ES2973340T3 - Material híbrido de hidrogel, método de su preparación y aplicación - Google Patents
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Abstract
Se divulga un material híbrido de hidrogel biocompatible útil en medicina regenerativa, en particular en la reconstrucción de tejido óseo y un método para su preparación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Material híbrido de hidrogel, método de su preparación y aplicación
La invención se refiere al campo de la ingeniería de materiales, y más en particular a materiales híbridos de hidrogel inyectables bioactivos estructuralmente estables, aplicables para uso en ingeniería de tejidos.
La fabricación de biomateriales novedosos diseñados para fines de ingeniería de tejidos y que se dirige a la reconstrucción de tejido óseo, es todavía un desafío significativo para la medicina regenerativa [1, 2]. Los estudios dirigidos al desarrollo y la producción de soportes de células bioactivos son especialmente importantes debido a las posibilidades de utilizar el potencial terapéutico de tales materiales en la reconstrucción de defectos óseos causados por accidentes, enfermedades del hueso, así como alteraciones en el tejido óseo causadas por procesos de envejecimiento [3]. Los hidrogeles biopoliméricos inyectables son candidatos extremadamente prometedores para aplicaciones de soporte debido a una variedad de propiedades distintivas [4, 5, 6].
El fin de la invención es proporcionar un material biopolimérico que sería particularmente adecuado para uso en medicina regenerativa, especialmente en la reconstrucción de tejido óseo. Es particularmente deseado que el material asegure la aceleración del proceso de mineralización y que sirva como una biomatriz conveniente para la colonización por células osteoblastos. El objeto de la invención es un material híbrido de hidrogel biocompatible y un método de producción del mismo, definido en detalle en las reivindicaciones adjuntas. Las implementaciones de la invención demostradas en la presente solicitud es un producto en forma de un material híbrido de hidrogel, caracterizado en que se obtuvo por entrecruzamiento simultáneo, con un agente de entrecruzamiento biocompatible, que es genipina, de una matriz de hidrogel biopolimérico compuesto de colágeno, quitosano y ácido hialurónico y dispersado en partículas de sílice con superficies intencionalmente modificadas, modificadas con grupos amino.
La funcionalización de las superficies con grupos amino permitió la unión covalente de partículas de sílice con la red polimérica de hidrogel durante el entrecruzamiento con genipina - un agente capaz de entrecruzar mediante la formación de enlaces covalentes con grupos amino primarios. El material bioactivo obtenido es un material híbrido homogéneo, en donde partículas de sílice bioactivas están permanentemente unidas con una matriz biopolimérica. La unión covalente de las nanopartículas de sílice con la matriz elimina un problema serio que es la separación de fases de partículas y su difusión incontrolada a tejidos en condicionesin vivo,observada en una situación cuando las partículas no están inmovilizadas.
El material híbrido según la invención se puede usar para la reconstrucción de defectos óseos ortopédicos, dentales. Se puede introducir en un defecto con un método no invasivo (inyección) y gelificar de una manera controlada, y después de cumplir su función terapéutica se degradará enzimáticamente (como se mostró) con la formación de productos biocompatibles.
Sorprendentemente, el material según la invención proporciona aceleración de los procesos de mineralización y es una biomatriz adecuada para la colonización por células de tipo osteoblasto. En ensayos biológicos realizados en el material híbrido de hidrogel según la invención, se reveló que el material retiene su biocompatibilidad, así como la capacidad de apoyar la adhesión, proliferación y mantener el fenotipo de células de tipo osteoblasto (MG-63).
En el presente documento a continuación, se muestran ejemplos de la invención.
Ejemplo 1. Preparación de material híbrido de hidrogel.
La preparación del material híbrido de hidrogel según la invención comprende dos etapas sustanciales, descritas en detalle a continuación en el apartado 1 y el apartado 2.
