Véase también el Ejemplo 5.
Resultados
Las concentraciones bajas de rifampicina incrementan significativamente la expresión del transportador de fármacos P-gp (figura 4A) y reducen la acumulación de paclitaxel en 3 veces (figura 4B). Una mayor expresión de P-gp protege a las neuronas frente al daño por paclitaxel (figura 5).
Conclusión
Estos datos ponen claramente de manifiesto que mediante la adición de un fármaco que incrementa la expresión de los transportadores de fármacos, se reduce la concentración intracelular del quimioterapéutico paclitaxel.
Estos resultados respaldan directamente que, mediante la aplicación tópica de un inductor de P-gp (y un inductor de MRP1) en la piel, se puede reducir la cantidad de quimioterapéutico intracelular dentro de las neuronas de la piel, y de este modo también se reduce el riesgo de que el paciente desarrolle efectos secundarios de la quimioterapia, tales como la NPIQ, a la vez que se mantiene el efecto completo del quimioterapéutico en la ubicación relevante del cuerpo (las células cancerosas).
Además, debido a que es conocido que P-gp y MRP1 se expresan en los folículos pilosos (Osman-Ponchet et al., Drug Metabol. Drug Interact. 2014), se puede conseguir el mismo efecto para estos tipos de células, protegiendo de esta manera al paciente frente a la alopecia.
Ejemplo 5: la toxicidad de la vincristina se ve exacerbada con la inhibición de ABCC1 por MK-571
Objetivo del estudio
Determinar la toxicidad de la vincristina en las neuronas sensoriales y determinar el impacto de la inhibición del transportador de eflujo asociado a la resistencia a múltiples fármacos 1 (MRP1).
Materiales y métodos
Se generaron neuronas sensoriales a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (CMPi) mediante la implementación del protocolo bien establecido de Chamberset. al..(Nat. Biotech. 2012). Se inició la diferenciación neuronal cuando las CMPi alcanzaron una confluencia de 70 % a 80 % utilizando medio KSR, que contenía 82 % de DMEM KnockOut (Gibco, 10829-018) y 15 % de sustituto de suero KnockOut (KSR, ThermoFisher, 10828-028), GlutaMAX-I al 1 % (Gibco, 35050-038), medio esencial mínimo con aminoácidos no esenciales al 1 % (MEM-NE<a>A, por sus siglas en inglés, Gibco, 11140-035), P/S al 1 % y p-mercaptoetanol 0,055 mM (Gibco, 21985023).
En los días 0 a 5, se inhibió la señalización de SMAD mediante la adición de LDN-1931890,1 pM (Selleck, S7507) y SB-431542 10 pM (Selleck, S1067) al medio. Se cambió el medio diariamente, y se añadió medio N2 con incrementos del 25 % cada dos días a partir del día 4 (100 % N2 el día 10). El medio N2 consiste en un 97 % de medio neurobasal (Gibco, 21103-049) con un 1 % de suplemento N2 (Gibco, 17502-048), un 1 % de suplemento B27 (Gibco, 17504 044) y un 1 % de P/S. Los días 2 a 10, se inició la inducción de nociceptores con la adición de los tres inhibidores, CHIR99021 3 pM (Selleck, S1263), SU5402 10 pM (Selleck, S7667) y DAPT 10 pM (Selleck, S2215).
Para el cultivo a largo plazo a partir del día 12, las células se lavaron con PBS y se incubaron con acutasa durante 30 minutos para obtener una suspensión de células individuales. Después de la incubación, las placas de cultivo se sometieron a balanceo suave y los agregados celulares se disociaron mecánicamente mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Las células se filtraron a través de un filtro celular de nilón de 40 pm (Corning, 431750) y se centrifugaron (800 rpm, 5 min, TA). Tras la resuspensión del pellet, las CMPi-SN se sembraron como células individuales sobre placas de cultivo recubiertas con PLO/LAM/FN a una densidad de 150.000 células viables/cm2. El medio de cultivo a largo plazo contenía un 100 % de medio N2 suplementado con 25 ng/ml del factor de crecimiento neuronal p (NGF-p, PeproTech, 450-01), el factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF, PeproTech, AF450-02), el factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales (GDNF, PeproTech, AF450-10), neurotrofina 3 (NT-3, PeproTech, 450-03) y ácido ascórbico 0,2 mM (AA, Sigma, A4403).
