ES3014396T3

ES3014396T3 - Novel method for synthesizing amanitins

Info

Publication number: ES3014396T3
Application number: ES18746964T
Authority: ES
Inventors: Werner Simon; Susanne Werner-Simon; Christian Lutz; CHRISTOPH MüLLER; Torsten Hechler; Michael Kulke
Original assignee: Heidelberg Pharma Research GmbH
Current assignee: Heidelberg Pharma Research GmbH
Priority date: 2017-08-07
Filing date: 2018-08-06
Publication date: 2025-04-22
Anticipated expiration: 2038-08-06
Also published as: JP7220199B2; US11926631B2; US11420971B2; CN110997676A; JP2020529453A; CN110997676B; EP3661938B1; US20220274995A1; WO2019030171A1; EP3661938A1; US20210061805A1

Abstract

La invención se refiere a nuevos métodos para sintetizar derivados de amanitina con un grupo amino unido a la posición 6' de la fracción central de triptófano. Además, la invención se refiere a un nuevo derivado de amanitina con un grupo amino unido a la posición 6' de la fracción central de triptófano, a nuevos conjugados de dicho derivado de amanitina y a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos conjugados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevo método para sintetizar amanitinas

Campo de la invención

La invención se refiere a un derivado amino-sustituido de 2-carboxi-3a-hidroxi-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrolo[2,3-b]indol, y a métodos para la síntesis de un precursor lineal que comprende ocho residuos de aminoácidos de un derivado de amanitina que comprende un resto de triptófano 6'-amino-sustituido, usando un derivado amino-sustituido de 2-carboxi-3a-hidroxi-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrolo[2,3-b]indol, y para la síntesis de un derivado de amanitina que comprende un resto de triptófano 6'-amino-sustituido. La invención se refiere además a un derivado de amanitina que tiene un grupo amino unido a la posición 6' del resto de triptófano central, a conjugados de tal derivado de amanitina y a composiciones farmacéuticas que comprenden tales conjugados.

Antecedentes de la invención

Las amatoxinas son péptidos cíclicos compuestos por 8 aminoácidos que se encuentran en hongosAmanita phalloides(véase la Fig. 1). Las amatoxinas inhiben específicamente la ARN polimerasa II dependiente de ADN de células de mamíferos y, por lo tanto, también la transcripción y la biosíntesis de proteínas de las células afectadas. La inhibición de la transcripción en una célula provoca la detención del crecimiento y la proliferación. Aunque no está unido covalentemente, el complejo entre la amanitina y la ARN polimerasa II es muy estrecho (K<d>= 3 nM). La disociación de la amanitina de la enzima es un proceso muy lento, haciendo por tanto poco probable la recuperación de una célula afectada. Cuando la inhibición de la transcripción dura demasiado tiempo, la célula experimentará una muerte celular programada (apoptosis).

El uso de amatoxinas como restos citotóxicos para la terapia tumoral ya se había explorado en 1981 mediante el acoplamiento de un anticuerpo anti-Thy 1.2 a a-amanitina usando un enlazador unido al anillo de indol de Trp (aminoácido 4; véase la Fig. 1) por medio de diazotación (Davis y Preston, Science 213 (1981) 1385-1388). Davis y Preston identificaron el sitio de unión como la posición 7'. Morris y Venton demostraron también que la sustitución en la posición 7' da como resultado un derivado, que mantiene la actividad citotóxica (Morris y Venton, Int. J. Peptide Protein Res. 21 (1983) 419-430).

La solicitud de patente EP 1859811 A1 (publicada el 28 de noviembre de 2007) describió conjugados en los que el átomo de C y del aminoácido 1 de la amatoxina de p-amanitina estaba acoplado directamente, es decir, sin una estructura de enlazador, a la albúmina o al anticuerpo monoclonal HEA125, OKT3 o PA-1. Además, se demostró el efecto inhibidor de estos conjugados sobre la proliferación de células de cáncer de mama (MCF-7), células de linfoma de Burkitt (Raji) y células de linfoma T (Jurkat). Se sugirió el uso de enlazadores, incluidos enlazadores que comprenden elementos como restos amida, éster, éter, tioéter, disulfuro, urea, tiourea, hidrocarburo y similares, pero en realidad no se mostraron tales constructos y no se proporcionaron más detalles, como sitios de unión en las amatoxinas.

Las solicitudes de patente WO 2010/115629 y WO 2010/115630 (ambas publicadas el 14 octubre de 2010) describen conjugados en donde anticuerpos, como anticuerpos anti-EpCAM, como el anticuerpo humanizado huHEA125, se acoplan a amatoxinas por medio de (i) el átomo de C y del aminoácido 1 de amatoxina, (ii) el átomo de C 6' del aminoácido 4 de amatoxina, o (iii) por medio del átomo de C 5 del aminoácido 3 de amatoxina, en cada caso directamente o por medio de un enlazador entre el anticuerpo y las amatoxinas. Los enlazadores sugeridos comprenden elementos como restos amida, éster, éter, tioéter, disulfuro, urea, tiourea, hidrocarburo y similares. Además, se demostraron los efectos inhibidores de estos conjugados sobre la proliferación de células de cáncer de mama (línea celular MCF-7), carcinoma pancreático (línea celular Capan-1), cáncer de colon (línea celular Colo205) y colangiocarcinoma (línea celular OZ).

La solicitud de patente WO 2017/046658 divulga derivados de toxinas de amanita y su conjugación con una molécula de unión celular. Estos derivados se preparan partiendo de 2-carboxi-3a-hidroxi-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrolo[2,3-b]indol, sin embargo, este último no está sustituido por un grupo amino en el resto fenilo de la parte de indol. La solicitud de patente US 2016/220687 divulga conjugados de alfa-amanitina-dendrímero escindibles por metaloproteinasa para tratar el cáncer, incluyendo un compuesto de este tipo con una 6'-amino-amanina, que sin embargo no está individualizado.

La solicitud de patente WO 2012/119787 divulga que los restos de unión a la diana pueden unirse a amatoxinas por medio de enlazadores en sitios de unión adicionales en el aminoácido 4 de triptófano, es decir, las posiciones 1 '-N, sin interferir con la interacción de tales amatoxinas con su diana, la ARN polimerasa II dependiente de ADN de células de mamíferos.

La solicitud de patente WO 2014/009025 describe la síntesis total de derivados de amanitina usando un nuevo sintón para Y,5-dihidroxiisoleucina como uno de los materiales de partida. Además, la solicitud de patente PCT/EP2016/078984 [publicado como documento WO 2017/089607] describe la síntesis total de derivados de y- y eamanitina usando (2S,3R,4S)-L-4-hidroxiisoleucina fácilmente disponible como uno de los materiales de partida. Sin embargo, estos enfoques, y todos los demás enfoques total o parcialmente sintéticos aplicados hasta ahora, incorporan el resto de triptófano central en el núcleo de amatoxina mediante el uso del método según Savige-Fontana. En este método, el cis-2-carboxi-3a-hidroxi-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrolo[2,3-b]indol (“Hpi”) se incorpora en una estructura precursora de amanitina lineal. En una reacción de acoplamiento de Hpi-cisteína catalizada por ácido, se forma el sistema de anillo de amanitina con el resto de triptófano central.

Sin embargo, Hpi no posee ningún resto funcional unido al anillo fenilo del resto indol de Hpi. Por lo tanto, los productos de amanitina resultantes del método según Savige-Fontana contienen un resto de triptófano central sin ningún otro sustituyente. Sin embargo, las a-, p-,<y>y £-amanitinas de origen natural contienen un resto de 6'-hidroxi-triptófano central, y ese grupo 6'-hidroxi se ha usado con éxito como grupo funcional para la funcionalización de las amanitinas, por ejemplo, mediante la unión de restos de direccionamiento, o bien directamente o bien por medio de enlazadores (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2010/115629, WO 2010/115630 y WO/2012/041504). Por lo tanto, en el caso de las amanitinas sintéticas, la funcionalización tenía que hacerse por medio de (i) el átomo de C y del aminoácido 1 de amatoxina, o (ii) por medio del átomo de C 5 del aminoácido 3 de amatoxina, como se describió anteriormente, o por medio del átomo de nitrógeno del resto de triptófano, como se describe en el documento WO 2012/119787.

Puede obtenerse Hpi mediante la reacción del triptófano con ácido peracético o fotoquímicamente con oxígeno singlete. Sin embargo, hasta el momento no se han descrito derivados con sustituyentes unidos al anillo fenilo del resto indol de Hpi.

Si bien el uso de rutas totalmente sintéticas para obtener amatoxinas puede ofrecer una opción para el suministro de mayores cantidades de amatoxinas requeridas para usos terapéuticos, y puede ofrecer la construcción de una variedad de nuevas variantes de amatoxina mediante el uso de materiales de partida apropiados como bloques de construcción, los enfoques seguidos en el pasado habían estado limitados por el hecho de que la estructura nativa a-, p- y y/o £-amanitina aún no podía obtenerse, ya que el resto 6'-hidroxi unido al resto de triptófano central en estas amanitinas no podía incorporarse. Por lo tanto, las opciones para funcionalizar amanitinas sintéticas han estado bastante limitadas hasta ahora. Además, la reactividad del grupo hidroxi fenólico de todos modos no es óptima, por lo que grupos funcionales alternativos, como grupos amino, serían particularmente interesantes, ya que es muy deseable ampliar la gama de opciones disponibles para la funcionalización, ya que factores como el impedimento estérico y la reactividad podrían tener un fuerte impacto sobre la reactividad, la actividad biológica y/o la estabilidad de las amanitinas sintéticas y de sus conjugados. Sin embargo, la estabilidad y eficacia de los conjugados que comprenden amanitinas altamente tóxicas son de suma importancia para el uso previsto como moléculas terapéuticas para su administración a seres humanos.

Hasta ahora, la introducción de funcionalidades amino en el resto de triptófano solo se ha logrado mediante la modificación de restos de amatoxina completos, por ejemplo mediante diazotación (Falck-Pedersenet al.,Int. J. Peptide Protein Res. 21, 1983, 431-439) o nitración (documento WO 2017/046658). En el caso del documento WO 2017/046658, sin embargo, la reacción de nitración dio como resultado derivados de amatoxina que se nitraron en la posición 5' del resto de triptófano central. Por lo tanto, hasta ahora no se ha descrito ningún enfoque que permita la introducción de un grupo amino en la posición 6'.

Objeto de la invención

Por lo tanto, todavía existía una gran necesidad de encontrar una forma rentable y robusta de sintetizar amatoxinas con un grupo amino unido al anillo fenilo del resto de triptófano central, en particular en la posición 6' del resto de triptófano. En particular, existe una gran necesidad de identificar materiales de partida que puedan usarse en la reacción de Savige-Fontana establecida y que estén configurados de manera que puedan provocar la incorporación de tales grupos amino.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en la observación inesperada de que pueden sintetizarse variantes de Hpi que permiten la introducción de un grupo amino durante la síntesis de derivados de amanitina. La presente invención se define por las características de las reivindicaciones independientes.

Por tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a un derivado amino-sustituido de 2-carboxi-3a-hidroxi-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrolo[2,3-b]indol según la fórmula I.

en donde R1 se selecciona de alquilo, arilo, heteroarilo, alquilo sustituido, arilo sustituido y heteroarilo sustituido; P<i>, P<2>son cada uno hidrógeno o un grupo protector, en donde el grupo protector, cuando está presente, se selecciona independientemente de Boc, PhCH<2>OCO-, CH<2>=CHCH<2>O-CO-, tritilo, un grupo acilo y un grupo alquilo; R2 se selecciona de H, alquilo, arilo, alquilo sustituido y arilo sustituido;

R3 se selecciona de OH, OR1 y una cadena polipeptídica que consiste en 1 -7 residuos de aminoácidos.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método para la síntesis de un precursor lineal que comprende ocho residuos de aminoácidos de un derivado de amanitina que comprende un resto de triptófano 6'-amino-sustituido, que comprende la etapa de usar un derivado amino-sustituido de 2-carboxi-3a-hidroxi-1,2,3,3a,8,8ahexahidropirrolo[2,3-b]indol de la presente invención en la síntesis peptídica de dicho precursor.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a un método para la síntesis de un derivado de amanitina que comprende un resto de triptófano 6'-amino-sustituido, que comprende las etapas de

(i) provocar o permitir la formación de un enlace entre el residuo de cisteína y el resto de triptófano del precursor lineal de la presente invención; y

(ii) provocar o permitir la formación de dicho derivado de amanitina haciendo reaccionar el extremo N-terminal del precursor lineal de la presente invención con el extremo C-terminal de dicho precursor.

En un cuarto aspecto, la invención se refiere a un derivado de amanitina que comprende un resto de triptófano 6'-amino-sustituido, que se selecciona de (i) S-desoxi-6'-amino-amanina, 6'-amino-amanina, (ii) S-desoxi-6'-aminoamaninamida, 6'-amino-amaninamida.

En un quinto aspecto, la invención se refiere a un conjugado que comprende (a) un derivado de amanitina que comprende un resto de triptófano 6'-amino-sustituido de la presente invención; (b) un resto de unión a la diana; y (c) opcionalmente un enlazador que une dicho derivado de amanitina y dicho resto de unión a la diana.