1. Preparación de partículas de sílice funcionalizadas con grupos amino
Las partículas de sílice funcionalizadas con grupos amino se obtuvieron con un método sol-gel. Se añadieron 1,0 ml de tetraetoxisilano (TEOS) y 0,1 ml de aminopropiltrietoxisilano (APTES) secuencialmente a una mezcla compuesta de etanol (5,1 ml) y agua (5 ml). La mezcla resultante se mezcló usando un agitador magnético durante 30 minutos a temperatura ambiente. El material obtenido se centrifugó y después se purificó lavando con etanol y centrifugando. El ciclo lavado con etanol/centrifugación se repitió cuatro veces. El material se secó en una cámara de vacío a 60°C. Después de la purificación, se obtuvo un polvo blanco.
2. Preparación del material híbrido
El material híbrido se obtuvo como resultado del entrecruzamiento simultáneo con genipina de una mezcla de biopolímeros (colágeno, quitosano y ácido hialurónico) y partículas de sílice modificadas en superficie. Se mezclaron volúmenes apropiados de soluciones de biopolímeros: 590 pl de solución de colágeno (Kol) (una solución en ácido clorhídrico con una concentración en el intervalo de 3,5-4,1 mg/ml - en la forma que proporciona el suministrador BD Biosciences) con 193 pl de solución de quitosano (Ch) (una solución con el 1% p/p en ácido acético al 1%) con 48 pl de solución de ácido hialurónico (HA) (una solución con el 1% p/p en tampón fosfato (PBS) 10x (con una composición de: NaCl (c = 1,37 M), KCl (c = 27 mM), Na<2>HPO<4>(c = 43 mM), KH<2>PO<4>(c = 14 mM), pH ajustado a 7,4 con ácido clorhídrico concentrado (c = 35%) solución de HCl). El sol obtenido se sometió a agitación vigorosa y después se añadieron 0,3 ml de dispersión acuosa de partículas de sílice funcionalizadas a una concentración adecuada (S1 = 16,6 mg/ml, S2 = 8,3 mg/ml, S3 = 1,7 mg/ml). La mezcla se agitó otra vez y después se añadieron 169 pl de solución de genipina (una solución con una concentración de 20 mM, preparada en<p>B<s>10x) y se incubó a 37°C hasta el entrecruzamiento completo. El material obtenido está en forma de hidrogel. La proporción en peso de los biopolímeros en el material obtenido era: Kol:Ch:HA - 50:40:10. Usando tres concentraciones diferentes de dispersiones de partículas de sílice, se obtuvieron tres tipos de materiales híbridos: KolChHA S1, KolChHA S2 y KolChHA S3. Como un material control, se obtuvo un hidrogel con una composición de biopolímeros análoga, pero sin la adición de las partículas de sílice (KolChHA).
Ejemplo 2. Propiedades fisicoquímicas del material híbrido de hidrogel obtenido y de los sustratos usados para su preparación.
1) Propiedades fisicoquímicas de las partículas de sílice funcionalizadas con grupos amino
La figura 1 muestra un esquema de la preparación de las partículas de sílice funcionalizadas con grupos amino.
La preparación de partículas de sílice funcionalizadas se confirmó con métodos espectroscópicos, su morfología y parámetros porosimétricos también se determinaron. La figura 2 muestra una comparación de los espectros de FTIR y XPS obtenidos para el material sintetizado. Las bandas visibles en el espectro de FTIR (Fig. 2A) confirman la presencia tanto de grupos silanol como de grupos amina. Una banda intensa, estrecha a 1027 cm-1 deriva de las vibraciones de flexión Si-O, mientras el pico a 779 cm-1 de las vibraciones de tensión Si-O-Si, siendo ambas características de la sílice. La banda a 942 cm-1 se puede asignar al grupo Si-OH, mientras el pico a 1523 cm-1 deriva del grupo NH<2>-. La banda a 1626 cm-1 se puede asignar al H<2>O adsorbida, mientras la banda ancha extensa encontrada en el intervalo 2600-3650 cm-1 es una yuxtaposición de bandas derivadas de partículas de agua adsorbidas, grupos OH- presentes en la superficie de la muestras y grupos amino.
