ES2988136T3

ES2988136T3 - Composición farmacéutica y método para inducir una respuesta inmune

Info

Publication number: ES2988136T3
Application number: ES21721110T
Authority: ES
Inventors: Ioannis Papasotiriou
Original assignee: RGCC Holdings AG
Current assignee: RGCC Holdings AG
Priority date: 2020-05-01
Filing date: 2021-04-27
Publication date: 2024-11-19
Anticipated expiration: 2041-04-27
Also published as: AU2021263889A1; CA3169995A1; JP2023523822A; AU2021263889B2; EP4153217C0; EP3903811A1; EP4153217A1; EP4153217B1; WO2021219639A1; US20230263889A1

Abstract

La presente invención se refiere a un método para inducir una respuesta inmune en un sujeto humano o animal, así como a una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune, además a un método para producir la composición farmacéutica in vitro y al uso de linfocitos T CD8+ citotóxicos activados para reconocer un péptido antigénico en una composición farmacéutica o en un método para inducir una respuesta inmune. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición farmacéutica y método para inducir una respuesta inmune

SECTOR TÉCNICO

La presente invención se refiere al sector de la inmunología celular y la inmunoterapia. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para inducir una respuesta inmune en un paciente humano o animal, así como a una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune, además de un método para preparar la composición farmacéutica in vitro y al uso de células dendríticas cebadas o de linfocitos T CD8+ citotóxicos activados en una composición farmacéutica o en un método para inducir una respuesta inmune.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Los patógenos, tales como virus, bacterias, hongos y parásitos, son organismos que pueden causar una enfermedad, mientras que se ha descubierto que algunos patógenos son responsables de efectos graves y víctimas en los huéspedes afectados.

La vacunación o la administración de antibióticos puede ser útil para prevenir o combatir enfermedades derivadas de patógenos. El cáncer suele tratarse mediante resección quirúrgica de los tumores, o con tratamientos agresivos como quimioterapia o radioterapia. Esas terapias han logrado minimizar o inhibir la metástasis y la proliferación de células cancerosas, pero no derrotar eficazmente los cánceres. Sin embargo, debido a las severas toxicidades y la recurrencia de los tumores, la vida del paciente aún podría estar en riesgo.

El sistema inmunológico del cuerpo humano proporciona defensa contra algunos patógenos comunes. Los patógenos están compuestos por proteínas, conocidas como antígenos, que pueden ser reconocidas por el sistema inmunológico del huésped. De manera similar, las células inmunes reconocen antígenos peptídicos naturales asociados a tumores presentados en la superficie celular de las células tumorales. Esos antígenos incluyen proteínas que están sobreexpresadas, proteínas embrionarias expresadas de forma anormal, productos de genes supresores u oncogenes mutados, o derivados de virus que provocan cáncer en las células cancerosas.

Los antígenos pueden pertenecer a muchas clases químicas diferentes y pueden derivar de proteínas, lípidos, carbohidratos o combinaciones de estos, como lipoproteínas o glicoproteínas, de virus o bacterias. Los antígenos también pueden ser pequeños compuestos químicos, denominados haptenos, fabricados sintéticamente en el laboratorio, como el nitrofenilo (NP), o ser un compuesto natural introducido en el huésped, como el urushiol, la toxina que se encuentra en la hiedra venenosa, que se modifica y se vuelve antigénica cuando se introduce en el huésped. Los haptenos generalmente requieren unirse a una proteína más grande del huésped o a una proteína extraña para volverse inmunogénicos.

Los linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés) son glóbulos blancos que tienen la capacidad de matar otras células del cuerpo de una manera muy específica. Los CTL son células T CD8+ que han sido estimuladas por péptidos presentados por el MHC I (complejo mayor de histocompatibilidad clase I) en las células afectadas. Cuando los CTL han sido estimulados por un antígeno, migran a través de los tejidos del cuerpo para encontrar y matar las células diana que llevan el antígeno específico. Los CTL específicos de antígeno proliferan para producir células hijas con la misma especificidad antigénica que las células madre. El número total de esos CTL específicos para el antígeno en el cuerpo aumenta mediante la división celular de los CTL activados.

Las células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) proporcionan las señales necesarias para la activación de las células T y son potentes células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés) en el sistema inmunológico. La interacción entre el antígeno presentado por una proteína de clase I o II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC I/II) que está presente en las APC y el complejo receptor de células T/CD3 es responsable de la especificidad de la respuesta inmune. Esta interacción es necesaria para la activación de las células T, pero no suficiente. La interacción entre los pares receptor-ligando de APC y las células T genera señales coestimuladoras que pueden llevar a la inducción de funciones de células T efectoras y a la proliferación completa de las células T.

Las células T tienen el receptor específico de antígeno, TCR, que reconoce un complejo físico entre las proteínas MHC del huésped y pequeños fragmentos peptídicos derivados de antígenos proteicos. La interacción entre el péptido y la molécula MHC es muy específica. Las moléculas del MHC de clase I presentan antígenos peptídicos a las células T CD8+ y el tamaño de esos péptidos que pueden unirse es de 8 a 10 aminoácidos.

El reconocimiento inmunológico de antígenos asociados a patógenos o cáncer se realiza mediante linfocitos T citotóxicos CD8+ específicos que interactúan con los péptidos que están unidos a las moléculas del MHC I. La estimulación in vitro de esa interacción se puede realizar con la presentación de esas moléculas por parte de las APC y especialmente de las DC. "Cebado" o "pulsación" es la etapa in vitro en la que las células dendríticas primero contactan con el antígeno y luego se "cargan" con el antígeno respectivo, es decir, presentan el péptido antigénico en sus moléculas de MHC I. Esta es una etapa esencial en la posterior presentación del antígeno a las células T CD4+ o CD8+, es decir, la activación de las células T. Las células T CD8+ que han sido activadas por las APC (dichas células T CD8+ activadas se denominan CTL en el alcance de la presente solicitud) pueden reconocer el mismo complejo MHC/péptido en las células diana, por ejemplo, las células infectadas por patógenos o cancerosas, y ser activadas para matarlas.

Peng W et al. (EWS/FLI-1 peptide pulsed dendritic cells induces the antitumor immunity in a murine Ewings sarcoma cell model, International Immunopharmacology 21 (2014) 336-341) demostraron que las DC derivadas de monocitos pulsadas con un péptido EWS/FLI-1 provocaron una respuesta de CTL específica para este péptido. Un estudio de Nectaria N. et al. (Ii-Key/HER-2/neu (776-790) hybrids peptides induce more effective immunological response over the native peptides in lymphocyte cultures from patients with HER-2/neu+ tumors, Cancer Immunol. Immunother (2007), 56:601-613) se centró en el hecho de que las células T CD4+, que habían sido activadas previamente con un péptido “auxiliar” que contiene un epítopo MHC II (péptido híbrido Ii-Key/HER-2/neu (776-790)) puede potenciar la activación de células T CD8+ cebadas con D<c>pulsadas con un péptido que contiene un epítope MHC I, en este caso HER-2/neu (435-443). El documento de Patente US 2010/0255501 A1 da a conocer un método de identificación de una respuesta de células T restringida a MHC Clase I en el tratamiento de cáncer de mama, utilizando péptidos derivados del polipéptido MUC-1 que son capaces de activar una respuesta de los CTL.

Por lo tanto, la inmunoterapia activa el propio sistema inmunológico del paciente para reconocer y matar las células que presentan antígenos, ya sean derivados de patógenos o de cáncer. La inmunoterapia se ha convertido en una alternativa prometedora en el tratamiento de pacientes con cáncer. Los efectos tóxicos de ese tipo de terapia son limitados en comparación con la quimioterapia o la radioterapia.

La terapia celular adoptiva es la activación y expansión ex vivo de células efectoras inmunes y la administración para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad. El desarrollo de una estrategia exitosa para el tratamiento de una enfermedad humana requiere una comprensión de las respuestas de las células inmunes que participan en el control de la condición patogénica. Las células inmunes pueden ser células efectoras no específicas, tales como células asesinas naturales y macrófagos, células efectoras con diversidad limitada para el reconocimiento de antígenos, tales como células T y§, y células efectoras altamente específicas, que tienen una enorme diversidad en el reconocimiento de antígenos, tales como las células B productoras de anticuerpos y las células T ap. La terapia celular adoptiva abarca el uso de células T reactivas al antígeno derivadas de una fuente endógena (células T específicas de tumores, como los linfocitos infiltrantes de tumores o de sangre periférica) o una población genéticamente modificada diseñada para reconocer el antígeno mediante la expresión del anticuerpo quimérico afín o del receptor de células T (CAR/TCR).

Las células cancerosas tienen mecanismos que les ayudan a escapar del sistema inmunológico. Se utilizan varios enfoques para mejorar la eficacia de la inmunoterapia y detener la evasión inmune de las células cancerosas.

Los bloqueos de los puntos de control inmunológico con anticuerpos monoclonales que bloquean la muerte celular programada-1 (PD-1), el ligando de muerte programada-1 (PD-L1) o la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), las vacunas contra células tumorales, las vacunas contra células dendríticas y la terapia celular adoptiva (ACT, por sus siglas en inglés), tal como las células T del receptor de antígeno quimérico (CAR, por sus siglas en inglés), han demostrado que la inmunoterapia tiene el potencial de usarse como una opción terapéutica básica en muchos cánceres [Farkona S., et al., BMC Med. 14, 73 (2016)].

Aunque los inhibidores de los puntos de control inmunológico se utilizan para aumentar la población de células T preexistentes del paciente, es probable que fracasen, especialmente en tipos de cáncer poco inmunogénicos. La administración de células T específicas de tumores mediante terapia celular adoptiva puede permitir que el sistema inmunológico supere problemas de inmunogenicidad deficiente. El reconocimiento de antígenos asociados a tumores (TAA, por sus siglas en inglés) lo otorgan diversos receptores que permiten la identificación de una variedad de péptidos tras su presentación por moléculas de MHC. Sin embargo, la señal derivada de TCR a través de la interacción con complejos péptido/MHC por sí sola no es capaz de desencadenar una activación adecuada de las células T, ya que la proliferación, diferenciación y supervivencia de las células T también requieren señales de moléculas coestimuladoras tal como CD28 y sus ligandos CD80 y CD86.

