ES2972185T3 - NH4MgPO4 × 6H2O, (NH4)2MgH2(PO4)2 × 4H2O, (NH4)2Mg3(HPO4)4 × 8H2O y NH4MgPO4 × H2O asociados o no con enzimas hidrolíticas para su uso en el tratamiento del cáncer - Google Patents

NH4MgPO4 × 6H2O, (NH4)2MgH2(PO4)2 × 4H2O, (NH4)2Mg3(HPO4)4 × 8H2O y NH4MgPO4 × H2O asociados o no con enzimas hidrolíticas para su uso en el tratamiento del cáncer Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a un método de obtención de un complejo nanoestructurado inorgánico (CFI-1), un complejo nanoestructurado asociado a proteínas (MRB-CF1-1) y su uso antitumoral. El uso principal es en el tratamiento del cáncer de vejiga urinaria, tanto en animales como en humanos. El complejo tiene una actividad antitumoral singular y potencialmente puede usarse como sustituto y/o actuar como adyuvante de otros fármacos antineoplásicos comerciales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
NH<4>MgPO<4>x 6H2O, (NH<4>)<2>MgH<2>(PO<4>)<2>x 4H2O, (NH<4>)<2>Mg<3>(HPO<4>)<4>x 8H2O y NH<4>MgPÜ<4>x H2O asociados o no con enzimas hidrolíticas para su uso en el tratamiento del cáncer
Campo de la invención
La presente invención se refiere a los compuestos NH4MgPO4 x 6H2O, (NH4)2MgH2(PO4)2 x 4H2O, (NH4)2Mg3(HPO4)4 x 8H2O y NH4MgPO4 x H2O asociados o no a enzimas catalíticas para su uso en el tratamiento del cáncer.
La principal aplicación tecnológica es el tratamiento del cáncer de vejiga urinaria, tanto en animales como en humanos. Su actividad antitumoral es única y un sustituto potencial de otros fármacos antineoplásicos comerciales.
Antecedentes de la invención
Todos los órganos del tracto urogenital son puntos potenciales para tumores malignos. La incidencia y el tipo varían de un órgano a otro. El cáncer de vejiga urinaria (CB) representa la segunda enfermedad maligna más común del tracto urinario (Siegelet al.,2012; American Cancer Society, 2016).
La Sociedad Americana Contra el Cáncer estimó aproximadamente 76.960 nuevos casos de CB en 2016 en los Estados Unidos, siendo 58.950 en hombres y 18.010 en mujeres. La estimación también predijo 16.390 muertes por CB, siendo 11.820 en hombres y 4.570 en mujeres (American Cancer Society, 2016). Según datos del Instituto Nacional del Cáncer (INCA, 2016), la estimación para Brasil en 2016 fue de 9.670 nuevos casos de CB, siendo 7.200 en hombres y 2.470 en mujeres. En 2013, se reportaron 3.642 muertes por CB, siendo 2.542 en hombres y 1.099 en mujeres, lo que demuestra un aumento drástico en la prevalencia de este tipo de tumor.
Más del 70 % de la incidencia de CB es superficial (pTis, pTa y pT1), de tumor no invasivo (CBNMI), y la aparición de una enfermedad invasiva es ocasional (Askelandet al.,2012). Sin embargo, el 50 % de los tumores invasivos no musculares recidivan hasta 4 años después del tratamiento y el 11 % evolucionan al fenotipo invasivo (Askelandet al.,2012).
La estadificación histológica del CB está determinada por la profundidad de la invasión tumoral de la pared vesical y dependerá de la resección transuretral (RTU) del tumor, por método endoscópico, para un diagnóstico correcto. Los fragmentos de resección superficial y profunda deben analizarse por separado (Epsteinet al.,1998; Epstein, 2003). La clasificación TNM 2009 (UICC - Unión para el Control del Cáncer) se utiliza para la estadificación.
Un número significativo de factores de riesgo se han relacionado con el desarrollo de CB. De acuerdo con los datos de registro de la base de datos de población INCA, el mayor factor de riesgo para el desarrollo de CB es el tabaquismo, representando aproximadamente el 66 % de los nuevos casos en hombres y el 30 % en mujeres (INCA, 2016). En el metanálisis de estudios epidemiológicos de Zeegerset al.(2000) en cuanto al impacto de las características del tabaquismo en el riesgo de cáncer de las vías urinarias, el tabaquismo fue designado como un factor que aumenta sustancialmente el riesgo de desarrollar cáncer de vejiga. Los cigarrillos contienen docenas de sustancias tóxicas, incluyendo aminas aromáticas y análogos N-nitrosos de MNU (N-metil-N-nitrosourea), un potente carcinógeno.
Otro factor de riesgo potencial para el desarrollo de CB es la exposición ocupacional a las aminas aromáticas por parte de trabajadores de las industrias del caucho, textil y de la tinta, y la infección porSchistosoma Haematobiun,que es endémica en los países mediterráneos, tal como Egipto (Zeegerset al.,2000; Poonet al.,2015; Rosenquist & Grollman, 2016). La exposición a ciertas sustancias, tal como el arsénico, que puede estar presente en los suministros de agua, el ácido aristolóquico presente en muchas plantas medicinales, y la pioglitazona presente en medicamentos para el tratamiento de la diabetes, se asocian como factor de riesgo (Poonet al.,2015; Rosenquist & Grollman, 2016).
Según la Sociedad Americana del Cáncer, la reducción de la ingesta de líquidos puede ser un factor de riesgo, ya que un individuo que ingiere altas cantidades de líquidos, principalmente agua, tiende a eliminar los químicos más rápidamente, teniendo en cuenta que esto tenderá a desinflar la vejiga con más frecuencia (Sociedad Americana del Cáncer, 2016).
En general, el CB es de 3 a 4 veces más común en hombres que en mujeres (Nezoset al.,2009). Por otro lado, la supervivencia de las mujeres es peor con este tipo de tumor. Se especula que la alta agresividad del cáncer de vejiga en las mujeres se debe al desequilibrio hormonal, que surge a partir de la quinta década de la vida. Aunque la vejiga urinaria está regulada en segundo lugar por hormonas sexuales esteroides, el urotelio normal y los tumores uroteliales responden a los andrógenos y estrógenos (Garciaet al.,2015). Garciaet al.(2015) demostraron por primera vez en ratas inducidas químicamente a CBNMI que el aumento de los niveles de proteína de la ubiquitina ligasa SIAH-2 regulaba los receptores androgénicos y disminuía los niveles de receptores de estrógeno, culminando en el escape de las células uroteliales neoplásicas del sistema inmune. Estos mismos autores encontraron que los niveles de receptores del sistema inmune, receptores tipo Toll (TLRs), fueron disminuidos en CBNMI y asociaron este efecto con el aumento de los niveles de SIAH-2 y receptores androgénicos.
El tratamiento primario del cáncer de vejiga invasivo no muscular (CBNMI) se basa en el tratamiento quirúrgico mediante resección transuretral (RTU), seguido de inmunoterapia intravesical con Bacillus Calmette-Guerin (BCG), para disminuir la recidiva y prevenir la progresión tumoral. Sin embargo, el uso de organismos vivos y atenuados puede causar efectos secundarios y dificultad para predecir la respuesta inmune y antitumoral. El uso de BCG es limitado en CBNMI debido al fracaso del tratamiento, los efectos adversos y la intolerancia que ocurre en más de dos tercios de los pacientes. Aunque el uso de RTU con quimioterapia o inmunoterapia adyuvante representa un avance importante en el tratamiento del CBNMI, el manejo de este tumor, especialmente para tumores de grado alto, sigue siendo un desafío debido a las altas tasas de recidiva y la progresión a fenotipos musculares invasivos y/o metastásicos. La opción quirúrgica para estos casos, cistectomía parcial o total, a menudo se asocia con altas tasas de morbilidad y mortalidad. Además, para algunos pacientes, la cistectomía no es una opción disponible debido a la presencia de comorbilidades concomitantes. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas realizaciones terapéuticas que prevengan la progresión de la enfermedad, permitan la preservación del órgano y la calidad de vida de los pacientes y, finalmente, ofrezcan una opción para aquellos que no son elegibles para la cistectomía, es de suma importancia. Los compuestos capaces de actuar como agonistas de los receptores del sistema inmunitario (receptores tipo Toll) pueden representar candidatos prometedores para ser desarrollados como medicamentos contra el cáncer.
El documento JP2016210733 divulga una composición farmacéutica para prevenir o tartar el cáncer, el cual comprende una preparación química que contiene platino en combinación con una composición que contiene un compuesto de magnesio. La composición farmacéutica puede aliviar la disfunción renal atribuida al compuesto platino al utilizarse en conjunto con una composición que contiene un compuesto de magnesio como ingrediente activo, y quitarle al paciente desventajas tales como una restricción temporal de una terapia con excreción de patino y falla renal, resultado de la reducción en la carga del paciente.
En este contexto, el uso del modificador de respuesta biológica - complejo de fosfato inorgánico 1 (MRB-CFl-1) y de los compuestos NH<4>MgPÜ<4>x 6H2O, (NH<4>)<2>MgH<2>(PO<4>)<2>x 4H2O, (NH<4>)<2>Mg<3>(HPÜ<4>)<4>x 8H2O y NH<4>MgPÜ<4>x H2O asociados o no con enzimas hidrolíticas, han sido propuestos con resultados prometedores en el tratamiento de CBNMI. Además, la invención de este nuevo nanofármaco para el tratamiento del CBNMI presenta una gran eficiencia, baja toxicidad y es económicamente viable, con gran reproducibilidad y rendimiento. Después de experimentos con animales de laboratorio y un protocolo clínico-veterinario en perros con CBNMI, la invención presenta un gran potencial para su uso en humanos.
Breve descripción de la invención
La presente invención se refiere a NH4MgPO4 x 6H2O, (NH4)2MgH2(PO4)2 x 4H2O, (NH4)2Mg3(HPO4)4 x 8H2O y NH4MgPO4 x H2O asociados o no con enzimas hidrolíticas para su uso en el tratamiento del cáncer. Aunque los compuestos NH4MgPO4 x 6H2O, (NH4)2MgH2(PO4)2 x 4H2O, (N ^ ) 2Mg3(HPO4)4 x 8H2O y NH4MgPO4 x H2O son descritos en la literatura, asociados o no con proteínas hidrolíticas, son objetos para tratar el cáncer en esta invención. La presente invención también divulga los mecanismos de los complejos antes mencionados en la activación del sistema inmune, tanto epitelial (local) como sistémico contra tumores.
Breve descripción de las figuras
Con el fin de lograr una visión completa y completa del objeto de esta invención, a continuación se presentan las figuras mencionadas, de la siguiente manera.
Figura 1: Patrón de difracción de rayos X (XRD) de CFI-1.
Figura 2: Análisis termogravimétrico (TGA) de C<f>I-1 (A) y MRB-CFl-1 (B).