El medio se cambió cada quinto día, extrayendo con cuidado la mitad del medio y sustituyéndolo por medio fresco de cultivo a largo plazo. Con el fin de reducir la población no neuronal, las células fueron tratadas con 1 pg/ml de mitomicina C (Sigma, M4287) durante 2 horas el día 14. Una vez a la semana, se añadió laminina al medio para mantener la adhesión celular.
Las células fueron tratadas con vincristina 0,001 a 1 pM durante 24 horas y marcadas inmunitariamente con anticuerpo de periferina. La cuantificación de la red se llevó a cabo utilizando ImageJ y MIPAR. En experimentos de inhibición, las células se pretrataron con MK-571 4 pM durante una hora antes del tratamiento quimioterapéutico.
Resultados
La vincristina (VCR) provocó una neurotoxicidad sustancial en las neuronas sensoriales derivadas de CMPi. De esta manera, la vincristina causa una disminución dependiente de la dosis del número de neuritas que se extienden desde un agregado de neuronas sensoriales (figura 6A). Además, la longitud de las neuritas se acorta de manera dependiente de la dosis (figura 6B).
La inhibición del transportador de eflujo MRP1 con MK-571 (MK) conduce a una neurotoxicidad sustancialmente incrementada incluso a bajas concentraciones de vincristina que de otro modo no resultarían tóxicas (figura 7).Conclusión
Estos datos indican que la vincristina causa una neurotoxicidad sustancial en neuronas sensoriales derivadas de CMPi. Además, se ha demostrado que la inhibición del transportador de eflujo MRP1 exacerba la neurotoxicidad inducida por la vincristina.
Estos datos también sugieren que la estimulación de MRP1 presentaría el efecto contrario y, por lo tanto, también que, p. ej., la NPIQ
podría prevenirse mediante la aplicación de dichos inductores de MRP1 en la piel.
Ejemplo 6: la toxicidad de la vincristina se alivia con el pretratamiento con rifampicina
Objetivo del estudio
Determinar si la rifampicina protege frente a la neuropatía periférica inducida por vincristina.
Materiales y métodos
Las células madre pluripotentes inducidas se diferenciaron en neuronas sensoriales durante 35 a 40 días tal como se ha indicado anteriormente. Se añadió rifampicina 48 horas antes de la vincristina a fin de incrementar la expresión de los transportadores de eflujo.
Resultados
La neurotoxicidad inducida por la vincristina se alivió sustancialmente con el pretratamiento con rifampicina 25 pM (figura 8).
Conclusión
La rifampicina (RIF) protege frente a la neurotoxicidad inducida por la vincristina (VCR), probablemente mediante la regulación ascendente del transportador de eflujo MRP1.
Ejemplo 7: el paclitaxel incrementa la expresión del receptor TRPV1 sensible al dolor y del ATF-3 relacionado con el estrés, mientras que la rifampicina protege frente a esta respuesta transcripcional.
Objetivo del estudio
El objetivo de este estudio fue evaluar el impacto transcripcional del tratamiento quimioterapéutico sobre la proteína relacionada con el estrés ATF-3 y el receptor sensorial del dolor TRPV1.
Materiales y métodos
Las células madre pluripotentes inducidas se diferenciaron en neuronas sensoriales durante 35 a 40 días tal como se ha indicado anteriormente. Se añadió rifampicina 48 horas antes del paclitaxel a fin de incrementar la expresión de los transportadores de eflujo. Los niveles de expresión se determinaron utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) para TRPV1 y ATF-3.
Resultados
El paclitaxel (PTX) causa una expresión sustancialmente incrementada tanto de TRPV1 (figura 9A) como de ATF-3 (figura 9B) de manera dependiente de la dosis. El pretratamiento con rifampicina (RIF) protege frente a estos cambios transcripcionales.