La identificación de epítopos a menudo implica la derivación y prueba de bibliotecas de péptidos superpuestos del patógeno o proteínas derivadas de tumores que se basan en bases de datos de proteínas conocidas. El desarrollo y perfeccionamiento de algoritmos que predicen epítopos asociados a patógenos, así como la definición de características de unión a péptidos preferentes para las proteínas MHC que están asociadas con la susceptibilidad a enfermedades o infecciones autoinmunes, ha sido una herramienta importante para la selección de epítopos con alta inmunogenicidad.

El reto ha sido la administración de un antígeno para inducir una respuesta CTL y mantenerla en el tiempo. In vitro, el MHC I puede cargarse externamente (ex vivo, in vitro) con un péptido sintético para provocar una respuesta de<c>T<l>, tal como se describe, por ejemplo, en el documento de Patente EP1448229A2.

Sin embargo, normalmente la cantidad de células dendríticas cargadas administradas puede ser insuficiente para activar una cantidad suficiente de células T CD8+ in vivo o el microambiente tumoral inmunosupresor puede impedir que las CD activen eficazmente las células T CD8+ para eliminar el tumor in vivo. La activación ex vivo de las células T CD8+ va seguida de una determinación de la funcionalidad y citotoxicidad de los CTL activados y a continuación de la administración de la composición farmacéutica que comprende los CTL como un "fármaco vivo" autólogo con una diana específica en el paciente para el propósito de inducir una respuesta inmune mejorada in vivo.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es dar a conocer un método mejorado para la terapia celular adoptiva autóloga mediante el cebado de células dendríticas ex vivo para su posterior administración al paciente para desencadenar una fuerte respuesta inmune in vivo, o para su posterior activación ex vivo y expansión de células efectoras inmunes derivadas del paciente y la administración de CTL activados ex vivo nuevamente al paciente para desencadenar una fuerte respuesta inmune in vivo.

La presente invención se refiere en un primer aspecto a un método ex vivo/in vitro para la generación y expansión de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno derivados de pacientes (células T CD8+ activadas, es decir, CTL) adecuados para su administración al paciente para terapia de células T adoptivas endógenas autólogas. El método comprende el cocultivo de células T CD8+ de un paciente con células dendríticas que han sido cargadas con un único péptido MHC de clase I de 9 o 16 unidades específico para el tipo de enfermedad del paciente y con otros tipos de células inmunitarias, incluidos otros subtipos de linfocitos T, células NK, linfocitos B, neutrófilos, basófilos, eosinófilos y plaquetas. Además, la presente invención se refiere a las células T CD8+ (CTL) activadas, es decir, específicas de antígeno, obtenidas por el método y sus usos.

En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método ex vivo para la estimulación de células dendríticas, es decir, cebado (pulsación, carga) en presencia de un péptido antigénico, preferentemente un péptido antigénico viral, que resulta en una población de células dendríticas presentadoras de antígeno (DC) que pueden incluirse en una composición farmacéutica como una vacuna para su administración a un sujeto humano o animal con el fin de prevenir una infección patógena, preferentemente viral, por un patógeno o virus específico, o para estimular el sistema inmunológico de un ser humano o animal ya infectado por un patógeno específico, preferentemente virus.

Más específicamente, la presente invención se refiere, con respecto al primer aspecto de la presente invención, a una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune en un sujeto humano o animal que padece una enfermedad o trastorno patológico, que comprende células T CD8+ citotóxicas activadas autólogas, es decir, linfocitos T CD8+ citotóxicos activados (denominados CTL). Los CTL de dicha composición farmacéutica han sido activados por células dendríticas maduras (DC) autólogas cebadas del sujeto humano o animal, en donde dichas células dendríticas maduras autólogas cebadas presentan un péptido antigénico. El término "cebado", o "pulsado" o "cargado", respectivamente, significa que las células dendríticas autólogas, en un estado todavía inmaduro, se han puesto en contacto con un péptido antigénico, dando como resultado células dendríticas maduras "cargadas", que presentan el péptido antigénico en las proteínas MHC I de su superficie celular.

En dicha composición farmacéutica, los CTL activados se derivan como células T CD8+ de una población autóloga de células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) aisladas de sangre periférica del mismo sujeto humano o animal. Una vez activados, los CTL pueden reconocer el péptido antigénico. Los CTL han sido activados por las DC autólogas cebadas/pulsadas/cargadas con un péptido antigénico, en donde las DC se han aislado del mismo sujeto humano o animal que las células T CD8+ que se activaron a CTL. Las DC se aíslan de una muestra separada de sangre periférica del mismo sujeto o paciente humano o animal. Sin embargo, preferentemente, para minimizar el número de intervenciones invasivas, las DC se derivan de la misma muestra de sangre periférica, es decir, la misma población de PBMC que las células T CD8+. Los CTL contenidos en la composición farmacéutica se han activado mediante el cocultivo de células T derivadas de la población de PBMC, con las células dendríticas presentadoras de antígeno. Sin embargo, preferentemente, no sólo se cocultivan células T con las CD maduras cargadas, sino también otras células inmunes no adherentes. Según la presente invención, los CTL que sirven como ingrediente activo en la composición farmacéutica se han activado por cocultivo con las DC maduras cargadas no sólo las células T CD8+ y/o las células T CD4+, sino cocultivando con las DC cargadas una población de células inmunes no adherentes derivadas de la misma población de PBMC que la población de la cual se han derivado las células dendríticas. Dicha población de células inmunes no adherentes incluye las células T CD8+ a activar, así como al menos una del siguiente grupo de células: células T CD4+, células NK, linfocitos B, plaquetas, neutrófilos, basófilos y eosinófilos. En otras palabras, los CTL se han activado cocultivando con las DC maduras cargadas una población de todas las células inmunitarias no adherentes derivadas de la misma población de PBMC que la población de la que se han derivado las células dendríticas.

Esto es especialmente ventajoso, porque las CD maduras se diferencian aún más, en un proceso llamado licencia, cuando reciben señales de otros linfocitos, como las células T CD4+, las células asesinas naturales (NK, por sus siglas en inglés) y las células T asesinas naturales (NKT, por sus siglas en inglés), y pueden inducir células T CD8+ de memoria de larga duración. Esas señales tienen varios efectos sobre las CD, incluyendo la secreción de citoquinas y la regulación positiva de moléculas coestimuladoras y antiapoptóticas, lo que resulta en la capacidad de las CD para activar las células T, especialmente las células T CD8+. Además, puede haber un efecto directo de las señales de los linfocitos auxiliares sobre el desarrollo de células T efectoras, la diferenciación a células efectoras o de memoria, o sobre la progresión del ciclo celular y la supervivencia celular.

Antes de su uso en la activación de células T CD8+, las CD se han cultivado ex vivo, cultivando monocitos aislados de la población de PBMC preferentemente en un medio de crecimiento con factor estimulante de colonias de granulocitos-monocitos e IL-4, dando como resultado un población de países en desarrollo inmaduros. Posteriormente, las CD inmaduras han sido cebadas/pulsadas exponiéndolas al péptido antigénico, dando como resultado una población de CD cargadas con el péptido antigénico, y han sido maduradas en presencia de un cóctel de citocinas, dando como resultado una población de CD maduras cargadas, antes de su uso en la activación de los CTL CD8+ mediante cocultivo tal como se mencionó anteriormente.

Con respecto al segundo aspecto de la presente invención, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune en un sujeto humano o animal que padece una enfermedad o trastorno patológico, que comprende DC autólogas cebadas que presentan un péptido antigénico en su MHC. Esta composición farmacéutica puede luego administrarse al sujeto humano o animal para inducir una respuesta inmune in vivo. Esta composición farmacéutica se puede utilizar como vacuna para un sujeto humano o animal o, en caso de que el sujeto ya haya sido infectado por el patógeno, por ejemplo virus, para el cual el péptido antigénico presentado en las CD es específico, como medicamento para tratar al sujeto humano o animal.

Según una realización preferente de la presente invención, el péptido antigénico utilizado para el cebado de las CD y para la posterior activación ex vivo o in vivo de las células T CD8+, los CTL activados son capaces de reconocer tras su activación ex vivo o in vivo, es un péptido MUC1 antigénico tumoral de una longitud de exactamente 9 aminoácidos, a saber un péptido MUC (79-87) TLAPATEPA (Seq. ID 1).

En una alternativa no reivindicada, el péptido antigénico puede también ser un péptido antigénico viral, preferentemente un péptido de la proteína S del SARS-CoV2 (el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo), la denominada "proteína espícula". En el caso de un péptido antigénico viral, el péptido antigénico presentado en las CD maduras cargadas y usado para la activación de los CTL CD8+ es un péptido LPFNDGVYF de la proteína S (84-92) del SARS-CoV2 (Seq. ID 2), un péptido RLNEVAKNLNESLIDL de la proteína S del SARS-CoV2 (1185-1200) (Seq. ID 3), un péptido RLNEVAKNL de la proteína S del SARS-CoV2 (1185-1193) (Seq. ID 4), o un péptido<n>L<n>ESLIDL de la proteína S del SARS-CoV2 (1192-1200) (Seq. ID 5).