Figura 3: Análisis de la calorimetría diferencial de barrido (DSC) CFI-1 (A) y MRB-CFl-1 (B). Velocidad de 10 °C/min Figura 4: Espectro Raman de CFI-1 (A) y MRB-CFl-1 (B).
Figura 5: Tamaño y carga superficial de CFI-1 (A) mediante el método dinámico de dispersión de luz (DLS) o espectroscopia de correlación de fotones (PCS) por intensidad. Potencial zeta medido por movilidad electroforética en Zeta Sizer (Ma LVEM). (B) muestra el mismo método aplicado a MRB-CF1-1.
Figura 6: Patrón de difracción de rayos X de MRB-CFl-1 (A) y CFI-1 (B). (C) Superposición de los estándares de CFI-1 y MRB-CFl-1.
Figura 7: Dicroismo circular (CD) de CFI-1 y CFI-1 asociado a la proteína P14-16 (o MRB-CFl-1).
Figura 8: Microscopias de exploración de campo de emisión (micrógrafo FESEM) para CFI-1 (A) y MRB-CFl-1 (B), concuerdan con el tamaño medido por el método de dispersión dinámica de luz (DLS) descrito en la Figura 5.
Figura 9: Ecografía de los animales del grupo de control (a) e inducidos con MNU (b, c, d, e). (a) Morfología urinaria de la vejiga con aspectos normales (a), (b) Masas tumorales que se infiltran en las paredes craneales y ventrales de la vejiga, con dimensiones de 0,32 cm x 0,21 cm (b), 0,32 cm x 0,24 cm (c) y 0,27 cm x 0,21 cm (d). Mapeo Doppler-Color que muestra un flujo sanguíneo intenso dentro de la masa tumoral (e) .
Figura 10: Fotomicrografías de la vejiga urinaria, uréter y riñón de ratas en el grupo control (a, b, c); MRB-CF11 20 (d, e, f); MRB-CF1150 (g, h, i); y MRB-CF11100 (m, n, o), (a) y (b) urotelio normal compuesto de 2-3 capas celulares: una capa de células basales (Bc), una capa de células intermedias (lc) y una capa superficial compuesta de células en paraguas (Uc). (c) y (f) Nefronas normales: glomérulos (Gl), podocitos (Pd), túbulo contorneado proximal (TPC), túbulo contorneado distal (TDC), mácula densa (Md), polo urinario (Up) y polo vascular (Vp). (j) y (k) hiperplasia urotelial plana e inflamación intensa (asteriscos y flechas), tanto en la vejiga urinaria como en el uréter; vaso sanguíneo (Bv). (I) Inflamación intensa (asteriscos) en las nefronas. (d) y (e) inflamación mínima (asteriscos y flechas) tanto en la vejiga urinaria como en el uréter, (g) y (h) inflamación moderada (asteriscos y flechas) e hiperplasia urotelial plana tanto en la vejiga urinaria como en el uréter, (i) inflamación moderada (asteriscos) en las nefronas. a - l: Gl - glomérulo, Lp - lámina propia, Ur - urotelio. Figuras 11: Fotomicrografías de vejiga urinaria y riñón de ratón de grupos de control (A, B), MRB-CF1-1 20 (c, d), MRB-CF11 50 (e, f) y MRB-CF11 100 (g, h). (a) urotelio urinario normal de la vejiga que consta de 2-3 capas de células: una capa de células basales (Bc), una capa de células intermedias (lc) y una capa superficial compuesta de células en paraguas (Uc). (b) y (d) Nefronas normales: glomérulos (Gl), podocitos (Pd), túbulo contorneado proximal (TPC), túbulo contorneado distal (TDC), mácula densa (Md), polo urinario (Up) y polo vascular (Vp). (c) Inflamación mínima (asteriscos y flechas) en la vejiga urinaria, (e) y (g) inflamación moderada (asteriscos y flechas) e hiperplasia urotelial plana en la vejiga urinaria, (f) y (h) inflamación moderada (asteriscos) en las nefronas. a - h: Gl - glomérulo, Lp - lámina propia, Ur -urotelio.
Figuras 12: Fotomicrografías de la vejiga urinaria y el riñón de conejo de los grupos de control (a, b), MRB-CF1-1 20 (c, d), MRB-CF1150 (e, f) y MRB-CF11100 (g, h). (a) y (c) urotelio urinario normal de la vejiga que consta de 2-3 capas de células: una capa de células basales (Bc), una capa de células intermedias (lc) y una capa superficial compuesta de células en paraguas (Uc). (b) y (d) Nefronas normales: glomérulos (Gl), podocitos (Pd), túbulo contorneado proximal (TPC), túbulo contorneado distal (TDC), mácula densa (Md), polo urinario (Up) y polo vascular (Vp). (e) y (g) inflamación moderada (asteriscos y flechas) e hiperplasia urotelial plana en la vejiga urinaria, (f) y (h) inflamación moderada (asteriscos) en las nefronas. a - h: Gl - glomérulo, Lp - lámina propia, Ur - urotelio.
Figura 13: Imágenes de la cavidad abdominal y valoración macroscópica del peritoneo de ratas de los grupos control (a), CFI-1 (b) y MRB-CFl-1 (c, d), (a) cavidad abdominal normal y peritoneo sin signos de inflamación, (b) peritoneo con signos moderados de inflamación caracterizados por enrojecimiento, aumento de la vascularización y puntos hemorrágicos (asteriscos), así como pequeños grupos de cristales de fosfato (flechas), (c), (d) inflamación peritoneal intensa caracterizada por aumento de enrojecimiento, vascularización y puntos hemorrágicos (asteriscos), y aumento de los depósitos de cristales de fosfato (flechas) en la cavidad abdominal.
Figura 14: Fotomicrografías de las vejigas urinarias del grupo control (A, B), MNU (c, d) y MNU complejo de fosfato inorgánico 1 (CFI-1) (e, f, g, h). (a), (b) Urotelio normal que consiste en 2-3 capas: una capa de células basales (cabeza de flecha cerrada), una capa de células intermedias (flecha) y una capa superficial o apical compuesta de células en paraguas (cabeza de flecha abierta), (c), (d), (f) carcinoma urotelial invasivo (pT1): células neoplásicas dispuestas en pequeños grupos (asteriscos) que invaden la mucosa conectiva y diferenciación escamosa focal, (e) carcinoma planoin situ(pTis), caracterizado por atipia celular: núcleos voluminosos con citoplasma reducido y nucleolos prominentes (flechas), (g), (h) hiperplasia plana compuesta de varias capas celulares en el urotelio, pero sin atipia citológica. a - h: Lp - mucosa conectiva, M - capa muscular propia, Ur - urotelio.
Figura 15: Fotomicrografías de las vejigas urinarias de los grupos MNU P14-16 (a, b, c, d) y MNU MRB-CF11 (e, f, g, h). (a), (b), (g), (h) Hiperplasia plana que consiste en varias capas celulares en el urotelio: capa de células basales, capa de células medias y capa superficial, pero sin atipia citológica. (c), (d) carcinoma urotelial no invasivo (pTa) que se caracteriza por lesiones papilares y células uroteliales con disposición desordenada y con pérdida de polaridad; figuras mitóticas (flechas), (e), (f) urotelio normal que consiste en 2-3 capas: una capa de células basales (punta de flecha cerrada), una capa intermedia de células (flecha) y una capa superficial o apical compuesta de células paraguas (cabeza de flecha abierta), a - h: Lp - mucosa conectiva, M - capa muscular propia, Ur - urotelio.
Figura 16: Ecografía representativa de la vejiga urinaria de los Perros 1 y 2 en los siguientes tiempos: antes de la primera instilación (a, b), después de la primera instilación (c, d) y después de 3 (e, f), 6 (g, h), 18 (i, j) y 22 (k, l) instilaciones de MRB-CF1-1.
Figura 17: Ecografía representativa de la vejiga urinaria de los Perros 3 y 4 en los siguientes tiempos: antes de la primera instilación (a, b), después de la primera instilación (c, d) y después de 3 (e, f), 6 (g, h), 18 (i, j) y 22 (k, l) instilaciones de MRB-CFl-3.
Figura 18: Ecografía representativa de la vejiga urinaria de los Perros 5 y 6 en los siguientes tiempos: antes de la primera instilación (a, b), después de la primera instilación (c, d) y después de 5 (e, f), 6 (g, h), 8 (i, j) y 22 (k, l) instilaciones de MRB-CFl-5.
Figura 19: Citotoxicidad de las células MRB-CFl-1 y 5637 del carcinoma de vejiga urinaria de grado II. (a) Las células 5637 se colocaron en placas en una densidad celular de 2,0 x 104 y tratadas con diluciones seriadas de los compuestos (12,5 mg, 6,25 mg, 3,13 mg, 1,56 mg y 0,39 mg) durante 24 horas de incubación. Cada valor representa la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (n = 3). La viabilidad celular se normalizó para el control no tratado. (B) Imágenes representativas del compuesto MRB-CFl-1 por el ensayo de calceína-AM/PI. Las células 5637 se colocaron en placas en una densidad celular de 2,0 x 104 y se trataron con 12,5 mg, durante 24 horas de incubación. Las imágenes se obtuvieron con DAPI, GFP y yoduro de propidio, ampliación de 100x y estiramiento 2x2. Línea: I - grupo de control; II - 12,5 mg MRB-CFl-1. Columna: 1 - Hoesch 33342 (DAPI); 2 - Calceína (GFP); 3 - Yoduro de propidio (PI), 4 -Fusión de todos los canales. Escala de barras: 300 pm.
Figura 20: Difracción de rayos X (XRD): (A) CFI-1-PIBR-2017; obtenido como se define en el ejemplo de realización (I). (B) CFI-1 etanolamina; obtenido como se define en el ejemplo de realización (II). (C) Superposición de las dos figuras de XRD.
Descripción detallada de la invención
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a los procesos de obtención de un complejo nanoestructurado inorgánico (CFI-1), un complejo nanoestructurado asociado a proteínas (MRB-CFl-1) y uso antitumoral.
A continuación se describen dos 2 (dos) ejemplos de realizaciones relacionadas con la obtención del complejo nanoestructurado inorgánico (CFI-1) y el complejo nanoestructurado asociado a proteínas (MRB-CFl-1).