Con el fin de hacer un análisis más completo de la composición de superficie del material obtenido, se realizó un análisis usando espectroscopía fotoelectrónica (XPS). La figura 2B muestra el espectro obtenido, con los picos visibles que se pueden asignar a O1s (531,1 eV), N1s (402,6 eV), C 1s (286,5 eV), Si 2s (155,1 eV) y Si 2p (103,5). Las señales derivadas de N1s y C1s se pueden considerar diagnósticas para la funcionalización de superficie usando APTES, porque las partículas de sílice obtenidas con TEOS no contienen estos elementos. El análisis de la composición de superficie del material mostrado en la tabla 1 demostró que se obtuvieron estructuras SiCON con composición atómica del 78%, 3%, 7% y 12% para O, N, C y Si, respectivamente. La composición atómica teórica se calculó mientras se asumía que la estructura química de las partículas de sílice funcionalizadas era resultante de la proporción molar TEOS:APTEs (10:1) usada en la síntesis. Al comparar los datos experimentales y teóricos, se puede observar un mayor nivel de oxígeno, que puede estar producido por la presencia de grupos silanol expuestos en la superficie, formados como resultado de la policondensación parcial de los precursores empleados.
La figura 2 muestra una comparación de los espectros de FTIR (A) y XPS (B) obtenidos para las partículas de sílice funcionalizadas con grupos amino.
Tabla 1. Resultados de XPS para la composición de superficie elemental (%) para partículas de sílice funcionalizadas con grupos amino.___________________________________________________________________________________Composición de superficie
elemental (%) O1s N1s C1s Si2p
Datos experimentales78 3 7 12
Datos teóricos49 2 5 44
Además, se determinaron los diámetros hidrodinámicos, así como los potenciales de superficie (zeta) para las partículas obtenidas. Los datos reunidos se resumieron en la tabla 2. Un diámetro hidrodinámico medio de las partículas obtenidas de medidas de DLS es aproximadamente 607 nm, con un índice de dispersión, DI = 0,3. El potencial zeta de las partículas obtenidas era positivo (35 mV) como resultado de la protonación de los grupos amino encontrados en el esqueleto de APTES, que es otro resultado que verifica la funcionalización eficaz.
Tabla 2. Resumen de los datos obtenidos para partículas de sílice funcionalizadas: diámetro hidrodinámico (dz), índice de dispersión (DI), potencial zeta (Z), así como parámetros porosimétricos, incluyendo: área de superficie específica (SBET), volumen (Vmes) y diámetro (Dmes) de los mesoporos._____________________________________________dz [nm] DI Z [mV] Sb e t [m<2>/g] Vm e s (BJH) [cm<3>/g] Dm e s (BJH) [nm]607 ± 23 0,3 35 ± 1 24 0,14 23
La morfología del material obtenido se determinó usando microscopía electrónica de barrido (MEB). La figura 3 muestra las microfotografías obtenidas de las partículas de sílice funcionalizadas, en donde se pueden ver dos poblaciones de partículas. Las más grandes tienen un diámetro de aproximadamente 400 nm mientras las partículas más pequeñas tienen un diámetro de aproximadamente 100 nm. Las partículas más pequeñas (indicadas con flechas en la figura 3B) tienen una tendencia a agregar alrededor de objetos mayores.
Basado en las medidas del isotermo de adsorción de nitrógeno, se determinaron los parámetros que caracterizan la porosidad para las partículas obtenidas (Tabla 2). El área de superficie específica (S<bet>) se midió basado en el modelo de Brunauer-Emmett-Teller (BET), así como el tamaño y volumen de los poros. Se encontró que las partículas de sílice funcionalizadas se caracterizan por un área de superficie específica de 24 m2/g y que tienen mesoporisidad sustancial (0,14 cm3/g).
2) Propiedades fisicoquímicas del material híbrido.
La figura 4 muestra un esquema de la preparación del material híbrido. Usando tres concentraciones diferentes de la dispersión de las partículas de sílice, se obtuvieron tres tipos de materiales híbridos: KolChHA S1, KolChHA S2 y KolChHA S3 con sus composiciones mostradas en la tabla 3.