La presente invención comprende además un método para obtener células dendríticas autólogas humanas o animales que presentan un péptido antigénico, es decir, cargadas con dicho péptido antigénico, a saber un péptido<m>U<c>(79-87) TLAPATEPA (Seq. ID 1), para la preparación de una composición farmacéutica tal como se describió anteriormente, que comprende las siguientes etapas:

a. ) cultivar monocitos aislados de células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) del sujeto humano o animal que padece una enfermedad o trastorno patológico, preferentemente que padece cáncer o una infección viral, dichos monocitos preferentemente aislados con separación de Ficoll;

b. ) cultivar los monocitos adherentes de la etapa a.) con factor estimulante de colonias de granulocitosmonocitos e IL-4, preferentemente en medio RPMI 1640 con 10 % de FBS inactivado por calor y 1 % de glutamina, preferentemente durante 6 días, dando como resultado un población de células dendríticas inmaduras;

c. ) pulsación de las células dendríticas inmaduras de la etapa b.), preferentemente el día 6 de cultivo con el péptido antigénico, preferentemente a una concentración final de 10 pg/ml del péptido antigénico, e incubación, preferentemente durante 5 h, preferentemente en la presencia de p2 microglobulina, preferentemente en una concentración final de 3 pg/ml de p2 microglobulina, dando como resultado una población de CD cargadas, pero aún inmaduras, que presentan el péptido antigénico en sus complejos de proteínas MHC I de la superficie celular;

d.) maduración de las CD cargadas que presentan el péptido antigénico de la etapa c.) con un cóctel de citoquinas, que incluye IL-6, preferentemente IL-6 a una concentración de 10 ng/ml, IL-1 p, preferentemente IL-1 p a una concentración de 25 ng/ml, TNF-a, preferentemente TNF-a a una concentración de 50 ng/ml, y PGE2, preferentemente PGE2 a una concentración de 10-6 M, e incubación, preferentemente incubación durante 48 h a 37 °C y 5 % de CO2.

Alternativas no reivindicadas al péptido MUC TLAPATEPA (Seq ID 1) incluyen péptidos antigénicos virales, tales como el péptido LPFNdGvYF de la proteína S (84-92) del SARS-CoV2 (Seq. ID 2), el péptido RLNEVAKNLNESLIDL de la proteína S del SARS-CoV2 (1185-1200) (Seq. ID 3), el péptido RLNEVAKNL de la proteína S del SARS-CoV2 (1185-1193) (Seq. ID 4), y el péptido NLNESLI<d>L de la proteína S del SARS-CoV2 (1192-1200) (Seq. ID 5).

La presente invención da a conocer además un método para preparar una composición farmacéutica tal como se describió anteriormente con respecto al primer aspecto de la presente invención, para inducir una respuesta inmune en un sujeto o paciente humano o animal en el tratamiento de una enfermedad o trastorno patológico, que comprende las siguiente etapas:

A. ) proporcionar una población de células dendríticas maduras presentadoras de antígenos autólogos que han sido aisladas de una población de células inmunitarias, que incluye monocitos, de sangre periférica del sujeto humano o animal, y posteriormente cultivadas, diferenciadas y cebadas (pulsadas, cargadas) con un péptido antigénico relacionado con una enfermedad o trastorno patógeno específico que padece el sujeto humano o animal; el péptido antigénico específico, es decir, el epítopo, se selecciona preferentemente basándose en la información de bases de datos;

B. ) proporcionar una población de células T CD8+ citotóxicas autólogas (generadas y expandidas) aisladas de una población de células inmunitarias de sangre periférica del mismo sujeto humano o animal, preferentemente de la misma población de células inmunitarias a partir de la cual se derivan las células dendríticas; en el que preferentemente las células T se dejan permanecer en una población de células inmunitarias no adherentes para su posterior activación;

C. ) cocultivar las células dendríticas maduras presentadoras de antígeno autólogo cebadas con células inmunitarias no adherentes, incluidas las células T CD8+ que se van a activar, en el que las células no adherentes incluyen al menos uno de los siguientes: linfocitos T, linfocitos B, plaquetas, neutrófilos, basófilos, eosinófilos; en el que dichas células no adherentes se han aislado de una población de PBMC de sangre periférica del mismo sujeto humano o animal, preferentemente de la misma población de PBMC de la que se derivaron las células dendríticas; en el que las células no adherentes de células dendríticas maduras presentadoras de antígeno autólogo cebadas se cocultivan preferentemente con todas las células inmunitarias no adherentes derivadas de la misma población de PBMC de sangre periférica del mismo sujeto humano o animal; en el que una proporción preferente de células inmunes no adherentes con respecto a las células dendríticas maduras presentadoras de antígenos autólogas es 30:1; en donde el cocultivo se lleva a cabo preferentemente en un medio de cocultivo durante 1 semana a 37 °C y CO2 al 5%, en donde el medio de cocultivo preferentemente se complementa con una o más interleucinas que apoyan la supervivencia y expansión celular;

D. ) aislar las células T CD8+ (CTL) activadas a partir de células inmunitarias no adherentes mediante selección positiva utilizando perlas magnéticas específicas de CD8 (perlas magnéticas acopladas con un anticuerpo anti-CD8 humano);

E. ) control de calidad de los CTL aislados.

Preferentemente, la etapa A.) anterior comprende además, en una primera etapa, el aislamiento de sangre periférica del sujeto humano o animal, que comprende células mononucleares de sangre periférica (PBMC) como material de partida para el aislamiento de las PBMC.

Otra realización preferente del método según la presente invención comprende, en la etapa A.), una etapa de separación de monocitos de las PBMC. Con el fin de separar los glóbulos blancos intactos de los glóbulos rojos, se utiliza un tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC, por sus siglas en inglés). Preferentemente, en una primera etapa, la población de PBMC de sangre periférica se deja en cultivo durante 2 horas a 37 °C y CO2 al 5% y, posteriormente, se recoge un sobrenadante después de la adhesión de los monocitos. El sobrenadante contiene células no adherentes, comprendiendo células inmunitarias no adherentes. Preferentemente, las células inmunitarias no adherentes se criopreservan para uso futuro en la activación de CTL en la etapa C.). El tratamiento de monocitos se lleva a cabo preferentemente en presencia de 100 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) y 50 ng/ml de IL-4 durante 7 días. Esto da como resultado una proliferación de monocitos y una diferenciación en células dendríticas (aún inmaduras).

Preferentemente, la etapa A.) comprende además al menos las siguientes etapas:

e. ) cultivar monocitos aislados de PBMC del sujeto humano o animal, preferentemente aislados mediante separación de Ficoll;

f. ) cultivar monocitos adheridos, preferentemente con factor estimulante de colonias de granulocitosmonocitos e IL-4, preferentemente en medio RPMI 1640 con 10 % de FBS inactivado por calor y 1 % de glutamina, preferentemente durante 6 días, dando como resultado una población de DC inmaduras diferenciadas;

g. ) cebado, es decir, pulsación o carga, de las CD inmaduras con un péptido antigénico, preferentemente en el día 6 de cultivo, preferentemente en una concentración final de 10 pg/ml, preferentemente durante 5 h, preferentemente en presencia de p2 microglobulina, preferentemente a una concentración final de 3 pg/ml de p2 microglobulina;

h. ) maduración de las células dendríticas inmaduras cargadas con un cóctel de citocinas (que incluye IL-6 (10 ng/ml), IL-1 p (25 ng/ml), TNF-a (50 ng/ml) y PGE2 (10-6 M) e incubación, preferentemente durante 48h a 37°C y 5% de CO2,

i. ) y preferentemente congelar alícuotas de las células dendríticas cargadas maduras para una etapa posterior de estimulación/activación de células T CD8+, preferentemente según la etapa C. anterior.

En otra realización preferente del método según la presente invención, en la etapa C), la activación de las células T CD8+ se realiza mediante tres etapas separadas de activación, preferentemente a intervalos de 7 días. En este caso, preferentemente en cada etapa de activación se usa una alícuota de CD maduras pulsadas con el péptido antigénico para activar las células T CD8+. En una primera etapa, las células inmunitarias no adherentes que contienen las células T CD8+ que se van a activar se cocultivan con una primera alícuota de CD maduras pulsadas con el péptido antigénico, en el que preferentemente una proporción de células inmunes no adherentes con respecto a CD maduras es 30:1 (por favor proporcione rangos, por ejemplo, 20:1-50:1, preferentemente 25:1-35:1, más preferentemente 30:1). Preferentemente, el día 7 del cocultivo, se añade una segunda alícuota de las CD maduras pulsadas a las células inmunitarias no adherentes que contienen las células T CD8+. Preferentemente el día 14, se añade una tercera alícuota de las CD maduras pulsadas a las células inmunes no adherentes. Preferentemente, se añaden IL-2 e IL-7 en la segunda y tercera activación. Preferentemente, en cada una de las etapas segunda y tercera, se agrega nuevamente el péptido antigénico a una concentración final de 10 pg/ml, y preferentemente en cada una de las etapas segunda y tercera, se agrega nuevamente p2 microglobulina, preferentemente a una concentración final de 3 pg/ml con el fin de estimular adicionalmente las células T CD8+, es decir, para reforzar la respuesta inmunitaria.

Para determinar si los CTL están suficientemente proliferados y son lo suficientemente citotóxicos para su uso para desencadenar una respuesta inmune después de su activación, se realizan los siguientes ensayos de control de calidad: Primero, se determina el grado de proliferación de los CTL, preferentemente mediante un ensayo CFSE (éster de succinimidil diacetato de carboxifluorescina), preferentemente después de cinco días de cocultivo con DC. Además, preferentemente se determina el nivel de citotoxicidad de los CTL, preferentemente mediante un ensayo de detección de citotoxicidad de LDH.

La presente invención se refiere además a un método para tratar una enfermedad o trastorno patológico en un sujeto humano o animal, preferentemente para el tratamiento de cáncer, especialmente cáncer de mama, o de una infección viral. Dicho método de tratamiento, que también puede denominarse "terapia de células T adoptivas endógenas", comprende la etapa de administrar a dicho sujeto una composición farmacéutica según el primer aspecto de la invención tal como se describió anteriormente, preferentemente preparada mediante el método según el primer aspecto de la presente invención tal como se describió anteriormente. Dicha composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz (dosis, concentración) de los CTL autólogos activados capaces de reconocer específicamente un péptido antigénico MUC (79-87) TLAPATEPA (Seq. ID 1). Los CTL CD8+ activados contenidos en una alternativa no reivindicada de la composición farmacéutica son capaces de reconocer un péptido antigénico seleccionado del péptido LPFNDGVYF de la proteína S del SARS-CoV2 (84-92) (Seq. ID 2), el péptido RLNEVAKNLNESLIDL de la proteína S del SARS-CoV2 (1185-1200) (Seq. ID 3), el péptido RLn Ev a Kn L de la proteína S del SARS-CoV2 (1185-1193) (Seq. ID 4) y el péptido N<l>N<e>SLIDL de la proteína S del SARS-CoV2 (1192-1200) (Seq. ID 5). La composición farmacéutica según la presente invención se administra preferentemente a través de una de las siguientes vías: por vía intravenosa, en una cavidad adyacente a la ubicación de un tumor sólido, tal como en la cavidad intraperitoneal, o directamente infundida en un tumor sólido o adyacente al mismo.