En un sexto aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la amanitina de la presente invención o el conjugado de la presente invención.

En un séptimo aspecto, la invención se refiere a un derivado de amanitina de la presente invención, al conjugado de la presente invención o a la composición farmacéutica de la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente, particularmente en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de páncreas, colangiocarcinoma, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer de riñón, melanoma maligno, leucemia y linfoma maligno.

En un octavo aspecto, la invención se refiere a un compuesto que comprende (a) un derivado de amanitina de la presente invención; y (b) un resto de enlazador que lleva un grupo reactivo Y para unir dicho derivado de amanitina a un resto de unión a la diana.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra las fórmulas estructurales de diferentes amatoxinas. Los números en negrita (del 1 al 8) designan la numeración estándar de los ocho aminoácidos que forman la amatoxina. También se muestran las designaciones estándar de los átomos de los aminoácidos 1, 3 y 4 (letras griegas a a<y>, letras griegas a a 5 y números del 1' al 7', respectivamente).

La Fig. 2 muestra el esquema de síntesis del derivado de Hpi amino-sustituido HDP 30.2416.

La Fig. 3 muestra el esquema de síntesis de 6'.amino-amaninamida (HDP 30.2528).

La Fig. 4 muestra la citotoxicidad de 6'.amino-amaninamida (HDP 30.2528) en células HEK293 (CE<50>= 3,010<-6>M) y en células HEK293 OATP1B3 (CE<50>= 3,0 10<-8>M).

La Fig. 5 muestra un constructo basado en 6'.amino-amaninamida (HDP 30.2528) con un enlazador escindible unido al grupo 6'-hidroxi y un grupo maleimida terminal como ejemplo de un grupo reactivo Y para unir dicho constructo a un resto de unión a la diana, y un derivado de 6'-hidroxi correspondiente (HDP 30.1699).

La Fig. 6 muestra la citotoxicidad de ADC HDP 30.2560 que se dirigen a A) HER-2/neu en células SKBR-3 (HER-2/neu+++) y células JIMT-1 (HER-2/neu+), B) PSMA en células LnCap (PSMA+++) y células 22rv1 (PSMA++) y C) CD19 en células Raji (CD19+++) y células Nalm-6 (CD19++) en comparación con H<d>P 30.1699.

La Fig. 7 muestra la citotoxicidad de T-D265C-30.2540 que se dirige a HER-2/neu en células SKBR-3 (HER-2/neu+++) y células JIMT-1 (HER-2/neu+) en comparación con T-D265C-30.1699.

Descripción detallada de la invención

Antes de describir en detalle la presente invención a continuación, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, los protocolos y los reactivos particulares descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene el propósito únicamente de describir realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica.

En particular, los términos usados en el presente documento se definen tal como se describe en “A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. y Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza).

A lo largo de esta memoria descriptiva y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto exija lo contrario, se entenderá que la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, implican la inclusión de un número entero, composición o etapa o grupo de números enteros o etapas indicados, mientras que cualquier número entero, composición o etapa o grupo de números enteros, composiciones o etapas adicionales pueden estar presentes también opcionalmente, incluidas las realizaciones en donde no hay ningún número entero, composición o etapa o grupo de números enteros, composiciones o etapas adicionales. En tales últimas realizaciones, el término “que comprende” se usa de forma coincidente con “que consiste en”.

A continuación se describirá adicionalmente la presente invención. En los siguientes pasajes se definen con más detalle diferentes aspectos de la invención. Cada aspecto así definido puede combinarse con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferida o ventajosa puede combinarse con cualquier otra característica o características indicadas como preferidas o ventajosas.

La presente invención se basa en la observación inesperada de que pueden sintetizarse variantes de Hpi que permiten la introducción de grupos amino durante la síntesis de derivados de amanitina.

Por tanto, en un aspecto la presente invención se refiere a un derivado amino-sustituido de 2-carboxi-3a-hidroxi-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrolo[2,3-b]indol según la fórmula I.

en donde R1 se selecciona de alquilo, arilo, heteroarilo, alquilo sustituido, arilo sustituido y heteroarilo sustituido;

P1 , P2 son cada uno hidrógeno o un grupo protector, en donde el grupo protector, cuando está presente, se selecciona independientemente de Boc, PhCH2OCO-, CH2=CHCH2O-CO-, tritilo, un grupo acilo y un grupo alquilo;

R2 se selecciona de H, alquilo, arilo, alquilo sustituido y arilo sustituido;

En el contexto de la presente invención, el término “grupo protector” se refiere a un grupo que está unido a un átomo de nitrógeno en las posiciones 1 u 8 del resto hexahidropirrolo[2,3-b]indol central con el fin de bloquear el átomo de nitrógeno para que no reaccione con otros reactivos usados para sintetizar y/o funcionalizar adicionalmente compuestos según la fórmula I. Un experto habitual en la técnica está muy familiarizado con los diferentes grupos protectores que están disponibles en la técnica y que pueden unirse al átomo de nitrógeno correspondiente cuando es necesario para proteger el átomo de nitrógeno, y que pueden escindirse posteriormente, cuando ya no se necesita la N-protección. En realizaciones particulares, la N-protección usa un reactivo N-acilante. Por lo tanto, en tales realizaciones, P1 y/o P2 son grupos acilo. En otras realizaciones particulares, la N-protección usa un reactivo N-alquilante. Por lo tanto, en tales realizaciones, P1 y/o P2 es un grupo alquilo.

En realizaciones particulares, el grupo protector P1 o P2, cuando está presente, se selecciona independientemente de Boc, PhCH2OCO-, CH2=CHCH2O-CO- y tritilo.

En una realización particular, el grupo hidroxi en la posición 3a y el átomo de hidrógeno en la posición 8a están en configuraciónciscon respecto al grupo funcional unido a la posición 2. En otra realización particular, el grupo hidroxi en la posición 3a y el átomo de hidrógeno en la posición 8a están en configuracióntranscon respecto al grupo funcional unido a la posición 2. En una realización particular, el derivado amino-sustituido según la presente invención es una mezcla de compuestos con configuracióncisytrans.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a un método para la síntesis de un derivado de amanitina que comprende un resto de triptófano 6'-amino-sustituido, que comprende las etapas de.

En aspectos adicionales, la invención se refiere al método para la síntesis de precursores de amanitina individuales como se muestra en los ejemplos, en particular los compuestos HDP 30.2516, HDP 30.2528 y los productos intermedios basados en fase sólida sintetizados según [00137].

En una realización particular, el método de la presente invención comprende además la oxidación del átomo de azufre del resto de cisteína para formar un sulfóxido o una sulfona, particularmente un sulfóxido.

Además, se divulga un derivado de amanitina de la presente invención que se selecciona de S-desoxi-6'-aminoamanina, 6'-amino-amanina, S-desoxi-6'-amino-amaninamida y 6'-amino-amaninamida.

En el contexto de la presente invención, el término “amanitina” se refiere a un grupo particular de amatoxinas. En el contexto de la presente invención, el término “amatoxina” incluye todos los péptidos cíclicos compuestos de 8 aminoácidos, tal como se aíslan del género Amanita y se describen en Wieland, T. y Faulstich H. (Wieland T, Faulstich H., CRC Crit Rev Biochem. 5 (1978) 185-260). En el contexto de la presente invención, el término “amanitinas” se refiere a estructuras bicíclicas que se basan en un residuo de ácido aspártico o asparagina en la posición 1, un residuo de prolina, particularmente un residuo de hidroxiprolina en la posición 2, una isoleucina, hidroxiisoleucina o dihidroxiisoleucina en la posición 3, un residuo de triptófano o hidroxitriptófano en la posición 4, residuos de glicina en las posiciones 5 y 7, un residuo de isoleucina en la posición 6 y un residuo de cisteína en la posición 8, particularmente un derivado de cisteína que se oxida a un derivado de sulfóxido o sulfona (para la numeración y ejemplos representativos de amanitinas, véase la Figura 1), e incluye además todos los derivados químicos de las mismas; además todos los análogos semisintéticos de las mismas; además, todos los análogos sintéticos de las mismas construidos a partir de bloques de construcción según la estructura maestra de los compuestos naturales (cíclicos, 8 aminoácidos), además, todos los análogos sintéticos o semisintéticos que contienen aminoácidos no hidroxilados en lugar de los aminoácidos hidroxilados, además, todos los análogos sintéticos o semisintéticos, en cada caso en donde cualquiera de tales derivados o análogos es funcionalmente activo inhibiendo la ARN polimerasa II de mamíferos. En el contexto de la presente invención, el residuo de triptófano en la posición 4 se reemplaza por un derivado 6'-amino sustituido.

Por tanto, en el contexto de la presente invención, el término “ocho residuos de aminoácidos de un derivado de amanitina” se refiere a los aminoácidos específicos que forman la estructura del polipéptido de amanitina bicíclico.

Funcionalmente, las amatoxinas se definen como péptidos o depsipéptidos que inhiben la ARN polimerasa II de mamíferos. Las amatoxinas preferidas son aquellas con un grupo funcional (por ejemplo, un grupo carboxílico o un derivado de ácido carboxílico como una carboxamida o ácido hidroxámico, un grupo amino, un grupo hidroxi, un tiol o un grupo de captura de tiol) que puede reaccionar con moléculas de enlazador o restos de unión a la diana como se definió anteriormente. Las amatoxinas que son particularmente adecuadas para los conjugados de la presente invención son variantes didesoxi de a-amanitina, p-amanitina, Y-amanitina, £-amanitina, amanulina o ácido amanulínico, o variantes monodesoxi de amanina, amaninamida, Y-amanina o Y-amaninamida como se muestra en la Fig. 1, así como sales, derivados químicos, análogos semisintéticos y análogos sintéticos de los mismos.

En una realización particular, el derivado amino-sustituido, el derivado de amanitina que comprende un resto de triptófano amino-sustituido y/o el conjugado de la presente invención tiene(n) una pureza mayor del 90 %, particularmente mayor del 95 %, más particularmente mayor del 98 %, o incluso mayor del 99 %.

En el contexto de la presente invención, el término “pureza” se refiere a la cantidad total de, por ejemplo, conjugados que están presentes. Una pureza superior al 90 %, por ejemplo, significa que, en 1 mg de una composición que comprende un conjugado de la presente invención, hay más del 90 %, es decir, más de 900 pg, de tal conjugado. La parte restante, es decir, las impurezas, pueden incluir material de partida sin reaccionar y otros reactivos, disolventes, productos de escisión y/o productos secundarios.

En una realización particular, una composición que comprende el derivado amino-sustituido, el derivado de amanitina que comprende un resto de triptófano amino-sustituido y/o el conjugado de la presente invención comprende más de 100 mg, en particular más de 500 mg y más particularmente más de 1 g de tal derivado amino-sustituido, derivado de amanitina que comprende un resto de triptófano amino-sustituido y/o conjugado. Por lo tanto, se excluyen explícitamente cantidades traza de, por ejemplo, un conjugado de la presente invención que posiblemente puedan estar presentes en preparaciones complejas de conjugados de la técnica anterior.

El término “resto de unión a la diana”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula o parte de una molécula que puede unirse específicamente a una molécula diana o a un epítopo diana. Los restos de unión a la diana preferidos en el contexto de la presente solicitud son (i) anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos; (ii) proteínas similares a anticuerpos; y (iii) aptámeros de ácidos nucleicos. Los “restos de unión a la diana” adecuados para su uso en la presente invención tienen normalmente una masa molecular de 40.000 Da (40 kDa) o más.

Como se usa en el presente documento, se considera que un primer compuesto (por ejemplo, un anticuerpo) se “une específicamente” a un segundo compuesto (por ejemplo, un antígeno, como una proteína diana), si tiene una constante de disociación K<d>a dicho segundo compuesto de 100 pM o menos, particularmente 50 pM o menos, particularmente 30 pM o menos, particularmente 20 pM o menos, particularmente 10 pM o menos, particularmente 5 pM o menos, más particularmente 1 pM o menos, más particularmente 900 nM o menos, más particularmente 800 nM o menos, más particularmente 700 nM o menos, más particularmente 600 nM o menos, más particularmente 500 nM o menos, más particularmente 400 nM o menos, más particularmente 300 nM o menos, más particularmente 200 nM o menos, incluso más particularmente 100 nM o menos, incluso más particularmente 90 nM o menos, incluso más particularmente 80 nM o menos, incluso más particularmente 70 nM o menos, incluso más particularmente 60 nM o menos, incluso más particularmente 50 nM o menos, incluso más particularmente 40 nM o menos, incluso más particularmente 30 nM o menos, incluso más particularmente 20 nM o menos, e incluso más particularmente 10 nM o menos.

En el contexto de la presente solicitud, los términos “molécula diana” y “epítopo diana”, respectivamente, se refieren a un antígeno y a un epítopo de un antígeno, respectivamente, que está unido específicamente por un resto de unión a la diana. En particular, la molécula diana es un antígeno asociado a tumor, en particular un antígeno o un epítopo que está presente en la superficie de uno o más tipos de células tumorales en una concentración aumentada y/o en una configuración estérica diferente en comparación con la superficie de células no tumorales. En particular, dicho antígeno o epítopo está presente en la superficie de uno o más tipos de células tumorales, pero no en la superficie de células no tumorales. En realizaciones particulares, el resto de unión a la diana se une específicamente a un epítopo de un antígeno seleccionado de: PSMA, CD19, CD269, sialil Lewisa, HER-2/neu y molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM). En otras realizaciones, dicho antígeno o epítopo se expresa preferentemente en células implicadas en enfermedades autoinmunitarias. En tales realizaciones particulares, el resto de unión a la diana se une específicamente a un epítopo del receptor de IL-6 (IL-6R).

