ES2975889T3 - Método para obtener información espacial y de secuenciación del ARNm de tejido - Google Patents
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Abstract
La invención está dirigida a un método para obtener la ubicación espacial y la información de secuencia de una secuencia diana de ARNm en una muestra de tejido que comprende los pasosa. proporcionar una superficie sólida que tenga al menos un marcador fiduciariob. unir una pluralidad de moléculas de anclaje que comprenden un conector fotoescindible y una unidad adaptadora a la superficie sólidac. Moléculas de armazón de unión que comprenden una unidad capaz de unirse a la unidad adaptadora de una molécula de anclaje, una unidad de poliinosina que tiene de 5 a 30 bases de inosina y una unidad de poliadenina que tiene de 10 a 50 bases de adenina a las moléculas de anclaje. incorporar aleatoriamente adenina, guanina, citosina y timina como bases nucleicas a la molécula de anclaje complementando las bases de inosina de las moléculas de andamiaje creando así códigos de barras en las moléculas de anclaje, en donde las bases nucleicas están provistas de una unidad fotodetectable y en donde la secuencia de las Los códigos de barras y su ubicación espacial en relación con el marcador fiduciario se detectan simultáneamente como información espacial. incorporar timina a las moléculas de anclaje complementando la unidad de poliadenina de las moléculas de andamiaje creando así una unidad de poli-T. Eliminación de las moléculas de andamiaje de las moléculas de anclaje. proporcionar una muestra de tejido que comprende al menos una cadena de ARNm en la que al menos una cadena de ARNm de la muestra se une a una unidad poli-T de al menos una molécula de anclaje. transcripción inversa de la cadena de ARNm creando una cadena de ADNc unida a la superficie sólidai. eliminar las hebras de ADNc de la superficie sólida escindiendo el conector fotoescindible de las moléculas de anclaje. obtener la información de secuencia de las cadenas de ADNc y vincular la información espacial con la información de secuencia de las cadenas de ADNc. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Método para obtener información espacial y de secuenciación del ARNm de tejido
Antecedentes
La presente invención está dirigida a un proceso para secuenciar y decodificar espacialmente moléculas de ARNm de un tejido.
Ha sido un desafío detectar todos los genes expresados a nivel subcelular en el tejido manteniendo la información espacial y luego secuenciando esos genes para detectar posibles variantes. Es especialmente difícil alcanzar una resolución subcelular.
Por ejemplo, el desarrollo de un sistema de secuenciación para la decodificación espacial de moléculas de códigos de barras de ADN se describe en "Single-molecule resolution" (Nature, diciembre de 2020, Yusuke Oguchi)
Está disponible un enfoque comercial en donde se mantiene la información espacial a medida que las moléculas de ARN del tejido se etiquetan con un identificador espacial previamente localizado en una matriz. Las bibliotecas resultantes se secuencian posteriormente mediante técnicas de secuenciación estándar NGS (secuenciación de próxima generación) in vitro. Con el proceso de localización, se conoce la posición del identificador espacial en la matriz antes de que tenga lugar el proceso de secuenciación. Después de la secuenciación del identificador espacial, la secuencia de ARN ligada de interés se puede asignar a la localización del tejido. Una limitación importante de este enfoque es la resolución de la tecnología, ya que depende del tamaño de las características de los puntos en la matriz, que actualmente se encuentra únicamente en un nivel multicelular.
Las tecnologías para obtener información espacial y de secuenciación están publicadas, por ejemplo, en los documentos US20150344942A1, WO2016162309A1 y WO2012/140224.
El análisis del transcriptoma unicelular se ha visto revolucionado por los códigos de barras de ADN que indexan bibliotecas de ADNc, lo que permite realizar análisis altamente multiplexados. Además, se están aprovechando los códigos de barras de ADN para transcriptomas espaciales. Aunque la resolución espacial depende de los métodos usados para decodificar códigos de barras de ADN, lograr la decodificación de una sola molécula (ARNm) sigue siendo un desafío.