Tabla 3. Resumen de las composiciones de los materiales híbridos obtenidos (Kol - colágeno, Ch - quitosano, HA -ácido hialurónico).____________________________________________________________________________________Tipo de material Proporción en peso Concentración de partículas de sílice Kol:Ch:HA funcionalizadas [mg/ml]KolChHA S1 50:40:10 16,6
KolChHA S2 50:40:10 8,3
KolChHA S3 50:40:10 1,7
La microestructura de los sistemas híbridos obtenidos se caracterizó usando MEB. El análisis de las microfotografías obtenidas (Fig. 5) muestra la presencia de partículas de sílice en cada uno de los sistemas preparados.
La figura 5 muestra las microfotografías de MEB obtenidas para los materiales híbridos resultantes, el material KolChHA S1 (A), el material KolChHA S2 (B) y el material KolChHA S3 (C).
La humectabilidad de superficie de los materiales obtenidos se ensayó basado en los resultados de las medidas del ángulo de contacto. Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 4. El análisis de los datos recogidos indica que la adición de partículas de sílice funcionalizadas a la matriz de polímero produce que la superficie de estos materiales se vuelva más hidrofílica, demostrado por los valores más bajos del ángulo de contacto comparado con el material sin partículas de sílice (KolChHA). El material que tiene el mayor nivel de partículas de sílice (KolChHA S1) se caracteriza por la superficie más hidrofílica. Las superficies de los materiales con menor concentración de partículas de sílice (KolChHA S2 y KolChHA S3) muestran un grado similar de humectabilidad. La hidrofilicidad aumentada se puede explicar por la presencia de partículas de sílice funcionalizadas híbridas en la superficie de materiales híbridos, que tienen grupos amino hidrofílicos expuestos en la superficie (confirmado por el análisis de XPS).
Tabla 4. Valores del ángulo de contacto para los materiales obtenidos________________________
Tipo de material Valor del ángulo de contacto [°]
KolChHA 87,2 ± 2,5
KolChHA S1 68,6 ± 1,6
KolChHA S2 76,9 ± 2,4
KolChHA S3 76,5 ± 1,7
También se determinó el grado de hinchamiento (SD) para los materiales híbridos obtenidos. El experimento se realizó en condiciones fisiológicas (pH = 7,4; temperatura = 37°C), con los resultados mostrados en la figura 6. Se puede ver que la concentración de partículas de sílice funcionalizadas tiene un impacto significativo en las características de hinchamiento de los materiales estudiados - el SP disminuye al subir sus niveles. En el caso del material con la mayor concentración de partículas (KolChHA S1), el grado de hinchamiento es sustancialmente menor en comparación con el material control (KolChHA). Este resultado indica que las partículas de sílice tienen un efecto sobre la rigidez de la estructura del hidrogel. Además, la funcionalización de las partículas de sílice que permite la unión covalente a una red polimérica contribuye al aumento de la densidad de la red en materiales híbridos y de esta manera produce una disminución en el SD. En el caso de los materiales KolChHA S2 y KolChHA S3, no se observó un cambio significativo en las características de hinchamiento en comparación con el hidrogel de KolChHA.
La figura 6 muestra el grado de hinchamiento en condiciones fisiológicas para los materiales obtenidos.
Ejemplo 3. Gelificación controlada del sol obtenido de la mezcla de biopolímeros y partículas de sílice funcionalizadas en superficie.
Con el fin de confirmar la posibilidad de emplear los sistemas híbridos desarrollados como materiales inyectables, se hicieron medidas reológicas, que mediante seguimiento de los cambios en el módulo de elasticidad (G') en el tiempo permitieron la verificación de la transición de la fase sol a gel. Los valores de G' medidos después de 10, 30 y 60 minutos de experimento se muestran en la figura 8 (el experimento se realiza a 37°C, después de la adición de solución de genipina al sol, como se describe anteriormente). Al principio del proceso de gelificación (después de 10 minutos), los valores de G' para todos los materiales están en niveles bajos (en el intervalo de 2-5 Pa) lo que confirma su condición viscoelástica y su forma inyectable. Los valores de G' aumentan sustancialmente después de 30 minutos y alcanzan valores máximos a los 60 minutos desde el inicio del proceso de entrecruzamiento (formación de gel). Por tanto, la comparación de los valores de G' al principio (sol) y al final (gel) del experimento reológico, demuestra que los materiales desarrollados pueden servir como materiales inyectables. Al mismo tiempo se puede concluir que la presencia de partículas de sílice funcionalizadas con grupos de superficie que permiten su incorporación mediante entrecruzamiento en la estructura del hidrogel, no impide el proceso de formación de gel. Los datos obtenidos revelaron un potencial de inyectabilidad de los materiales híbridos desarrollados que es particularmente significativo debido a la facilidad de su implantación en las potenciales aplicaciones de ingeniería de tejidos.