Realización ejemplar (I):
El proceso de obtención de un complejo nanoestructurado (CFI-1) por síntesis química comprende los siguientes pasos:
(a) Preparar fosfato amónico dibásico [(NH4)2HP04]in situen presencia de amoníaco y ácido ortofosfórico, en un homogeneizador mecánico con una potencia mínima de 500 W (por ejemplo, del tipo Ultra Turrax), a una temperatura entre 25 y 55 °C durante 20-30 min hasta la neutralización;
(b) Mezclar dos sales: Cloruro de magnesio hexahidratado, al 1-3 % (en masa) y fosfato amónico dibásico obtenido en el paso (a) al 1-4 % (en masa) entre 22 y 30 °C y pH 5-7, en un homogeneizador mecánico con una potencia mínima de 500 W (por ejemplo, del tipo Ultra-Turrax) en un intervalo de rotación variable entre 7000 y 15000 rpm durante 30-40 min; (c) Aplicar un nivel de presión a la mezcla obtenida en el paso (b) en un homogeneizador de alta presión (por ejemplo, NIRO) con la válvula de homogeneización con presión variable entre 407,8 a 713,8 kg/cm240 y 70 MPa (400 y 700 bares), preferiblemente 611.8 kg/cm260 MPa (600 bares), y en la segunda etapa, la válvula de homogeneización con presión variable entre 50,9 y 71,3 kg/cm270 bares(5 y 7 MPa [50 y 70 bares]), preferiblemente 61,1 kg/cm2 (6 MPa [60 bares]), para hasta 1 a 3 ciclos, preferiblemente 2 ciclos;
(d) Enfriar la suspensión obtenida en el paso (c) en baño de hielo a un intervalo de temperatura comprendido entre 0 y 20 °C, 20 °C, preferiblemente 15 °C;
(e) Precipitar; y
(f) Lavar los cristales con agua destilada y estéril y secar a 30 a 40 °C, preferiblemente a 37 °C durante 24 a 72 h, preferiblemente 48 h.
Después del paso (f), los cristales CFI-1 se secaron y pesaron, mostrando un rendimiento en masa de 45-50 %.
El complejo nanoestructurado (CFI-1), obtenido como se define en el ejemplo de realización (I) (PRODUCTO 1), comprende fosfato inorgánico con tamaño que varía de 190,0 a 310,3 ± 36,4 nm, polidispersión de 0,563 y potencial zeta de -22,6 4,5 mV.
El proceso de obtención de un complejo nanoestructurado asociado a proteínas (MRB-CF1-1) por síntesis química comprende los siguientes pasos:
(a) Preparar fosfato amónico dibásico [(NH4)2HP04]in situen presencia de amoníaco y ácido ortofosfórico, en un homogeneizador mecánico con una potencia mínima de 500 W (por ejemplo, del tipo Ultra Turrax), a una temperatura entre 25 y 55 °C durante 20-30 min hasta la neutralización;
(b) Mezclar dos sales: Cloruro de magnesio hexahidratado, al 1-3 % (en masa) y fosfato amónico dibásico obtenido en el paso (a) al 1-4 % (en masa) entre 22 y 30 °C y pH 5-7, en un homogeneizador mecánico en un intervalo de rotación variable entre 7000 y 15000 rpm durante 30-40 min;
(c) Añadir proteína en una concentración de 0,5-1,5 % (masa/masa), preferiblemente 1 %, al complejo obtenido en el paso (b), en donde la proteína mencionada comprende las proteínas hidrolíticas seleccionadas del grupo compuesto por quitinasa deBacillus subtilis(14 kDa) y lisozima de claras de huevo (14 kDa), preferiblemente lisozima, que tienen actividad inmunomoduladora.
(d) Aplicar un nivel de presión a la mezcla obtenida en el paso (c) en un homogeneizador de alta presión (NIRO) con la válvula de homogeneización con presión variable entre 407,8 a 713,8 kg/cm2 40 y 70 MPa (400 y 700 bares), preferiblemente 611,8 kg/cm260 MPa (600 bares), y en la segunda etapa, la válvula de homogeneización con presión variable entre 50,9 y 71,3 kg/cm270 bares(5 y 7 MPa [50 y 70 bares]), preferiblemente 61,1 kg/cm2 (6 MPa [60 bares]), para hasta 1 a 3 ciclos, preferiblemente 2 ciclos;
(e) Enfriar la suspensión obtenida en el paso (c) en baño de hielo a un intervalo de temperatura comprendido entre 0 y 20 °C, 20 °C, preferiblemente 15 °C;
(f) Precipitar; y
(g) Lavar los cristales con agua destilada y estéril y secar a 30 a 40 °C, preferiblemente a 37 °C durante 24 a 72 h, preferiblemente 48 h.
La proteína añadida en el paso (c) comprende preferiblemente una concentración del 0,7 %.
El complejo nanoestructurado asociado a proteínas (MRB-CFl-1), obtenido como se define en el ejemplo de realización (I), dicho PRODUCTO 2, comprende fosfato inorgánico asociado a proteínas, con un tamaño que varía de 318,0 a 477,1 ± 146 nm, polidispersión de 0,9 y potencial zeta de -28,60 ± 6,74 mV.
Realización ejemplar (II):
El proceso de obtención de un complejo nanoestructurado (CFI-1) por síntesis química comprende los siguientes pasos:
(A) Preparación de una disolución de fosfato amónico dibásico ultrapuro (99,99 %) [(NH4)2HPO4] (masa molar: 132,6 g/mol) con concentración comprendida en el intervalo de 1 y 4 % (en masa), preferiblemente 1 %, diluida en 1.000-2.000 mL de agua destilada, bajo agitación magnética con velocidad controlada y rotación entre 200 y 400 rpm, preferiblemente 300 rpm, a temperatura entre 22 °C y 30 °C y pH 8,26-8,57 durante 5 minutos;
b) añadir del 0,5 al 2,0 % de una amina seleccionada del grupo compuesto por monoetanolamina; dietanolamina y trietanolamina, preferiblemente monoetanolamina (2-aminoetanol; C2H7NO; masa molar: 61,08 g/mol), en la disolución de fosfato amónico dibásico [(NH4)2HPO4] obtenida en el paso (a) con agitación, con rotación entre 200 y 400 rpm, a un intervalo de temperatura entre 22 °C y 30 °C, y pH entre 9,72 y 9,80 durante 5 minutos, hasta completar la homogeneización.
(c) mantener la disolución de fosfato amónico dibásico [(NH4)2HPO4] y monoetalonamina, obtenida en el paso (b), con agitación mecánica, rotación entre 200 y 400 rpm, a una temperatura entre 22 °C y 30 °C y pH 9,72-9,80;
(d) Preparar una disolución ultrapura (99,99 %) de cloruro de magnesio hexahidratado (MgChH2O) (masa molar: 203,3 g/mol), en una concentración comprendida en el intervalo de 1-3 % (en masa), preferiblemente 2 %, en agitación con rotación comprendida entre 200 y 400 rpm, preferiblemente 300 rpm, en el intervalo de temperatura entre 22 y 30 °C, y pH entre 7,38 y 7,56, durante 5 min hasta completar la homogeneización; posteriormente, la disolución se transfiere a un embudo de separación de 200-600 mL o a un aparato de bureta con tapa de botella Titrette® con el volumen adecuado; (e) Goteo lento y controlado del líquido más denso obtenido en el paso (d) en la disolución resultante obtenida en el paso (b) con agitación, con rotación entre 200 y 400 rpm, a temperatura entre 22 °C y 30 °C y pH 9,72-9,80;
(f) mantener la disolución resultante del paso (e) bajo agitación durante 2 horas con rotación entre 200 y 400 rpm, a una temperatura entre 22 °C y 30 °C, y pH 8,10-8,20 hasta la disolución completa;
(g) Enfriar la suspensión obtenida en el paso (f) en baño de hielo a un intervalo de temperatura comprendido entre 0 y 20 °C, 20 °C, preferiblemente 15 °C;
(h) Precipitar;
(g) Lavar los cristales CFI-1 con agua destilada y estéril y secar a 30 a 40 °C, preferiblemente a 37 °C durante 24 a 72 h, preferiblemente 48 h.
El control de goteo en el paso (e) se lleva a cabo a la velocidad entre 26 y 33 gotas por minuto, en un intervalo de tiempo entre 3-4 horas.
El pH en el paso (e) se controla de modo que 30 minutos después del inicio del goteo, el pH está comprendido entre 9,12 y 9,32; 1 hora después del inicio del goteo, el pH está comprendido entre 8,81 y 8,89; 2 horas después del inicio del goteo, el pH está comprendido entre 8,25 y 8,43; y 3 horas después del inicio del goteo, el pH está comprendido entre 8,10 y 8,20; el pH debe mantenerse constante durante toda la reacción.
Después del paso (i), los cristales CFI-1 se secaron y pesaron, mostrando un rendimiento en masa de 98-100 %.
El complejo nanoestructurado (CFI-1) en presencia de un compuesto con un grupo amínico que actúa como estabilizador de pH, obtenido como se define en la realización de ejemplo (II), dicho PRODUCTO 3, comprende fosfato inorgánico con un tamaño de promedio de 449,6 ± 116,6 nm, polidispersión de 0,55 y potencial zeta de -20,0 ± 5,1 mV.
El proceso de obtención de un complejo nanoestructurado (CFI-1) asociado a la proteína (MRB-CFl-1) en presencia de un compuesto con un grupo amínico que actúa como estabilizador de pH comprende la adición del CFI-1, obtenido como se define en el ejemplo de realización (II), a una proteína de estado sólido, a 1:1, 1:2, relaciones peso/peso 1:3 y preferiblemente 1:2, en donde la proteína mencionada se selecciona del grupo compuesto por P14-16, quitinasa deBacillus subtilis(14 kDa) o lisozima de clara de huevo (14 kDa), que se sabe que tienen actividades inmunomoduladoras.
El complejo nanoestructurado asociado a proteínas P14-16 (MRB-CFl-1) comprende fosfato inorgánico mezclado con proteína, por simple adición de cristales de proteína a CFI-1 en concentraciones apropiadas para el estudio del cáncer de vejiga: con un tamaño de media de 509,6 ± 92,6 nm y potencial zeta de -26,3 ± 6,7 mV.
Otros objetos son el uso de los complejos obtenidos (CFI-1) y (MRB-CFI-1) para tratar el cáncer, preferiblemente de próstata, vejiga, colorrectal, mastocitoma y linfoma. Además, los complejos (CFI-1) y (MRB-CFl-1) se pueden utilizar como adyuvantes de los medicamentos quimioterapéuticos comerciales para tratar los cánceres de próstata, vejiga, colorrectal, mastocitoma y linfoma.
Aunque los compuestos NH4MgPO4 x 6H2O, (NH4)2MgH2(PO4)2 x 4H2O, (NH4)2Mg3(HPO4)4 x 8H2O y NH4MgPO4 x H2O se describen en la literatura, asociados o no con proteínas hidrolíticas, son objetos para tratar el cáncer en esta invención.
Resultados - Ejemplo de realización (I)
Caracterización del complejo nanoestructurado de magnesio y fosfato amónico (CFI-1):
El análisis de XFD muestra la presencia de amonio, magnesio y fosfato: La Tabla 1A (CFl-1) muestra una relación de fosfato a magnesio de 3,2 y muestra sólo trazas de metales, como hierro y calcio, y un valor de la estructura restante, como NH4 H2O (calculado por diferencia en peso de la masa total). Mediante este análisis, la célula unitaria aproximada sería (NH4)6Mg3(PO4)4. Relación P/Mg = 3,2. La Tabla 1B (MRB-CFl-1) muestra una relación de fosfato a magnesio de 2,86. Mediante este análisis, la célula unitaria es (NH4)6Mg3(PO4)4, sin tener en cuenta la parte orgánica.
