ES2989557B2 - Complejo ternario de inclusion de glicina-betaina, glutamato monosodico y prolina, metodo de obtencion y uso - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
COMPLEJO TERNARIO DE INCLUSIÓN DE GLICINA-BETAÍNA, GLUTAMATO
MONOSÓDICO Y PROLINA, MÉTODO DE OBTENCIÓN Y USO
SECTOR TÉCNICO
La presente invención se encuadra en el ámbito general de la Química, más en concreto en la Química Orgánica, y tiene su aplicación en los sectores agrícola, silvícola y/o de jardinería. De forma más particular, se encuadra en el sector de composiciones que actúan como como reguladores del estrés abiótico en las plantas en general, en los cultivos agrícolas, silvicultura y/o jardinería.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Varios factores ambientales afectan negativamente al crecimiento y desarrollo de las plantas y al rendimiento final de los cultivos. La sequía, la salinidad, los desequilibrios de nutrientes (incluidas las toxicidades y deficiencias minerales) y las temperaturas extremas son algunas de las principales limitaciones ambientales para la productividad de los cultivos en todo el mundo. Estos factores inducen el denominado estrés abiótico.
Se calcula que menos del 10% de las tierras cultivables del mundo pueden estar libres de perturbaciones ambientales, siendo las más extendidas la sequía y la salinidad. Por ejemplo, hasta el 45% de las tierras agrícolas del mundo están sometidas a sequías continuas o frecuentes, en las que reside el 38% de la población humana mundial, y la superficie mundial afectada por la salinidad es de más de 3 millones de km2, aprox. el 6% de la superficie total. Además, el 19,5% de las tierras agrícolas de regadío se consideran salinas y cada año se produce un deterioro de 2 millones de hectáreas (aprox. el 1%) de las tierras agrícolas del mundo a causa de la salinidad, lo que conlleva una reducción o la ausencia de productividad de los cultivos. Las escasas precipitaciones, la elevada evaporación superficial, la meteorización de las rocas autóctonas, el riego con agua salina y las malas prácticas culturales son algunos de los principales factores que contribuyen al aumento de la salinidad. La salinización secundaria agrava el problema, ya que las tierras agrícolas, antes productivas, se están volviendo inadecuadas para el cultivo debido a la mala calidad del agua de riego.
El cambio climático está en el horizonte, y sus implicaciones tendrán una huella significativa en la productividad de los cultivos y, por consiguiente, en la seguridad alimentaria y nutricional. Las actividades fisiológicas y metabólicas de las plantas de cultivo se ven radicalmente alteradas no sólo por el aumento de las temperaturas diurnas, sino también por las elevadas temperaturas nocturnas. Todos los cultivos alimentarios importantes, como los cereales y las leguminosas, son propensos al estrés por altas temperaturas (EAT), provocando una reducción general del rendimiento. Además de la pérdida de rendimiento derivado del EAT, se producen varios cambios fisiológicos como la disminución de la eficiencia fotosintética, y la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) que conducen al estrés oxidativo particularmente en los cloroplastos, con una consecuencia de daño de la membrana, y el inicio de la senescencia de la hoja. Para generar cultivos resistentes al clima, es necesario comprender los mecanismos fisiológicos y bioquímicos subyacentes asociados al EAT.
El estrés por altas temperaturas provoca cambios en el crecimiento de las plantas, el desarrollo, la senescencia de las hojas, su decoloración, la degradación de la clorofila y la disminución de la eficiencia fotosintética. La integridad de los cloroplastos se colapsa, lo que conduce a la muerte celular programada. En estas condiciones, se produce una reprogramación metabólica como la descomposición de la clorofila, la producción de ROS y las alteraciones en el metabolismo del carbono. Esta alteración de la programación metabólica es quizás esencial durante la aclimatación al estrés. Los cloroplastos juegan un papel crucial en la inducción de la expresión de genes nucleares de respuesta al calor bajo la respuesta al EAT, y la intensidad de la luz inhibe la síntesis de clorofila. El estrés térmico provoca una reducción de las concentraciones de nitrógeno en las hojas, daños en las proteínas y estrés oxidativo, limitando el crecimiento y la productividad de las plantas. El estrés por temperatura reduce la biosíntesis de la clorofila debido a la disminución de las enzimas que la biosintetizan, como la 5-aminolevulinato deshidratasa, que está relacionada con el daño oxidativo.