El término “anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo”, como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno. Por lo tanto, el término “fragmentos de unión a antígeno del mismo” se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende al menos un dominio de unión a antígeno funcional. También se incluyen proteínas similares a inmunoglobulina que se seleccionan mediante técnicas que incluyen, por ejemplo, presentación en fagos para unirse específicamente a una molécula diana, por ejemplo, a una proteína diana seleccionada de: PSMA, CD19, CD269, sialil Lewisa, HER-2/neu y EpCAM. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. Los “anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos” adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, monovalentes, biespecíficos, heteroconjugados, multiespecíficos, humanos, humanizados (en particular injertados con CDR), desinmunizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla (por ejemplo, scFv), fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, diacuerpos o tetracuerpos (Holliger P.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (1993) 6444-8), nanocuerpos, anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluidos, por ejemplo, anticuerpos anti Id para anticuerpos de la invención) y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores.

En algunas realizaciones, los fragmentos de unión a antígeno son fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno humanos de la presente invención e incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos monocatenarios, Fv unidos por disulfuro (dsFv) y fragmentos que comprenden un dominio VL o VH. Los fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, incluidos los anticuerpos de cadena sencilla, pueden comprender el/los dominio(s) variable(s) solo(s) o en combinación con la totalidad o una parte de los siguientes: región bisagra, dominios CL, CH1, CH2 y CH3. También se incluyen en la invención fragmentos de unión a antígeno que también comprenden cualquier combinación de dominio(s) variable(s) con una región bisagra, dominios CL, CH1, CH2 y CH3.

Los anticuerpos utilizables en la invención pueden ser de cualquier origen animal, incluyendo aves y mamíferos. En particular, los anticuerpos son de origen humano, roedor (por ejemplo, ratón, rata, cobaya o conejo), pollo, cerdo, oveja, cabra, camello, vaca, caballo, burro, gato o perro. Se prefiere particularmente que los anticuerpos sean de origen humano o murino. Tal como se usan en el presente documento, “anticuerpos humanos” incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas, tal como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. núm.

5,939,598 de Kucherlapati y Jakobovits.

El término “proteína similar a un anticuerpo” se refiere a una proteína que se ha modificado por ingeniería genética (por ejemplo, mediante mutagénesis de bucles) para unirse específicamente a una molécula diana. Normalmente, una proteína similar a un anticuerpo de este tipo comprende al menos un bucle peptídico variable unido en ambos extremos a un armazón de proteína. Esta doble restricción estructural aumenta en gran medida la afinidad de unión de la proteína similar a un anticuerpo a niveles comparables a los de un anticuerpo. La longitud del bucle peptídico variable consiste normalmente en de 10 a 20 aminoácidos. La proteína de armazón puede ser cualquier proteína que tenga buenas propiedades de solubilidad. En particular, la proteína de armazón es una proteína globular pequeña. Las proteínas similares a anticuerpos incluyen, sin limitación, aficuerpos, anticalinas y proteínas de repetición de anquirina diseñadas (para una revisión, véase: Binzet al.,Nat Biotechnol. 2005, 1257-68). Las proteínas similares a anticuerpos pueden derivarse de grandes bibliotecas de mutantes, por ejemplo, pueden seleccionarse de grandes bibliotecas de presentación en fagos y pueden aislarse de manera análoga a los anticuerpos regulares. Además, las proteínas de unión similares a anticuerpos pueden obtenerse mediante mutagénesis combinatoria de residuos expuestos en la superficie de las proteínas globulares.

El término “aptámero de ácido nucleico” se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha modificado por ingeniería genética a través de rondas repetidas de selecciónin vitroo SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) para unirse a una molécula diana (para una revisión, véase: Brody y Gold, J Biotechnol.

74 (2000) 5-13). El aptámero de ácido nucleico puede ser una molécula de ADN o ARN. Los aptámeros pueden contener modificaciones, por ejemplo, nucleótidos modificados, como pirimidinas sustituidas con flúor en 2'.

Un “enlazador”, en el contexto de la presente invención, se refiere a una estructura que conecta dos componentes, estando cada uno de los cuales unido a un extremo del enlazador. En el caso de que el enlazador sea un enlace, una unión directa de la amatoxina al anticuerpo puede disminuir la capacidad de la amatoxina para interactuar con la ARN polimerasa II. En realizaciones particulares, el enlazador aumenta la distancia entre dos componentes y alivia la interferencia estérica entre estos componentes, como en el presente caso entre el anticuerpo y la amatoxina. En realizaciones particulares, el enlazador tiene una cadena continua de entre 1 y 30 átomos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 átomos) en su estructura principal, es decir, la longitud del enlazador se define como la conexión más corta medida por el número de átomos o enlaces entre el resto de amatoxina y el anticuerpo, en donde un lado de la estructura principal del enlazador se ha hecho reaccionar con la amatoxina y el otro lado está disponible para la reacción, o se ha hecho reaccionar con un anticuerpo. En el contexto de la presente invención, un enlazador es particularmente un alquileno C1-20 heteroalquileno, C1-20, alquenileno C2-20, heteroalquenileno C2-20, alquinileno C2-20, heteroalquinileno C2-20, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno o un grupo heteroaralquileno, opcionalmente sustituido. El enlazador puede contener uno o más elementos estructurales tales como restos carboxamida, éster, éter, tioéter, disulfuro, urea, tiourea, hidrocarburo y similares. El enlazador también puede contener combinaciones de dos o más de estos elementos estructurales. Cada uno de estos elementos estructurales puede estar presente en el enlazador más de una vez, por ejemplo, dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o seis veces. En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender un enlace disulfuro. Se entiende que el enlazador tiene que unirse en una sola etapa o en dos o más etapas posteriores a la amatoxina y al anticuerpo. Para ello, el enlazador llevará dos grupos, en particular en un extremo proximal y distal, que pueden (i) formar un enlace covalente con un grupo presente en uno de los componentes que va a unirse, en particular un grupo activado en una amatoxina o el péptido de unión a la diana o (ii) que está o puede activarse para formar un enlace covalente con un grupo en una amatoxina. En consecuencia, se prefiere que los grupos químicos estén en el extremo distal y proximal del enlazador, que son el resultado de tal reacción de acoplamiento, por ejemplo, un éster, un éter, un uretano, un enlace peptídico, etc.

En realizaciones particulares, el enlazador L es una cadena lineal de entre 1 y 20 átomos seleccionados independientemente de C, O, N y S, particularmente entre 2 y 18 átomos, más particularmente entre 5 y 16 átomos, e incluso más particularmente entre 6 y 15 átomos. En realizaciones particulares, al menos el 60 % de los átomos en la cadena lineal son átomos de C. En realizaciones particulares, los átomos en la cadena lineal están unidos por enlaces sencillos.

En realizaciones particulares, el enlazador L es un grupo alquileno, heteroalquileno, alquenileno, heteroalquenileno, alquinileno, heteroalquinileno, cicloalquileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno o heteroaralquileno, que comprende de 1 a 4 heteroátomos seleccionados de N, O y S, en donde dicho enlazador está opcionalmente sustituido.

El término “alquileno” se refiere a grupos hidrocarbonados saturados de cadena lineal bivalente que tienen de 1 a 20 átomos de carbono, incluidos grupos que tienen de 1 a 10 átomos de carbono. En ciertas realizaciones, los grupos alquileno pueden ser grupos alquileno inferior. El término “alquileno inferior” se refiere a grupos alquileno que tienen de 1 a 6 átomos de carbono, y en ciertas realizaciones de 1 a 5 o de 1 a 4 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquileno incluyen, pero no se limitan a, metileno (-CH2-), etileno (-CH2-CH2-), n-propileno, n-butileno, n-pentileno y nhexileno.

El término “alquenileno” se refiere a grupos de cadena lineal bivalente que tienen de 2 a 20 átomos de carbono, en donde al menos uno de los enlaces carbono-carbono es un enlace doble, mientras que otros enlaces pueden ser enlaces sencillos o enlaces dobles adicionales. El término “alquinileno” en el presente documento se refiere a grupos que tienen de 2 a 20 átomos de carbono, en donde al menos uno de los enlaces carbono-carbono es un enlace triple, mientras que otros enlaces pueden ser enlaces sencillos, dobles o triples adicionales. Los ejemplos de grupos alquenileno incluyen etenileno (-CH=CH-), 1-propenileno, 2-propenileno, 1-butenileno, 2-butenileno, 3-butenileno y similares. Los ejemplos de grupos alquinileno incluyen etinileno, 1-propinileno, 2-propinileno, etc.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cicloalquileno” pretende referirse a un anillo bivalente que forma parte de cualquier sistema monocíclico o policíclico estable, en donde dicho anillo tiene entre 3 y 12 átomos de carbono, pero ningún heteroátomo, y en donde tal anillo está completamente saturado, y el término “cicloalquenileno” se refiere a un anillo bivalente que forma parte de cualquier sistema monocíclico o policíclico estable, en donde tal anillo tiene entre 3 y 12 átomos de carbono, pero ningún heteroátomo, y en donde tal anillo está al menos parcialmente insaturado (pero excluyendo cualquier anillo de arileno). Los ejemplos de cicloalquilenos incluyen, pero no se limitan a, ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno y cicloheptileno. Los ejemplos de cicloalquenilenos incluyen, pero no se limitan a, ciclopentenileno y ciclohexenileno.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “heterocicloalquileno” y “heterocicloalquenileno” pretenden referirse a un anillo bivalente que forma parte de cualquier sistema de anillo monocíclico o policíclico estable, en donde tal anillo tiene entre 3 y aproximadamente 12 átomos, y en donde tal anillo consiste en átomos de carbono y al menos un heteroátomo, particularmente al menos un heteroátomo seleccionado independientemente del grupo que consiste en N, O y S, refiriéndose heterocicloalquileno a un anillo de este tipo que está completamente saturado, y refiriéndose heterocicloalquenileno a un anillo que está al menos parcialmente insaturado (pero excluyendo cualquier anillo de arileno o heteroarileno).

El término “arileno” pretende significar un anillo o sistema de anillos bivalente que forma parte de cualquier sistema monocíclico o policíclico estable, donde tal anillo o sistema de anillos tiene entre 3 y 20 átomos de carbono, pero no tiene ningún heteroátomo, y anillo o sistema de anillos que consiste en un resto aromático según se define por la regla de electrones n “4n+2”, incluido fenileno.

Como se usa en el presente documento, el término “heteroarileno” se refiere a un anillo o sistema de anillos bivalente que forma parte de cualquier sistema monocíclico o policíclico estable, en donde tal anillo o sistema de anillos tiene entre 3 y 20 átomos, anillo o sistema de anillos que consiste en un resto aromático como se define por la regla de electrones n “4n+2” y contiene átomos de carbono y uno o más heteroátomos de nitrógeno, azufre y/u oxígeno.

En el contexto de la presente invención, el término “sustituido” pretende indicar que uno o más hidrógenos presentes en la cadena principal de un enlazador se reemplazan con una selección del/de los grupo(s) indicado(s), siempre que no se exceda la valencia normal del átomo indicado, o la del átomo apropiado del grupo que se sustituye, y que la sustitución dé como resultado un compuesto estable. El término “opcionalmente sustituido” pretende significar que el enlazador no está sustituido o está sustituido, como se define en el presente documento, con uno o más sustituyentes, como se define en el presente documento. Cuando un sustituyente es un grupo ceto (u oxo, es decir =O), un grupo tio o imino o similar, entonces se reemplazan dos hidrógenos en el átomo de la cadena principal del enlazador. Los sustituyentes a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, acilo, aroílo, heteroaroílo, carboxilo, alcoxi, ariloxi, aciloxi, aroiloxi, heteroaroiloxi, alcoxicarbonilo, halógeno, (tio)éster, ciano, fosforilo, amino, imino, (tio)amido, sulfhidrilo, alquiltio, aciltio, sulfonilo, un sulfato, un sulfonato, un sulfamoílo, un sulfonamido, nitro, azido, haloalquilo, incluyendo perfluoroalquilo (tal como trifluorometilo), haloalcoxi, alquilsulfanilo, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, alquilsulfonilamino, arilsulfonoamino, fosforilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, alquilcarboxi, alquilcarboxiamida, oxo, hidroxi, mercapto, amino (opcionalmente mono- o disustituido, por ejemplo por alquilo, arilo o heteroarilo), imino, carboxamida, carbamoílo (opcionalmente mono- o disustituido, por ejemplo por alquilo, arilo o heteroarilo), amidino, aminosulfonilo, acilamino, aroilamino, (tio)ureido, (ariltio)ureido, alquil(tio)ureido, cicloalquil(tio)ureido, ariloxi, aralcoxi o -O(CH<2>)<n>-OH, -O(CH<2>)<n>-NH<2>, -O(CH<2>)<n>COOH, -(CH<2>)<n>COOH, -C(O)O(CH<2>)<n>R,-(CH<2>)<n>N(H)C(O)OR o -N(R)S(O)<2>R en donde n es 1-4 y R se selecciona independientemente de hidrógeno, -alquilo, -alquenilo, -alquinilo, -cicloalquilo, -cicloalquenilo, -(heterocicloalquilo unido a C), -(heterocicloalquenilo unido a C), -arilo y -heteroarilo, permitiéndose múltiples grados de sustitución. Los expertos en la técnica entenderán que los sustituyentes, como heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, alquilo, etc., o los grupos funcionales como -OH, -NHR, etc., pueden sustituirse ellos mismos, si es apropiado. Los expertos en la técnica también entenderán que los restos sustituidos también pueden sustituirse ellos mismos cuando sea apropiado.