La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno patológico de un sujeto humano o animal, que comprende como ingrediente activo una cantidad terapéuticamente eficaz de CTL activados capaces de reconocer un el péptido TLAPATEPA MUC (79-87) (Seq. ID 1). Alternativas no reivindicadas incluyen el péptido LPFNDGVYF de la proteína S del SARS-CoV2 (84-92) (Seq. ID 2), péptido RLNEVAKNLNESLIDL de la proteína S del SARS-CoV2 (1185-1200) (Seq. ID 3), el péptido RLNEVAKNL de la proteína S del SARS-CoV2 (1185-1193) (Seq. ID 4) y el péptido NLNE<s>L<i>DL de la proteína S del SARS-CoV2 (1192-1200) (Seq. ID 5). Dicha composición farmacéutica comprende además opcionalmente al menos una de las siguientes sustancias: un aditivo farmacéuticamente aceptable, un vehículo, un excipiente, un estabilizador, en la que los CTL activados se han obtenido preferentemente mediante el método descrito anteriormente.

La presente invención se refiere además, según el segundo aspecto de la invención, a una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno patológico de un sujeto humano o animal, que comprende como ingrediente activo una cantidad terapéuticamente eficaz de células dendríticas cebadas autólogas, que presentan, en su superficie celular M<h>C, un péptido antigénico TLAPATEPA MUC (79-87)(Seq. ID 1). Alternativas no reivindicadas incluyen el péptido LPFNDGVYF de la proteína S del SARS-CoV2 (84-92) (Seq. ID 2), péptido RLNEVAKNLNESLIDL de la proteína S del SARS-CoV2 (1185-1200) (Seq. ID 3), el péptido RLNEVAKNL de la proteína S del SARS-CoV2 (1185-1193) (Seq. ID 4) y el péptido NLNESLIDL de la proteína S del SARS-CoV2 (1192-1200) (Seq. ID 5). Dicha composición farmacéutica comprende además opcionalmente al menos una de las siguientes sustancias: un aditivo farmacéuticamente aceptable, un vehículo, un excipiente, un estabilizador, en la que las células dendríticas cebadas autólogas se han obtenido mediante el método descrito anteriormente.

La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica tal como se describió anteriormente, con respecto al primer o segundo aspectos de la presente invención, para su uso como medicamento en el tratamiento de un trastorno patológico de un sujeto humano o animal, preferentemente en el tratamiento de cáncer o de una infección viral.

La presente invención se refiere además, con respecto al primer aspecto de la presente invención, al uso de CTL autólogos activados en una composición farmacéutica o una vacuna en una terapia de células T adoptivas endógenas para el tratamiento de una enfermedad o trastorno patológico en un sujeto humano o animal que padecen la enfermedad patológica, preferentemente cáncer, tal como cáncer de mama, en el que los CTL CD8+ activados son capaces de reconocer un péptido antigénico TLAPATEPA MUC (79-87) (Seq ID 1), tras la activación de las células T CD8+ por células dendríticas autólogas cebadas (cargadas) con dicho péptido antigénico y que presentan el mismo.

Una alternativa no reivindicada se refiere al uso de CTL CD8+ citotóxicos autólogos activados en una composición farmacéutica o una vacuna en una terapia de células T adoptivas endógenas para el tratamiento o la prevención de una infección viral, donde los CTL CD8+ citotóxicos activados son capaces de reconocer un péptido antigénico seleccionado de un grupo que consiste en el péptido LPFNDGVYF (Seq. ID 2) de la proteína S del SARS-CoV2 (84-92), el péptido RLNEVAKNLNESLIDL (Seq. ID 3) de la proteína S del SARS-CoV2 (1185-1200), el péptido R<l>N<ev>A<k>NL (Seq. ID 4) de la proteína S del SARS-CoV2 (1185-1193) y el péptido NLNESLIDL (Seq. ID 5) de la proteína S del SARS-CoV2 (1192-1200), tras la activación de las células T CD8+ por células dendríticas autólogas cebadas (cargadas) y que presentan dicho péptido antigénico.

La presente invención se refiere además, con respecto al segundo aspecto de la invención, al uso de células dendríticas autólogas cebadas en una composición farmacéutica o una vacuna en una terapia de células T adoptivas endógenas para el tratamiento de una enfermedad o trastorno patológico en un sujeto humano o animal que padece la enfermedad patológica, preferentemente cáncer, tal como cáncer de mama, en el que cada una de las células dendríticas cebadas autólogas presenta en su superficie celular un péptido antigénico TLAPATEPA MUC (79-87)(Seq ID 1).

Una alternativa no reivindicada se refiere se refiere al uso de células dendríticas cebadas autólogas en una composición farmacéutica o una vacuna para el tratamiento o prevención de una infección viral, en el que cada, en el que cada una de las células dendríticas cebadas autólogas presenta en su superficie celular un péptido antigénico seleccionado de un grupo que consiste en el péptido LPFNDGVYF de la proteína S del SARS-CoV2 (84-92) (Seq.ID 2), el péptido RLNEVAKNLNESLIDL de la proteína S del SARS-CoV2 (1185 1200) (Seq. ID 3), el péptido RLNEVAKNL proteína S del SARS-CoV2 (1185-1193) (Seq. ID 4), y el péptido NLNESLIDL de la proteína S del SARS-CoV2 (1192-1200) (Seq. ID 5).

Otras realizaciones de la presente invención se establecen en las reivindicaciones dependientes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Las realizaciones preferentes de la presente invención se describen a continuación con referencia a las figuras, que tienen el propósito de ilustrar las presentes realizaciones preferentes de la presente invención y no el propósito de limitarlas. En las figuras,

La figura 1 muestra una imagen de microscopía de contraste de fases de células dendríticas inmaduras con un aumento de X40;

la figura 2 muestra una imagen de microscopía de contraste de fases de células dendríticas maduras con un aumento de X40;

la figura 3 muestra una imagen de microscopía de contraste de fases de todas las células no adherentes cocultivadas con células dendríticas maduras con un aumento de X10;

la figura 4 muestra los resultados de un ensayo de proliferación CFSE;

las figuras 5A,B muestran los resultados de un ensayo de detección de citotoxicidad de LDH, en el que en la figura 5A, los resultados se muestran en formato de placa y en la figura 5B, en formato de tabla.

la figura 6 muestra los resultados de un ensayo de detección de citotoxicidad de LDH en formato de tabla.

DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES PREFERENTES

La presente invención describe, en un primer aspecto, un enfoque novedoso del desarrollo de CTL específicos de antígeno autógeno que pueden administrarse para terapia de células T adoptivas, así como, en un segundo aspecto, el cebado de células dendríticas autógenas para presentar un péptido antigénico. Las células que se utilizan en el presente documento son autólogas, es decir, de la misma especie y del mismo donante que el sujeto receptor, es decir, el paciente que padece una enfermedad o trastorno específico, que puede estar relacionado o no con un patógeno. El primer aspecto de la presente invención es la selección de un péptido de 9 unidades apropiado del antígeno que está relacionado con el patógeno o enfermedad específica que el sujeto humano, es decir, el paciente sufre o está en riesgo de sufrir (en el caso de una vacuna). La selección se puede realizar a partir de bases de datos que son muy conocidas en el estado de la técnica, tales como la base de datos SYFPEITHI MHC, una base de datos de predicción de epítopos. La selección se basa en la comparación de las puntuaciones más altas de inmunogenicidad y predicción de epítopos de células T derivadas de dichas bases de datos. La siguiente etapa es el aislamiento de células inmunes de la sangre periférica. La sangre periférica contiene monocitos, linfocitos T, linfocitos B, células NK, plaquetas, neutrófilos, eosinófilos y basófilos. La caracterización de las poblaciones de células inmunes se puede realizar con citometría de flujo (análisis de dispersión directa versus dispersión lateral). Las CD que en el método según la presente invención sirven como células presentadoras de antígenos, pueden obtenerse a partir de la sangre periférica del paciente siguiendo protocolos conocidos en el estado de la técnica para el aislamiento de monocitos y la diferenciación de células dendríticas. La diferenciación de monocitos en células dendríticas se logra en presencia de citoquinas bien conocidas en el estado de la técnica, tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y la interleucina 4 (IL-4). Las CD que han sido estimuladas con GM-CSF e IL-4 expresan moléculas MHC de clase I y clase II. El péptido antigénico seleccionado sintético puede obtenerse de cualquier fabricante calificado. La "carga" de las células dendríticas con dicho péptido, una etapa también denominada "cebado" o "pulsación", se realiza preferentemente con la adición de p2 microglobulina. A esta etapa le sigue la maduración de las CD en presencia de un "cóctel" de citocinas. Según el primer aspecto de la presente invención, las CD maduras cebadas autólogas se usan para la activación ex vivo de células T CD8+ autólogas, es decir, para desencadenar una respuesta inmune ex vivo. Como alternativa, según el segundo aspecto de la presente invención, estas CD maduras cebadas autólogas pueden usarse directamente en una composición farmacéutica para administración al sujeto humano o animal para desencadenar una respuesta inmune, es decir, activación de células T CD8+ in vivo después de administración.

Las células efectoras (células T CD8+) utilizadas en el método según el primer aspecto de la presente invención pueden generarse y expandirse in vitro según técnicas conocidas (incluidas pero no limitadas a las descritas en Ranieri, Cytotoxic T-Cells: Methods & Protocols, ISBN: 978-1-4939-1157-8, Humana Press, New York, NY, 2014) o variaciones de las mismas que son bien conocidas por los expertos en la materia.