Ejemplo 4. Propiedades bioactivas de los materiales híbridos obtenidos.
Considerando las potenciales aplicaciones de los materiales híbridos obtenidos como soportes en ingeniería de tejido óseo, se estudiaron sus características bioactivas. Para este fin, se realizó un experimento de biomineralizaciónin vitroen condiciones de fluido corporal simulado (SBF). Los datos de la bibliografía indican que los materiales capaces de formar una capa de apatita en su superficie en SBF también experimentarán biomineralización en un cuerpo vivo proporcionando de esta manera la integración eficaz del soporte con el hueso natural. Se estudió una capacidad de los materiales desarrollados para iniciar el proceso de nucleación de apatita en un experimento que implica su incubación de 7 días en SBF a 37°C. A continuación, los materiales se analizaron usando dos técnicas: MEB y EDS. La figura 9 muestra las microfotografías de MEB obtenidas y la tabla 5 resume las proporciones de calcio a fósforo (Ca/P) determinadas por EDS para la fase mineral formada en la superficie de los materiales.
Tabla 5. Proporción Ca/P determinada por EDS para la fase mineral formada en la superficie de los materiales después de incubación de 7 días en SBF.
Tipo de material Proporción Ca/P
KolChHA -KolChHA S1 1,29 ± 0,03
KolChHA S2 1,29 ± 0,08
KolChHA S3 -
Los resultados obtenidos claramente sugieren que las partículas de sílice funcionalizadas hacen los materiales híbridos obtenidos KolChHA S1 y KolChHA S2 bioactivos. Solo en el caso de estos materiales se puede observar biomineralización, evidenciada por la formación de una nueva fase mineral con una estructura y una proporción Ca/P típicas para apatita. Para el material control (KolChHA), así como el material híbrido con la menor concentración de partículas (KolChHA S3) la biomineralización no se produce. Por tanto, se puede concluir que los materiales híbridos KolChHA S1 y KolChHA S2 tienen propiedades bioactivas.
Ejemplo 5. Propiedades biológicas de los materiales híbridos obtenidos.
También se investigaron las propiedades biológicas de los materiales híbridos obtenidos, incluyendo su biocompatibilidad, capacidad de apoyar adhesión, proliferación y actividad fosfatasa alcalina (ALP) para células de tipo osteoblasto MG-63 cultivadas en la superficie de estos materiales.
La figura 10 muestra la proliferación de células MG-63 después de 1, 3 y 7 días de cultivo en la superficie de los materiales ensayados (A), y la actividad fosfatasa alcalina (ALP) para las células MG-63 después de 3 y 7 días de cultivo en la superficie de los materiales ensayados.
Los resultados de las pruebas de viabilidad celular (el ensayo de azul Almar) realizados después de 1, 3 y 7 días de cultivo (Fig. 10A) demostraron que la presencia de partículas de sílice funcionalizadas permanentemente asociadas con la red polimérica no deteriora la biocompatibilidad de los materiales híbridos, ni su capacidad para apoyar la proliferación de células MG-63 en comparación con el material control KolChHA.
La fosfatasa alcalina (ALP) es una proteína de formación de hueso que es un marcador para fases tempranas de la diferenciación de osteoblastos. Debido a la función fisiológica de ALP también desempeña el papel de una conformación de fenotipo y marcador de mineralización de osteoblastos. La actividad ALP en las células MG-63 cultivadas sobre los materiales estudiados se determinó el día 3 y 7 de cultivo, con los resultados mostrados en la figura 10B. En el caso de todos los materiales híbridos, así como el material control, se observó una tendencia similar para un aumento en actividad después de 7 días de experimento. Además, los niveles de ALP tanto el día 3 como el 7 de cultivo eran significativamente mayores en comparación con la actividad ALP de células en una placa de cultivo.