Las plantas superiores son sésiles y, por tanto, no pueden escapar a las condiciones ambientales adversas, que constituyen una amenaza constante a lo largo de su ciclo vital. Las condiciones desfavorables para el crecimiento, como las temperaturas extremas (calor, frío y congelación), la sequía (precipitaciones deficientes y vientos secos) y la contaminación de los suelos con altas concentraciones de sal, se consideran los principales estresores ambientales abióticos que no solo pueden limitar el crecimiento y el desarrollo de las plantas, sino que también determinan la distribución geográfica de las especies vegetales y afectan directamente al rendimiento agronómico. Los primeros efectos de la alta salinidad y la sequía en el metabolismo de las plantas son relativamente similares porque ambos restringen la disponibilidad de agua para las células de las plantas e imponen un estrés osmótico que puede conducir a la pérdida de turgencia. Para hacer frente a ello, las plantas reaccionan con el cierre estomático, lo que inhibe la asimilación de CO2y, por tanto, desencadena una cadena de acontecimientos que incluye la acumulación de equivalentes reductores, la reducción de las cadenas de transporte de electrones plastidiales y mitocondriales y, como consecuencia, el aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno ROS que, a su vez, dañan las proteínas, los lípidos y los ácidos nucleicos. El estrés salino prolongado induce además un estrés hiperiónico y deficiencias secundarias de K+y NO3-. En condiciones de campo, éste puede ser incluso el factor predominante que afecta al rendimiento de las plantas. Las plantas han desarrollado diferentes estrategias para minimizar los efectos adversos de las condiciones de estrés abiótico y varias de ellas están relacionadas con el metabolismo de los aminoácidos. Por ejemplo, el ajuste osmótico se logra mediante la acumulación de osmolitos compatibles que no interfieren con el metabolismo de la planta incluso a altas concentraciones y que también pueden actuar como eliminadores de ROS.
Por último, las características que debe conseguir un regulador del estrés abiótico se pueden resumir en las siguientes:
• actúa como mediador del ajuste osmótico;
• estabiliza proteínas y membranas celulares;
• induce genes relacionados con el estrés osmótico;
• es una fuente de carbono y nitrógeno fácilmente disponible en la rehidratación celular;
• es una fuente de sustentación de la fosforilación oxidativa;
• genera ATP durante la recuperación post-estrés;
• ayuda a controlar la acidosis del citosol y mantener la relación NADH/NAD+ en valores compatibles con el metabolismo;
• ayuda en la detoxificación del exceso del catión amonio NH4+; y
• ayuda a las células a superar el estrés oxidativo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Es un primer objeto de la invención un método para obtener un complejo ternario de inclusión compuesto por glicina-betaína, glutamato monosódico y prolina, en solución acuosa, que comprende las siguientes etapas:
a) mezclar entre un 2,5% y un 6% p/v, y más preferentemente entre un 2,5% y un 4% p/v, de glutamato monosódico y entre un 4% y un 7% p/v, y más preferentemente entre un 5% y un 6% p/v, de prolina en agua y agitar hasta obtener una mezcla dispersada homogénea. De manera particular, esta etapa puede llevarse a cabo añadiendo inicialmente el glutamato monosódico al agua, agitando y, posteriormente, añadiendo la prolina a la mezcla anterior. Asimismo, en una realización preferente de la invención, esta etapa de mezcla puede favorecerse mediante la aplicación de ultrasonidos, tras la adición del glutamato monosódico y la prolina al agua;
b) añadir entre un 30 y un 45% p/v, y más preferentemente entre un 40% y un 45% p/v, de glicina-betaína con respecto al total de la mezcla dispersada obtenida en la etapa anterior y añadir agua hasta completar el 100% p/v;
c) calentar hasta una temperatura de entre 30 y 50°C, agitar preferentemente a una velocidad de agitación de entre 300 y 1000 rpm y aplicar ultrasonidos con una frecuencia preferentemente comprendida entre 15 y 25 kHz, y más preferentemente entre 20 y 25 HZ, hasta completar la disolución total de todos los componentes y la formación del complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa. De manera particular, esta etapa puede llevarse a cabo durante un tiempo comprendido entre 5 y 15 minutos; y
d) preferentemente, dejar enfriar la solución acuosa hasta alcanzar una temperatura por debajo de 20°C, preferentemente entre 10°C y 20°C.