La activación de las células T CD8+ se puede lograr cultivando una población de células que contienen células T CD8+ con una alícuota de CD maduras pulsadas con el péptido antigénico seleccionado. Algunos protocolos seleccionan primero sólo los linfocitos T CD8+ de la población de PBMC (de los cuales los monocitos ya se han separado con el fin de generar CD). Sin embargo, según una realización preferente de la presente invención, las CD pulsadas maduras se cultivaron conjuntamente con todas las células no adherentes que se aislaron, incluidos linfocitos T, linfocitos B, plaquetas, neutrófilos, basófilos y eosinófilos. Preferentemente, en el método según la presente invención, con el fin de activar los CTL, las CD pulsadas/cargadas se cocultivaron con la mayoría de las células inmunitarias, es decir, todas las células inmunitarias aisladas de la sangre periférica excepto los monocitos. El motivo para hacerlo es imitar los procesos del sistema inmunológico in vivo, es decir, estimular las interacciones que ocurren fisiológicamente in vivo. Esto conduce a una activación más fuerte y, por tanto, a un mayor grado de citotoxicidad de los CTL, ya que aumentan las interacciones entre células, las vías de señalización y diferenciación celular, es decir, las reacciones a la liberación de citocinas de diversas células.

Las células no adherentes obtenidas de sangre periférica, preferentemente de la misma muestra utilizada para el aislamiento de monocitos, se descongelan usando protocolos conocidos en el estado de la técnica y posteriormente se cocultivan con las CD maduras preferentemente durante 1 semana a 37 °C y 5 % de CO2. En este caso, la proporción de células no adherentes a CD maduras es preferentemente 30:1. El medio para el cocultivo se suplementa preferentemente con interleucinas que favorecen la supervivencia y expansión celular. El aislamiento de células T CD8+ activadas a partir de cultivos de células T en masa se realiza preferentemente mediante selección positiva utilizando perlas magnéticas recubiertas con un anticuerpo específico para el antígeno de membrana CD8. Las perlas magnéticas se pueden eliminar de las células aisladas positivamente usando protocolos conocidos en el estado de la técnica.

Después de la selección de células T CD8+, los CTL activados están listos para el control de calidad, como la proliferación y la actividad citotóxica, y cuando pasan la evaluación pueden administrarse nuevamente al paciente. Además, las células se pueden analizar en términos de expresión de genes y proteínas. La proliferación de células T se puede determinar mediante el ensayo CFSE, en el que a cada generación de células se le presenta un subconjunto diferente en citometría de flujo. De este modo, se pueden controlar distintas generaciones de células en proliferación mediante dilución de tinte. Las células vivas se marcan covalentemente con un tinte estable y muy brillante. Cada generación de células aparece como un pico diferente en un histograma de citometría de flujo. Los medios adecuados para evaluar la actividad biológica de las células pueden ser la estimulación in vitro de CTL con células diana durante un período de tiempo, normalmente 24 o 48 h, y la determinación de la producción de citoquinas mediante un ensayo de detección adecuado basado en proteínas, por ejemplo mediante citometría de flujo, ensayo ELISPOT o ELISA. Además, la medición de la actividad citotóxica de los CTL se puede realizar mediante estimulación in vitro de los CTL con células diana y determinación con medios adecuados, por ejemplo mediante un ensayo de detección de citotoxicidad LDH. Alternativamente, los CTL activados generados según el método con respecto al primer aspecto de la presente invención se pueden evaluar usando un modelo animal in vivo adecuado para dirigirse a los CTL.

Los CTL preparados según el método de la presente invención están destinados a la inducción de una respuesta inmune en el sujeto humano o animal receptor. Las células administradas al sujeto son células autólogas, es decir, el donante es el mismo que el receptor. La composición farmacéutica se puede preparar mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en el estado de la técnica farmacéutica que no sean tóxicos para los receptores en las concentraciones y dosis utilizadas. Preferentemente, se usan al menos 106 CTL activados para la infusión. Las formulaciones normalmente requieren un ingrediente activo, que es la población de CTL activados, con uno o más vehículos aceptables. La composición farmacéutica que comprende los CTL activados puede entonces administrarse directamente al sujeto a tratar. Puede administrarse por vía intravenosa o en una cavidad adyacente a la ubicación de un tumor sólido (por ejemplo, cavidad intraperitoneal) o infundirse directamente en un tumor sólido o adyacente a él. Se pueden usar soluciones inyectables estériles bien conocidas en el estado de la técnica para la resuspensión de los CTL y como vehículos para la inyección, tales como, por ejemplo, cloruro de sodio al 0,9%.

Ejemplo 1:

Células T CD8+ de una paciente con cáncer de mama activadas contra TLAPATEPA (79-87) MUC (Seq. ID 1) matan eficazmente las células de adenocarcinoma de mama humano MCF7

Selección de epítopo:

MUC1 es una proteína transmembrana de tipo I de etapa única con un dominio extracelular que está fuertemente glicosilado y se extiende hasta 200-500 nm desde la superficie celular y normalmente se expresa en células epiteliales. MUC1 asociado a tumores está sobreexpresada y subglucosilada en la mayoría de los cánceres epiteliales humanos. Se ha considerado como un objetivo notable para inmunoterapias, aunque hasta ahora las vacunas dirigidas a MUC1 no han logrado beneficios significativos para los pacientes [Scheikl-Gatard T., et al., J Transl Med. 15, 154 (2017)].

Aislamiento celular:

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) de la sangre de una paciente con cáncer con separación Ficoll (solución separadora Biocoll, n° de catálogo 1077, Biochrom, Berlín, Alemania).

Generación de DC:

La sangre periférica contiene monocitos o células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) inmaduras que pueden diferenciarse en presencia de citoquinas. Se lleva a cabo la separación de los monocitos de otros tipos de células, ya que los monocitos se adhieren al matraz durante la incubación. Para ello, se cultivaron PBMC durante 2 h a 37 °C y CO2 al 5 %. Después de la adhesión de los monocitos, se recogió el sobrenadante y las células no adherentes, que incluían linfocitos T, linfocitos B, plaquetas, neutrófilos, basófilos y eosinófilos, se criopreservaron para su uso posterior en la etapa de "activación". La proliferación de monocitos aislados y la diferenciación en DC se realizó mediante el tratamiento de los monocitos aislados con 100 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) y 50 ng/ml de interleucina 4 (IL-4) durante 7 días. Esto resultó en una población de CD diferenciadas, pero aún inmaduras (ver figura 1). La generación de CD inmaduras y el progreso del desarrollo de CD maduras se revisaron mediante microscopía invertida de contraste de fases. Al inicio del cultivo los monocitos eran esféricos y adheridos a la superficie del matraz. Al día 5, se encontraron DC inmaduras formando grupos suspendidos en el medio de cultivo.

Pulsación de DC:

La pulsación/cebado de CD inmaduras se llevó a cabo con la adición del péptido TLAPATEPA MUC(79-87) a una concentración final de 10 pg/ml y p2 microglobulina a una concentración final de 3 pg/ml y en un tiempo de incubación de 2-4 h a 37 °C y 5 % de CO2, con agitación ocasional. Después de pulsar las CD inmaduras con el péptido, se eliminó el sobrenadante del matraz, se centrifugó, se descartó y el sedimento celular se resuspendió en medio nuevo (RPMI 1640) que contenía IL-1p a 25 ng/ml, TNF-a a 50 ng/ml. ml, IL-6 a 10 ng/ml, PGE2 a 10-6 M y 20 pl de Pen/Strep. Las células se dejaron en cultivo durante 48 h a 37 °C y 5 % de CO2 para su maduración. La maduración se verificó mediante microscopía invertida de contraste de fases. En la figura 2, se muestra que tras la maduración, las CD se transformaron en células irregulares grandes con proyecciones citoplasmáticas. Las CD maduras se distribuyeron en tres alícuotas y dos alícuotas de las mismas se criopreservaron para su uso posterior.

Activación y ampliación de CTL:

Para la activación y expansión de los CTL, se descongelaron y cocultivaron una alícuota de células no adherentes (de la población de PBMC de la cual se aislaron y eliminaron los monocitos adherentes) con una alícuota de C<d>maduras pulsadas con el péptido TLAPATEPA MUC(79-87) (Seq ID 1) en OPTMIZER T CELL EXPANSION SFM que contiene 1% de L-Glutamina, IL-2 a 10 ng/ml y 10% de Pen/Strep. El día 7, se descongeló la segunda alícuota de CD maduras y se repitió la estimulación de las células T con la adición de IL-2 a 10 ng/ml e IL-7 a 5 ng/ml, a una concentración final de péptido TLAPATEPA MUC(79- 87) de 10 pg/ml y una concentración final de p2 microglobulina de 3 pg/ml. En la figura 3, se muestra una imagen de todas las células no adherentes, incluidas las células T cocultivadas con células dendríticas.

El día 14, se descongeló la tercera alícuota de CD maduras y se repitió la estimulación de las células T de la misma manera que la primera y segunda estimulación con la adición de IL-2 a 10 ng/ml e IL-7 a 5 ng/ml a una concentración final del péptido TLAPATEPA MUC(79-87) de 10 pg/ml y una concentración final de p2 microglobulina de 3 pg/ml. El día 21, las células T CD8+ se separaron y aislaron de los cultivos de células T en masa mediante selección positiva utilizando perlas magnéticas específicas para CD8.

Ensayo CFSE:

La proliferación de células T se evaluó con el kit de proliferación celular CellTraceTM CFSE n° de catálogo C34554 (ThermoFischer Scientific, Darmstadt, Alemania) de acuerdo con las sugerencias del fabricante. Después de cinco días de cocultivo con CD, se analizaron las células T vivas para determinar la dilución del éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) mediante citometría de flujo. A cada generación de células se le presenta un subconjunto diferente en la citometría de flujo. Como controles, las células T no estimuladas cultivadas solas mostraron la intensidad CFSE de las células no divididas, mientras que las células no marcadas mostraron la autofluorescencia de las células y los límites de las divisiones celulares detectables. Tal como se muestra en la figura 4, se analizó un conjunto de datos utilizando el gráfico de proliferación en FCS Express para determinar la capacidad de las CD maduras para estimular la proliferación de células T. El software pudo reconocer la primera generación (células no divididas) y contó un total de 9 generaciones de células divididas de células T CD8+ que habían sido estimuladas con CD maduras que fueron pulsadas con el péptido TLAPATEPA MUC(79-87).