Compendio
Por lo tanto, un objetivo de la invención era proporcionar un método para secuenciar y decodificar espacialmente moléculas de ARNm de un tejido donde la generación y decodificación del código de barras de ADN se realizan de forma concomitante.
Por lo tanto, el objetivo de la invención es un método para obtener la localización espacial y la información de secuencia de una secuencia diana de ARNm en una muestra de tejido que comprende las etapas
a. proporcionar una superficie sólida que tiene al menos un marcador de referencia
b. anclar una pluralidad de moléculas de anclaje que comprenden un enlazador foto-escindible y una unidad adaptadora a la superficie sólida
c. unir moléculas de armazón que comprenden una unidad capaz de unirse a la unidad adaptadora de una molécula de anclaje, una unidad de poli-inosina que tiene de 5 a 30 bases de inosina y una unidad de poli-adenina que tiene de 10 a 50 bases de adenina a las moléculas de anclaje.
d. incorporar aleatoriamente adenina, guanina, citosina y timina como bases nucleicas a la molécula de anclaje complementando las bases de inosina de las moléculas de armazón opcionalmente durante la secuenciación por síntesis (SBS) creando así códigos de barras en las moléculas de anclaje, en donde las bases nucleicas están provistas de una unidad foto-detectable y en donde la secuencia de los códigos de barras (y opcionalmente su generación) y su localización espacial con respecto al marcador de referencia se detecta simultáneamente como información espacial.
e. incorporar timina a las moléculas de anclaje complementando la unidad de poli-adenina de las moléculas de armazón creando así una unidad poli-T
f. eliminar las moléculas de armazón de las moléculas de anclaje
g. una muestra de tejido que se ha proporcionado comprende al menos una cadena de ARNm en donde al menos una cadena de ARNm de la muestra se une a una unidad poli-T de al menos una molécula de anclaje
h. transcripción inversa de la cadena de ARNm creando una cadena de ADNc unida a la superficie sólida i. eliminar las cadenas de ADNc de la superficie sólida escindiendo el enlazador foto-escindible de las moléculas de anclaje
j. obtener la información de secuencia de las cadenas de ADNc y ligar la información espacial con la información de secuencia de las cadenas de ADNc.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 muestra un flujo de trabajo genérico de la invención.
La Fig. 2 muestra la formación de la sección del código de barras en las moléculas de anclaje.
Descripción detallada
El método aquí descrito se usa para detectar ARNm en tejido con una resolución espacial muy alta de 50 a 300 nm. El procedimiento de la invención se describe a continuación con más detalle de acuerdo con las etapas del proceso que se deben realizar en el orden a) hasta j).
Etapa a): proporcionar una superficie sólida que tenga al menos un marcador de referencia
Es preferible que el sustrato sólido esté provisto de una superficie funcionalizada. La superficie se puede funcionalizar con productos químicos comúnmente usados disponibles para la unión de oligonucleótidos a soportes sólidos que contienen un enlazador foto-escindible y, opcionalmente, ensamblarse junto con otras partes para formar una celda de flujo de microfluidos con una entrada y una salida.
La superficie funcionalizada puede incluir, por ejemplo, oligos modificados con amina unidos covalentemente a un grupo carboxilato activado o éster de succinimidilo, oligos modificados con tiol unidos covalentemente mediante un reactivo alquilante como yodoacetamida o maleimida, oligos modificados con acridita MR unidos covalentemente a través de un tioéter, digoxigenina éster NHS u oligos modificados con éster o biotina capturados mediante estreptavidina inmovilizada que puede interaccionar con la biotina.
Opcionalmente, las moléculas de anclaje se distribuyen aleatoriamente sobre el sustrato sólido con una densidad correspondiente a la concentración de la molécula.
La molécula de anclaje puede comprender además al menos una secuencia cebadora para la polimerasa capaz de amplificación por círculo rodante.