En realizaciones particulares, el enlazador L comprende un resto seleccionado de uno de los siguientes restos: un disulfuro (-S-S-), un éter (-O-), un tioéter (-S-), una amina (-NH-), un éster (-O-C(=O)- o -C(=O)-O-), una carboxamida (-NH-C(=O)- o -C(=O)-NH-), un uretano (-NH-C(=O)-O- o -O-C(=O)-NH-) y un resto urea (-NH-C(=O)-NH-).

En realizaciones particulares de la presente invención, el enlazador L comprende un número de grupos m seleccionados de la lista de: alquileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, heteroalquileno, heteroalquenileno, heteroalquinileno, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno, aralquileno y un grupo heteroaralquileno, en donde cada grupo puede estar opcionalmente sustituido independientemente, el enlazador comprende además un número de restos n seleccionados independientemente de uno de los siguientes restos: un disulfuro (-S-S-), un éter (-O-), un tioéter (-S-), una amina (-NH-), un éster (-O-C(=O)- o -C(=O)-O-), una carboxamida (-NH-C(=O)- o -C(=O)-NH-), un uretano (-Nh -C(=O)-O- o -O-C(=O)-NH-) y un resto urea (-NH-C(=O)-NH-), en donde m = n+1. En realizaciones particulares, m es 2 y n es 1, o m es 3 y n es 2. En realizaciones particulares, el enlazador comprende 2 o 3 grupos alquileno no sustituidos, y 1 o 2, respectivamente, restos disulfuro, éter, tioéter, amina, éster, carboxamida, uretano o urea que unen los grupos alquileno no sustituidos.

En una realización particular, el enlazador L no comprende un grupo heteroarileno.

En realizaciones particulares, los átomos de C en la cadena lineal son independientemente parte de grupos metileno opcionalmente sustituidos (-CH<2>-). En tales realizaciones particulares, los sustituyentes opcionales se seleccionan independientemente de halógeno y alquilo C<1-6>, particularmente metilo.

En realizaciones particulares, el enlazador L es un enlazador estable.

En el contexto de la presente invención, el término “enlazador estable” se refiere a un enlazador que es estable (i) en presencia de enzimas, y (ii) en un entorno reductor intracelular.

En realizaciones particulares, el enlazador estable no contiene (i) una subestructura escindible por enzimas y/o (ii) un grupo disulfuro. En realizaciones particulares de este tipo, el enlazador tiene una longitud de hasta 12 átomos, particularmente de 2 a 10, más particularmente de 4 a 9 y lo más particularmente de 6 a 8 átomos.

En otras realizaciones particulares, el enlazador es un enlazador escindible.

En el contexto de la presente invención, el término “enlazador escindible” se refiere a un enlazador que es (i) escindible por una enzima, o (ii) un enlazador reducible. En realizaciones particulares, el término solo se refiere a un enlazador que es escindible por una enzima (no a un enlazador reducible).

En el contexto de la presente invención, el término “enlazador que es escindible... por una enzima” se refiere a un enlazador que puede escindirse por una enzima, particularmente por una peptidasa lisosomal, tal como catepsina B, dando como resultado la liberación intracelular de la carga de toxina conjugada con el anticuerpo de direccionamiento después de la internalización (véase Dubowchiket al.,Bioconjug Chem. 13 (2002) 855-69). En realizaciones particulares, el enlazador escindible comprende un dipéptido seleccionado de: Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Ala, Val-Ala, Phe-Cit y Val-Cit, particularmente en donde el enlazador escindible comprende además un espaciador de paminobencilo (PAB) entre los dipéptidos y la amatoxina.

En tales realizaciones particulares, el enlazador escindible comprende una estructura L<1>-L*-L<2>, en donde L* es el resto de dipéptido de p-aminobencilo, L<1>es una parte del enlazador que conecta L* a la amatoxina, en particular, en donde L<1>está conectado a L* por medio de un grupo -NH- o -O-, particularmente un grupo -C(=O)-NH-, un grupo -C(=O)-NH-O- o un grupo -C(=O)-O-, y en donde L<2>es una parte del enlazador que conecta L* al resto de unión a la diana, en particular donde L<2>está conectado a L* por medio de un resto -(CH<2>)<m>-, siendo m un número entero seleccionado de 1 a 8, en particular de 1 a 5, o por medio de un resto -(CH<2>CH<2>O<V>, siendo n un número entero seleccionado de 1 a 3, en particular de 1 a 2. Por ejemplo, en el caso del enlazador escindible que comprende el dipéptido Val-Ala, la estructura de L<1>-L*-L<2>Es como sigue:

En otras realizaciones particulares de este tipo, L* comprende el dipéptido Val-Lys y tiene la siguiente estructura:

En realizaciones particulares, el enlazador L1 es una cadena lineal de entre 1 y 4 átomos seleccionados independientemente de C, O, N y S, particularmente entre 1 y 3 átomos, más particularmente entre 1 y 2 átomos, e incluso más sólo 1 átomo. En realizaciones particulares, al menos el 50 % de los átomos en la cadena lineal son átomos de C. En realizaciones particulares, los átomos en la cadena lineal están unidos por enlaces sencillos.

En una realización particular, L1 es un grupo -NH- o -O- que forma parte de la amatoxina. En realizaciones particulares, L1 es un grupo -NH- que se origina a partir del grupo amino unido a la posición 6' del resto de triptófano central según la presente invención. En realizaciones particulares, L1 es un grupo -O- que se origina a partir del grupo hidroxilo que forma parte del grupo ácido carboxílico del residuo de aminoácido 1 de un derivado de amanina según la presente invención. En realizaciones particulares, L1 es un grupo -NH- que se origina a partir del grupo amino que forma parte del grupo carboxamida del residuo de aminoácido 1 de un derivado de amaninamida según la presente invención. En realizaciones particulares, L1 es un grupo -O- que se origina a partir de un grupo hidroxilo que forma parte del residuo de aminoácido 3 de un derivado de amanina o amaninamida según la presente invención.

En el contexto de la presente invención, el término “enlazador reducible” se refiere a un enlazador que puede escindirse en el entorno reductor intracelular, particularmente un enlazador que contiene grupos disulfuro, dando como resultado la liberación intracelular de la carga de toxina conjugada con el resto de unión a la diana después de la internalización por el entorno reductor intracelular (véase Shenet al.,J. Biol. Chem. 260 (1985) 10905-10908). En realizaciones particulares, el enlazador reducible comprende un resto

en donde R1 a R4 se seleccionan independientemente de H y metilo.

En tales realizaciones particulares, tal enlazador escindible tiene una longitud de hasta 20 átomos, particularmente de 6 a 18, más particularmente de 8 a 16, y lo más particularmente de 10 a 15 átomos. En tales realizaciones particulares, la parte del enlazador que une la amatoxina según la presente invención y el grupo disulfuro escindible es una cadena lineal de 3 o 4 átomos de C, particularmente 3 átomos de C. En realizaciones particulares, los 3 o 4 átomos de C en la cadena lineal están unidos por enlaces sencillos. En realizaciones particulares, el enlazador es un grupo n-propileno.

En realizaciones particulares, dicho enlazador está presente y está conectado en un lado al grupo amino unido al anillo de fenilo del resto de triptófano central, es decir, al sustituyente 6'-amino.

En otras realizaciones particulares, dicho enlazador está presente y está conectado en un lado a una posición en el derivado de amanitina de la presente invención, en donde dicha posición se selecciona de

(i) en el caso de S-desoxi-6'-amino-amaninamida o 6'-amino-amaninamida, el átomo de nitrógeno del grupo amida en el átomo de C y del aminoácido 1 de amatoxina (enlace amida);

(ii) en el caso de S-desoxi-6'-amino-amanina o 6'-amino-amanina, el átomo de oxígeno del grupo ácido en el átomo de C y del aminoácido 1 de amatoxina (enlace éster);

(iii) en el caso de un derivado de la amanitina de la presente invención, en donde el resto ácido carboxílico libre del aminoácido 1 se ha convertido en un resto -C(=O)NH-OR1, el átomo de oxígeno del grupo ácido hidroxámico en el átomo de C y del aminoácido 1 de amatoxina;

(iv) el átomo de oxígeno del grupo hidroxi en el átomo de C 5 del aminoácido 3 de amatoxina, particularmente por medio de un enlace éster, un enlace éter o un enlace uretano; o

(v) el nitrógeno del anillo del aminoácido 4.

El acoplamiento del enlazador al resto de unión a la diana puede lograrse mediante una variedad de métodos bien conocidos por un experto habitual en la técnica, particularmente en la técnica de conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC).

En realizaciones particulares, dicho enlazador está conectado al resto de unión a la diana por medio de un resto urea (...-enlazador-NH-C(=O)-NH-resto de unión a la diana). En realizaciones particulares de este tipo, el resto urea resulta de una reacción de una amina primaria originalmente presente en el resto de unión a la diana, tal como un grupo amino de una cadena lateral de lisina, con un derivado de ácido carbámico ...-enlazador-NH-C(O)-Z, en donde Z es un grupo saliente que puede reemplazarse por una amina primaria.

En otras realizaciones particulares, dicho enlazador está presente y está conectado al resto de unión a la diana por medio de un resto tioéter (...-enlazador-S-resto de unión a la diana). Por lo tanto, en tales realizaciones, la presente invención se refiere a un conjugado de fórmula genérica:

Amanitina - L - X* - S - Tbm,

en donde Amanitina es un derivado de amanitina según la presente invención, L es un enlazador, X* es un resto resultante del acoplamiento de un grupo tiol a un grupo reactivo con tiol, S es el átomo de azufre de dicho grupo tiol, particularmente el grupo tiol de un residuo de aminoácido cisteína, y Tbm es un resto de unión a la diana, particularmente un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo funcional que comprende dicho residuo de aminoácido cisteína. En realizaciones particulares, dicho residuo de aminoácido cisteína (i) está ubicado en un dominio de anticuerpo seleccionado de CL, CH1, CH2 y CH3; (ii) está ubicado en una posición, donde la secuencia de línea germinal que muestra la homología más cercana a la secuencia de dicho dominio de anticuerpo contiene un residuo de aminoácido diferente de cisteína; y (iii) está ubicado en una posición que está expuesta al disolvente.

En el contexto de la presente invención, el término “grupo reactivo con tiol” se refiere a un grupo que reacciona selectivamente con el grupo tiol de, por ejemplo, una cisteína libre de un anticuerpo, particularmente en un valor de pH en el intervalo entre 6,0 y 8,0, más particularmente en un valor de pH en el intervalo entre 6,5 y 7,5. En particular, el término “selectivamente” significa que menos del 10 % de las reacciones de acoplamiento de una molécula que comprende un grupo reactivo con tiol con un anticuerpo que comprende al menos un residuo de cisteína libre son reacciones de acoplamiento con residuos distintos de cisteína del anticuerpo, tales como residuos de lisina, particularmente menos del 5 %, más particularmente menos del 2 %. En realizaciones particulares, el grupo reactivo con tiol se selecciona de bromoacetamida, yodoacetamida, maleimida, una maleimida que tiene un grupo saliente en la posición 3, en particular un grupo saliente seleccionado de -Br, y tiol sustituido (véase, por ejemplo, el documento US 9,295,729), una 1,2-dihidropiridazin-3,6-diona que tiene un grupo saliente en la posición 4, en particular un grupo saliente seleccionado de -Br, y tiol sustituido (véase, por ejemplo, el documento US 9,295,729), metilsulfonilbenzotiazol, metilsulfonilfeniltetrazol, metilsulfonilfeniloxadiazol (véase Todaet al.,Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 52 (2013) 12592-6), un 3-arilpropionitrilo (véase Kolodychet al.,Bioconjugate Chem. 2015, 26, 197-200) y 5-nitro-piridin-2-il-disulfuro (... -L-S-S-(5-nitro-piridin-2-ilo).