Ensayo de detección de citotoxicidad de LDH:

El ensayo se realizó siguiendo los consejos del fabricante. Brevemente, se sembraron 500 células cancerosas en una placa de 96 pocillos con fondo en U, número de catálogo 4430200 (Orange Scientific, Braine-I'Alleud, Bélgica) y se dejaron durante la noche a 37 °C para que se adhirieran. Al día siguiente, se agregaron células T preactivadas en una proporción de 1:10 y se cultivaron conjuntamente durante 20 horas a un volumen final de 100 pl. Las placas se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 minutos y se transfirieron 50 pl de sobrenadantes a los pocillos correspondientes de una microplaca de fondo plano de 96 pocillos ópticamente transparente, n° de catálogo 781722 (Brand, Wertheim, Alemania). El nivel de citotoxicidad se midió con el kit de detección de citotoxicidad (LDH), número de catálogo 11644793001 (Roche, Darmstadt, Alemania). Se añadieron 50 pl de sustrato a los pocillos correspondientes y la microplaca se dejó incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La absorbancia se midió a 490 nm utilizando un lector ELISA a una longitud de onda de referencia de 605 nm. El porcentaje de citotoxicidad se calculó como (valor experimental - liberación espontánea de células efectoras - liberación espontánea de células diana) / (liberación máxima de células diana - liberación espontánea de células diana) x 100%. El valor de fondo se restó de todos los valores anteriores. En la figura 5A, se muestran los CTL activados que se dirigen a las líneas celulares de adenocarcinoma de mama humano MCF7 y MDA-MB-231. El color más oscuro representa una mayor muerte celular. Tal como se muestra en la figura 5B, los controles "bajos" representan la tasa de muerte normal de las células, mientras que los controles "altos" representan la tasa de muerte de las células con Triton-X 100. El control de fondo es RPMI 1% FBS.

Resultados:

Se logró con éxito la generación in vitro de CTL específicos de antígeno a partir de la sangre de un paciente de mama. El proceso requirió un manejo cuidadoso de las muestras ya que las células primarias eran muy sensibles. Parece que la activación provocó que las células T CD8+ comenzaran a proliferar, ya que había nueve generaciones de nuevas células T. Los resultados del ensayo de detección de citotoxicidad de LDH demostraron que los CTL específicos de MUC1 tenían la capacidad de inducir citotoxicidad en líneas celulares de adenocarcinoma de mama humano. MCF7 y MDA-M<b>-231 eran dos líneas celulares que tenían características diferentes, en el sentido de que MCF7 era una población de un paciente que padecía cáncer de mama de tipo luminal y MDA-MB-231 era una población de un paciente que padecía cáncer de mama triple negativo. Las dos líneas celulares dieron como resultado una resistencia diferente a los CTL. Los CTL que habían sido activados para reconocer el péptido MUC(79-87) TLAPATEPA demostraron un mayor efecto citotóxico en la línea celular MCF7 (106%) que en la línea celular MDA-MB-231 (9,8%). El porcentaje de citotoxicidad se calculó como (valor experimental - liberación espontánea de células efectoras - liberación espontánea de células diana)/(liberación máxima de células diana - liberación espontánea de células diana) x 100%. El valor de fondo se restó de todos los valores anteriores. Un valor superior al 100% debe interpretarse como una citotoxicidad muy alta, es decir, se mató toda la población de células diana. La absorbancia proveniente de la muestra en este ensayo colorimétrico fue mayor que la del control "alto". Estos resultados sugieren que los CTL activados mataron a casi toda la población de células diana MCF7.

Ejemplo 2:

Células T CD8+ de donantes sanos activadas contra el péptido LPFNDGVYF de la proteína S (84-92) del SARS-CoV2 (Seq. ID 2)

Selección de epítopo:

Al igual que otros coronavirus, la proteína de la espícula (S) del SARS-CoV, el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo, es una glicoproteína transmembrana de tipo I grande con múltiples funciones biológicas. La subunidad S1 predicha correspondiente a la región de los aminoácidos (aa) 13 a 680 contiene el dominio mínimo de unión al receptor (Rb D) y media la unión de la proteína S a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), un receptor funcional en células susceptibles. La subunidad S2 predicha (aa 681 a 1255) contiene dos regiones repetidas en heptada (HR1 y HR2) y es responsable de la fusión entre las membranas virales y celulares. Una segunda característica importante de la proteína S del coronavirus es su capacidad para inducir anticuerpos neutralizantes e inmunidad protectora, por lo que se la considera un objetivo importante para el desarrollo de vacunas (He et al., 2006).

En el ejemplo 2, las células dendríticas inmaduras se cebaron con el péptido LPFNDGVYF de la proteína S (84-92) del SARS-CoV2 (Seq. ID 2), un péptido de la glicoproteína de superficie, la llamada "proteína de espícula" del SARS-CoV2, que luego maduró. A continuación, las CD cebadas se cultivaron conjuntamente con células inmunes no adherentes, incluidas células T CD8+ tal como se describió en el ejemplo 1 para inducir una respuesta inmune ex vivo, o se utilizaron directamente en una composición farmacéutica para desencadenar una respuesta inmune in vivo. La activación de las células T se puede verificar extrayendo una muestra de sangre de los sujetos y confirmando la presencia de CTL activados contra el antígeno específico.

Ejemplo 3:

Células T CD8+ de pacientes humanos o de donantes sanos, respectivamente, activadas ex vivo o in vivo contra RLNEVAKNLNESLIDL (1185-1200) (Seq. ID 3) de la proteína S del SARS-CoV2

Selección de epítopo:

En el ejemplo 3, las células dendríticas inmaduras también se cebaron con un péptido de la proteína S del SARS-CoV2 de la glicoproteína de superficie, la llamada "proteína de espícula", es decir, la proteína S del SARS-CoV2, como en el ejemplo 2. Sin embargo, esta vez con el péptido RLNEVAKNLNESLIDL (1185-1200) (Seq. ID 3) de la proteína S del SARS-CoV2 y luego madurado. Este péptido antigénico del SARS-CoV-2 tiene una longitud de 16 aminoácidos. El reconocimiento también ocurre en una secuencia de nueve aminoácidos, pero el péptido de longitud completa es más inmunogénico. Las CD cebadas pueden entonces cocultivarse con células inmunitarias no adherentes, incluidas células T CD8+ tal como se describió en el ejemplo 1 para inducir una respuesta inmunitaria ex vivo, o usarse directamente en una composición farmacéutica para desencadenar una respuesta inmunitaria in vivo. La activación de las células T se puede verificar extrayendo una muestra de sangre de los sujetos y confirmando la presencia de CTL activados contra el antígeno específico.

Ejemplo 4:

Células T CD8+ de pacientes humanos o de donantes sanos, respectivamente, activadas ex vivo o in vivo contra RLNEVAKNL (1185-1193) (Seq. ID 4) de la proteína S del<s>A<r>S-C<o>V2

En el ejemplo 4, las células dendríticas inmaduras se cebaron con RLNEVAKNL (1185-1193) (Seq. ID 4) de la proteína S del SARS-CoV2, un péptido de la glicoproteína de superficie, la llamada "proteína de espícula" del SARS-CoV2, que luego maduró. Las CD cebadas pueden entonces cocultivarse con células inmunitarias no adherentes, incluidas células T CD8+ como se describió en el ejemplo 1 para inducir una respuesta inmunitaria ex vivo, o usarse directamente en una composición farmacéutica para desencadenar una respuesta inmunitaria in vivo. La activación de las células T se puede verificar extrayendo una muestra de sangre de los sujetos tratados y confirmando la presencia de CTL activados contra el antígeno específico.Ejemplo 5:

Células T CD8+ de pacientes humanos o de donantes sanos, respectivamente, activadas ex vivo o in vivo contra NLNESLIDL (1192-1200) (Seq. ID 5) de la proteína S del SARS-CoV2

En el ejemplo 5, las células dendríticas inmaduras se cebaron con la proteína S del SARS-CoV2 (1192-1200) NLNESLIDL (Seq. ID 5), un péptido de la glicoproteína de superficie, la llamada "proteína de espícula" del SARS-CoV2, que luego maduró. Las CD cebadas pueden entonces cocultivarse con células inmunitarias no adherentes, incluidas células T CD8+ como se describe en el ejemplo 1 para inducir una respuesta inmunitaria ex vivo, o usarse directamente en una composición farmacéutica para desencadenar una respuesta inmunitaria in vivo. -La activación de las células T se puede verificar extrayendo una muestra de sangre de los sujetos y confirmando la presencia de CTL activados contra el antígeno específico.

Ejemplo 6:

Las células T CD8+ de dos individuos sanos, activadas contra TLAPATEPA MUC (79-87) (Seq. ID 1), eliminan eficazmente las células de adenocarcinoma de mama humano MCF7 cultivadas como esferoides Aislamiento de células:

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) de la sangre de dos individuos sanos con separación con Ficoll (solución separadora Biocoll, catálogo n° 1077, Biochrom, Berlín, Alemania).