Tabla 1A: Análisis de rayos X de fluorescencia (XFD) de CFI-1:
Tabla 1B: Análisis de ra os X de fluorescencia XFD de MRB-CFI-1:
La Tabla 2 muestra los componentes del complejo CFI-1 y MRB-CFl-1 en la superficie de los cristales, tales como magnesio, nitrógeno, fósforo y oxígeno, y la ausencia total de carbono por XPS. Por lo tanto, esta técnica muestra, en la superficie cristalina, nitrógeno (NH4), fosfato y magnesio como los únicos componentes del compuesto CFI-1. En el caso de MRB-CFl-1, se muestran los componentes de la proteína. Por lo tanto, para CFI-1 sería NO6Mg3(PO)2 y para MRB-CFl-1 sería C-i4NOaMg2(PO4)2.
Tabla 2: Análisis de CFI-1 MRB-CFl-1 mediante espectroscopía fotoelectrónica de ra os X XPS %
La fórmula química mínima de la superficie cristalina fue la siguiente: para CFI-1: NO6Mg3(PO4)2 y para MRB-CFl-1: C<14>NO<8>Mg<2>(PO<4>)<2>.
La superficie del cristal tiene los siguientes valores: Relación CFI-1: P/Mg = 0,86; relación MRB-CFl-1 = P/Mg = 1,68.
Patrón de refracción de rayos X:
En la Figura 1, las difracciones de CFI-1 son similares a algunas de las sales de fosfatos de amonio y magnesio; sin embargo, difieren en términos de intensidades. Por lo tanto, deben tener una distribución diferente en el complejo CFI-1. Hay un aumento en la expresión de la faz (022) y disminución de la expresión de la faz [002], [111] y [211] en relación con otras sales de fosfato. La relación fosfato/magnesio de CFI-1 es de 3,2, como se demostró en el análisis anterior. Por lo tanto, la célula unitaria del grupo CFI-1 presenta una fórmula diferente a las otras sales de fosfato reportadas en la literatura, además de que el<c>FI-1 es nanoparticulado, como se muestra en el siguiente artículo. La nanocristalización evidentemente indica que el producto mineralizado se orientó a lo largo de una dirección específica de fases.
Espectro infrarrojo de la transformada de Fourier (FTIR):
Las bandas observadas para CFI-1 (espectro no mostrado en la figura) aproximadamente 3600, 3500, 3260 y 3115 cir r<1>, en el espectro FTIR, probablemente pertenecen a las vibraciones de estiramiento del grupo OH y a la vibración de estiramiento antisimétrica de los grupos NH4. La unión agua-PO4-H aparece a aproximadamente 2500 y 2200 cm<-1>. La deformación del agua aparece a 1680 cm<-1>y las bandas a 1600 a 1400 cm<-1>fueron las del modo de deformación del H-NH del grupo NH4. El grupo PO4 sólo se observa a 1006 cm<-1>(alargamiento antisimétrico), 571 cm<-1>(flexión P-O), 463 y 438 cm<' 1>( modo PO4'3). A 618 y 688 cm<' 1>(unión Mg-O), y a 894 cm<' 1>la unión de deformación del grupo con Mg). La unión agua-agua-hidrógeno se observó a 760 y 695 cm<-1>, mientras que la unión entre agua-hidrógeno y el grupo NH4 se observó a 890 cm<-1>. El espectro MRB-CFl-1 FTIR presenta las mismas bandas con la adición de las bandas amida I 1640-1650 cm<-1>y amida II 1574-1550 cm<-1>.
Análisis termogravimétrico de CFI-1 y MRB-CFl-1:
La Figura 2A (CFI-1) muestra pérdida de peso a 100 °C del 8 %, a 200 °C del 47 %, a 250 °C del 50 % y, a 350 °C, pérdida del 53 %. Esto muestra la pérdida de amoníaco y agua casi simultáneamente. La Figura 2B mostró pérdida de peso a 100 °C, 150 °C, 200 °C, 250 °C y 350 °C de 25 %, 48 %, 52 %, 53 % y 54 %, respectivamente. Por lo tanto, el MRB-CFl-1 presentó una pérdida de peso más rápida que el CFI-1, probablemente debido a la presencia de proteínas.
Análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC) de CFI-1 y MRB-CFl-1:
La Figura 3A (CFI-1) muestra la temperatura en elconjunto:109,1 °C, entalpia (J/g), (AH°m) 1,262,00 J/g y punto de fusión a 125,94 °C para CFI-1. La Figura 3B (MRB-CFl-1) muestra el inicio de la temperatura: 108,1 °C, la entalpia (J/g) (AH°m) 1.311,00 J/g y MP = 122,37 °C. MRB-CFl-1 presenta un punto de fusión inferior al CFI-1 debido a la presencia de la proteína.
Espectro Raman:
La Figura 4A muestra las bandas Raman de CFI-1 observadas a 189 y 296 cm<-1>, que se designan respectivamente como la vibración de tensión MgO y la vibración de deformación O-Mg-O. La banda a 574 cm<-1>se puede asignar al v3 del grupo PO4. La banda de 944 cm<-1>se puede asignar a la banda de estiramiento simétrica del grupo P-O. En la amplia región de longitud de onda entre 2670 and 3300 cm<-1>se encuentran características de vibración de vibración de tensión de H2O y NH4+, y las pequeñas bandas entre 1400 y 1740 cm<-1>corresponden a sus vibraciones de deformación. La Figura muestra MRB-CFl-1 y todas estas bandas aparecieron correspondientes a los grupos fosfatos, magnesio y amonio, concomitantes con bandas convencionales Raman de amidas entre 1300-1650 cm<-1>, correspondientes a amidas I, II y III, respectivamente.
Tamaño (nm) y carga superficial (potencial zeta, mV) de CFI-1:
La Figura 5A (CFI-1) muestra un valor de tamaño de partícula en la región nano de 190,0-310,3 ± 36,4 nm. El potencial zeta medido fue de -22,6 ± 4,15 mV. La Figura 5B muestra el MRB-CFl-1. Tamaño que oscila entre 318,0 y 477,1 ± 146 nm, polidispersión de 0,9 y potencial zeta de -28,60 ± 6,74 mV.
Solubilidad a diferentes pH:
La Tabla 3 muestra la solubilidad del sistema de agua CFI-1 que se determinó a 25 y 35 °C mediante el balance de cristal y disolución en un recipiente. Una disolución experimental de 100 ml de volumen que contenía 0,45 g de CFI-1 fue tratada a varios pH. La variación de pH de la disolución se realizó mediante la adición de disoluciones de HCl y NaOH. Las mezclas se agitaron continuamente durante 24 h para garantizar la saturación de la disolución. El sólido no disuelto se asentó sin agitación y, después de 2 horas adicionales, se filtró a través de un filtro de membrana de 0,22 pm. El residuo se secó durante la noche en el horno a 35 °C. Las muestras secas se pesaron utilizando una balanza analítica. La diferencia entre el residuo y la masa inicial de CFI-1 proporcionó la solubilidad. La Tabla 3 muestra que el valor de solubilidad a pH 7 fue de 80 mg/l. Este valor puede cambiar en función del pH y la fuerza iónica.
Tabla 3: Solubilidad de CFI-1 a diferentes pH [0,45 /100 ml CFI-1].
Caracterización del complejo MRB-CFl-1:
Patrón de difracción de rayos X (XRD).
La Figura 6 muestra claramente la asociación de CFI-1 con la proteína lisozima (P14-16). Las superposiciones de las dos difracciones difieren en algunos de los valores de 20. La Figura 5 muestra que el producto obtenido en presencia de la proteína P 14-16 tuvo una mayor expresión de difracción en las faces (002) y (120), lo que indica que el producto de mineralización se orientó preferentemente en una sola dirección. Esto muestra una fuerte interacción de la proteína P14-16 en relación con CFI-1.
Dicroismo circular de MRB-CF1-1.
La Figura 7 muestra en la región UV 200-250 nm, la magnitud de la elipticidad a 208 nm y 222 nm, en donde hubo una variación para el complejo MRB-CFl-1 a pH 7,4 (PBS). El aumento indicó un aumento en el contenido de alfa-hélice de la proteína nativa P14-16 (lisozima). Este aumento del contenido de alfa-hélice indica una estructura más ordenada, ya que algunos de los residuos deben estar involucrados en la interacción en la región no helicoidal de la estructura terciaria. Este tipo de efecto ocurre en las proteínas cuando se someten a la acción de tensioactivos negativos. En este caso, el CFI-1, que es negativo, muestra el mismo efecto.
Tamaño (nm) y carga superficial (potencial zeta, mV) de CFI-1 (A) frente a (B) MRB-CF1-1.
La Figura 8 mostró una comparación de la distribución diferente cuando el CFI-1 se asocia con la proteína P14-16 (MRB-CFl-1). El MRB-CFl-1 muestra una homogeneidad menor que el CFI-1 solo (Figura 8A). MRB-CFl-1 muestra un pequeño aumento en el tamaño de partícula y la carga superficial (Figura 5). Sus análisis por FESEM muestran claramente las características esféricas y nanométricas tanto del CFI-1 (Figura 8C) como del MRB-CFl-1 (Figura 8D).
Análisis toxicológicos y bioquímicosin vivode MRB-CFI-1 :
Para los análisis toxicológicos y bioquímicos del nanofármaco MRB-CFl-1, se utilizaron 20 ratas hembra Fischer 344, 20 ratones hembra C57BL/6, y 20 conejos hembra Nueva Zelanda.
Los animales se distribuyeron en 4 grupos para cada especie, específicamente: grupo de control (n = 5 animales para cada especie): recibió una dosis intravesical de la disolución fisiológica al 0,9 %, durante 6 semanas consecutivas; grupo MRB-CFl-1 20 (n = 5 animales para cada especie): recibió una dosis intravesical de MRB-CF1-1 20 mg/kg durante 6 semanas consecutivas; grupo MRB-CFl-1 50 (n = 5 animales para cada especie): recibió una dosis intravesical de MRB-CFl-1 50 mg/kg durante 6 semanas consecutivas; grupo MRB-CFl-1 100 (n = 5 animales para cada especie): recibió una dosis intravesical de MRB-CFl-1 100 mg/kg durante 6 semanas consecutivas.
El protocolo para el uso de animales en la investigación fue aprobado por el Comité de Ética sobre el Uso de Animales (CEUA) - UNICAMP (números de protocolo: 4536-1/2017; 4579-1/2017; 4435-1).