Conclusión
La regulación positiva de P-gp inducida por la rifampicina conduce a menores concentraciones intracelulares de paclitaxel, lo que lleva a la protección frente a los cambios transcripcionales causados por el paclitaxel. Lo anterior apoya la afirmación de que la inducción de P-gp debería proteger frente a la NPIQ a través de la restricción de las concentraciones intracelulares de paclitaxel. Se espera que mecanismos similares limiten la disposición de la quimioterapia a los folículos pilosos, protegiendo de esta manera frente a la alopecia.
Ejemplo 8: el pretratamiento con rifampicina reduce la acumulación intracelular de paclitaxel en neuronas sensoriales derivadas de CMPi
Objetivo del estudio
Determinar las concentraciones intracelulares de paclitaxel en neuronas sensoriales derivadas de CMPi y evaluar si el pretratamiento con rifampicina conduce a una menor acumulación.
Métodos
Las células madre pluripotentes inducidas se diferenciaron en neuronas sensoriales durante 35 a 40 días tal como se ha indicado anteriormente. Se añadió rifampicina 48 horas antes del paclitaxel a fin de dejar suficiente tiempo para incrementar la expresión de los transportadores de eflujo. Se añadieron 1 y 5 pM de paclitaxel a las células durante 1 hora y las células se lisaron utilizando tampón RIPA. Las concentraciones de paclitaxel se determinaron utilizando un método de LC-MS/MS ya establecido.
Resultados
Las concentraciones intracelulares de paclitaxel eran aproximadamente 3 veces más bajas después del pretratamiento con rifampicina (figura 10).
Conclusiones
El pretratamiento con rifampicina condujo a una acumulación reducida del quimioterapéutico paclitaxel, lo que provocó una reducción de la toxicidad neuronal, tal como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 9: inductores adicionales de P-gp en neuronas sensoriales
Objetivo del estudio
Confirmar que agonistas adicionales de PXR, además de la rifampicina, incrementan la expresión de P-gp en neuronas sensoriales derivadas de células madre pluripotentes inducidas.
Materiales y métodos
Las células madre pluripotentes inducidas se diferenciaron en neuronas sensoriales durante 35 a 40 días tal como se ha indicado anteriormente. Las células fueron tratadas con carbamazepina y dexametasona durante 48 horas. El nivel de expresión de P-gp (ABCB1) se determinó utilizando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (RT-qPCR) y se ajustó para un gen de mantenimiento (GAPDH). Los datos se muestran como expresión relativa al control (DMSO al 0,2 %).
Resultados
Tanto la carbamazepina como la dexametasona incrementan la expresión de P-gp hasta en un 50 % (figura 10).Conclusión
El presente ejemplo muestra que los fármacos que activan PXR (ejemplificados por la carbamazepina y la dexametasona) incrementan la expresión de P-gp en las neuronas sensoriales derivadas de células madre pluripotentes inducidas. Lo anterior respalda la hipótesis de que los agonistas de PXR podrán proteger frente a los quimioterapéuticos que son sustratos de P-gp, tales como el paclitaxel, la vincristina, el bortezomib y el ixabepilona, mediante el incremento de la expresión de P-gp y reduciendo la acumulación de estos fármacos en las neuronas sensoriales.
Ejemplo 10: rifampicina en precursores de células de Schwann derivadas de CMPi
Objetivo del estudio
El objetivo de este estudio fue evaluar si la rifampicina incrementaba la expresión de P-gp en las células de Schwann. Las células de Schwann son las principales células gliales en el sistema nervioso periférico. Las células de Schwann existen en forma tanto de células mielinizantes como no mielinizantes, y las células de Schwann mielinizantes envuelven neuronas de gran diámetro en capas de mielina, incrementando de esta manera la conductancia. Las células de Schwann no mielinizantes apoyan a las neuronas mediante la secreción de factores de crecimiento neuronal que desempeñan un papel crucial en el mantenimiento y reparación de las neuronas después de una lesión y pueden transmitir señales de dolor.