Es un segundo objeto de la invención un complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa, que comprende, en peso con respecto al volumen total:
a) entre un 2,5 y un 6% p/v, y más preferentemente entre un 2,5% y un 4% p/v, de glutamato monosódico y entre un 4 y un 7% p/v, y más preferentemente entre un 5% y un 6% p/v, de prolina,
b) entre un 30 y un 45% p/v, y más preferentemente entre un 40% y un 45% p/v, de glicina-betaína, y
c) agua hasta completar el 100% p/v de la solución acuosa,
y donde dicho complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa, no contiene ningún surfactante o emulsionante químico.
De manera particular, la densidad del complejo de inclusión en solución acuosa reivindicado puede variar entre 1,08 y 1,12 kg/l (a 25°C), en función de la cantidad de glutamato monosódico, prolina y glicina-betaína que se añadan al proceso (cuanto menor sea el porcentaje, menor será la densidad de la solución final).
Una de las principales ventajas que ofrece el complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa objeto de la invención frente a otros productos descritos en el estado de la técnica es la sorprendente mejora que presenta en cuanto a la solubilidad de sus principios activos, el glutamato monosódico, la prolina y la glicina-betaína, en agua.
Adicionalmente, ofrece la ventaja de que se trata de un producto inocuo, basado en sustancias naturales, seguras y biodegradables, que incluso son de grado alimentario humano. Es importante señalar que los componentes del complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa reivindicado son generalmente reconocidos como seguros (GRAS), favoreciendo así su empleo en el tratamiento de cultivos, ya que no implica medidas de seguridad adicionales por parte de los aplicadores, factor muy importante en la agricultura. Se trata por tanto de un producto que respeta el medio ambiente y que no daña los ecosistemas, al no incluir sustancias tóxicas. En particular, permite mejorar la biodisponibidad de la prolina, eliminando la presencia de otros productos químicos imprescindibles para su disolución, como surfactantes o emulsionantes, actualmente empleados en el sector agrícola.
Es asimismo objeto de la invención el uso del complejo de inclusión reivindicado como agente fertilizante. En el contexto de la presente invención, se entiende por fertilizante una composición que comprende los nutrientes esenciales para el crecimiento y desarrollo de un vegetal. El complejo de inclusión objeto de la invención tiene función fertilizante debido a la presencia de los aminoácidos o pro-aminoácidos en la propia composición. De este modo, cumple la función fertilizanteper se,evitando que la planta tenga que producir los nutrientes a partir del nitrógeno fijado a través de sus raíces, con el consiguiente ahorro económico que ello conlleva. Adicionalmente, son numerosos los beneficios adicionales asociados a la presencia de los aminoácidos en la composición, actuando en aspectos diversos como la resistencia al estrés, la fotosíntesis, la polinización, la activación de las fitohormonas y otras sustancias de crecimiento, el equilibrio de la flora en los suelos y el sistema de absorción y translocación de los microelementos a nivel de la planta.
Adicionalmente, es objeto de la invención el uso del complejo de inclusión reivindicado como agente bioestimulante. En el contexto de la presente invención, se entiende por bioestimulante una sustancia que altera los procesos vegetales mejorando su rendimiento. En particular, el complejo de inclusión objeto de la invención tiene la capacidad de estimular el sistema de crecimiento de la planta en condiciones de estrés abiótico, por efecto de altas temperaturas, sequía o salinidad excesiva en el terreno.