Después del período experimental de 6 semanas, todos los animales de cada grupo fueron sacrificados. Para los análisis de toxicidad local y sistémica del nanofármaco MRB-CFl-1, se recolectaron los órganos del sistema urinario (vejiga urinaria, uréteres y riñones) y otros órganos objetivo, tales como hígado, bazo, estómago y páncreas, y se sometieron a análisis histopatológicos. Se evaluó la histopatología de estos órganos y la toxicidad se correlacionó con los grados de inflamación. El grado de inflamación se evaluó mediante una escala semicuantitativa: 0, ausencia de inflamación, 1, inflamación mínima (menos de cinco linfocitos en un área de 0,25 mm2), 2, inflamación moderada (células inflamatorias mononucleares diseminadas en todo el tejido, pero aún con estroma visible), 3, inflamación intensa (células inflamatorias mononucleares densamente infiltradas en los tejidos).
Además, se realizaron análisis bioquímicos para verificar la toxicidad sistémica de este compuesto, específicamente: alanina aminotransferasa (ALT), un marcador específico para lesión parenquimatosa hepática; aspartato aminotransferasa (AST), un marcador inespecífico para lesión hepática y/o cardíaca; fosfatasa alcalina; así como niveles circulantes de creatinina y urea para verificar la función renal. Las determinaciones espectrofotométricas se realizaron en un espectrofotómetro Pharmacia Biotech con una cámara de cubeta controlada por temperatura (UV/Visible Ultrospec 5.000 con software de aplicación Swift II para control por ordenador, 97-4213, Cambridge, Inglaterra, Reino Unido). Todos los reactivos químicos fueron de la empresa LaborLab (Guarulhos, Sao Paulo, Brasil).
Valoraciónin vivode la respuesta inflamatoria peritoneal después de la administración de CFI-1, proteína P14-16 y compuesto MRB-CFl-1:
Para verificar si el compuesto MRB-CFl-1 y sus constituyentes (CFI-1 y proteína P14-16) fueron capaces de deshinchar la respuesta inflamatoria peritoneal (activación del sistema inmune) cuando se administró directamente a la cavidad abdominal, se utilizaron 8 ratas hembra Fischer 344 de 7 semanas de edad, con un peso de 150 gramos en promedio, y con un peso de 7,5 gramos. los cuales fueron obtenidos en el Centro Animalario de la Universidad Estatal de Campinas (CEMIB/UNICAMP).
Los animales se dividieron en 4 grupos (n = 2 animales por grupo): Grupo control: recibió una dosis intraperitoneal de 0,3 mL de disolución fisiológica al 0,9 % cada 72 horas, un total de 3 dosis; grupo CFI-1: recibió una dosis intraperitoneal de 20 mg/kg de CFI-1 suspendido en disolución fisiológica al 0,9 % cada 72 horas, un total de 3 dosis; grupo P14-16: recibió una dosis intraperitoneal de 20 mg/kg de proteína P14-16 suspendida en disolución fisiológica al 0,9 % cada 72 horas, un total de 3 dosis; grupo MRB-CFl-1: recibió una dosis intraperitoneal de 20 mg/kg de compuesto MRB-CFl-1 suspendido en disolución fisiológica al 0,9 % cada 72 horas, un total de 3 dosis. Después de 24 horas de la última aplicación de cada compuesto, los animales fueron eutanizados y los peritoneos fueron evaluados macroscópicamente y recolectados para una valoración histológica adicional.
El protocolo para el uso de animales en la investigación fue aprobado por el Comité de Ética sobre el Uso de Animales (CEUA) - UNICAMP (número de protocolo: 4536-1/2017).
Ensayo pre-clínico: inducción y tratamiento del cáncer de vejiga urinaria invasivo no muscular (CBNMI) en ratas Fischer 344:
En la presente invención, se utilizaron 100 ratas Fischer 344 de 7 semanas, con un peso de 150 gramos en promedio, las cuales fueron obtenidas del Centro Animalario de la Universidad Estatal de Campinas (CEMIB/UNICAMP). Para la inducción de CBNMI, 80 animales fueron anestesiados con clorhidrato de xilazina al 2 % (5 mg/kg i.m.; Koig, Sao Paulo, Brasil) y clorhidrato de ketamina al 10 % (60 mg/kg, i.m.; Fort Dodge, lowa, EE. UU.), se mantuvieron en este estado durante 45 minutos para evitar la micción espontánea y una dosis de 1,5 mg/kg de N-metil-N-nitrosourea (MNU-Sigma, St Louis, MO, EE. UU.) disuelto en 0,3 ml de citrato de sodio (6,0 pH) se instilaron cada 15 días (semanas 0, 2, 4 y 6), un total de 4 dosis (Fávaroetal.,2014; Garciaetal.,2016). Los otros 20 animales que no recibieron MNU fueron considerados como el grupo control.
Dos semanas después de la última dosis de MNU, los animales fueron sometidos a un examen de ecografía para evaluar la ocurrencia de tumores. Las ecografías se evaluaron mediante un sistema de ecografía portátil controlado por software con un transductor lineal de 10-5 MHz 38 mm.
La ecografía de la vejiga urinaria de los animales inducidos con MNU mostró masas tumorales infiltradas en las paredes craneales y ventrales del órgano, con dimensiones de 0,32 cm x 0,21 cm; 0,32 cm x 0,24 cm; y 0,27 cm x 0,21 cm (Figuras 9b, 9c y 9d). El mapeo Doppler-Color evidenció un flujo sanguíneo intenso dentro de las masas tumorales, reforzando el diagnóstico de neoplasia urotelial.
Después de la inducción de CBNMI con MNU, los animales se distribuyeron en 5 grupos (20 animales por grupo): grupo de control (grupo 1): recibió una dosis intravesical de 0,3 ml de disolución fisiológica al 0,9 % durante 6 semanas consecutivas; grupo MNU (cáncer, grupo 2): recibió el mismo tratamiento que el grupo 1; grupo MNU CFI-1 (grupo 3): recibió una dosis intravesical de 20 mg/kg de CFI-1 suspendido en disolución fisiológica al 0,9 % durante 6 semanas consecutivas; grupo MNU P14-16 (grupo 4): recibió una dosis intravesical de 20 mg/kg de proteína P14-16 suspendida en disolución fisiológica al 0,9 % durante 6 semanas consecutivas; grupo MNU MRB-CFl-1 (grupo 5): recibió una dosis intravesical de 20 mg/kg de compuesto MRB-CF1-1 suspendido en disolución fisiológica al 0,9 % durante 6 semanas consecutivas.
Las dosis intravesicales en los diferentes grupos experimentales se instilaron utilizando un catéter flexible de calibre 20 (Abocath, Sao Paulo, Brasil). Los animales de todos los grupos experimentales recibieron agua y la misma dieta sólidaad libitum(Nuvilab, Colombo, PR, Brasil). Después de 16 semanas de tratamiento, los animales fueron sacrificados y las vejigas urinarias fueron recolectadas y sometidas a análisis histopatológicos e inmunohistoquímicos. El protocolo para el uso de animales en la investigación fue aprobado por el Comité de Ética sobre el Uso de Animales (CEUA) - UNICAMP (número de protocolo: 4536-1/2017).
Análisis histopatológico:
Para el análisis histológico, se recolectaron muestras de la vejiga urinaria de todos los animales de cada grupo experimental (n = 20 animales por grupo) y se fijaron con Bouin durante doce horas. Después de la fijación, los tejidos se lavaron en alcohol etílico al 70 %, con posterior deshidratación en una serie creciente de alcoholes. Posteriormente, los fragmentos se limpiaron con xileno durante 2 horas y se incluyeron en polímeros plásticos (Paraplast Plus, ST. Louis, MO, EE. UU.). Posteriormente, los materiales se seccionaron utilizando un micrótomo Slee CUT5062 RM 2165 (Slee Mainz, Mainz, Alemania) con un espesor de 5 micrómetros, teñido con hematoxilina-eosina y se fotografiaron con un fotomicroscopio DM2500 (Leica, Múnich, Alemania).
El diagnóstico de lesiones uroteliales se clasificó según la estadificación propuesta por el entendimiento común de la Organización Mundial de la Salud/Sociedad Internacional de Patología Urológica (Epsteinet al.,1998).
Inmunotinción de antígenos: TLR4, TRIF, IRF3, INF-<y>, TLR2, IKK-a, MyD88, IL-6 y TNF-a:
Se utilizaron muestras de la vejiga urinaria de todos los animales de cada grupo experimental (n = 20 animales por grupo), las mismas utilizadas para los análisis histopatológicos, para la inmunotinción. Luego, se recolectaron cortes con un espesor de 5 pm en el micrótomo giratorio Slee CUT5062 RM 2165 (Slee Mainz, Mainz, Alemania) en secciones silanizadas. La recuperación antigénica se realizó incubando las secciones en disolución amortiguadora de citrato (pH 6,0) a 100 °C en microondas, o por tratamiento con proteinasa K, dependiendo de las características de cada anticuerpo.
El bloqueo de las peroxidasas endógenas se realizó con H2O2 (metanol 0,3 %) con posterior incubación en una disolución de bloqueo con albúmina sérica bovina (BSA) al 3 %, en disolución amortiguadora TBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, los antígenos TLR4, TRIF, IRF3, INF-y, TLR2, IKK-a, MyD88, IL-6 y TNF-a se localizaron a través de los anticuerpos primarios específicos (Tabla 4), se diluyeron en BSA al 1 % y se almacenaron durante la noche a 4 °C. El kit HRP AdvanceTM (Dako Cytomation Inc., EE. UU.) se utilizó para la detección de antígenos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del lavado con disolución amortiguadora TBS-T, los cortes se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado de HRP del kit AdvanceTM HRP durante 40 minutos, y posteriormente se revelaron con diaminobenzidina (DAB), se contratiñeron con hematoxilina Harris y se evaluaron con un fotomicroscopio DM2500 (Leica, Múnich, Alemania).
Para evaluar la intensidad de la inmunorreactividad de los antígenos, se examinó el porcentaje de células uroteliales positivas en diez campos para cada anticuerpo con una magnitud 400x. La intensidad de tinción se clasificó en una escala de 0-3 y se expresó como 0 (ausencia de inmunorreactividad), 0 % de células uroteliales positivas; 1 (inmunorreactividad débil), 1-35 % de células uroteliales positivas; 2 (inmunorreactividad moderada), 36-70 % de células uroteliales positivas; y 3 (inmunorreactividad intensa), > 70 % de las células uroteliales positivas (Garciaet al.,2016).
Tabla 4: Características del anticuerpo primario para inmunotinción.
Análisis estadístico:
Los análisis histopatológicos e inmunohistoquímicos se evaluaron utilizando la prueba de relación. Para estos análisis, se consideró estadísticamente significativo un error tipo I del 5 %.