Etapa b): anclar una pluralidad de moléculas de anclaje y un enlazador foto-escindible a la superficie sólida funcionalizada
Más tarde, las moléculas de anclaje pre-fabricadas se cargan sobre la superficie sólida con una solución tampón. Las moléculas de anclaje interaccionarán con la superficie funcionalizada y se distribuirán espacialmente de forma aleatoria en toda el área.
Preferiblemente, las moléculas de anclaje se generan con un enlazador foto-escindible, una unidad adaptadora como un adaptador P5 o P7 u otras secuencias cortas. Se pueden fabricar miles de millones de estas moléculas individuales. La densidad de las moléculas de anclaje se puede controlar mediante la concentración cargada.
Etapa c): unir moléculas de armazón que comprenden una unidad capaz de unirse a la unidad adaptadora de una molécula de anclaje, una unidad de poli-inosina que tiene de 5 a 30 bases de inosina y una unidad de poli-adenina que tiene de 10 a 50 bases de adenina a las moléculas de anclaje.
Las moléculas de armazón se muestran en las Figs. 1 a y b y se unen a través de la unidad adaptadora a la molécula de anclaje. El experto en la materia conoce adaptadores adecuados y sus equivalentes, como P5 o P7.
La unidad de poli-inosina sirve como molde para la generación de códigos de barras aleatorios y puede tener preferiblemente de 5 a 30 bases de inosina.
Etapa d): incorporar aleatoriamente adenina, guanina, citosina y timina como bases nucleicas a la molécula de anclaje complementando las bases de inosina de las moléculas de armazón opcionalmente durante la secuenciación por síntesis (SBS), creando así códigos de barras en las moléculas de anclaje, en donde las bases nucleicas están provistas con una unidad foto-detectable y en donde la secuencia de los códigos de barras (y opcionalmente su generación) y su localización espacial con respecto al marcador de referencia se detecta simultáneamente como información espacial.
Preferiblemente, la incorporación aleatoria de adenina, guanina, citosina y timina como bases nucleicas a la molécula de anclaje se realiza proporcionando una mezcla de A, T, G y C y una polimerasa.
Durante esta etapa, se crean códigos de barras aleatorios en las moléculas de anclaje que se usan para identificar y asignar simultáneamente su localización espacial en relación con los marcadores de referencia.
En esta etapa, las bases de inosina de la molécula de armazón se complementan con adenina, guanina, citosina y timina (A, C, G, T) de forma aleatoria para crear una secuencia de código de barras. Para ello, las bases nucleicas están provistas de una unidad foto-detectable. Tales bases nucleicas se conocen a partir de la secuenciación por síntesis y están disponibles comercialmente. La forma aleatoria se establece proporcionando una mezcla de A, T, G y C y una polimerasa a la muestra.
Gracias a las unidades foto-detectables, la generación del código de barras se puede controlar fácilmente tomando las imágenes adecuadas.
La información espacial se obtiene preferiblemente detectando la unidad foto-detectable de las bases nucleicas y/o mediante secuenciación por síntesis.
Como se muestra en la Fig. 2, se toma una imagen después de cada ciclo de extensión para determinar la base incorporada. La imagen puede tener súper resolución con el fin de poder distinguir cada código de barras.
Las bases A, C, G, T se incorporarán aleatoriamente en cada molécula individual en cada ciclo y, por lo tanto, crearán un identificador molecular espacial único. El sustrato sólido también contiene al menos 2 marcas de referencia independientes que podrían ser marcadores fluorescentes o auto-fluorescentes. También se toman imágenes de esas marcas de referencia y se determina la posición X-Y de la base incorporada con respecto a los marcadores. De esta manera, se registra cada secuencia de cada molécula individual y se almacena la base incorporada, su localización espacial con respecto a las marcas de referencia como información especial (distancias X-Y).