Finalmente, es asimismo objeto de la invención el uso del complejo de inclusión reivindicado como agente para mitigar el estrés abiótico, inducido por la falta de agua de riego, altas temperaturas o excesiva salinidad.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Acompañando a la presente descripción se incluyen una serie de figuras donde, con carácter ilustrativo y no limitativo, se muestran los resultados de los ensayos experimentales llevados a cabo para probar la eficacia de la invención. En particular: • la Fig. 1 muestra una fotografía de las lechugasLollo rnssotratadas según se describe en el ejemplo 3, a los 64 días después del tratamiento, junto con una escala de tamaño en centímetros;
• la Fig. 2 muestra el porcentaje de supervivencia de las lechugas sometidas al ensayo según se describe en el ejemplo 3;
• la Fig. 3 muestra el diámetro medio (en centímetros) de las lechugas sometidas al ensayo según se describe en el ejemplo 3;
• la Fig. 4 muestra el peso medio de las lechugas (en gramos) sometidas al ensayo según se describe en el ejemplo 3;
• la Fig. 5 muestra la longitud radicular (en centímetros) de las lechugas sometidas al ensayo según se describe en el ejemplo 3.
• la Fig. 6 muestra el peso radicular (en gramos) de las lechugas sometidas al ensayo según se describe en el ejemplo 3.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Tal y como se ha descrito previamente, la presente invención ofrece un nuevo proceso para incrementar la solubilización de la prolina en agua en presencia de otros solutos, no habiendo sido descrito hasta el momento en la literatura técnica. El nuevo complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa reivindicado consigue aumentar la solubilidad de la prolina en agua hasta 4 veces y está especialmente indicado para su empleo en la elaboración de composiciones fertilizantes, bioestimulantes y antiestrés abiótico naturales y biodisponibles.
En particular, el método desarrollado permite obtener un complejo de glutamato monosódico/prolina/glicina-betaína mediante un proceso de mezcla a media/baja temperatura con aplicación de ultrasonidos. El complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa obtenido mediante dicho proceso puede ser diluido posteriormente en agua hasta un porcentaje que faculte su empleo en la agricultura, silvicultura y/o jardinería. En este sentido, se ha demostrado que, de manera sorprendente, los aminoácidos del complejo de inclusión reivindicado se mantienen solubles tras su dilución en grandes cantidades de agua, sin precipitar o sin formar un polvo aislado en la superficie libre del líquido. Ello se debe al fenómeno que se ha descrito anteriormente, referente a la biodisponibilidad del complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa, lo que permite tener un mayor efecto fertilizante, bioestimulante y antiestrés abiótico al aplicarse en los cultivos. En particular, se ha demostrado que la glicina-betaína forma un complejo de inclusión en solución acuosa que aumenta al menos 4 veces la solubilidad en agua de la prolina. De este modo, es también objeto de la invención la aplicación del complejo de inclusión reivindicado diluido en agua. Así por ejemplo, 1 litro del complejo de inclusión en solución acuosa reivindicado podrá utilizarse diluido en 50, 100, 200, 300, 400 o 500 litros de agua, sin perder su solubilidad.
En el contexto de la presente invención, la formación del complejo se produce como consecuencia de la pérdida del protón por parte de ambos grupos carboxílicos de los aminoácidos, que se deslocan, en el caso del prolina, hasta el grupo amino de la glicinabetaína.
La eficacia del producto objeto de la presente invención, unido a su elevada biodisponibilidad, hace que sea un producto realmente ventajoso en comparación con los fertilizantes, bioestimulantes y/o agentes antiestrés abiótico conocidos en el mercado, que apenas llegan a disolver un 2% de prolina en agua en presencia de otros solutos. Junto a esto, el complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa reivindicado está constituido por componentes naturales eficaces, evitando así el uso de químicos responsables de efectos tóxicos para el medioambiente.