Ensayo pre-clínico: inducción y tratamiento del cáncer de vejiga urinaria invasivo no muscular (CBNMI) en ratones C57BL/6:
En la presente invención, se utilizaron 100 ratones hembra de 7 semanas de edad, con un peso de 40 gramos en promedio, que fueron obtenidos del Centro Animalario de la Universidad Estatal de Campinas (CEMIB/UNICAMP). Los animales de todos los grupos experimentales recibieron agua y la misma dieta sólidaad libitum(Nuvilab, Colombo, PR, Brasil). Para la inducción de CBNMI, 80 animales fueron anestesiados con clorhidrato de xilazina al 2 % (5 mg/kg i.m.; Konig, Sao Paulo, Brasil) y clorhidrato de ketamina al 10 % (60 mg/kg, i.m.; Fort Dodge, Iowa, EE. UU.), se mantuvieron en este estado durante 45 minutos para evitar la micción espontánea y una dosis de 1,5 mg/kg de N-metil-N-nitrosourea (MNU-Sigma, St Louis, MO, EE.<u>U.) disuelto en citrato de sodio (6,0) se instiló cada 15 días (semanas 0, 2, 4 y 6), un total de 3 dosis (Fávaroet al.,2012). Los otros 20 animales que no recibieron MNU fueron considerados como el grupo control.
Una semana después de la última dosis de MNU, los animales fueron sometidos a un examen de ecografía para evaluar la ocurrencia de tumores y posteriormente se dividieron en 5 grupos (n = 20 animales por grupo) para los tratamientos respectivos: a) grupo de control (grupo 1): recibió un dosis intravesical de 0,1 ml de disolución fisiológica 0,9 % durante 6 semanas consecutivas; b) grupo MNU (cáncer): recibió el mismo tratamiento que el grupo 1; c) grupo MNU CFI-1 (grupo 3): recibió un dosis intravesical de 20 mg/kg de fosfato inorgánico (CFI-1) durante 6 semanas consecutivas; d) grupo m Nu P14-16 (grupo 4): recibió un dosis intravesical de 20 mg/kg de proteína P14-16 durante 6 semanas consecutivas; e) grupo MNU MRB-CFl-1 (grupo 5): recibió un dosis intravesical de 20 mg/kg de compuesto MRB-CFl-1 durante 6 semanas consecutivas.
Las dosis intravesicales en los diferentes grupos experimentales se instilaron utilizando un catéter flexible de calibre 22 (Abocath, Sao Paulo, Brasil). La orina se recolectó semanalmente y, después del tratamiento, los animales fueron sacrificados y las vejigas urinarias fueron recolectadas. El protocolo para el uso de animales en la investigación fue aprobado por el Comité de Ética sobre el Uso de Animales (CEUA) - u NiCAMP (número de protocolo: 4579-1/2017).
Análisis histopatológico:
Para el análisis histológico, se recolectaron muestras de la vejiga urinaria de todos los animales de cada grupo experimental (n = 20 animales por grupo) y se fijaron con Bouin durante doce horas. Después de la fijación, los tejidos se lavaron en alcohol etílico al 70 %, con posterior deshidratación en una serie creciente de alcoholes. Posteriormente, los fragmentos se limpiaron con xilol durante 2 horas y se incluyeron en polímeros plásticos (Paraplast Plus, ST. Louis, MO, EE. UU.). Posteriormente, los materiales se seccionaron utilizando un micrótomo Slee CUT5062 RM 2165 (Slee Mainz, Mainz, Alemania) con un espesor de 5 micrómetros, teñido con hematoxilina-eosina y se fotografiaron con un fotomicroscopio DM2500 (Leica, Múnich, Alemania). El diagnóstico de lesiones uroteliales se clasificó según la estadificación propuesta por el entendimiento común de la Organización Mundial de la Salud/Sociedad Internacional de Patología Urológica (Epsteinet al.,1998).
Ensayos de viabilidad celular
La viabilidad celular del nanofármaco MRB-CFl-1 y sus constituyentes fue evaluada en células de carcinoma de vejiga urinaria grado II (línea celular 5637), con 24 horas de incubación. Para ello, se utilizaron dos enfoques (MTT y calceína/yoduro de propidio), con diferentes agentes químicos para aumentar la robustez de los resultados y evitar artefactos. Las células 5637 se colocaron en placas en una densidad celular de 2,0 x 104 y tratadas con diluciones seriadas de los compuestos (12,5 mg, 6,25 mg, 3,13 mg, 1,56 mg y 0,39 mg) durante 24 horas de incubación.
Análisis estadísticos:
Los análisis histopatológicos se evaluaron utilizando la prueba de relación. Para estos análisis, se consideró estadísticamente significativo un error tipo I del 5 %.
Resultados:
Análisis toxicológicos y bioquímicosin vivode MRB-CFI-1 :
Los niveles séricos de ALT, AST, fosfatasa alcalina, urea y creatinina en ratas, ratones y conejos tratados intravesicalmente con MRB-CFl-1 a dosis de 20 mg/kg, 50 mg/kg y 100 mg/kg no difirieron estadísticamente de sus respectivos controles (Tablas 5, 6 y 7), lo que indica que este compuesto no presentó efectos tóxicos sistémicos.
La vejiga urinaria, el uréter y los riñones de ratas, ratones y conejos del grupo control no presentaron inflamación ni alteraciones histopatológicas (Figuras 10a, 10b, 10c, 11a, 11b, 12a y 12b; Tabla 5). Las ratas del grupo MRB-CF1-1 20 mostraron una inflamación mínima en la vejiga urinaria (100,0 %), los uréteres (80,0 %) y los riñones (60,0 %) (Figuras 10d, 10e, 10f, Tabla 5). Se observó inflamación moderada en la vejiga urinaria (80,0 %), uréteres (80,0 %) y riñones (60,0 %) de ratas del grupo MRB-CFl-1 50 (Figuras 110g, 10h, 10i, Tabla 5). Las ratas del grupo MRB-CFl-1 100 mostraron inflamación intensa en la vejiga urinaria (80,0 %), uréteres (80,0 %) y riñones (60,0 %) (Figuras 10g, 10k, 10L, Tabla 5). Las ratas de los grupos MRB-CFl-1 50 y MRB-CFl-1 100 presentaron hiperplasia plana en el urotelio de la vejiga urinaria y uréteres (Figuras 10g, 10h, 10j y 10k) .
Los ratones del grupo MRB-CFl-1 20 mostraron una inflamación mínima en la vejiga urinaria (100,0 %) y los uréteres (100,0 %), y ausencia de inflamación en los riñones (Figuras 11c, 11d, Tabla 6). Se observó una inflamación moderada en la vejiga urinaria (100,0 %), los uréteres (00,0 %) y los riñones (100,0 %) de ratones de los grupos MRB-CFl-1 50 y MRB-CFl-1 100 (Figuras 11e, 11f, 11g, 11h, Tabla 6). Se observó hiperplasia plana en el urotelio de la vejiga urinaria y uréteres de ratones de los grupos MRB-CFL-50 y m Rb -CFI-1100 (Figuras 11e y 11g). Los conejos de los grupos MRB-CFl-1 50 y MRB-CF1-mostraron inflamación moderada en la vejiga urinaria (100,0 %) y los riñones (00,0 %), mientras que los animales del grupo MRB-CFl-1 20 no presentaron inflamación ni alteraciones histopatológicas en los órganos del sistema urinario (Figuras 12c, 12d, 12e, 12f, 12g, 12h, Tabla 7). Se observó hiperplasia plana en el urotelio de la vejiga urinaria y uréteres de conejos de los grupos MRB-CFL-50 y MRB-CFl-1 100 (Figuras 12e y 12g).
Se verificó ausencia de inflamación y alteraciones histopatológicas en el hígado, bazo, estómago y páncreas de todos los animales de cada especie (Tablas 8, 9, 10).
Tabla 5: Parámetros toxicoló icos bioquímicos para ratas.
Datos expresados como media ± desviación estándar (n = 5 animales por grupo).
Dos medias seguidas de la misma letra minúscula no difieren estadísticamente, de acuerdo con el prueba de Tukey (P < 0,05).
Tabla 6: Parámetros toxicoló icos bioquímicos para ratones.
Datos expresados como media ± desviación estándar (n = 5 animales por grupo).
Dos medias seguidas de la misma letra minúscula no difieren estadísticamente, de acuerdo con el prueba de Tukey (P < 0,05).
Tabla 7: Parámetros toxicoló icos bioquímicos para coneos.
Datos expresados como media ± desviación estándar (n = 5 animales por grupo).
Dos medias seguidas de la misma letra minúscula no difieren estadísticamente, de acuerdo con el prueba de Tukey (P < 0,05).
Tabla 8: Valoración semicuantitativa de la inflamación en la vejiga urinaria, uréteres, riñones, hígado, bazo, páncreas y estóma o para las 5 ratas de cada rupo experimental.
0, ausencia de inflamación, 1, inflamación mínima (menos de cinco linfocitos en un área de 0,25 mm2), 2, inflamación moderada (células inflamatorias mononucleares diseminadas en todo el tejido, pero aún con estroma visible), 3, inflamación intensa (células inflamatorias mononucleares densamente infiltradas en los tejidos).
Tabla 9: Valoración semicuantitativa de la inflamación en la vejiga urinaria, uréteres, riñones, hígado, bazo, páncreas y estómago para los 5 ratones de cada grupo experimental.
0, ausencia de inflamación, 1, inflamación mínima (menos de cinco linfocitos en un área de 0,25 mm2), 2, inflamación moderada (células inflamatorias mononucleares diseminadas en todo el tejido, pero aún con estroma visible), 3, inflamación intensa (células inflamatorias mononucleares densamente infiltradas en los tejidos).
Tabla 10: Valoración semicuantitativa de la inflamación en la vejiga urinaria, uréteres, riñones, hígado, bazo, páncreas y estóma o para los 5 coneos de cada rupo experimental.
0, ausencia de inflamación, 1, inflamación mínima (menos de cinco linfocitos en un área de 0,25 mm2), 2, inflamación moderada (células inflamatorias mononucleares diseminadas en todo el tejido, pero aún con estroma visible), 3, inflamación intensa (células inflamatorias mononucleares densamente infiltradas en los tejidos).
Valoración de la respuesta inflamatoria peritoneal después de la administración de CFI-1, proteína P14-16 y compuesto MRB-CFl-1:
Los análisis macroscópicos de los peritoneos revelaron que los animales de los grupos control (Figura 13a) y P14-16 no mostraron signos inflamatorios, así como aumento de la vascularización. Todos los animales del grupo CFI-1 presentaron signos moderados de inflamación peritoneal, caracterizados por enrojecimiento, aumento de la vascularización y puntos hemorrágicos y pequeños grupos de cristales de fosfato en la cavidad abdominal. En relación con el grupo MRB-CFl-1, todos los animales presentaron inflamación peritoneal intensa caracterizada por aumento de enrojecimiento, vascularización y puntos hemorrágicos (Figuras 13c y 13d). Además, hubo un aumento de los depósitos de cristales de fosfato en la cavidad abdominal. Así, los resultados macroscópicos actuales divulgaron que el compuesto MRB-CFl-1 fue capaz de inducir la respuesta inflamatoria, lo que justifica su evaluación como inmunomodulador en los experimentos en animales con cáncer de vejiga invasivo no muscular (CBNMI) inducido químicamente, asociado a sus efectos tóxicos mínimos o ausentes.