Generación de células dendríticas:

La sangre periférica contiene monocitos o células dendríticas inmaduras (DC, por sus siglas en inglés) que pueden diferenciarse en presencia de citocinas. La separación de monocitos de los otros tipos de células se llevó a cabo a medida que los monocitos se adhieren al matraz durante la incubación. Para este propósito, las PBMC se cultivaron durante 2 h a 37 °C y 5 % de CO2. Después de la adhesión de los monocitos, se recogió el sobrenadante y las células no adherentes, que incluían linfocitos T, linfocitos B, plaquetas, neutrófilos, basófilos y eosinófilos, se criopreservaron para su uso posterior en la etapa de "activación". La proliferación de monocitos aislados y la diferenciación en células dendríticas se realizó mediante el tratamiento de los monocitos aislados con 100 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y 50 ng/ml de interleucina 4 (IL-4) durante 7 días. Esto dio como resultado una población de células dendríticas diferenciadas, pero aún inmaduras. Al comienzo del cultivo, los monocitos eran esféricos y adheridos a la superficie del matraz. Al quinto día, se encontraron células dendríticas inmaduras formando racimos suspendidos en el medio de cultivo.

Pulsación de las células dendríticas:

La pulsación/cebado de las células dendríticas inmaduras se llevó a cabo con la adición del péptido TLAPATEPA MUC(79-87) a una concentración final de 10 pg/ml y de la microglobulina p2 a una concentración final de 3 pg/ml y un tiempo de incubación de 2-4 h a 37 °C y 5 % de CO2, con agitación ocasional. Después de la pulsación de las células dendríticas inmaduras con el péptido, se retiró el sobrenadante del matraz, se centrifugó y se descartó. El pellet celular se resuspendió en medio fresco (RPMI 1640) que contenía IL-Ip a 25 ng/ml, TNF-a a 50 ng/ml, IL-6 a 10 ng/ml, PGE2 a 10-6M y 20 pl de Pen/Strep. Las células se dejaron en cultivo durante 48 h a 37 °C y 5 % de CO2 para su maduración. La maduración se verificó mediante microscopía invertida de contraste de fases. Las células dendríticas maduras se distribuyeron en tres alícuotas y dos alícuotas de las mismas se criopreservaron para su uso posterior.

Activación y expansión de los CTL:

Para la activación y expansión de los CTL, una alícuota de células no adherentes (de la población de PBMC de la que se aislaron y eliminaron los monocitos adherentes) se descongeló y se cocultivaron con una alícuota de células dendríticas maduras pulsadas con el péptido TLAPATEPA MUC(79-87) en un SFM OpTmizer T CELL EXPANSION que contenía 1 % de L-glutamina, IL-2 a 10 ng/ml y 10 % de Pen/Strep. El día 7 se descongeló la segunda alícuota de DC maduras y se repitió la estimulación de las células T con la adición de IL-2 a 10 ng/ml e IL-7 a 5 ng/ml, a una concentración final del péptido TLAPATEPA MUC(79-87) de 10 pg/ml y una concentración final de p2 microglobulina de 3 pg/ml. El día 14 se descongeló la tercera alícuota de DC maduras y se repitió la estimulación de las células T de la misma manera que la primera y la segunda estimulación con la adición de IL-2 a 10 ng/ml e I L-7 a 5 ng/ml, a una concentración final del péptido TLAPATEPA MUC(79-87) de 10 pg/ml y una concentración final de p2 microglobulina de 3 pg/ml. El día 21 se separaron y aislaron las células T CD8+ de los cultivos de células T a granel mediante selección positiva utilizando perlas magnéticas específicas para CD8.

Formación de esferoides tumorales:

Los esferoides tumorales se prepararon mediante la técnica de gota colgante. Brevemente, se extrajeron células MCF7 de un cultivo 2D y se contaron. Para cada gota, se transfirieron 10000 células en 30 pl de medio RPMI 1640 que contenía 10 % de Methocel. Las gotas se colocaron en placas de Petri y se dejaron a 37 °C y 5 % de CO2 hasta que se formaron los esferoides.

Ensayo de citotoxicidad 3D:

El ensayo se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se sembró un esferoide (10000 células) de MCF7 en una placa de 96 pocillos con fondo en U, número de catálogo 4430200 (Orange Scientific, Braine-Falleud, Bélgica) y se añadieron células T preactivadas (100000) en una proporción de 1:10 y se cocultivaron durante 20 horas a un volumen final de 100 pl. Las placas se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 minutos y se transfirieron 50 pl de sobrenadantes a los pocillos correspondientes de una microplaca de fondo plano de 96 pocillos ópticamente transparente, número de catálogo 781722 (Brand, Wertheim, Alemania). El nivel de citotoxicidad se midió con el kit de detección de citotoxicidad (LDH), número de catálogo 1644793001 (Roche, Darmstadt, Alemania). Se añadieron 50 pl de sustrato a los pocillos correspondientes y la microplaca se dejó incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La absorbancia se midió a 490 nm utilizando un lector ELISA a una longitud de onda de referencia de 605 nm. El porcentaje de citotoxicidad se calculó de la siguiente manera: (valor experimental - liberación espontánea de células efectoras) / (liberación espontánea de células diana) 100 %. El valor de fondo se restó de todos los valores anteriores.

Resultados:

Se logró generar in vitro CTL específicos de antígeno a partir de dos individuos humanos sanos de forma exitosa. En experimentos anteriores, se determinó el efecto citotóxico de los CTL específicos de antígeno contra líneas celulares de adenocarcinoma de mama humano en cultivos celulares 2D. En el presente estudio, la determinación de la citotoxicidad de los CTL específicos de antígeno se realizó en condiciones 3D. Las células preactivadas del sujeto A mostraron una citotoxicidad del 86,8 % contra esferoides MCF7 y las células preactivadas del sujeto B tuvieron una citotoxicidad del 84,6 % contra esferoides MCF7. La tabla que se muestra en la figura 6 ilustra los resultados de las dos poblaciones de células preactivadas junto con la citotoxicidad relativa de las células de control. El grupo de control se generó a partir de células dendríticas que maduraron sin pulso previo con el péptido respectivo.

LISTA DE SIGNOS DE REFERENCIA

Ninguno

REFERENCIAS

Eisenbarth, S.C. Dendritic cell subsets in T cell programming: location dictates function. Nat Rev Immunol 19, 89-103 (2019). https://doi.org/10.1038/s41577-018-0088-1

Farhood, B, Najafi, M, Mortezaee, K. CD8+ cytotoxic T lymphocytes in cancer immunotherapy: A review. J Cell Physiol. 2019; 234: 8509-8521. https://doi.org/10.1002/jcp.27782.

Franck J. Barrat, Lishan Su; A pathogenic role of plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity and chronic viral infection. J Exp Med 2 September 2019; 216 (9): 1974-1985. doi: https://doi.org/10.1084/jem.20181359. He Y, Li J, Heck S, Lustigman S, Jiang S. Antigenic and immunogenic characterization of recombinant baculovirus-expressed severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein: implication for vaccine design. J Virol. 2006;80(12):5757-5767. doi:10.1128/JVI.00083-06.

Jebastin, T., Narayanan, S., In silico epitope identification of unique multidrug resistance proteins from Salmonella Typhi for vaccine development, Comput. Biol. Chem., 2019 Feb; 78:74-80, ISSN 1476-9271, https://doi.org/10.1016/i.compbiolchem.2018.11.020.

Krause P.J., Kavathas P.B., Ruddle N.H. (2019) Immunotherapy for Infectious Diseases, Cancer, and Autoimmunity. In: Krause P., Kavathas P., Ruddle N. (eds) Immunoepidemiology. Springer, Cham Maddur, M.S., Lacroix-Desmazes, S., Dimitrov, J.D. et al. Natural Antibodies: from First-Line Defense Against Pathogens to Perpetual Immune Homeostasis. Clinic Rev Allerg Immunol 58, 213-228 (2020). https://doi.org/10.1007/s12016-019-08746-9.

Met, O., Jensen, K.M., Chamberlain, C.A. et al. Principles of adoptive T cell therapy in cancer. Semin Immunopathol 41, 49-58 (2019). https://doi.org/10.1007/s00281 -018-0703-Z.

Roy A. Mariuzza, Pragati Agnihotri and John Orban (2020) The structural basis of T-cell receptor (TCR) activation: An enduring enigma J. Biol. Chem. 2020, 295:914-925 doi: 10.1074/jbc.REV119.009411 originally published online December 17, 2019

Sant, A.J., 6 - Overview of T-Cell Recognition: Making Pathogens Visible to the Immune System, Editor(s): Robert R. Rich, Thomas A. Fleisher, William T. Shearer, Harry W. Schroeder, Anthony J. Frew, Cornelia M. Weyand, Clinical Immunology (Fifth Edition), Content Repository Only!, 2019, Pages 93-106.e1, ISBN 9780702068966, https://doi.org/10.1016/B978-0-7020-6896-6.00006-5 .

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune en un sujeto humano o animal que padece una enfermedad o trastorno patológico, que comprende linfocitos T CD8+ citotóxicos (CTL) autólogos activados, activados por células dendríticas maduras cebadas autólogas del sujeto humano o animal, presentando dichas células dendríticas maduras cebadas autólogas un péptido antigénico,

- en la que los CTL activados derivan de una población autóloga de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de la sangre periférica del mismo sujeto humano o animal; y

- en la que los cTl activados son capaces de reconocer el péptido antigénico;

- en la que los CTL se han activado mediante células dendríticas autólogas cebadas con un péptido antigénico, en el que las células dendríticas se han aislado del mismo sujeto humano o animal que los CTL, en el que los CTL se han activado mediante cocultivo de células T CD8+ derivadas de la población de PBMC, con las células dendríticas presentadoras de antígeno;

- y en la que las células dendríticas antes de su uso en la activación de células T CD8+ se han cultivado ex vivo y posteriormente se han cebado (cargado, pulsado) con el péptido antigénico, y se han madurado en presencia de un cóctel de citoquinas antes de su uso en la activación de las células T CD8+ mediante cocultivo,

caracterizada por queel péptido antigénico es un péptido TLAPATEPA MUC (79-87) (Seq. ID 1), yen quelos CTL se han activado cocultivando con las células dendríticas maduras cargadas una población de todas las células inmunitarias no adherentes derivadas de la misma población de PBMC que la población de la cual las células dendríticas se derivan, en el que dicha población de células inmunes no adherentes además de incluir las células T CD8+ a activar, incluye además todos los siguientes grupos de células: linfocitos T CD4+, linfocitos B, plaquetas, neutrófilos, basófilos y eosinófilos.