Como se ha descrito anteriormente, cabe destacar que, gracias a la composición química del complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa reivindicado, se ha incrementado la solubilidad del prolina. De hecho, se ha demostrado que la solubilidad de la prolina se incrementa con la concentración de la glicina-betaína, presente entre un 30% y un 45% en peso, facilitando así la formación del complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa entre ambos aminoácidos por interacciones moleculares débiles o de corto alcance entre las moléculas de ambos compuestos en agua. En particular, dichas interacciones consisten en enlaces por puentes de hidrógeno entre los dos aminoácidos descritos, es decir, la soluble y la menos soluble en agua. El enlace de hidrógeno es una fuerza electrostática que proporciona gran estabilidad, pero es más débil que el enlace covalente o el enlace iónico. En la aparición de estos enlaces es esencial la acción de los ultrasonidos que se aplican durante el método de obtención del complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa.
En realizaciones particulares de la presente invención, la solución acuosa del complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína reivindicado, presenta un pH comprendido entre 7,5 y 9 y carácter catiónico, derivado de la presencia de grupo amino de la glicina-betaína y de la prolina, con gran tendencia a captar el protón del grupo carboxílico de la prolina y quedar cargado positivamente, lo que otorga el carácter catiónico al complejo formado. En realizaciones preferidas, el pH de la solución acuosa estará comprendido entre 8 y 9.
Una gran ventaja del complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicinabetaína en solución acuosa reivindicado es que no precisa de la incorporación de emulsionantes o surfactantes para mejorar su solubilidad y biodisponibilidad en solución acuosa, a diferencia de otros productos alternativos del estado de la técnica, los cuales llevan asociado un importante riesgo de toxicidad en cultivos, así como en los suelos destinados a la agricultura, silvicultura y jardinería en general.
Por lo tanto, se trata de una solución muy ventajosa con respecto a los compuestos que existen actualmente en el mercado, ya que con una simple elaboración del complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa se obtiene un producto muy estable, el cual se vehicula de forma más elemental que otras alternativas basadas en aceites y emulsionantes, polielectrolitos, así como otros productos más complicados de encapsulación, con el consiguiente ahorro económico. Aunque es conocido que la estabilidad de las soluciones se puede mejorar mediante la adición de un agente surfactante, por razones de sostenibilidad medioambiental el producto objeto de la invención no los contiene en su composición.
En una realización preferida, la composición fertilizante, bioestimulante y antiestrés abiótico puede comprender adicionalmente al menos un aditivo, preferentemente un conservante, y más preferentemente metabisulfito potásico. De manera preferente, dicho aditivo estará presente en una cantidad comprendida entre 0,1% y 0,5% en peso con respecto al volumen total de la solución acuosa. En realizaciones aún más preferidas, la cantidad de aditivo (preferentemente, conservante y más preferentemente metabisulfito potásico) puede ser de un 0,2%, 0,3% o 0,4% en peso respecto al volumen total. Dicho aditivo puede ser añadido en una última etapa del proceso, tras la formación del complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
Ejemplo 1. Procedimiento de obtención y caracterización de un complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa según ha sido reivindicado
Se parte de la producción del complejo entre ambos aminoácidos, de acuerdo con la siguiente composición y procedimiento:
A 575 gramos de agua se añaden 50 gramos del aminoácido prolina, en forma sólida en polvo y, después de 5 minutos de agitación, se añaden 25 gramos de glutamato monosódico y se procede a la sonicación (aplicación de ultrasonidos). Posteriormente, se añaden 450 gramos de la glicina-betaína bajo agitación de 300 a 800 rpm. Se calienta hasta alcanzar una temperatura de 30° a 50°C y se aplican nuevamente los ultrasonidos, dando lugar a la formación del complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa. La sonicación se lleva a cabo durante periodos de 2 minutos cada uno, y un tiempo total de 10 minutos, no dejando que la solución se caliente por encima de 50°C. La solución resultante, protegida de la luz, cambia de color hasta adquirir un color amarillo ocre. Posteriormente, se puede envasar el complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína ya formado. No se puede alterar el pH de la solución resultante para evitar que se formen precipitados no deseables.