Análisis histopatológico: Tratamiento del cáncer de vejiga urinaria invasivo no muscular (CBNMI) en ratas Fischer 344:
El tracto urinario del grupo control no presentó alteraciones microscópicas (Figuras 14a y 14b; Tabla 11). El urotelio normal estaba compuesto por dos capas: una capa de células basales, una capa celular intermedia y una capa superficial o apical compuesta por células en paraguas (Figuras 14a y 14b).
En contraste, las vías urinarias del Grupo MNU (cáncer) presentaron alteraciones histopatológicas drásticas, tales como: carcinoma urotelial invasivo (pT1) (Figuras 14c, 14d) y carcinoma urotelial no invasivo (pTa) en el 60 % y el 40 % de los animales, respectivamente (Tabla 11). El carcinoma pT1 (Figuras 14c, 14d, 14f) se caracterizó por células neoplásicas agrupadas en pequeños grupos o cordones que invaden la mucosa conectiva, numerosas figuras mitóticas y células pleomórficas con núcleos agrandados y diferenciación escamosa focal.
Las lesiones neoplásicas más frecuentes en el complejo de grupo MNU fosfato inorgánico fueron el carcinoma planoinsitu(pTis) (Figura 14e) y el carcinoma pT1 (Figura 14f), que se presentaron en el 20 % de los animales, respectivamente (Tabla 11). Los otros animales no presentaron lesiones malignas, y el 20 % de ellos presentaron hiperplasia plana (Figuras 14g, 14h; Tabla 11) y el 20 % morfología vesical normal, lo que indica que este tratamiento promovió el 40 % de la regresión tumoral (Tabla 11). El carcinoma pTis se caracterizó por una proliferación desordenada de células uroteliales en un urotelio plano, con atipias celulares acentuadas caracterizadas por núcleos voluminosos, reducción del citoplasma, y nucleolos múltiples y prominentes.
Los análisis histopatológicos de los animales del grupo MNU P14-presentaron un 40 % de regresión tumoral, y el 20 % de ellos presentaron hiperplasia plana (Figuras 15a, 15b; Tabla 11) y un 20 % morfología vesical normal (Tabla 11). Las lesiones neoplásicas más frecuentes en este grupo fueron el carcinoma de pTa de alto grado (Figuras 15c, 15d) y el carcinoma pT1, ambos en el 20 % de los animales (Tabla 11). El carcinoma pTa no invasivo se caracterizó por lesiones papilares o no papilares, células uroteliales con disposición desordenada y con pérdida de polaridad, núcleos hipercromáticos, pleomórficos, y nucleolos prominentes (Figuras 15c, 15d).
Los aspectos microscópicos de la vejiga urinaria del grupo MRB-CFl-1 fueron similares a los encontrados en el grupo control. Se encontró urotelio normal en el 40 % de los animales (Figuras 15e, 15f; Tabla 11). La alteración histopatológica más frecuente en este grupo fue la hiperplasia plana (Figuras 15g, 15h) que ocurrió en el 40 % de los animales (Tabla 11), lo que indica que este compuesto promovió la regresión tumoral en el 80 % de los animales. La hiperplasia plana se caracterizó por engrosamiento del urotelio y ausencia de atipia citológica (Figuras 14h, 15a, 15b, 15g y 15h). El carcinoma pTis se presentó en el 20 % de los animales de este grupo (Tabla 11).
Tabla 11: Porcentae de alteraciones histopatoló icas en la vei a urinaria de ratas de diferentes rupos experimentales.
Inmunotinción de antígenos: TLR4, TRIF, IRF3, INF-y, TLR2, IKK-a, MyD88, IL-6 and TNF-a: tratamiento del cáncer de vejiga urinaria invasivo no muscular (CBNMI) en ratas Fischer 344:
Las inmunotinciones para MyD88 e IKK-a fueron moderadas significativamente en los grupos control, MNU CFI-1, MNU P14-16 y MRB-CFl-1 en relación con el grupo MNU, que presentó inmunorreactividad débil para estos antígenos (Tabla 12). Además, la inmunotinción para IL-6 y TNF-a fue significativamente moderada en el grupo de MNU en comparación con los otros grupos experimentales, lo que indica que el nanofármaco MRB-CF1-1 y sus constituyentes no indujo la vía para producir citoquinas inflamatorias mediadas por los TLR 2 y 4.
Por el contrario, los inmunomarcadores para TLR2, TLR4, TRIF, IRF3 y INF-<y>fueron significativamente intensos en el urotelio de MRB-CFl-1 y grupos control en comparación con los otros grupos experimentales (Tabla 12), lo que indica que el nanofármaco MRB-CFl-1 fue capaz de estimular la vía del interferón mediada por los TLR 2 y 4. Además, los inmunomarcadores para estos antígenos se moderaron en los grupos MNU CFI-1 y MNU P14-16 en relación con el grupo MNU (Tabla 12).
Tabla 12: Intensidad de inmunotinción media para los diferentes antígenos en la vejiga urinaria de grupos de control,
MNU, MNU CFI-1, MNU P14-16 y MNU MRB-CF1-1.
Análisis histopatológico - tratamiento del cáncer de vejiga urinaria invasivo no muscular (CBNMI) en ratones C57BL/6:
El tracto urinario del grupo control no presentó alteraciones microscópicas (Tabla 13). En contraste, las vías urinarias del grupo MNU (cáncer) presentaron alteraciones histopatológicas drásticas, como: carcinoma pT1, carcinoma pTa y carcinoma pTis en el 20 %, 20 % y 60 % de los animales, respectivamente (Tabla 13).
Las lesiones neoplásicas más frecuentes en el grupo MNU+CFI-1 fueron el carcinoma pTis y el carcinoma pTa, que se presentaron en el 20 % y el 40 % de los animales, respectivamente (Tabla 13). Los otros animales no presentaron lesiones malignas, con un 20 % de ellos presentando hiperplasia plana y un 20 % una lesión premaligna llamada neoplasia intraurotelial de bajo grado (Tabla 13), lo que indica que este tratamiento promovió la regresión e inhibió la progresión tumoral en el 40 % de los animales.
Tabla 13: Porcentaje de alteraciones histopatológicas en la vejiga urinaria de ratones de diferentes grupos
experimentales.
Los análisis histopatológicos de los animales del grupo MNU+P14-16 presentaron un 20 % de regresión tumoral, y un 20 % de ellos presentaron hiperplasia plana (Tabla 13). Las lesiones neoplásicas más frecuentes en este grupo fueron los carcinomas pTis, pTa y pT 1, ambos en 20 %, 40 % y 60 % de los animales, respectivamente (Tabla 13).
Los aspectos microscópicos de la vejiga urinaria del grupo MRB-CFl-1 fueron similares a los encontrados en el grupo control. Se encontró urotelio normal en el 40 % de los animales (Tabla 13). Se encontraron lesiones benignas, tal como la hiperplasia plana, y lesiones premalignas, tal como la neoplasia intraurotelial de bajo grado, en el 20 % y el 20 % de los animales, respectivamente (Tabla 13), lo que indica que este tratamiento promovió la regresión e inhibió la progresión tumoral en el 80 % de los animales. La lesión neoplásica más frecuente en este grupo fue el carcinoma pTis en el 20 % de los animales (Tabla 13).
Ensayo clínico-veterinario: Tratamiento del cáncer de vejiga urinaria espontáneo en perros:
Se han establecido varios modelos animales inducidos experimentalmente para el cáncer de vejiga, incluyendo tumores inducidos químicamente. Aunque estos modelos animales están en uso en la investigación del cáncer de vejiga, los modelos animales en los que la enfermedad ocurre de forma normal se asemejan lo más posible a los humanos y pueden ser útiles para evaluar nuevas terapias (Wuet al.,2006; Arantes-Rodrigueset al.,2013), incluida la terapia con MRB-CFli.
El cáncer de vejiga de origen natural en perros puede proporcionar un modelo excelente a medida que se acerca al cáncer de vejiga invasivo humano, específicamente el carcinoma urotelial invasivo de alto grado en términos de características celulares y moleculares; el comportamiento biológico, incluidos los sitios y la frecuencia de metástasis; y la respuesta a la terapia (Knappet al.,2014).
Para este extremo, se están evaluando los efectos de la inmunoterapia intravesical con MRB-CFl-1 en la progresión del cáncer de vejiga en 20 perros, atendidos en la clínica veterinaria “Dr. Ronaldo Tizziani” (Campiñas, Sao Paulo, Brasil). Tras el diagnóstico de carcinoma urotelial y el consentimiento de los dueños de los perros, se inició el tratamiento con MRB-CFl-1. El protocolo para el uso de perros en la investigación fue aprobado por el Comité de Ética sobre el Uso de Animales (CEUA) - UNICAMP (número de protocolo: 4481-1/2017).
Los perros recibieron 25 mg de MRB-CFl-1 disuelto en 2,0 mL de disolución salina fisiológica al 0,9 % intravesicalmente (sondeo) o por cistocentesis, dependiendo de las condiciones de acceso a la vejiga urinaria de cada perro. Estos animales recibieron una dosis semanal de MRB-CFl-1 durante seis semanas consecutivas. Para la terapia de mantenimiento, los animales recibieron una dosis de MRB-CFl-1 cada 15 días durante 6 meses y una dosis mensual durante otros 6 meses.
Los efectos terapéuticos del MRB-CFl-1 fueron evaluados por ecografía durante el ciclo de tratamiento. Las evaluaciones ecográficas se realizaron en los siguientes momentos: antes de la primera instilación, después de la primera instilación y después de 3, 6, 18 y 24 instilaciones de MRB-CFl-1.
Seis perros completaron el régimen terapéutico completo con MRB-CFl-1, mientras que 12 estaban en la fase de mantenimiento y 2 en la fase de inducción. Los siguientes son los resultados de los 6 perros, que completaron el régimen terapéutico completo: Perro 1: raza Dachshund, género: femenino, edad: 9 años; Perro 2: raza indefinida (SRD), género: femenino, edad: 16 años; Perro 3: raza Dachshund, género: femenino, edad: 9 años; Perro 4: raza Teckel , género: femenino, edad: 1 año; Perro 5: raza Lhasa Apso, género: femenino, edad: 13 años; Perro 5: raza Dachshund, género: femenino, edad: 12 años; Perro 6: raza Poodle, género: femenino, edad: 16 años.
Resultados:
Análisis bioquímicos de perros con cáncer de vejiga urinaria que reciben tratamiento con MRB-CFl-1:
Los análisis de hemoglobina sérica, leucocitos, plaquetas, función hepática (ALT) y función renal (urea y creatinina) indicaron que el tratamiento completo con MRB-CFl-1 (24 aplicaciones) no fue tóxico para los 6 perros, y muchos parámetros, tales como hemoglobina, leucocitos y ALT alcanzaron valores normales con el tratamiento propuesto (Tabla 14) .