También se estudiaron la morfología y adhesión de las células MG-63 después de 3 días de cultivo en la superficie de los materiales. Para este fin, las células se fijaron y evaluaron usando la técnica de MEB. La figura 11 muestra las microfotografías de MEB (Fig. 11A) que demuestran la morfología de células fijadas, así como un gráfico que muestra su área de superficie media (estimada basada en las microfotografías de MEB). Basado en el análisis de microfotografía se puede observar que las células se adhieren bien tanto a la superficie de los materiales híbridos como al hidrogel control. En todas las superficies ensayadas, las células tienen formas alargadas que puede indicar una estructura compacta y bien entrecruzada de los materiales estudiados. El área de superficie media estimada para las células tiene valores similares para todos los materiales que confirma cualitativamente que la morfología celular en los materiales estudiados es similar. Por tanto, estos datos demuestran que la presencia de partículas de sílice funcionalizadas no tiene un efecto perjudicial sobre la adhesión celular.
Ejemplo 6. Degradación enzimática del material híbrido.
El proceso de degradación se estudió en PBS, así como en presencia de una enzima - una colagenasa. La figura 7 muestra los cambios en la masa de los materiales durante la incubación en tampón PBS (Fig. 7A) y en presencia de colagenasa (Fig. 7B). La mayor pérdida en masa se produce después del primer día de degradación e implica todos los materiales estudiados. En los siguientes días solo se observaron ligeras variaciones de masa. En el caso de los materiales híbridos KolChHA S1 y KolChHA S2, el curso del proceso de degradación a lo largo del experimento es similar a la degradación para el material control KolChHA (los cambios no son estadísticamente significativos). Esto sugiere que la presencia de partículas de sílice funcionalizadas a las concentraciones más alta (1) y media (2) no tiene impacto en la velocidad de pérdida en la masa de hidrogel. La falta de diferencias significativas en la pérdida en masa además confirma la eficacia de incorporación de las partículas de sílice funcionalizadas en la red polimérica, porque de otra forma la 'liberación' de sílice de la red de hidrogel se debería manifestar en una mayor pérdida en masa para los sistemas híbridos obtenidos. El material con la menor concentración de partículas de sílice (KolChHA S3) durante casi el tiempo entero a lo largo del experimento muestra una pérdida en masa relativamente mayor cuando se compara a los otros materiales estudiados. Después de terminar el experimento (después de 21 días) los valores para la masa restante para todos los materiales son similares, con el grado de degradación de la muestra del 37 al 48%.
La degradación enzimática se estudió durante 144 horas, en la figura 7B se representan los resultados obtenidos. Después de 4 horas de degradación enzimática, la pérdida en masa era aproximadamente el 35-50%. El siguiente cambio significativo se produjo después de 24 horas cuando los materiales perdieron aproximadamente el 65-80% de su masa inicial. Extender la incubación de los materiales con colagenasa a 144 horas no produjo cambios significativos adicionales en su masa. El análisis de la pérdida en masa para todos los materiales estudiados en un punto de medida determinado muestra un menor grado de degradación para el material con la mayor concentración de partículas de sílice (KolChHA S3). De forma similar a la degradación en PBS, ligeras variaciones en el curso de la degradación enzimática entre el material control (KolChHA) y los materiales híbridos pueden indicar inmovilización eficaz de las partículas de sílice funcionalizadas en la estructura de hidrogel.