Ejemplo 2. Análisis y determinación teórica de la formación del complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa
La verificación teórica de la formación del complejo se fundamenta en el estudio del contenido energético del mismo, que se calculó utilizando el software ChemBio3D Ultra 16,0 (Perkin-Elmer Inc., Waltham, MA, USA) y el método de cálculo de Mecánica Molecular (MM2). Se realizaron cálculos para obtener la energía de la estructura 3D molecular, analizando y exponiendo la energía del estado basal. Cuanto menor es la energía final, mayor es la estabilidad de la molécula. El MM2 es un método que sirve para determinar la geometría, las energías moleculares, los espectros vibracionales y las entalpías de formación de moléculas en su estado basal y se utiliza habitualmente para determinar el comportamiento de grandes moléculas de importancia biológica y farmacéutica. Suele utilizarse para determinar las geometrías de grandes moléculas, como las de importancia biológica y farmacéutica, que están fuera del alcance de métodos más intensivos basados en los orbitales moleculares. Por esta razón, el MM2 no es útil para modelar estados de transición de procesos químicos con un gran espectro de pasos experimentales.
Se realizaron cálculos para obtener la energía de diferentes conformaciones de un mismo complejo 3D, analizando y exponiendo aquellas con menor energía de formación. Se estimaron diferentes conformaciones tridimensionales para el complejo formado. El contenido energético total, expresado en kcal/mol, de cada molécula se describe mediante la suma de las siguientes interacciones:
Para verificar el contenido energético de los dos aminoácidos por separado y del complejo formado entre ambos, se estudiaron su estructura conformacional y su interrelación mediante formación de puentes de hidrógeno. Los resultados fueron los siguientes:
Se llevó a cabo un primer estudio de formación de puentes de hidrógeno en el complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa, obteniéndose un contenido energético de -474,94 kcal/mol. En otra estructura conformacional diferente se obtiene un contenido energético de -275,40 kcal/mol, tal como se expone a continuación:
Del estudio energético de las diferentes posibilidades de formación del complejo entre el prolina y la glicina-betaína mediante formación de enlaces por puente de hidrógeno, se concluye que el primer estudio es el más favorable energéticamente y, por lo tanto, el que ocurre, ya que se produce la protonación del grupo amino de la glicina-betaína y del grupo amino libre del prolina, mediante la cesión de protones de los grupos carboxílicos presentes en ambos aminoácidos.
Ejemplo 3. Prueba in vivo realizada con el complejo descrito en el Ejemplo 1.
Se aporta un resumen de la metodología y de los resultados obtenidos en las pruebas in vivo que han sido realizadas.
Diseño de las pruebas y objetivo de las mismas:
En el presente ensayo se estudia la eficacia del producto denominado STRESSLESS LIQUID frente al estrés hídrico en lechuga Lollo rosso, obtenido de acuerdo con el proceso descrito en el ejemplo de realización 1. El estudio se desarrolló en los campos experimentales de la empresa NEVAL y consta de 3 tesis, incluyendo dos tesis sometidas a estrés hídrico (riego al 70%) y un control con riego al 100%. La tesis fue tratada con STRESSLESS LIQUID en una concentración de 2 ml/l de agua. Además, la evolución de esta tesis se comparó con la de un control no sometido a estrés (riego al 100%). Cada tesis se compuso de 30 macetas de lechugaLollo rosso,que se regaron dos veces por semana. El comienzo del ensayo tuvo lugar tras el trasplante, desde el cual se empezaron los riegos completos para la tesis control al 100% y los reducidos (70% de agua frente al control al 100%). La primera aplicación se hizo en el momento en el que se iniciaron los síntomas y, la segunda, pasados 21 días. En la Fig. 1 se muestra una fotografía de las lechugasLollo rossoa los 64 días después del tratamiento.
Al final del ensayo se llevaron a cabo las evaluaciones. Se evaluó el peso medio de las lechugas (g/lechuga) así como su diámetro y la longitud y peso de las raíces. Además, se evaluó el porcentaje de supervivencia en cada tesis, compuesta cada una por 30 macetas (10 macetas por bloque).