Materiales y métodos
Las células madre pluripotentes inducidas (CMPi) se diferenciaron en precursores de células de Schwann utilizando un protocolo previamente publicado. Se cultivaron las CMPi en placas de cultivo recubiertas con Matrigel reducido en factores de crecimiento. Al día siguiente, el medio de cultivo se cambió de medio de cultivo de CMPi a medio de diferenciación neural (MDN) que contenía 1x N2, 1x B27, BSA al 0,005 %, GlutaMAX 2 mM, p-mercaptoetanol 0,11 mM, CT 99021 3 |<j>M y SB43154220 |<j>M en DMEM/F12 avanzado y medio Neurobasal (mezcla 1:1). Después de 6 días de diferenciación, se sustituyó el medio por un medio de inducción neuronal que contenía 50 ng/ml de NRG1 (esto se designa como medio de diferenciación de precursores de células de Schwann [SCPDM, por sus siglas en inglés]) y se sustituyó por medio fresco diariamente. Las células se disociaron rutinariamente con tratamiento de Accutase al alcanzar un 80 % de confluencia y se expandieron mediante un cultivo adicional en SCPDM. Los precursores de células de Schwann derivados de CMPh se generaron después de aproximadamente 18 días de diferenciación. Se utilizó SCPDM para la inducción y el mantenimiento de precursores de células de Schwann derivados de CMPi.
Los precursores de células de Schwann se trataron con rifampicina durante 48 horas. El nivel de expresión de P-gp (ABCB1) se determinó utilizando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (RT-qPCR) y se ajustó para un gen de mantenimiento (GAPDH). Los datos se muestran como expresión relativa al control (DMSO al 0,2 %).
Resultados
La expresión de P-gp se incrementó de manera dependiente de la dosis en precursores de células de Schwann derivados de CMPi (figura 11).
Conclusión
El presente estudio muestra que la rifampicina también incrementa la expresión de P-gp en otras células del sistema nervioso periférico. Lo anterior indica que la rifampicina también puede proteger las células de Schwann de la quimioterapia, además de las neuronas sensoriales. Considerando el efecto desconocido de la quimioterapia en otras células además de las neuronas sensoriales en el sistema nervioso periférico, lo anterior resulta prometedor y podría representar una ventaja sustancial.

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    i.Composición que comprende un inductor de P-gp, para la utilización en la prevención de uno o más efectos secundarios de un quimioterapéutico y/o para la reducción del riesgo de que se produzca uno o más efectos secundarios de un quimioterapéutico y/o para la reducción de la gravedad de uno o más efectos secundarios de un quimioterapéutico y/o para el incremento de la tolerabilidad a un quimioterapéutico y/o para la eliminación de los efectos secundarios limitativos de la dosis de un quimioterapéutico en un sujeto,
    en donde, dicho quimioterapéutico,in vivo,es transportado al exterior de las células por P-gp; en el que el inductor de P-gp se selecciona del grupo que consiste en rifampicina, carbamazepina y dexametasona,
    en el que el quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en taxanos, alcaloides vinca, epotilonas, antraciclinas, inhibidores del proteasoma e inhibidores de topoisomerasas,
    en donde el inductor de P-gp se prepara para la administración por vía tópica al sujeto antes de administrar el quimioterapéutico al mismo, y
    en la que dicho efecto o efectos secundarios se seleccionan del grupo que consiste en NPIQ (es decir, neuropatía periférica inducida por quimioterapia), pérdida de cabello (alopecia) y daño en las uñas, tal como el daño a la matriz ungueal.
  2. 2. Composición para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicho inductor de P-gp es para la aplicación tópica en las manos y/o pies y/o brazos y/o piernas, preferentemente por lo menos en las manos y pies del sujeto,
    o
    dicho inductor de P-gp es para la aplicación tópica en el cuero cabelludo, cejas y/o pestañas del sujeto.
  3. 3. Composición para la utilización según cualquiera de las reclamaciones anteriores, en la que el quimioterapéutico
    - se selecciona de docetaxel, paclitaxel, vincristina, vinorelbina, ixabepilona, doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, etopósido, irinotecán y topotecán; con la salvedad de que la composición está destinada a prevenir la alopecia y/o a reducir el riesgo de desarrollar alopecia y/o a reducir la gravedad de la alopecia en un sujeto, o
    - se selecciona de docetaxel, paclitaxel, vincristina, ixabepilona y bortezomib; con la condición de que la composición esté destinada a la prevención de la NPIQ y/o a la reducción del riesgo de desarrollar NPIQ y/o a la reducción de la gravedad de la NPIQ en un sujeto, o
    - se selecciona de paclitaxel, docetaxel y doxorubicina, o
    - es paclitaxel o vincristina.