Etapa e): incorporar timina a las moléculas de anclaje complementando la unidad de poli-adenina de las moléculas de armazón creando así una unidad de poli-T
Después de la secuenciación, las bases de las colas de poli-A se llenan con nucleótidos T sin marcar. Esta etapa permite formar una molécula de ADN de doble cadena que es estable.
Por supuesto, se debe eliminar la mezcla de bases de las etapas anteriores y, opcionalmente, después del lavado, se proporciona timina y polimerasa.
Etapa f): eliminar las moléculas de armazón de las moléculas de anclaje
Como una siguiente etapa, el sustrato sólido con el complejo de ADN bicatenario se desnaturaliza con calor para eliminar la molécula de armazón que forma un oligonucleótido monocatenario en la superficie sólida.
Etapa g): una muestra de tejido que se ha suministrado comprende al menos una cadena de ARNm en donde al menos una cadena de ARNm de la muestra se une a una unidad poli-T de al menos una molécula de anclaje.
Una muestra de tejido se pone en contacto con el sustrato sólido donde se localizan todas las moléculas individuales y se permeabilizan para liberar las moléculas de ARNm. La cola poli T de 30-50 bases de los oligonucleótidos, localizada en las proximidades, se hibridará luego con el ARNm expresado en el tejido mediante la interacción estándar ADN/ARNm.
Opcionalmente, la muestra de tejido se permeabiliza después de suministrarla a la superficie.
Etapa h): transcripción inversa de la cadena de ARNm creando una cadena de ADNc unida a la superficie sólida
En las siguientes etapas, todas las moléculas de anclaje con el ARNm se transcriben de forma inversa en ADNc y posteriormente el tejido se puede eliminar del sustrato sólido mediante reacciones enzimáticas o químicas.
La cadena de ADNc se puede circularizar y luego multiplicar mediante una polimerasa capaz de realizar una amplificación circular en una pluralidad de concatémeros de ADN.
Opcionalmente, solo se puede transcribir de forma inversa un subconjunto del ARNm (región de interés o ROI) si solo se mantiene un subconjunto predefinido de los anclajes eliminando áreas no deseadas usando luz dirigida antes de la generación del ADNc.
Se pueden definir las regiones de interés (ROI) en el tejido usando una fuente de luz UV láser externa usando un dispositivo digital de micro-espejo (DMD). Cada ROI recibirá una cierta dosis de luz láser UV y todos los enlaces fotoescindibles de las moléculas individuales ancladas al sustrato sólido se cortarán y eliminarán.
Etapa j): eliminar las cadenas de ADNc de la superficie sólida escindiendo todo los enlazadores foto-escindibles de las moléculas de anclaje.
Opcionalmente, sólo se puede eliminar un subconjunto del ADNc usando una fuente de luz UV láser externa dirigida a una región de interés en la superficie sólida como se describió anteriormente.
Etapa i): obtener la información de la secuencia de las cadenas de ADNc y vincular la información de la secuencia del código de barras espacial de las cadenas de ADNc al código de barras de la superficie sólida.
Se pueden realizar procesos adicionales para preparar el ADNc para una biblioteca de secuenciación. En la última etapa, cada molécula con el identificador molecular de anclaje espacial único se secuencia in vitro y se vincula con la localización original determinada en el tejido. Como se conoce a partir de la etapa d) la secuencia de los códigos de barras y su localización espacial con respecto al marcador de referencia, se puede determinar fácilmente la información espacial del ARNm. Dado que la información de secuencia de las cadenas de ADNc incluye la secuencia de los códigos de barras y la información de secuencia del código de barras generado en la superficie sólida se conoce a partir de las etapas d) e i), se pueden hacer coincidir las secuencias de dos códigos de barras para identificar el origen/ información espacial del ARNm en el tejido.
El enfoque de la invención es más adecuado para secuenciar el extremo 3' de los ARNm capturados.