En realizaciones particulares, dicha posición o grupo funcional, que está conectado en un lado al enlazador y que puede estar conectado directa o indirectamente a una posición o grupo funcional presente en un resto de unión a la diana, es un resto que puede reaccionar con dos grupos tiol presentes en un resto de unión a la diana o en dos restos de unión a la diana. En realizaciones particulares, los grupos reactivos con tiol son una maleimida que tiene dos grupos salientes en las posiciones 3 y 4, en particular seleccionados de 3,4-dibromomaleimida, 3,4-bis(ariltio)-maleimida, en particular 3,4-difeniltio-maleimida y 3,4-bis(heteroariltio)-maleimida, en particular 3,4-bis(2-piridinil-sulfanil)-maleimida, y. En otras realizaciones particulares, los grupos reactivos con tiol son una 1,2-dihidropiridazin-3,6-diona que tiene dos grupos salientes en las posiciones 4 y 5, en particular seleccionados de 4,5-bromo-1,2-dihidropiridazin-3,6-diona, 4,5-bis(ariltio)-1,2-dihidropiridazin-3,6-diona, en particular 4,5-difeniltio-1,2-dihidropiridazin-3,6-diona y 4,5-bis(heteroariltio)-1,2-dihidropiridazin-3,6-diona, en particular 4,5-bis(2-piridinil-sulfanil)-1,2-dihidropiridazin-3,6-diona.

En realizaciones particulares, el resto resultante del acoplamiento de un grupo tiol a un grupo reactivo con tiol se selecciona de: acetamida sustituida con tiol; succinimida sustituida con tiol; ácido succinámico sustituido con tiol; heteroarilo sustituido con tiol, particularmente benzotiazol sustituido con tiol, feniltetrazol sustituido con tiol y feniloxadiazol sustituido con tiol; y un disulfuro, en donde un átomo de azufre se deriva de un residuo de cisteína del anticuerpo. En realizaciones particulares, el resto resultante del acoplamiento de un grupo tiol a un grupo reactivo con tiol es una succinimida sustituida con tiol.

En realizaciones particulares, el enlazador L en el resto L-X*-S presente en la fórmula genérica de la sección [0092], se selecciona del siguiente grupo de restos:

(Lado de amanitina) -(CH<2>)<2>-S-S-(CH<2>)<2>-X-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -(CH<2>)<3>-S-S-(CH<2>)<2>-X-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -(CH<2>)<2>-S-S-(CH<2>)<3>-X-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -(CH<2>)<3>-S-S-(CH<2>)<3>-X-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -(CH<2>)<4>-S-S-(CH<2>)<4>-X-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -(CH<2>)<2>-Cme<2>-S-S-(CH<2>)<2>-X-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -(CH<2>)<2>-S-S-C-Me<2>-(C<2>)<2>-X-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -(CH<2>)<3>-S-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Cit-Val-CO(CH<2>)<5>-X-S- (lado de Tbm)

(Lado de amanitina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Ala-Val-CO(CH<2>)<5>-X-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Ala-Val-CO(CH<2>)<2>-X-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Ala-Phe-CO(CH<2>)<2>-X-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Lys-Phe-CO(CH<2>)<2>-X-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Cit-Phe-CO(CH<2>)<2>-X-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Val-Val-CO(CH<2>)<2>-X-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Ile-Val-CO(CH<2>)<2>-X-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-His-Val-CO(CH<2>)<2>-X-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Met-Val-CO(CH<2>)<2>-X-S- (lado de Tbm);

(Lado de amanitina) -CH<2>-C<6>H<4>-NH-Asn-Lys-CO(CH<2>)<2>-X-S- (lado de Tbm); y

en donde -NH- y -CO- que flanquean las secuencias dipeptídicas representan restos amino y carbonilo del enlazador que forman enlaces amida con el extremo carboxi y amino del dipéptido, respectivamente.

En el contexto de la presente invención, el término “un resto resultante del acoplamiento de un grupo tiol a un grupo reactivo con tiol” se refiere a una estructura que resulta de (i) la sustitución nucleofílica de un grupo saliente Y presente en un grupo reactivo con tiol por el átomo de azufre de un residuo de cisteína, por ejemplo un grupo bromoacetamida, una yodoacetamida, un grupo 4,6-dicloro-1,3,5-triazin-2-ilamino, una alquilsulfona o una heteroarilsulfona; (ii) la adición del grupo HS de un residuo de cisteína a un doble enlace activado de un grupo reactivo con tiol, por ejemplo maleimida, o (iii) un intercambio de disulfuro de un disulfuro activado o metanotiosulfonato con el átomo de azufre de un residuo de cisteína, por ejemplo con piridin-2-tiol, 5-nitropiridin-2-tiol o metanosulfinato como grupo saliente; o (iv) cualquier otra reacción química que dé como resultado un enlace estable entre el átomo de azufre de un residuo de cisteína y un resto reactivo que forma parte del grupo reactivo con tiol.

El resto primario resultante del acoplamiento del grupo tiol puede derivatizarse adicionalmente de manera opcional, por ejemplo, el succinimidil tioéter resultante de una maleimida puede hidrolizarse a tioéteres de ácido succinámico de las siguientes estructuras genéricas.

En otras realizaciones particulares, el acoplamiento específico de sitio puede lograrse reduciendo un puente disulfuro presente en el resto de unión a la diana y haciendo reaccionar los dos residuos de cisteína con un resto de puente X* presente en un constructo de amanitina - L - X* (véase Badescuetal.Bridging disulfides for stable and defined antibody drug conjugates. Bioconjugate Chemistry. 25 (2014) 1124-1136).

En una realización similar, el acoplamiento específico de sitio puede lograrse reduciendo un puente disulfuro presente en el resto de unión a la diana y haciendo reaccionar los dos residuos de cisteína con un resto de puente X* presente en una constructo de amanitina - L - X*, particularmente en donde X* es

(véase Brydenet al.,Bioconjug Chem, 25 (2014) 611-617; Schumacheret al.,Org Biomol Chem, 2014, 7261-7269).

En otra realización particular, el acoplamiento se logra mediante acoplamiento regioespecífico de un grupo amino presente en el enlazador a un residuo de glutamina presente en el resto de unión a la diana por medio de una transaminasa, particularmente mediante acoplamiento a la glutamina Q295 de un anticuerpo.

En una realización particular, el acoplamiento se logra mediante conjugación específica de sitio con restos de unión a la diana que comprenden cadenas laterales de N-glicano. En particular, la cadena lateral de N-glicano puede degradarse enzimáticamente, seguido de trans-glicosilación con una azido-galactosa. Usando química de clic, tal resto de unión a la diana modificado puede acoplarse a constructos modificados apropiadamente amanitina - L - X*, en donde X* es, por ejemplo, un dibenzo-ciclooctino (DIBO) o un resto análogo que comprende un triple enlace C-C. Por ejemplo, un constructo amanitina -L-NH2 puede acoplarse a DIBO-SE

mediante sustitución nucleofilica del resto hidroxisuccinimida. El constructo de DIBO-enlazador modificado resultante puede acoplarse luego al derivado de azido mencionado anteriormente. En una realización alternativa, el resto de unión a la diana puede modificarse mediante la incorporación de un aminoácido no natural que permita la química de clic, en particular mediante la incorporación de una para-azidometil-L-fenilalanina (pAMF).

En realizaciones particulares, el enlazador L en - L - X* es una cadena lineal de al menos 5, particularmente al menos 10, más particularmente entre 10 y 20 átomos seleccionados independientemente de C, O, N y S, particularmente entre 10 y 18 átomos, más particularmente entre 10 y 16 átomos, e incluso más particularmente entre 10 y 15 átomos. En realizaciones particulares, al menos el 60 % de los átomos en la cadena lineal son átomos de C. En realizaciones particulares, los átomos en la cadena lineal están unidos por enlaces sencillos.

En realizaciones alternativas, la posición o el grupo funcional, que puede estar conectado directa o indirectamente a una posición o grupo funcional presente en un resto de unión a la diana, no es un grupo etinilo o, más generalmente, no es un grupo alquinilo o no es un grupo que pueda reaccionar con un dipolo 1,3 en una cicloadición 1,3-dipolar (química de clic).

En otras realizaciones particulares, el acoplamiento específico de sitio de un constructo amanitina - L - X* a un resto de unión a la diana puede lograrse mediante la incorporación de un aminoácido no natural que comprende un grupo ceto, en particular p-acetilfenilalanina (pAcPhe), en el resto de unión a la diana, y mediante la reacción de tal resto de unión a la diana modificado con un constructo amanitina - L - X*, en donde X* es un resto hidroxilamina.

En una realización adicional, puede introducirse un grupo formilo mediante la enzima generadora de formilglicina (FGE), que es altamente selectiva para un grupo cisteína en una secuencia de reconocimiento CxPxR para generar una etiqueta de aldehído. Tal etiqueta de aldehído puede hacerse reaccionar con un grupo X* apropiado presente en un constructo amanitina - L - X*, en particular en donde X* es

(véase Agarwalet al.,Bioconjugate Chem 24 (2013) 846-851).

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el conjugado de la presente invención.

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado de la presente invención para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente, particularmente en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de páncreas, colangiocarcinoma, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer de riñón, melanoma maligno, leucemia y linfoma maligno.

Tal como se usa en el presente documento, “tratar”, “que trata” o “tratamiento” de una enfermedad o trastorno significa lograr uno o más de los siguientes: (a) reducir la gravedad del trastorno; (b) limitar o prevenir el desarrollo de síntomas característicos del trastorno o trastornos que están tratándose; (c) inhibir el empeoramiento de los síntomas característicos del trastorno o trastornos que están tratándose; (d) limitar o prevenir la recurrencia del trastorno o trastornos en pacientes que previamente han tenido el/los trastorno(s); y (e) limitar o prevenir la recurrencia de los síntomas en pacientes que previamente eran sintomáticos para el/los trastorno(s).

Como se usa en el presente documento, el tratamiento puede comprender administrar un conjugado o una composición farmacéutica según la presente invención a un paciente, en donde “administrar” incluye la administraciónin vivo,así como la administración directamente al tejidoex vivo,tal como injertos de vena.

En realizaciones particulares, se usa una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado de la presente invención.

Una “cantidad terapéuticamente eficaz” es una cantidad de un agente terapéutico suficiente para lograr el propósito previsto. La cantidad eficaz de un agente terapéutico determinado variará en función de factores como la naturaleza del agente, la vía de administración, el tamaño y la especie del animal que recibirá el agente terapéutico y el propósito de la administración. La cantidad eficaz en cada caso individual puede determinarla empíricamente un experto en la técnica según métodos establecidos en la técnica.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un derivado de amanitina según la presente invención, o un conjugado de la presente invención de un derivado de amanitina con un resto de unión a la diana, y que comprende además uno o más diluyentes, portadores, excipientes, cargas, aglutinantes, lubricantes, deslizantes, disgregantes, adsorbentes; y/o conservantes farmacéuticamente aceptables.

“Farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o incluido en la Farmacopea de los EE. UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos.

En realizaciones particulares, la composición farmacéutica se usa en forma de un medicamento administrado sistémicamente. Esto incluye parenterales, que comprenden entre otros inyectables e infusiones. Los inyectables se formulan en forma de ampollas o como los denominados inyectables listos para usar, por ejemplo, jeringas listas para usar o jeringas de un solo uso y, además, en frascos perforables para múltiples extracciones. La administración de inyectables puede ser en forma de aplicación subcutánea (s.c.), intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.) o intracutánea (i.c.). En particular, es posible producir las formulaciones de inyección adecuadas respectivamente como una suspensión de cristales, soluciones, nanopartículas o sistemas dispersos coloidales como, por ejemplo, hidrosoles.

Pueden producirse además formulaciones inyectables como concentrados, que pueden disolverse o dispersarse con diluyentes isotónicos acuosos. La infusión también puede prepararse en forma de soluciones isotónicas, emulsiones grasas, formulaciones liposomales y microemulsiones. De manera similar a los inyectables, también pueden prepararse formulaciones de infusión en forma de concentrados para dilución. También pueden aplicarse formulaciones inyectables en forma de infusiones permanentes tanto en terapias hospitalarias como ambulatorias, por ejemplo, mediante minibombas.

Es posible añadir a las formulaciones de fármacos parenterales, por ejemplo, albúmina, plasma, expansor, sustancias tensioactivas, diluyentes orgánicos, sustancias que influyen en el pH, sustancias complejantes o sustancias poliméricas, en particular como sustancias para influir en la adsorción de los conjugados de resto de unión a la dianatoxina de la invención a proteínas o polímeros o también pueden añadirse con el objetivo de reducir la adsorción de los conjugados de resto de unión a la diana-toxina de la invención a materiales como instrumentos de inyección o materiales de embalaje, por ejemplo, plástico o vidrio.

Los derivados de amanitina de la presente invención que comprenden un resto de unión a la diana pueden unirse a microportadores o nanopartículas en parenterales como, por ejemplo, a partículas finamente dispersas basadas en poli(met)acrilatos, polilactatos, poliglicolatos, poliaminoácidos o poliéter uretanos. Las formulaciones parenterales también pueden modificarse como preparaciones de depósito, por ejemplo, basándose en el “principio de múltiples unidades”, si los conjugados de resto de unión a la diana-toxina de la invención se introducen en forma finamente dispersa, dispersa y suspendida, respectivamente, o como una suspensión de cristales en el medicamento o basándose en el “principio de una sola unidad” si el conjugado de resto de unión a la diana-toxina de la invención está encerrado en una formulación, por ejemplo, en un comprimido o una varilla que se implanta posteriormente. Estos implantes o medicamentos de depósito en formulaciones de una sola y de múltiples unidades a menudo consisten en los denominados polímeros biodegradables como, por ejemplo, poliésteres de ácido láctico y ácido glicólico, poliéter uretanos, poliaminoácidos, poli(met)acrilatos o polisacáridos.