Emplazamiento:
Procedimientos durante el ensayo:
Abreviaturas: DDA: Días después de aplicación; Ap.: Aplicación
Mantenimiento durante el estudio:
Meteorología: El ensayo se desarrolló en macetas en campo. Los datos meteorológicos se han obtenido de la estación meteorológica de Vall d’Uixó (Castellón).
Conclusiones:
En la Fig. 2 se muestra el porcentaje de supervivencia de las muestras tratadas con STRESSLESS LIQUID.
En cuanto a los resultados relativos al tamaño (diámetro) del cogollo, el control 100 (13,10 cm) y el control 70 (11,66 cm) mostraron diferencias significativas entre sí, según se muestra en la Fig. 3.
Además, también se observó un aumento del peso medio por lechuga con STRESSLESS LIQUID, obteniéndose una diferencia significativa y clara con el control sometido a estrés, según se muestra en la Fig.4.
Las lechugas tratadas con STRESSLESS LIQUID mostraron también un mayor crecimiento radicular que el control 70%, según se muestra en la Fig. 5, lo cual indica una mayor tolerancia al estrés.
Por último, el peso radicular de las lechugas tratadas con STRESSLESS LIQUID mostró diferencias significativas con el control 70%, obteniendo valores prácticamente idénticos a los del control 100%, según se muestra en la Fig. 6.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Método para obtener un complejo ternario de inclusión compuesto por glicinabetaína, glutamato monosódico y prolina, en solución acuosa, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:
a) mezclar entre un 2,5% y un 6% p/v de glutamato monosódico y entre un 4% y un 7% p/v de prolina en agua y agitar hasta obtener una mezcla dispersada homogénea;
b) añadir entre un 30 y un 45% p/v de glicina-betaína con respecto al total de la mezcla dispersada obtenida en la etapa anterior y añadir agua hasta completar el 100% p/v;
c) calentar hasta una temperatura de entre 30 y 50°C, agitar y aplicar ultrasonidos hasta lograr la disolución completa de la prolina, glutamato monosódico y glicinabetaína en agua, seguida de la obtención del complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa.
2. Método, de acuerdo a la reivindicación 1, donde dicho método comprende una etapa adicional final que comprende dejar enfriar la solución acuosa hasta alcanzar una temperatura inferior a 20°C.
3. Complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa, caracterizado por que comprende, en peso con respecto al volumen total:
a) entre un 2,5 y un 6% p/v de glutamato monosódico ,
b) entre un 4 y un 7% p/v de prolina,
c) entre un 30 y un 45% p/v de glicina-betaína, y
d) agua hasta completar el 100% p/v de la solución acuosa,
y donde dicho complejo de inclusión de prolina, glutamato monosódico y glicina-betaína en solución acuosa no contiene ningún surfactante o emulsionante químico.
4. Complejo de inclusión, de acuerdo a la reivindicación 3, donde la densidad del complejo de inclusión en solución acuosa varía entre 1,08 kg/l y 1,12 kg/l a 25°C.
5. Uso del complejo de inclusión, de acuerdo a la reivindicación 3 o 4, como agente fertilizante.
6. Uso del complejo de inclusión, de acuerdo a la reivindicación 3 o 4, como agente bioestimulante.
7. Uso del complejo de inclusión, de acuerdo a la reivindicación 3 o 4, como agente para mitigar el estrés abiótico.
8. Uso del complejo de inclusión de acuerdo a la reivindicación 3, en agricultura, silvicultura y/o jardinería, donde dicho uso comprende la dilución del complejo de inclusión en solución acuosa en agua de manera previa a su uso.
9. Composición fertilizante, bioestimulante y antiestrés abiótico caracterizada por que comprende un complejo de inclusión de acuerdo a la reivindicación 3 o 4.
10. Composición, de acuerdo a la reivindicación 9, donde dicha composición comprende adicionalmente al menos un aditivo que consiste en un conservante comprendido entre un 0,1% y 0,5% en peso con respecto al volumen total de la solución acuosa.
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