Muchas aplicaciones de secuenciación de ARNm también requieren identificar el extremo 5' del ARNm. El siguiente flujo de trabajo (también aplicable para soporte sólido) resuelve este problema como se visualiza en la Figura 2. B se refiere a bases universales como inosina.
Opcionalmente, el tejido se puede caracterizar adicionalmente mediante la identificación de diferentes proteínas expresadas en el tejido, por ejemplo, con colorantes conjugados con anticuerpos, preferiblemente con la tecnología MACSima.
En teoría, el método de la invención es capaz de producir 30 tipos de moléculas de código de barras de ADN con una longitud de lectura promedio de ~20 nt con una tasa de error de menos del 5 % por nucleótido. Esto es suficiente para identificarlas espacialmente. Además, las moléculas de códigos de barras de ADN espacialmente identificadas unidas a anticuerpos se pueden detectar con una resolución de una sola molécula.
Ejemplo de flujo de trabajo:
Cargar oligonucleótidos idénticos como moléculas de anclaje que consisten en un enlazador foto-escindible con un adaptador P5 con 20-30 bases de inosina y 30-50 bases de cola de bases poli A en una superficie sólida funcionalizada (p. ej., cubreobjetos estándar de 25x75x1 mm)
Las moléculas de anclaje se inmovilizarán aleatoriamente en una superficie funcionalizada. Densidad de moléculas de anclaje en la superficie controlada mediante concentración.
Las moléculas de anclaje pueden tener una distancia mínima entre sí de aproximadamente 50-300 nm.
En teoría, 25-30 bases de inosina permitirán de 1,2 * 10A15 a 1,5 * 10A18 combinaciones posibles al incorporar aleatoriamente nucleótidos individuales marcados que consisten en A, C, T y G al realizar la secuenciación por síntesis (SBS).
Realizar una secuenciación por síntesis durante 25-30 ciclos y determinar cada base que se incorporó en cada molécula de la base complementaria de inosina. La Fig. 1 muestra el ciclo de secuenciación. Muestra la etapa de extensión donde la primera ronda de nucleótidos marcados se incorpora a la base de inosina.
La secuenciación por síntesis se puede realizar con un sistema óptico dedicado de súper resolución. La información de localización de cada molécula en el soporte del corte de tejido se escribirá en una base de datos y el usuario podrá descargarla (sitio web, nube) o enviarse con un consumible.
Después de secuenciar todas las bases de la inosina, cada molécula tendrá un identificador molecular espacial único. Cada localización de la molécula individual con el identificador molecular espacial único se puede determinar con respecto a una posición relativa en la superficie sólida funcionalizada (p. ej., marca de referencia).
El sustrato sólido también contiene 2 marcas de referencia independientes. Se toman imágenes de esas marcas de referencia y se determina la posición X-Y. Se registra cada secuencia de cada molécula individual y se almacena la localización espacial relativa a las marcas de referencia como coordenadas X-Y.
Después de secuenciar las 25-30 bases, las colas de poli A (~30 bases) se llenan con nucleótidos T sin marcar. Esta etapa formará una molécula de ADN bicatenario que es estable:
Como una siguiente etapa, el sustrato sólido con moléculas de doble cadena se desnaturaliza de modo que la molécula de ADN de doble cadena forme un oligonucleótido monocatenario unido covalentemente a la superficie.
Una muestra de tejido se pone en contacto con el sustrato sólido que contiene las moléculas individuales y se permeabiliza. El ARNm expresado en el tejido se liberará del tejido después de la permeabilización y sus colas poli A interaccionarán con la cola poli T de 30-50 bases. En la siguiente etapa, se eliminará el tejido del sustrato sólido.
El ARNm se transcribirá de forma inversa usando la molécula única anclada en la superficie como el cebador.
El ADNc que contiene códigos de barras generados, secuenciados y pre-decodificados de forma exclusiva ligados a la superficie sólida a través de un enlazador foto-escindible se liberará usando una fuente de luz UV láser externa dirigida y se procesará adicionalmente fuera de la superficie sólida.