Los adyuvantes y portadores añadidos durante la producción de las composiciones farmacéuticas de la presente invención formuladas como parenterales son particularmenteaqua sterilizata(agua esterilizada), sustancias que influyen en el valor de pH como, por ejemplo, ácidos o bases orgánicos o inorgánicos, así como sales de los mismos, sustancias tamponantes para ajustar los valores de pH, sustancias para la isotonización como, por ejemplo, cloruro de sodio, hidrogenocarbonato de sodio, glucosa y fructosa, tensioactivos y surfactantes, respectivamente, y emulsionantes como, por ejemplo, ésteres parciales de ácidos grasos de polioxietilen sorbitanos (por ejemplo, Tween®) o, por ejemplo, ésteres de ácidos grasos de polioxietilenos (por ejemplo, Cremophor®), aceites grasos como, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja o aceite de ricino, ésteres sintéticos de ácidos grasos como, por ejemplo, oleato de etilo, miristato de isopropilo y aceite neutro (por ejemplo, Migloyl®) así como adyuvantes poliméricos como, por ejemplo, gelatina, dextrano, polivinilpirrolidona, aditivos que aumentan la solubilidad de disolventes orgánicos como, por ejemplo, propilenglicol, etanol, N,N-dimetilacetamida, propilenglicol o sustancias formadoras de complejos como, por ejemplo, citrato y urea, conservantes como, por ejemplo, éster hidroxipropílico y éster metílico de ácido benzoico, alcohol bencílico, antioxidantes como, por ejemplo, sulfito de sodio y estabilizadores como, por ejemplo, EDTA.

Al formular las composiciones farmacéuticas de la presente invención como suspensiones, en una realización preferida se añaden agentes espesantes para evitar el asentamiento de los conjugados de resto de unión a la diana-toxina de la invención o tensioactivos y polielectrolitos para garantizar la resuspendibilidad de los sedimentos y/o agentes formadores de complejos como, por ejemplo, EDTA. También es posible lograr complejos del principio activo con varios polímeros. Ejemplos de tales polímeros son polietilenglicol, poliestireno, carboximetilcelulosa, Pluronics® o éster de ácido graso de polietilenglicol sorbitol. Los conjugados de resto de unión a la diana-toxina de la invención también pueden incorporarse en formulaciones líquidas en forma de compuestos de inclusión, por ejemplo, con ciclodextrinas. En realizaciones particulares, pueden añadirse agentes dispersantes como adyuvantes adicionales. Para la producción de liofilizados, pueden usarse agentes de andamiaje como manita, dextrano, sacarosa, albúmina humana, lactosa, PVP o variedades de gelatina.

Ejemplos

A continuación, se explica la invención con más detalle mediante ejemplos no limitativos:

Síntesis total de 6'-amino-amaninamida (HDP 30.2528)

1. Preparación de N-(terc-butoxicarbonil)-6-nitro-L-triptófano HDP 30.2353

Se suspendieron 9,0 g (28,8 mmol) de 6-nitro-L-triptófano (preparado según Hu, Weimin; Zhang, Fengying; Xu, Zhengren; Liu, Qiang; Cui, Yuxin; Jia, Yanxing Organic Letters volumen 12 número 5 páginas 956-959 revista de 2010) en una mezcla de 60 ml de 1,4-dioxano y 30 ml de agua. Bajo argón, se añadieron 57,7 ml (57,7 mmol) de NaOH 1 N a temperatura ambiente. La solución resultante se enfrió en un baño de hielo a 0 °C y se trató con 7,3 ml (6,9 g; 31,7 mmol) de anhídrido Boc (Boc<2>O) La mezcla se agitó durante 2,5 horas a temperatura ambiente y se acidificó con KHSO<4>1 N a pH 3,0 usando un medidor de pH. La fase acuosa se extrajo tres veces con 75 ml de acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con solución saturada de NaCl y se secaron sobre MgSO<4>. La filtración y evaporación hasta sequedad dieron 9,7 g de material en bruto. El N-Boc-6-nitro-L-triptófano en bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida sobre una columna de gel de sílice de 330 g (longitud de onda de detección 254 nm) con un gradiente de CHCl<3>+ ácido acético al 1 % a CHC<h>/MeOH (9:1) ácido acético al 1 % y dio después de la evaporación y coevaporación con tolueno 3,8 g (38 %) de HDP30.2353 como un sólido blanco.

MS (ESI-) hallado: 348,07[M-H]<->; calc.: 348,12 (C<16>H<18>N<3>O<6>)

2. Preparación de N-(terc-butoxicarbonil)-6-amino-L-triptófano HDP 30.2375

Se disolvieron 6,9 g (19,9 mmol) de N-(terc-butoxicarbonil)-6-nitro-L-triptófano HDP 30.2353 en 250 ml de metanol. Se añadieron 1,7 g de paladio al 10 % sobre carbono y la mezcla se hidrogenó durante 19 horas con hidrógeno a temperatura ambiente y 1 bar. Se separó el catalizador por filtración y se evaporó la solución hasta sequedad. El producto en bruto fue un sólido de color beis que se usó para la siguiente etapa sin purificación adicional.

5,6 g (rendimiento del 89,0 %)

MS (ESI) hallado: 321,23[M+1]<+>; calc.: 320,16 (C<16>H<22>N<3>O<4>)

3. Preparación de N-(terc-butoxicarbonil)-L-6-trifluoroacetamino-triptófano HDP 30.2381

Se suspendieron 4,5 g (14,2 mmol) de N-(terc-butoxicarbonil)-6-amino-L-triptófano HDP30.2375 en 45 ml de tetrahidrofurano seco. Se añadieron bajo argón 12,0 ml (14,4 g, 101,1 mmol) de éster etílico del ácido trifluoroacético y 174 mg de dimetilaminopiridina (DMAP) a temperatura ambiente. La solución resultante se calentó a reflujo durante 7 h y se agitó durante 12 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad. El residuo sólido restante se disolvió en 150 ml de acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con ácido cítrico acuoso al 5 % y tres veces con agua y se secó sobre MgSO4. La filtración y evaporación hasta sequedad dieron 3,8 g de material en bruto. El N-(terc-butoxicarbonil)-L-6-trifluoroacetamino-triptófano en bruto HDP30.2381 se purificó mediante cromatografía ultrarrápida sobre una columna de gel de sílice de 330 g (longitud de onda de detección 254 nm) con un gradiente de CHCh ácido acético al 1 % a CHCh/MeOH (9:1) ácido acético al 1 %. Después de la evaporación y coevaporación con tolueno, se aisló HDP30.2381 como un sólido blanco (2,4 g, 41 %).

1H-RMN (400 MHz, CDCl3a, 5=ppm)

5 = 1,41 [s, 9H, C(CHa)a]; 3,13-3,18 (m, 2H); 4,46-4,53 (m, 1H); 6,88 (s, 1H); 7,40-7,42 (m, 1H); 7,71 (s, 1H); 6,43-6,48 (m, 1H)

13C-RMN (100 MHz, CDCl33, 5 = ppm)

5 = 28,23, 31,10, 54,21,69,49, 80,55, 104,39, 109,73, 113,31,114,74, 118,96, 124,32, 125,84, 129,52, 135,72, 154,83, 155,66, 175,70

MS (ESI-) hallado: 414,17 [M-H]-; calc.: 414,13 (C18H19F3N3O8)

MS (ESI-) hallado: 829,17 [2M-H]-; calc.: 829,26 (C36H39F6N6O19)

MS (ESI-) hallado: 1243,92 [3M-H]-; calc.: 1243,39 (C54H58F9N9O15)

4. Preparación de cis,trans-1 -(terc-butoxicarbonil)-2-carboxi-3a-hidroxi-6-trifluoroacetamino-1,2,3,3a,8,8ahexahidropirrolo[2,3-b]indol (cis-HDP 30.2416 y trans HDP 30.2416 (cis,trans-6-trifluoroacetamino-Hpi))

La fotooxigenación se llevó a cabo con una lámpara de vapor de sodio de alta presión de 400 W (lámpara Sirius X400 230 V, 400 W; 55.000 lúmenes a una distancia de 1,3 m) o alternativamente con una lámpara de tungsteno-halógeno (500 W). Se usó una luz de corte de solución de filtro (CuCl2-CaCO3) con A < 490 nm para una lámpara de tungstenohalógeno.

Se usó azul de metileno o rosa de Bengala como colorante sensibilizador.

La reacción se llevó a cabo en un recipiente de reacción cilíndrico de 500 ml con camisa de intercambio de calor hecha de vidrio de borosilicato DURAN®, fondo plano y brida de laboratorio plana (DN) con dos conectores con rosca GL 18. La distancia de la lámpara al recipiente de reacción fue de 15 cm y la temperatura de reacción estaba en un intervalo de 3-4 °C.

Se burbujeó oxígeno seco (99,5 % de pureza) a través de la mezcla de reacción a una velocidad de 2-4 l por minuto.

El producto final se purificó en un sistema de cromatografía ultrarrápida Teledyne ISCO con una columna ultrarrápida Redi Sept de sílice de 330 g (Teledyne ISCO cat. 69-2203-330). Los disolventes CH2Cl2, CH3OH, CH3COOH eran de calidad para HPLC o BP estándar.

Se disolvieron 2,30 g (5,54 mmol) de N-(terc-butoxicarbonil)-6-trifluoracetilamino-L-triptófano HDP 30.2381 y 160 mg de rosa de Bengala en 500 ml de metanol y se enfriaron hasta 3 °C usando un criostato Huber con glicol/agua como medio de enfriamiento. La solución de reacción se irradió con la lámpara de vapor de sodio de alta presión de 400 W. Durante la irradiación, se burbujeó una corriente lenta de oxígeno a través de la solución de reacción. Después de 4 h de irradiación, se detuvieron la oxigenación y el enfriamiento y el medio de reacción se trató con 15 ml de sulfuro de dimetilo. La mezcla se agitó durante 2 h y se evaporó hasta sequedad usando un evaporador rotatorio con una temperatura de baño de agua de 35 °C. El residuo rojo oscuro se secó adicionalmente al vacío alto hasta obtener un sólido cristalino (2,67 g). El producto en bruto se purificó en una columna de gel de sílice de 330 g (longitud de onda de detección de 254 nm) con un gradiente de CH2CL ácido acético al 5 % a CH2Cl2/MeOH (15:1) ácido acético al 5 %. Rendimiento 163 mg (8%) de cis-HDP 30.2416 y 466 mg (20%) de trans-HDP 30.2416 junto con 297 mg de mezcla cis/trans. El producto se coevaporó con tolueno. Después de la liofilización en terc-butanol, ambos isómeros se obtuvieron como polvos blanquecinos.

cis-1-(terc-Butoxicarbonil)-2-carboxi-3a-hidroxi-6-trifluoroacetamino-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrolo[2,3-b]indol (cis-HDP 30.2416)

1H-RMN (400 MHz, CD3OD, 5 = ppm)

5 = 1,43, 1,54 (s, 9H, C(CH3)3); 2,45-2,63 (m, 2H, CH<2>); 4,12-4,27 (m, 1H, 2-H); 5,35 (d, 1H, 8a-H); 6,92-7,12 (m, 2H, 7-H, 5-H); 7,20-7,25 (m, 1H, 4-H)

13C-RMN (100 MHz, CD<3>OD, 5 = ppm)

5 = 28,70, 31,11,42,81,61,73, 82,18, 85,11,86,75, 104,20, 112,86, 124,64, 129,46, 139,21, 151,17, 156,06, 176,14 MS (ESI<+>) hallado: 432,00 [M+H]<+>; calc.: 432,14 (C<18>H<21>F<3>N<3>O<6>)

MS (ESI<+>) hallado: 454,17 [M+Na]<+>; calc.: 454,13 (C<18>H<2ü>F<3>N<3>NaO<6>)

MS (ESI<+>) hallado: 862,92 [2M+H]<+>; calc.: 863,26 (C<36>H<41>F<6>N<6>O<12>)

MS (ESI<+>) hallado: 885,08 [2M+Na]<+>; calc.: 885,26 (C<36>H<4ü>F<6>N<6>NaO<12>)

MS (ESI<+>) hallado: 1315,67 [3M+Na]<+>; calc.: 1316,39 (C<54>H<s0>F<9>N<9>NaO<18>)

UV/VIS (CH<3>OH): A<máx.>= 309 nm, 231 nm

Amín. = 285 nm

trans-1-(terc-Butoxicarbonil)-2-carboxi-3a-hidroxi-6-acetoxi-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrolo[2,3-b]indol (trans-HDP 30.2416)

1H-RMN (400 MHz, CD<3>OD, 5 = ppm)

5 = 1,44, 1,54 (s, 9H, C(CH3)3); 2,56-2,72 (m, 2H, CH<2>); 4,50-4,56 (m, 1H, 2-H); 5,19-5,22 (d, 1H, 8a-H); 6,90-7,05 (m, 2H, 7-H, 5-H); 7,17-7,18 (m, 1H, 4-H)

13C-RMN (100 MHz, CD<3>OD, 5=ppm)

5 = 28,05, 31,12, 40,40, 60,94, 69,45, 82,01, 84,87, 86,81, 103,65, 112,25, 124,95, 128,55, 139,46, 152,30, 156,05, 174,67

MS (ESI<+>) hallado: 432,08 [M+H]<+>; calc.: 432,14 (C<18>H<21>F<3>N<3>O<6>)

MS (ESI<+>) hallado: 454,17 [M+Na]<+>; calc.: 454,13 (C<18>H<20>F<3>N<3>NaO<6>)

MS (ESI<+>) hallado: 863,00 [2M+H]<+>; calc.: 863,26 (C<36>H<41>F<6>N<6>O<12>)

UV/VIS (CH<3>OH): A<max>= 312 nm, 233 nm

A<mín.>= 286 nm

5. Síntesis en fase sólida de HDP 30.2528

Etapa 1: HDP 30.0013

Se suspendió FmocHypOH (10,0 g, 28,3 mmol) en 100 ml de MeOH al 80 % y se añadió Cs2CO3 (4,6 g, 14,1 mmol). La suspensión se agitó a 50 °C durante 30 minutos hasta su disolución completa. La mezcla de reacción se concentró hasta sequedad y volvió a disolverse en 100 ml de DMF. Se añadió gota a gota bromuro de alilo (1,6 ml, 3,6 g, 29,7 mmol) y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se eliminó por destilación DMF y el residuo se disolvió en terc-butil metil éter. Los precipitados se filtraron y la solución transparente se absorbió sobre Celite antes de la cromatografía en columna. El compuesto se purificó en 220 g de gel de sílice con gradiente de n-hexano/acetato de etilo.