  4. 4. Composición para la utilización según la reivindicación 1,
    - en la que el inductor de P-gp es la rifampicina,
    - en la que el quimioterapéutico es el paclitaxel o la vincristina,
    - para la utilización en la prevención de la NPIQ y/o la reducción del riesgo de contraer NPIQ y/o reducir la gravedad de la NPIQ y/o incrementar la tolerabilidad a la NPIQ y/o eliminar la NPIQ como efecto secundario limitativo de la dosis de paclitaxel o vincristina en un sujeto, y
    - en la que la rifampicina se formula para aplicación tópica, preferentemente en manos y pies.
  5. 5. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el inductor de P-gp se prepara para ser administrado al sujeto antes de administrar el quimioterapéutico al sujeto más de 1 día antes de administrar el quimioterapéutico al sujeto, tal como más de 3 días, tal como 1 a 7 días.
  6. 6. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la aplicación tópica es epicutánea.
  7. 7. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición se presenta en forma de una crema, una espuma, un gel, una loción o una pomada.
  8. 8. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición comprende, además, uno o más potenciadores que mejoran que el inductor de P-gp alcance la dermis de las células.
  9. 9. Kit de partes que comprende:
    • un primer recipiente que comprende un quimioterapéutico, que,in vivo,es transportado al exterior de las células por P-gp, en el que el quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en taxanos, alcaloides vinca, epotilonas, antraciclinas, inhibidores del proteasoma e inhibidores de topoisomerasa, • un segundo recipiente que comprende un inductor de P-gp, formulado para la aplicación tópica, en donde el inductor de P-gp se selecciona del grupo que consiste en rifampicina, carbamazepina y dexametasona, y
    • opcionalmente, instrucciones de utilización,
    en el que la composición del segundo recipiente se presenta en forma de una crema, una espuma, un gel, una loción o una pomada,
    o
    en el que la composición del segundo recipiente comprende, ademaás, uno o más potenciadores que potencian que el inductor de P-gp alcance la dermis de las células,
    en el que uno o más potenciadores se seleccionan del grupo que consiste en etanol, acetona, glicoles, tales como polipropilenglicol, fosfatidilcolina y laurilsulfato sódico.
  10. 10. KIt de partes según la reivindicación 9, para la utilización como medicamento.
  11. 11. Kit de partes según la reivindicación 9 o 10, para la utilización en el tratamiento de un cáncer en un sujeto.
  12. 12. Composición que comprende un quimioterapéutico, que,in vivo,es transportado al exterior de las células por P-gp, para la utilización en el tratamiento del cáncer,
    en la que dicho sujeto ha sido pretratado tópicamente con un inductor de P-gp,
    en la que el inductor de P-gp se selecciona del grupo que consiste en rifampicina, carbamazepina y dexametasona, y
    en la que el quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en taxanos, alcaloides vinca, epotilonas, antraciclinas, inhibidores del proteasoma e inhibidores de topoisomerasa.
  13. 13. Composición para la utilización según la reivindicación 12, en la que el pretratamiento con el inductor de P-gp está destinado a prevenir uno o más efectos secundarios de la quimioterapia y/o para reducir el riesgo de experimentar uno o más efectos secundarios de la quimioterapia y/o reducir la gravedad de uno o más efectos secundarios de la quimioterapia y/o incrementar la tolerabilidad al quimioterapéutico y/o eliminar los efectos secundarios limitativos de dosis del quimioterapéutico en el sujeto.
  14. 14. Composición para la utilización según la reivindicación 12 o 13, en la que uno o más efectos secundarios se seleccionan del grupo que consiste en NPIQ, pérdida de cabello (alopecia) y daño en las uñas, tal como daño a la matriz ungueal.
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