2. Método para obtener células dendríticas autólogas humanas o animales que presentan un péptido TLAPATEPA MUC (79-87) (Seq. ID 1) antigénico tumoral, para la preparación de una composición farmacéutica según la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas:

a. ) cultivar monocitos aislados de PBMC del sujeto humano o animal que padece una enfermedad o trastorno patológico, dichos monocitos preferentemente aislados con separación de Ficoll;

b. ) cultivar los monocitos adherentes de la etapa a.) con factor estimulante de colonias de granulocitosmonocitos e IL-4, preferentemente en medio RPMI 1640 con 10% de FBS inactivado por calor y 1% de glutamina, preferentemente durante 6 días, dando como resultado un población de células dendríticas inmaduras;

c. ) pulsación de las células dendríticas inmaduras de la etapa b.), preferentemente el día 6 de cultivo con el péptido antigénico TLAPATEPA MUC (79-87) (Seq. ID 1), preferentemente a una concentración final de 10 pg/ml, e incubación, preferentemente durante 5 h, preferentemente en presencia de p2 microglobulina, preferentemente a una concentración final de 3 pg/ml de p2 microglobulina, dando como resultado una población de células dendríticas cargadas que presentan el péptido antigénico;

d. ) maduración de las células dendríticas cargadas que presentan el péptido antigénico TLAPATEPA MUC (79-87) (Seq. ID 1), con un cóctel de citoquinas, que incluye preferentemente IL-6, preferentemente IL-6 en una concentración de 10 ng/ml, IL-1 p, preferentemente IL-1 p en una concentración de 25 ng/ml, TNF-a, preferentemente TNF-a a una concentración de 50 ng/ml, y PGE2, preferentemente PGE2 a una concentración de 10-6 M, e incubación, preferentemente incubación durante 48 h a 37°C y 5% de CO2.

3. Método para preparar una composición farmacéutica, preferentemente una composición farmacéutica según la reivindicación 1, para inducir una respuesta inmune en un sujeto humano o animal en el tratamiento de una enfermedad patológica, que comprende las siguientes etapas:

A. ) proporcionar una población de células dendríticas maduras presentadoras de antígenos autólogas que han sido aisladas de una población de células inmunitarias, incluidos monocitos, de sangre periférica del sujeto humano o animal, y posteriormente cultivadas, diferenciadas y, antes de la maduración, cebadas con en un estado inmaduro con un péptido antigénico relacionado a una enfermedad o trastorno patógeno específico que padezca el sujeto humano o animal;

B. ) proporcionar una población de células T CD8+ citotóxicas autólogas (generadas y expandidas) aisladas de una población de células inmunitarias de sangre periférica del mismo sujeto humano o animal, preferentemente de la misma población de células inmunitarias a partir de la cual se derivaron las células dendríticas;

C. ) cocultivar las células dendríticas maduras presentadoras de antígeno autólogas cebadas con células inmunitarias no adherentes, incluidas las células T CD8+ que se van a activar, en el que dichas células no adherentes se han aislado de una población de PBMC de sangre periférica del mismo sujeto humano o animal, preferentemente de la misma población de PBMC de la que se derivaron las células dendríticas; en el que las células dendríticas maduras presentadoras de antígeno autólogas cebadas se cocultivan preferentemente con todas las células inmunitarias no adherentes derivadas de la misma población de PBMC de sangre periférica del mismo sujeto humano o animal; en el que una proporción preferente de células inmunes no adherentes a células dendríticas maduras presentadoras de antígenos autólogas es 30:1; en el que el cocultivo se lleva a cabo preferentemente en un medio de cocultivo durante 1 semana a 37°C y CO2 al 5%, en el que el medio de cocultivo preferentemente se complementa

con una o más interleucinas que apoyan la supervivencia y expansión celular;

D. ) aislamiento de los CTL CD8+ de las células inmunitarias no adherentes mediante selección positiva utilizando perlas magnéticas específicas de CD8;

E. ) control de calidad de los CTL CD8+ aislados.

caracterizado por que en la etapa C.), las células inmunitarias no adherentes incluyen todas las siguientes: linfocitos T, linfocitos B, plaquetas, neutrófilos, basófilos, eosinófilos.

4. Método, según la reivindicación 3,caracterizado por quela etapa A.) comprende el aislamiento de sangre periférica del sujeto humano o animal, que comprende PBMC como material de partida para el aislamiento de

las PBMC.

5. Método, según la reivindicación 3,caracterizado por quela etapa A.) comprende una etapa de separación de los monocitos de las PBMC, en el que preferentemente, en una primear etapa, las PBMC se

dejan en cultivo durante 2 horas a 37°C y CO2 al 5%, y posteriormente, se recogen de un sobrenadante después de la adhesión de los monocitos, y preferentemente la criopreservación de las células no adherentes

para uso futuro en la activación de células T CD8+ en la etapa C), y preferentemente tratamiento de monocitos con 100 ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y 50

ng/ml de IL-4 durante 7 días para la proliferación de monocitos y la diferenciación en células dendríticas.

6. Método, según la reivindicación 3,caracterizado por quela etapa A.) comprende al menos las siguientes etapas:

e. ) cultivar monocitos aislados de células mononucleares de sangre periférica del sujeto humano o animal, preferentemente aislados mediante separación de Ficoll;

f. ) cultivar los monocitos adheridos, preferentemente con factor estimulante de colonias de granulocitosmonocitos e IL-4, preferentemente en medio RPMI 1640 con 10% de FBS inactivado por calor y 1% de glutamina, preferentemente durante 6 días, dando como resultado una población de células dendríticas inmaduras diferenciadas;

g. ) cebar las DC inmaduras con un péptido antigénico TLAPATEPA MUC (79-87) (Seq. ID 1), preferentemente el día 6 de cultivo, preferentemente a una concentración final de 10 pg/ml, preferentemente durante 5 h, preferentemente en presencia de p2 microglobulina, preferentemente a una concentración final de 3 pg/ml de p2 microglobulina;

h. ) maduración de las células dendríticas inmaduras cargadas (cebadas) con un cóctel de citoquinas, que incluye preferentemente IL-6, IL-1 p, TNF-a y PGE2 e incubación, preferentemente durante 48 h a 37 °C y

5 % de CO2,

i. ) y preferentemente congelar alícuotas de las células dendríticas cargadas maduras para una etapa posterior de estimulación de células T CD8+.

7. Método, según la reivindicación 3,caracterizado por queen la etapa C.), la activación de las células T

CD8+ se realiza mediante tres etapas de activación separadas, preferentemente a intervalos de 7 días, en el que preferentemente en cada etapa de activación se pulsa una alícuota de DC maduras con el péptido antigénico TLAPATEPA MUC (79-87) (Seq. ID 1) se usa para activar las células T CD8+, en el que preferentemente en una primera etapa, se cocultivan células inmunes no adherentes que contienen células T

CD8+ con una primera alícuota de CD maduras pulsadas con el péptido antigénico TLAPATEPA MUC (79

87) (Seq. ID 1), en el que preferentemente una proporción de células inmunitarias no adherentes con respecto a las CD maduras es de 30:1; y en el que preferentemente el día 7 de cocultivo, se añade una segunda alícuota de las DC maduras pulsadas a las células inmunes no adherentes, y en el que preferentemente el día 14, se añade una tercera alícuota de las DC maduras pulsadas a las células inmunitarias no adherentes, en el que preferentemente en cada uno de las segunda y tercera etapas de activación se agregan IL-2 e IL-7, y en donde preferentemente, en cada uno de las segundas y terceras

etapas de activación se añade el péptido antigénico TLAPATEPA MUC (79-87) (Seq. ID 1) a una concentración final de 10 pg/ml, y en el que en cada uno de las etapas segunda y tercera de activación se añade preferentemente p2 microglobulina, preferentemente a una concentración final de 3 pg/ml.

8. Método, según la reivindicación 3,caracterizado por queel método comprende al menos uno de las siguientes etapas:

- determinación de la proliferación de CTL, preferentemente mediante un ensayo CFSE (carboxifluorescina diacetato succinimidil éster), preferentemente después de cinco días de cocultivo con DC;

- determinación de la citotoxicidad de los CTL, preferentemente mediante un ensayo de detección de citotoxicidad de LDH.

9. Composición farmacéutica para usar como medicamento en el tratamiento de un trastorno patológico de un sujeto humano o animal, que comprende como ingrediente activo una cantidad terapéuticamente eficaz de<c>T<l>citotóxicos activados capaces de reconocer un péptido antigénico TLAPATEPA MUC (79-87) (Seq. ID 1), comprendiendo opcionalmente dicha composición farmacéutica al menos una de las siguientes sustancias: un aditivo farmacéuticamente aceptable, un vehículo, un excipiente, un estabilizador,caracterizada por quelos CTL activados se han obtenido preferentemente mediante el método definido en una de las reivindicaciones 3-8.

10. Composición farmacéutica, según la reivindicación 1, para uso como medicamento en el tratamiento de cáncer.

11. Composición farmacéutica, preferentemente preparada mediante un método según la reivindicación 2, para uso como medicamento en el tratamiento de un trastorno patológico de un sujeto humano o animal o como vacuna para la prevención de un trastorno patológico de un sujeto humano o animal, en la que el trastorno patológico preferentemente es cáncer, preferentemente cáncer de mama,caracterizada por quela composición farmacéutica comprende una dosis terapéuticamente eficaz de células dendríticas cebadas autólogas, cada una de las cuales presenta en su superficie celular un péptido antigénico TLAPATEPA MUC (79-87) (Seq ID 1).

12. Uso de células dendríticas autólogas cebadas en una composición farmacéutica o una vacuna para el tratamiento de una enfermedad o trastorno patológico en un sujeto humano o animal que padece la enfermedad patológica, preferentemente cáncer, tal como cáncer de mama, en el que cada una de las células dendríticas autólogas cebadas presentan en su superficie celular un péptido TLAPATEPA MUC (79-87) (Seq ID 1).