Conclusiones:
Basado en los ensayos realizados, se pueden encontrar las siguientes ventajas inesperadas del material híbrido obtenido:
a) Estabilidad estructural de los materiales híbridos con una retención simultánea de una forma inyectable de sol de biopolímero. Los estudios fisicoquímicos realizados (grado de hinchamiento, humectabilidad, degradación) demostraron la eficacia de la incorporación de las partículas de sílice funcionalizadas en la red de biopolímero. Se obtuvo un material híbrido por primera vez en donde las partículas de sílice se han unido permanentemente a la matriz de la red biopolimérica, que sustancialmente mejora las características del sistema, en particular elimina el problema de la potencial separación de fases de las partículas y su difusión incontrolada a tejidosin vivo.Los estudios reológicos confirmaron que los materiales híbridos desarrollados se pueden preparar en forma de un sol y después de la adición de un agente de entrecruzamiento, genipina e incubación a 37°C transformar a gel que se corresponde con la posibilidad de su uso en una forma inyectable en condiciones fisiológicas. Este hecho es de una gran importancia cuando se considera el potencial de aplicación de los materiales híbridos obtenidos. Los materiales híbridos desarrollados pueden servir como soportes inyectables que después de introducirse a un sitio de defecto en el tejido en forma de sol viscoso experimentarían gelificaciónin situen condiciones fisiológicas con una velocidad controlada por la composición, en particular por la cantidad de genipina añadida.
b) Bioactividad de los materiales híbridos. Los ensayos realizados en condiciones que simulan plasma humano (SBF, fluido corporal simulado) confirmaron la bioactividad de los materiales híbridos: los sistemas KolChHA S1 y KolChHA S2. Basado en datos bibliográficos se pueden esperar las propiedades bioactivas para materiales que comprenden partículas de sílice que tienen grupo silanol Si-OH en su superficie [(1)J. Lewandowska-tañcucka, K. Mystek, A. Mignon, S. Van Vlierberghe, A. tatkiewicz, M. Nowakowska,Alginate-and gelatin-based bioactive photocross-linkable hybrid materials for bone tissue engineering,Carbohydrate polymers, (2017), 157, 1714-1722;(2)K. Li, H. Sun, H. Sui, Y. Zhang, H. Liang, X. Wu, Q. Zhao,Composite mesoporous silica nanoparticle/chitosan nanofibers for bone tissue engineering,RSC Adv. 5 (23) (2015) 17541-17549;(3)L. Keller, A. Regiel-Futyra, M. Gimeno, S. Eap, G. Mendoza, V. Andreu, Q. Wagner, A. Kyzot, V. Sebastian, G. Stochel, M. Arruebo y N. Benkirane-Jessel,Chitosan-based nanocomposites for the repair of bone defects,Nanomedicine 13 (7) (2017) 2231-2240]. Por tanto, no es obvio que tales propiedades se encontrarían en materiales híbridos en donde se introdujeron partículas de sílice funcionalizadas con grupos amino. Además, era una preocupación si sustituir grupos silanol con grupos amino no limitaría la bioactividad de las partículas de sílice.
c) Se observó un aumento sustancial en el proceso de biomineralización (hasta 7 días) en comparación a la investigación previamente mostrada en donde se usaron partículas de sílice sin modificar a concentración análoga. En publicaciones ((1)J. Lewandowska-tancucka, S. Fiejdasz, t . Rodzik, M. Koziet, M. Nowakowska,Bioactive hydrogel-nanosilica hybrid materials: a potential injectable scaffold for bone tissue engineering,Biomedical Materials, (2015), 10(1), 015020;(2)J. Lewandowska-tancucka, S. Fiejdasz, t . Rodzik, A. tatkiewicz, M. Nowakowska,Novel hybrid materials for preparation of bone tissue engineering scaffolds,Journal of Materials Science: Materials in Medicine, (2015), 26(9), 231), la formación de la fase mineral se observó solo después de 21 días de incubación en SBF.
d) Retener la biocompatibilidad, así como la capacidad para fomentar la adhesión, proliferación y mantenimiento del fenotipo para células de tipo osteoblasto (MG-63). Los estudios biológicosin vitrorealizados mostraron que la presencia de partículas de sílice funcionalizadas permanentemente unidas a la red polimérica no deteriora la biocompatibilidad de los materiales híbridos (en comparación con el material control KolChHA) ni la capacidad de apoyar adhesión, proliferación y también mantener el fenotipo de células de tipo osteoblasto (MG-63).
Referencias:
1. R. Mishra, T Bishop, I. L. Valerio, J. P Fisher, D. Dean, The potential impact of bone tissue engineering in the clinic, Regen. Med. 11 (6) (2016) 571-587.
2. M. Liu, X. Zeng, Ch. Ma, H. Yi, Z. Ali, X. Mou, S. Li, Y Deng, N. He, Injectable hydrogels for cartilage and bone tissue engineering, Bone Res. 5 (2017) 17014.