Rendimiento: 11,5 g, 100 %.

Etapa 2: HDP 30.0400

Se añadieron HDP 30.0013 (5,0 g, 14,1 mmol) y 4-toluenosulfonato de piridinio (1,33 g, 5,3 mmol) a una suspensión de resina de 1,3-dihidro-2H-piran-2-il-metoximetilo (5,0 g, 1,0 mmol/g de THP-resina) en 40 ml de dicloroetano. La reacción se agitó a 80 °C durante la noche. Después de enfriar, la resina se filtró y se lavó exhaustivamente con dicloroetano, dimetilformamida, acetonitrilo, diclorometano y terc-butil metil éter.

La carga fue de 0,62 mmol/g (determinada por espectroscopia UV del grupo fluorenilmetilo después de la desprotección).

Etapa 3: HDP 30.2516 (síntesis en fase sólida)

Pretratamiento de resina:

Se trató HDP 30.0400 (0,31 g, 0,25 mmol) con ácido N,N-dimetilbarbitúrico (241 mg, 1,55 mmol) y Pd(PPh3)4 (35 mg, 0,03 mmol). La resina se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de eso, la resina se lavó exhaustivamente con diclorometano, DMF, acetonitrilo, diclorometano y terc-butil metil éter y se secó a presión reducida.

Procedimiento de acoplamiento:

Todos los reactivos y reactantes se disolvieron en diclorometano/DMF (1:1, v/v). Se disolvió HDP 30.0477 (descrito en el documento EP 2872479B1) (102 mg, 0,30 mmol) en 6,0 ml de diclorometano/N,N-dimetilformamida y se trató con 4,0 ml de una solución 0,2 N de PyBOP/HOBt y 2 ml de DIEA (40 % en DMF). Después de la adición de 2,0 ml de N,N-dimetilformamida, la reacción se calentó hasta 50 °C durante 8 minutos mediante irradiación de microondas (20 W, reactor de microondas CEM) y se lavó con N,N-dimetilformamida después del acoplamiento.

Desprotección de Fmoc:

La desprotección se realizó mediante la adición de 6,0 ml de piperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida a 50 °C durante 10 minutos. La resina se lavó con N,N-dimetilformamida (sin desprotección después del acoplamiento del aminoácido final).

Todos los demás aminoácidos se acoplaron siguiendo el protocolo anterior, las ponderaciones se muestran a continuación:

(0,102 g, 0,30 mmol 1,5 eq. HDP30.0477 PM: 39,6, véase anteriormente)

0,72 g, 1,2 mmol 5,0 eq. FmocAsn(Trt)OH PM: 599,7

0,71 g, 1,2 mmol 5,0 eq. FmocCys(OT rt)OH PM: 586,7

0,36 g, 1,2 mmol 5,0 eq. FmocGlyOH PM: 297,3

0,36 g, 1,2 mmol 5,0 eq. FmoclleOH PM: 353,4

0,36 g, 1,2 mmol 5,0 eq. FmocGlyOH PM: 297,3

0,161 g, 0,37 mmol 1,5 eq. HDP30.2416 PM: 431,1

Tras la finalización, la resina se transfirió finalmente a una jeringa con frita inferior, se lavó con DCM y se secó a presión reducida.

Liberación de resina y formación del anillo B

Se aspiró una solución de 5 ml de TFA, 5 ml de DCM más MeOH al 10 % a la resina y se agitó durante 15 min a temperatura ambiente. La solución se dispensó en un matraz de reacción de 50 ml y la resina se lavó con TFA/DCM 1:1 más MeOH 10 % una vez y se vertió en el mismo matraz. El matraz de reacción se agitó durante 16 h. Se añadió triisopropilsilano (0,5 ml) y la reacción se concentró al vacío. El residuo se disolvió en 500 pl de MeOH y el péptido se precipitó en 50 ml de TBM<e>helado. Después de la centrifugación, el sobrenadante se decantó y el precipitado se lavó una vez con 50 ml de TBME y se secó a presión reducida.

El precipitado se solubilizó en 2 ml de metanol y se purificó mediante cromatografía preparativa en columna de fase inversa. El metanol se eliminó por destilación a presión reducida y la fase acuosa restante se liofilizó.

Rendimiento: 113 mg, 41 %.

MS (ESI+) hallado: 1100,4 [M+H]+; calc.: 1100,1 (C48H60F3N11O16S)

HPLC: 99,1 % del área.

Etapa 4: ciclización (formación del anillo A, HDP 30.2524)

El producto intermedio monocíclico liofilizado anterior HDP 30.2516 (113 mg, 104 pmol) se disolvió en 5 ml de DMF y se trató con difenilfosforilazida (DPPA, 28 pl, 522 pmol, 5 eq.) y diisopropiletilamina (DIEA, 88 pl, 522 pmol, 5 eq.). La reacción se agitó durante 16 h y se extinguió con 500 pl de agua tras la finalización. La conversión se monitorizó mediante HPLC. La mezcla se concentró a presión reducida, volvió a disolverse en 1 ml de metanol y se purificó mediante cromatografía en columna preparativa de fase inversa.

Rendimiento: 43,6 mg, 38,6 %

MS (ESI<+>) hallado: 1082,33 [M+H]<+>; calc.: 1082,1 (C<45>H<58>F<3>N<11>O<15>S)

HPLC: 97,8 % del área.

Etapa 5: Desprotección de acetato (HDP 30.2528)

Se disolvió HDP 30.2524 (33,6 mg, 31,1 gmol) en solución de NH<3>metanólica 7 N (5,0 ml) y se agitó. La conversión se verificó mediante HPLC/MS. Después de la finalización (6 - 8 h), la reacción se concentró al vacío, se resuspendió en 100 |ul de MeOH y se purificó mediante HPLC preparativa.

Rendimiento: 17,8 mg, 63,5 %

HPLC:100 %

MS (ESI<+>) hallado: 902,4 [M+H]<+>; calc.: 902,00 (C<39>H<55>N<11>O<12>S)

hallado: 924,3 [M+Na]<+>

6. Preparación de 6-maleimidopropionil-L-Val-L-Al-PABA-S-desoxi-amanitina HDP 30.2560

6.1 Preparación de maleimidopropionil-L-Val-L-Ala-PABA HDP 30.2559

Se disolvieron 5,87 g (10 mmol) de NH<2>-L-Val-L-Ala-PABA (preparado según el documento WO 2014/197871) en 100 ml de dimetilformamida seca (DMF). Bajo argón, se añadieron de una vez 2,66 g (10 mmol) de ácido 3-(maleimido)propiónico-N-hidroxisuccinimida (BMPS) y 3,40 ml (20 mmol) de diisopropiletilamina (DIPEA). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La DMF se evaporó al vacío y el residuo se trató con 150 ml de metil-terc-butil éter. El disolvente orgánico se descartó y el residuo (4,57 g) se purificó en una columna de gel de sílice de 120 g (longitud de onda de detección de 246 nm) con un gradiente de CH<2>Cl<2>a CH<2>Cl<2>/MeOH (9:1). Se obtuvieron 1,98 g (rendimiento del 44,6 %) de HDP30.2559 como un sólido marrón.

MS (ESI+) hallado: 445,17 [M+H]+; calc.: 445,21 (C22H29N4O6)

MS (ESI+) hallado: 467,25 [M+Na]+; calc.: 467,19 (C22H28N4NaO6)

MS (ESI+) hallado: 911,00 [2M+Na]+; calc.: 911,39 (C44H56N8NaO12)

1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6)

5 = 9,76 (s, 1H), 8,12 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 8,00 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,58 - 7,51 (m, 2H), 7,27 - 7,21 (m, 2H), 6,99 (s, 2H), 5,06 (s, 1H), 4,43 (s, 2H), 4,39 (q, J = 7,1 Hz, 1H), 4,13 (dd, J = 8,3, 6,7 Hz, 1H), 3,69 - 3,55 (m, 2H), 2,49 - 2,40 (m, 2H), 2,03 - 1,89 (m, J = 6,5 Hz, 1H), 1,31 (d, J = 7,1 Hz, 3H), 0,86 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,83 (d, J = 6,8 Hz, 3H). 13C-RMN (126 MHz, DMSO-d6)

5 = 170,78, 170,64, 170,62, 169,73, 137,47, 137,30, 134,44, 126,80, 118,78, 62,52, 57,71,48,93, 33,96, 33,64, 30,18, 19,02, 18,07, 17,83, 0,01.

6.2 Preparación de maleimidopropionil-L-Val-L-Ala-PABA-4-nitrofenil-carboxilato HDP 30.2586

Se disolvieron 200,0 mg (0,45 mmol) de maleimidopropionil-L-Val-L-Ala-PABA HDP30.2559 en 4 ml de dimetilformamida seca (DMF). Se añadieron 273,9 mg (0,90 mmol) de bis-(4-nitrofenil-carbonato) y 117,6 |ul de DIPEA (87,3 mg, 0,68 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante tres horas a temperatura ambiente bajo argón. La mezcla de reacción se precipitó con 40 ml de n-hexano/MTBE frío 1:1 y se separó con una centrífuga. El sólido se lavó dos veces con MTBE frío y se filtró. El sólido restante es lo suficientemente puro para la siguiente etapa.

Rendimiento 231,3 mg (84,3 %) de un sólido blanco.

MS (ESI+) hallado: 610,08 [M+H]+; calc.: 609,21 (C29H31N5O10)

MS (ESI+) hallado: 632,25 [M+Na]+; calc.: 632,42 (C29H31N5NaO1ü)

MS (ESI+) hallado: 1241,00 [2M+Na]+; calc.: 1241,42 (C58H62N10NaO20)

6.3 Preparación de 6-maleimidopropionil-L-Val-L-Al-PABA-S-desoxi-6-amino-amanitina HDP 30.2560

Se disolvieron 6,73 mg (6,62 |umol) de 6-amino-S-desoxi-amanitina HDP30.2528 y 4,04 mg (6,62 |umol) de maleimidopropionil-L-Val-L-Ala-PABA-4-nitrofenil-carboxilato HDP30.2586 en 100 |ul de dimetilformamida seca (DMF). Se añadieron 207 |ul de la siguiente solución, 9,02 mg (66,2 |umol) de 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) en 2070 |ul de dimetilformamida seca, seguido de 5,77 |ul (33,6 |umol) de diisopropiletilamina (DIPEA). La solución se agitó durante 7 horas a temperatura ambiente bajo argón. El disolvente se evaporó hasta sequedad en alto vacío y el producto en bruto se purificó mediante HPLC RP18 (Luna™ 10 |u, 250 x 21 mm, Phenomenex®, 290 nm) con un gradiente del 95 % de H2O/5 % de MeOH al 95 % de MeOH/5 % de H2O y un caudal de 15 ml/min. La fracción pura se evaporó hasta sequedad y se liofilizó en agua produciendo 3,71 mg (41 %) de HDP30.2560 como un sólido amorfo.

MS (ESI+) hallado: 1394,50 [M+Na]+; calc.: 1394,56 (C62Hs1N15NaO19S)

7. Preparación de 6-maleimidohexenoil-L-Val-L-Ala-PAB-S-desoxi-6-aminoamanitina HDP 30.2540

Se preparó 6-(maleimido)hexanoil-L-Val-L-Ala-PABA-4-nitrofenil-carboxilato (HDP 30.2079) de manera análoga a la etapa 6.1/6.2 con éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 6-(maleimido)hexanoico (EMCS) como material de partida.