Se realizan procesos adicionales para preparar el ADNc para una biblioteca de secuenciación usando enfoques comúnmente conocidos como reparación final. Adición de cola A y ligación con adaptador.
En la última etapa, cada ADNc con el identificador molecular espacial único se secuencia in vitro y se vincula a la localización original determinada en el tejido.
Opcionalmente, también se podría caracterizar adicionalmente la muestra de tejido e identificar algunas proteínas diferentes expresadas en el tejido, por ejemplo, con la tecnología MACSima.
Además, se pueden definir regiones de interés (ROI) en el tejido eliminando la porción no deseada disponible para la hibridación del ARNm usando una fuente de luz láser UV externa usando un dispositivo digital de micro-espejo (DMD) para eliminar todos los enlaces foto-escindibles de las moléculas individuales ancladas al sustrato sólido no deseado. De manera inversa, el ADNc de interés también se puede liberar sólo a partir de la ROI pre-determinada mediante los mismos principios, pero seguido de la generación del ADNc.
Claims (9)
1. Un método para obtener la información de la localización espacial y de la secuencia de una secuencia diana de ARNm en una muestra de tejido que comprende las etapas
a. proporcionar una superficie sólida que tiene al menos un marcador de referencia
b. anclar una pluralidad de moléculas de anclaje que comprenden un enlazador foto-escindible y una unidad adaptadora a la superficie sólida
c. unir moléculas de armazón que comprenden una unidad capaz de unirse a la unidad adaptadora de una molécula de anclaje, una unidad de poli-inosina que tiene de 5 a 30 bases de inosina y una unidad de poli-adenina que tiene de 10 a 50 bases de adenina a las moléculas de anclaje
d. incorporar aleatoriamente adenina, guanina, citosina y timina como bases nucleicas a la molécula de anclaje complementando las bases de inosina de las moléculas de armazón creando así códigos de barras en las moléculas de anclaje, en donde las bases nucleicas están provistas de una unidad foto-detectable y en donde la secuencia de los códigos de barras y su localización espacial con respecto al marcador de referencia se detectan simultáneamente como información espacial.
e. incorporar timina a las moléculas de anclaje complementando la unidad de poli-adenina de las moléculas de armazón creando así una unidad poli-T
f. eliminar las moléculas de armazón de las moléculas de anclaje
g. una muestra de tejido que se ha suministrado comprende al menos una cadena de ARNm en donde al menos una cadena de ARNm de la muestra se une a una unidad poli-T de al menos una molécula de anclaje
h. transcripción inversa de la cadena de ARNm creando una cadena de ADNc unida a la superficie sólida i. eliminar las cadenas de ADNc de la superficie sólida escindiendo el enlazador foto-escindible de las moléculas de anclaje
j. obtener la información de secuencia de las cadenas de ADNc y vincular la información espacial con la información de secuencia de las cadenas de ADNc.
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado por que la incorporación aleatoria de adenina, guanina, citosina y timina como bases nucleicas a la molécula de anclaje se realiza proporcionando una mezcla de A, T, G y C y una polimerasa.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 caracterizado por que la información espacial se obtiene detectando la unidad foto-detectable de las bases nucleicas.
4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado por que la información espacial se obtiene mediante secuenciación por síntesis.
5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado por que el tejido de muestra se elimina de la superficie.
6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado por que la cadena de ADNc se circulariza y luego se multiplica mediante una polimerasa capaz de realizar una amplificación circular en una pluralidad de concatémeros de ADN.
7. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado por que las moléculas de anclaje se distribuyen aleatoriamente sobre el sustrato sólido con una densidad correspondiente a la concentración de la molécula.
8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado por que la muestra de tejido se permeabiliza después de suministrarla a la superficie.
9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado por que la molécula de anclaje comprende al menos una secuencia cebadora para la polimerasa capaz de amplificación por círculo rodante.
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