3. J. Nourmohammadi, F. Roshanfar, M. Farokhi, M. H. Nazarpak, Silk fibroin/kappa-carrageenan composite scaffolds with enhanced biomimetic mineralization for bone regeneration applications, Mater. Sci. Eng. C. 76 (2017) 951-958.
4. H. Tan, K. G. Marra, Injectable, biodegradable hydrogels for tissue engineering applications, Materials 3 (3) (2010) 1746-1767.
5. K. Y. Lee, D. J. Mooney, Hydrogels for tissue engineering, Chem. Rev. 101 (7) (2001) 1869-1879.
6. A. Gilarska et al, Colloids and Surfaces B, Biointerfaces 170 (2018) 152-162.
Claims (7)
- REIVINDICACIONESi. Un método de preparación de un material híbrido de hidrogel,caracterizado en quecomprende las siguientes etapas:a) se obtienen partículas de sílice funcionalizadas con grupos amino usando un método sol-gel, b) las partículas de sílice funcionalizadas con grupos amino obtenidas en la etapa a) se suspenden en sol que comprende una mezcla de soluciones de colágeno, quitosano y ácido hialurónico, preferiblemente en una proporción en peso de colágeno:quitosano:ácido hialurónico de 50:40:10, en donde preferiblemente el contenido de las partículas de sílice funcionalizadas en el sol no es menos de 1,9 mg/ml del sol, preferiblemente desde 1,9 a 3,8 mg/ml del sol,c) la suspensión obtenida en la etapa b) se somete a una reacción de entrecruzamiento con genipina.
- 2. El método según la reivindicación 1,caracterizado en queen la etapa a), se hace reaccionar tetraetoxisilano con aminopropiltrietoxisilano en presencia de agua y etanol, en donde la reacción se realiza en un exceso de tetraetoxisilano, preferiblemente con una proporción en volumen tetraetoxisilano:aminopropiltrietoxisilano de 10:1, y después el material obtenido se separa y opcionalmente se lava y seca proporcionando un polvo incoloro.
- 3. El método según la reivindicación 1,caracterizado en queen la etapa b), el sol se obtiene mezclando:- de 12 a 13 volúmenes de una solución de colágeno en ácido clorhídrico a una concentración en el intervalo de 3,5 a 4,1 mg/ml,- aproximadamente 4 volúmenes de una solución de quitosano en una concentración del 1% p/p en ácido acético al 1%,- aproximadamente 1 volumen de una solución de ácido hialurónico en una concentración del 1% p/p en tampón fosfato PBS 10x.
- 4. El método según la reivindicación 1,caracterizado en queen la etapa b), el sol obtenido se mezcla con una suspensión acuosa de partículas de sílice funcionalizadas con grupos amino, preferiblemente en una cantidad que proporciona su concentración en el sol de no menos de 1,9 mg/ml del sol, preferiblemente desde 1,9 a 3,8 mg/ml del sol.
- 5. El método según la reivindicación 1,caracterizado en queen la etapa c), la suspensión obtenida en la etapa b) se mezcla con una solución de genipina en PBS 10x, preferiblemente en una cantidad que proporciona su concentración de no menos de 0,6 mg/ml de la suspensión.
- 6. Un material híbrido de hidrogel,caracterizado en quecomprende un hidrogel que es una mezcla de colágeno, quitosano y ácido hialurónico entrecruzados con genipina, preferiblemente en una proporción en peso de colágeno:quitosano:ácido hialurónico de 50:40:10, junto con partículas de sílice funcionalizadas con grupos amino suspendidas en el mismo, en donde las partículas de sílice funcionalizadas con grupos amino están covalentemente unidas a los polímeros que forman el hidrogel y el contenido de las partículas de sílice funcionalizadas no es menos de 1,9 mg/ml, preferiblemente desde 1,9 a 3,8 mg/ml del sol final.
- 7. El material híbrido de hidrogel según la reivindicación 6 u obtenido por el método según las reivindicaciones 1 5 para uso en medicina regenerativa, en particular en reconstruir tejido óseo.
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