1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) d 9,96 (s, 1H), 8,35 - 8,27 (m, 2H), 8,11 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 7,77 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,65 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,60 - 7,53 (m, 2H), 7,41 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 6,98 (s, 2H), 5,25 (s, 2H), 4,41 (p, J = 7,1 Hz, 1H), 4,18 (dd, J = 8 ,6 , 6,8 Hz, 1H), 3,37 (t, J = 7,1 Hz, 2H), 2,24 - 2,08 (m, 2H), 1,98 (h, J = 6,8 Hz, 1H), 1,58 - 1,42 (m, 4H), 1,32 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,20 (p, J = 7,6 Hz, 2H), 0,88 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,84 (d, J = 6,8 Hz, 3H).

13C-RMN (126 MHz, DMSO-d6) 172,21, 171,10, 170,91, 170,89, 155,19, 151,82, 145,08, 139,32, 134,30, 129,28, 129,18, 125,25, 122,44, 118,98, 70,16, 57,50, 48,96, 36,92, 34,83, 30,23, 27,64, 25,69, 24,77, 19,09, 18,06, 17,78.

MS (ESI+) hallado: 674,36 [M+ Na]+; calc.: 674,24 (C32H37N5NaO1ü)

Se acopló HDP 30.2528 (5 mg, 5,5 pmol) con HDP 30.2079 (7,1 mg, 11,0 pmol) en 275 pl de DMF y se añadió diisopropiletilamina (9,4 pl, 55 pmol). Después de 16 h, se añadieron HDP 30.2079 (3,5 mg, 5,4 pmol) y diisopropiletilamina (9,4 pl, 55 pmol). La reacción se agitó durante 4 días. La mezcla de reacción se purificó directamente mediante cromatografía preparativa.

Rendimiento: 1,18 mg, 15,2 %.

HPLC:100%.

MS (ESI+) hallado: 1437,6 [M+ Na]+; calc.: 1414,7 (C65H87N15O19S)

8. Síntesis de conjugados de HDP 30.2540 y 30.2560

Ejemplo: Síntesis de T-D265C-30.2560:

Se usaron 10 mg de Thiomab T-D265C en tampón PBS para la conjugación con HDP 30.2560.

Ajustar la solución de anticuerpos a EDTA 1 mM:

2 ml de solución de anticuerpos (10,0 mg) 20 pl de EDTA 100 mM, pH 8,0

Cantidad de anticuerpos: 10 mg = 6,9 x 10-8 mol

Desencapsulamiento de cisteínas mediante reacción de anticuerpo con 40 eq. de TCEP:

- 2 ml de solución de anticuerpos (6,9 x 10-8 mol) 55,2 pl de solución de TCEP 50 mM (2,76 x 10-6 mol) - Incubar durante 3 h a 37 °C en un agitador.

- Dos diálisis consecutivas a 4 °C en 2,0 l de PBS 1x, EDTA 1 mM, pH 7,4 en un casete de diálisis Slide-A-Lyzer de 20000 de MWCO, primera diálisis de aproximadamente 4 h, segunda diálisis durante la noche.

Oxidación por reacción del anticuerpo con 20 eq. de ácido deshidroascórbico (dhAA):

- aprox. 2 ml de solución de anticuerpos (6,9 x 10-8 mol) 27,6 pl de solución de dhAA 50 mM nueva (1,38 x 10-6 mol) - Incubar durante 3 h a temperatura ambiente en un agitador.

Conjugación con amanitina usando 6 eq. de HDP 30.2560 y extinción con 25 eq. de N-acetil-L-cisteína:

Solubilizar 2 mg de HDP 30.2560 en 200 pl de DMSO = 10 pg/pl

- aprox.2 ml de solución de anticuerpos (= 9,5 mg; 6,53 x 10-8mol) 53,8 pl de HDP 30.2560 (= 538 pg; 3,92 x 10-7 mol). - Incubar 1 h a TA.

- Extinguir mediante la adición de 16,3 pl de N-acetil-L-cisteína 100 mM (1,63 x 10-6 mol).

- Incubar 15 minutos a TA (o durante la noche a 4 °C).

- Purificar la mezcla de reacción con 1 columna PD-10 equilibrada con PBS 1x, pH 7,4. Identificar las fracciones que contienen proteínas con reactivo de Bradford sobre parafilm y reunir las fracciones que contienen proteínas. - Diálisis de la solución de anticuerpos a 4 °C durante la noche en 2,0 l de PBS, pH 7,4 y casetes de diálisis Slide-A-Lyzer de 20000 de MWCO.

Determinación de la relación fármaco-anticuerpo (DAR) mediante análisis de LC-ESI-MS.

Ajustar la concentración de proteína a 5,0 mg/ml (3,4 x 10-5 M) y esterilizar por filtración. Almacenar a 4 °C.

Se produjeron ADC con un anticuerpo diferente o con HDP 30.2540 por consiguiente. La cantidad molecular del anticuerpo se calculó según el PM del anticuerpo respectivo. Las cantidades de toxina enlazadora, TCEP, dhAA y N-acetil-L-cisteína se ajustaron por consiguiente para alcanzar los respectivos equivalentes.

9. Citotoxicidadin vitrode 6'-amino-amaninamida 30.2528

Ensayo de proliferación celular de BrdU en células HEK293 y HEK293 OATP1B3

Se recubrieron placas de cultivo de células HEK293-OATP1B3 con poli-D-lisina.

Recubrimiento con poli-D-lisina:

° 5 mg de poli D-lisina en 50 ml de agua estéril

° 50 pl en cada pocillo de una placa de 96 pocillos

° Incubación durante 1 h a TA

° Lavado de los pocillos dos veces con 200 pl de agua estéril

° Secado durante al menos 2 h (TA)

Se prepararon placas negras de 96 pocillos con fondo transparente con 2,0 x 103 células HEK293 y HEK293 OATP1B3 por pocillo y 90 pl de medio de crecimiento por pocillo, incluido un 10 % de FCS y suplementos. Controles: el “blanco” se preparó con 100 pl de medio sin células, el “fondo” y el “100 %” se prepararon con células en 100 pl de medio. • Incubación durante 24 h a 37 °C y un 5 % de CO2.

Esquema de dilución de HDP 30.2528 y alfa-amanitina:

Las soluciones madre se diluyeron 1:1.000 (dilución 1:10 y 1:100) en medio: 10 pl de solución madre de derivado de amanitina (1,0 x 10-2 M) 90 pl de PBS = 100 pl de 1,0 x 10-3 M 2

2 pl de dilución 198 pl de medio = 200 pl de 1 x 10-5 M

Diluciones adicionales:

A: 200 μl de 1,0x10-5 M

B: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución A (dilución 1:5)

C: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución B (dilución 1:5)

D: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución C (dilución 1:5)

E: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución D (dilución 1:5)

F: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución E (dilución 1:5)

G: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución F (dilución 1:5)

H: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución G (dilución 1:5)

Se añadieron 10 μl de cada solución a pocilios por triplicado. Volumen final: 100 μl/pocillo. Dosis final: partiendo de 1 x 10-6 M; serie de dilución 1:5.

• Incubación durante 96 h a 37 °C y un 5 % de CO2.

• Después de 96 h: Ensayo de proliferación celular de Roche, luminiscente según instrucciones del fabricante. • CE50-Las concentraciones se determinaron con el software de análisis de datos Graphpad Prism 4.0.

10. : Citotoxicidadin vitrode conjugados de HDP 30.2560 y HDP 30.2540

Ensayo de proliferación celular de BrdU en células SKBR-3, JIMT-1, LnCap y 22rv1

El ensayo se realizó como se describió anteriormente (9.) con los siguientes cambios:

Las placas de cultivo celular no se recubrieron con poli-D-lisina.

• Esquema de dilución de ADC:

• Las soluciones madre se diluyeron hasta 1,0 x 10-6 M en medio de crecimiento

Diluciones adicionales:

A: 100 μl de 1,0 x 10-6 M

B: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución A (dilución 1:5)

C: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución B (dilución 1:5)

D: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución C (dilución 1:5)

E: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución D (dilución 1:5)

F: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución E (dilución 1:5)

G: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución F (dilución 1:5)

H: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución G (dilución 1:5)

• Se añadieron 10 μl de cada solución a pocilios por triplicado. Volumen final: 100 μl/pocillo. Dosis final: partiendo de 1x10-7 M; serie de dilución 1:5

Ensayo WST-I en células Raji y células Nalm-6:

• Se prepararon placas de 96 pocilios con fondo en F transparente con 2,0 x 103 células/pocillo y 90 μl del medio de crecimiento respectivo por pocilio, incluido un 10 % de FCS y suplementos. Controles: el “blanco” se preparó con 100 gl de medio sin células; el “solo células” se preparó con células en 100 μl de medio.

• Incubación durante 24 h a 37 °C y un 5 % de CO2.

• Esquema de dilución de ADC:

Diluciones adicionales:

A: 100 μl de 1,0 x 10-6 M

B: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución A (dilución 1:5)

C: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución B (dilución 1:5)

D: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución C (dilución 1:5)

E: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución D (dilución 1:5)

F: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución E (dilución 1:5)

G: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución F (dilución 1:5)

H: 80 μl de medio de crecimiento 20 μl de solución G (dilución 1:5)

• Incubación durante 96 h a 37 °C y un 5 % de CO2.

• Después de 96 h: ensayo de proliferación celular Roche WST-1 según las instrucciones del fabricante.

• CE50-Las concentraciones se determinaron con el software de análisis de datos Graphpad Prism 4.0.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un derivado amino-sustituido de 2-carboxi-3a-hidroxi-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrolo[2,3-b]indol según la fórmula I

en donde R1 se selecciona de alquilo, arilo, heteroarilo, alquilo sustituido, arilo sustituido y heteroarilo sustituido; P1, P2 se seleccionan independientemente de un hidrógeno y un grupo protector, en donde el grupo protector, cuando está presente, se selecciona independientemente de Boc, PhCH2OCO-, CH2=CHCH2O-CO-, tritilo, un grupo acilo y un grupo alquilo; R2 se selecciona de H, alquilo, arilo, alquilo sustituido y arilo sustituido; R3 se selecciona de OH, OR1 y una cadena polipeptídica que consiste en 1 -7 residuos de aminoácidos.
2. El derivado amino-sustituido de 2-carboxi-3a-hidroxi-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrolo[2,3-b]indol según la reivindicación 1, en donde R1 es CF3.
3. Un método para la síntesis de un precursor lineal que comprende ocho residuos de aminoácidos de un derivado de amanitina que comprende un resto de triptófano 6'-amino-sustituido en el extremo N-terminal del precursor lineal y una dihidroxiisoleucina en el extremo C-terminal del precursor lineal, que comprende la etapa de usar un derivado aminosustituido de 2-carboxi-3a-hidroxi-1,2,3,3a,8,8a-hexahidropirrolo[2,3-b]indol de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en la síntesis peptídica de dicho precursor, en donde los residuos de aminoácidos de dicho precursor lineal son un residuo de ácido aspártico o asparagina en la posición 1; un residuo de prolina o un residuo de hidroxiprolina en la posición 2; una isoleucina, hidroxi-isoleucina o dihidroxiisoleucina en la posición 3; un residuo de hidroxitriptófano en la posición 4; residuos de glicina en las posiciones 5 y 7; un residuo de isoleucina en la posición 6; y un residuo de cisteína en la posición 8.
4. Un método para la síntesis de un derivado de amanitina que comprende un resto de triptófano 6'-amino-sustituido, que comprende las etapas de. (i) provocar o permitir la formación de un enlace entre el residuo de cisteína y el resto de triptófano del precursor lineal como se define en la reivindicación 3; y (ii) provocar o permitir la formación de dicho derivado de amanitina haciendo reaccionar el extremo N-terminal del precursor lineal de la reivindicación 3 con el extremo C-terminal de dicho precursor.
5. El método de la reivindicación 4, que comprende además la oxidación del átomo de azufre del resto de cisteína para formar un sulfóxido o una sulfona.
6. El método de la reivindicación 4, que comprende la oxidación del átomo de azufre del resto de cisteína para formar un sulfóxido.
7. Un derivado de amanitina que comprende un resto de triptófano 6'-amino-sustituido, que se selecciona de (i) S-desoxi-6'-amino-amanina, 6'-amino-amanina, (ii) S-desoxi-6'-amino-amaninamida, 6'-amino-amaninamida.
8. Un conjugado que comprende (a) un derivado de amanitina que comprende un resto de triptófano 6'-aminosustituido de la reivindicación 7; (b) un resto de unión a la diana; y (c) opcionalmente un enlazador que une dicho derivado de amanitina y dicho resto de unión a la diana.
9. Una composición farmacéutica que comprende el derivado de amanitina de la reivindicación 7 o el conjugado de la reivindicación 8.
10. El derivado de amanitina de la reivindicación 7, el conjugado de la reivindicación 8 o la composición farmacéutica de la reivindicación 9 para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente, particularmente en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer de páncreas, colangiocarcinoma, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de riñón, melanoma maligno, leucemia y linfoma maligno.
11. Un compuesto que comprende (a) un derivado de amanitina de la reivindicación 7; y (b) un resto de enlazador que lleva un grupo reactivo Y para unir dicho derivado de amanitina a un resto de unión a la diana.