Por lo tanto, estos exámenes indicaron que el tratamiento con MRB-CFl-1 no mostró signos de toxicidad sistémica en la dosis terapéutica propuesta.
Análisis por ecografía de perros con cáncer de vejiga urinaria que reciben tratamiento con MRB-CFl-1:
a) Perro 1: Antes de la primera instilación de MRB-CFl-1, se observó la presencia de masa tumoral con contornos irregulares, ecogenicidad mixta y ecotextura hiperecoica, con unas dimensiones de 3,08 cm x 1,89 cm, y volumen de 5,75 cm3 (Figura 16a, Tabla 15). Después de 6 instilaciones de MRB-CFl-1, la masa tumoral redujo un 56,52 % de su volumen respecto a la ecografía inicial (Figuras 16c, 16e, 16g, Tabla 15). Al final de las 24 instilaciones, la masa tumoral redujo un 79,30% de su volumen (Figura 16i, 16k, Tabla 15). Al inicio del tratamiento, el perro 1 presentó hematuria, que desapareció después de la tercera aplicación de MRB-CFl-1 y no recayó incluso después de la última aplicación (Tabla 15).
b) Perro 2: Antes de la primera instilación de MRB-CFl-1, se observó la presencia de masa tumoral con contornos irregulares, ecogenicidad mixta y ecotextura hiperecoica, con unas dimensiones de 3,42 cm x 2,75 cm, y volumen de 13,53 cm3 (Figura 16b, Tabla 15). Después de 6 instilaciones de MRB-CFl-1, la masa tumoral redujo un 88,17 % de su volumen respecto a la ecografía inicial (Figuras 16d, 16f, 16h, Tabla 15). Al final de las 24 instilaciones, la masa tumoral redujo un 93,93% de su volumen (Figura 16j, 16l, Tabla 15). Al inicio del tratamiento, el perro 2 presentó hematuria, que desapareció después de la tercera aplicación de MRB-CFl-1 y no recayó incluso después de la última aplicación (Tabla 15) .
c) Perro 3: Antes de la primera instilación de MRB-CFl-1, se observó la presencia de masa tumoral con contornos irregulares, ecogenicidad mixta y ecotextura hiperecoica, con unas dimensiones de 4,22 cm x 2,60 cm, y volumen de 14,93 cm3 (Figura 17a, Tabla 15). Después de 6 instilaciones de MRB-CFl-1, la masa tumoral redujo un 61,35 % de su volumen respecto a la ecografía inicial (Figuras 17c, 17e, 17g, Tabla 15). Al final de las 24 instilaciones, la masa tumoral redujo un 81,0% de su volumen (Figura 17i, 17k, Tabla 15). Al inicio del tratamiento, el Perro 3 presentó hematuria, que desapareció tras la decimoctava aplicación de MRB-CFl-1 (Tabla 15), sin recaída tras finalizar el tratamiento.
d) Perro 4: Antes de la primera instilación de MRB-CFl-1, se observó la presencia de masa tumoral con contornos irregulares, ecogenicidad mixta y ecotextura hiperecoica, con unas dimensiones de 3,91 cm x 1,84 cm, y volumen de 6,92 cm3 (Figura 17b, Tabla 15). Después de 6 instilaciones de MRB-CFl-1, la masa tumoral redujo un 48,84 % de su volumen respecto a la ecografía inicial (Figuras 17d, 17f, 17h, Tabla 15). Al final de las 24 instilaciones, la masa tumoral redujo un 82,22% de su volumen (Figura 17j, 17l, Tabla 15). Al inicio del tratamiento, el Perro 4 presentó hematuria, que desapareció tras la decimoctava aplicación de MRB-CFl-1 (Tabla 15), sin recaída tras finalizar el tratamiento.
e) Perro 5: Antes de la primera instilación de MRB-CFl-1, se observó la presencia de masa tumoral con contornos irregulares, ecogenicidad mixta y ecotextura hiperecoica, con unas dimensiones de 2,25 cm x 1,86 cm, y volumen de 4,07 cm3 (Figura 18a, Tabla 15). Después de 6 instilaciones de MRB-CFl-1, la masa tumoral redujo un 44,71 % de su volumen respecto a la ecografía inicial (Figuras 18c, 18e, 18g, Tabla 15). Al final de las 24 instilaciones, la masa tumoral redujo un 84,5% de su volumen (Figura 18i, 18k, Tabla 15). Al inicio del tratamiento, el perro 5 presentó hematuria, que desapareció sólo después de la última aplicación (Tabla 15).
f) Perro 6: Antes de la primera instilación de MRB-CFl-1, se observó la presencia de masa tumoral con contornos irregulares, ecogenicidad mixta y ecotextura hiperecoica, con unas dimensiones de 2,84 cm x 2,73 cm, y volumen de 11,08 cm3 (Figura 18b, Tabla 15). Después de 6 instilaciones de MRB-CFl-1, la masa tumoral redujo un 74,45 % de su volumen respecto a la ecografía inicial (Figuras 18d, 18f, 18h, Tabla 15). Al final de las 24 instilaciones, la masa tumoral redujo un 86,28% de su volumen (Figura 18j, 18l, Tabla 15). El perro 6 no presentó hematuria desde el inicio del tratamiento hasta el final (Tabla 15).
Así, estos resultados indicaron que la inmunoterapia intravesical con MRB-CFl-1 fue efectiva para reducir y prevenir la progresión de lesiones neoplásicas uroteliales en cáncer espontáneo de vejiga urinaria canina.
Ensayos de viabilidad celular
La viabilidad celular de MRB-CFl-1 y sus componentes, CFl-y proteína P14-16, fue de 76,01 % ± 12,39, 68,63 % ± 9,47 y 75,71 % ± 11,52, respectivamente, utilizando la concentración máxima de 12,5 mg, como se indica en el ensayo de reducción de MTT (Figura 19A).
La Figura 19B demuestra el impacto del tratamiento con MRB-CFl-1 en la integridad de la membrana celular. Además, se observaron células negativas para calceína, lo que indica pérdida de viabilidad celular, así como células positivas para yoduro de propidio (PI), lo que indica la muerte celular. Los resultados con 12,5 mg de compuesto MRB-CFl-1 mostraron 75,25 % ± 6,19 de calceína positiva y 25,50 % ± 2,52 de PI positivo para muerte celular. Por lo tanto, todas las técnicas reportaron una relación dosis-respuesta comparable, y el nanocompuesto MRB-CFl-1 mostró baja toxicidad, como se esperaba de los fármacos con propiedades inmunomoduladoras.
Tabla 14: Evaluación clínica de perros antes después de tratamientos intravesicales con MRB-CFl-1.
Tabla 15: Evaluaciones ecográficas del tamaño, volumen y reducción del tumor en comparación con la presencia de eritrocitos en la orina de los perros antes después de los tratamientos intravesicales con MRB-CFl-1.
Valor de referencia de eritrocitos (orina I): hasta 6.000 p/ml
Análisis de adyuvancia terapéutica de inmunoterapia intravesical con MRB-CFl-1 y quimioterapia sistémica con cisplatino en cáncer de vejiga invasivo no muscular (CBNMI)
Los efectos histopatológicos de la inmunoterapia intravesical con MRB-CFl-1 combinada con quimioterapia sistémica con cisplatino sistémico se verificaron en ratas hembra Fischer 344, inducidas químicamente al cáncer de vejiga invasivo no muscular (CBNMI), según el método ya descrito anteriormente. Después de inducir CBNMI con N-metil-N-nitrosourea (MNU), los animales se distribuyeron en cuatro grupos experimentales (n = 7 animales por grupo): grupo 1 (cáncer): recibió una dosis intravesical de 0,2 mL de disolución fisiológica al 0,9 % durante 6 semanas consecutivas; grupo 2 (cáncer MRB-CFl-1): recibió una dosis intravesical de 20 mg/kg de compuesto MRB-CFl-1 durante 6 semanas consecutivas; grupo 3 (cáncer cisplatino): recibió una dosis intraperitoneal de 0,25 mg/kg de cisplatino una vez a la semana durante 4 semanas consecutivas; grupo 4 (cáncer MRB-CFl-1 cisplatino): recibió tratamiento simultáneo con MRB-CFl-1 y cisplatino en las mismas concentraciones y a través de las mismas vías de administración que los grupos 2 y 3. El protocolo para el uso de animales en la investigación fue aprobado por el Comité de Ética sobre el Uso de Animales (CEUA) - UNICAMP (número de protocolo: 4324-1).
Los resultados mostraron carcinoma urotelial con invasión de lámina propia (pT1) y carcinoma papilar (pTa) en el 100 % de los animales del grupo de cáncer.
Los animales tratados sistémicamente con cisplatino mostraron una disminución en la progresión de las lesiones neoplásicas uroteliales en el 14,28 % de los animales, que presentaron una lesión benigna caracterizada por hiperplasia papilar (Tabla 16). Las lesiones neoplásicas más frecuentes en este grupo fueron el carcinomain situ(pTis), el carcinoma pTa y el carcinoma pT1 en el 14,28 %, 57,14 % y 14,28 % de los animales, respectivamente (Tabla 16).
Los animales tratados con MRB-CFl-1 intravesical mostraron una disminución del 42,85 % en la progresión de las lesiones neoplásicas uroteliales, que presentaron urotelión normal (Tabla 16). Las lesiones neoplásicas más frecuentes en este grupo fueron el carcinoma de pTis y el carcinoma pTa en el 28,57 % y el 28,57 % de los animales, respectivamente (Tabla 16).
El tratamiento combinado con inmunoterapia intravesical con MRB-CFl-1 y quimioterapia sistémica con cisplatino mostró una mejor recuperación histopatológica del estado canceroso y disminución de la progresión de las lesiones neoplásicas uroteliales en el 71,42 % de los animales, de los cuales el 42,85 % tenían urotelión normal y el 28,57 % tenían una lesión benigna caracterizada por hiperplasia plana (Tabla 16). La lesión neoplásica más frecuente en este grupo fue el carcinoma pTis en el 28,57 % de los animales (Tabla 16).
Por lo tanto, se puede concluir que la combinación de inmunoterapia intravesical con MRB-CFl-1 y cisplatino sistémico puede considerarse una opción valiosa para el tratamiento de pacientes que no responden al tratamiento estándar con BCG y/o que no cumplen los criterios de cistectomía temprana.
Tabla 16: Porcentae de alteraciones histopatoló icas en la vei a urinaria de ratas de diferentes rupos experimentales.
Resultados - Realizaciones ejemplares (I) y (II)
La caracterización de CFl-1 con control de pH en ausencia (PIBR 102017 012768 0) (CFl-1-PIBR-2017) y presencia de monoetanolamina son las siguientes:
Análisis elemental:
(A) CFI-1 (obtenido como se define en la realización ejemplar (I)): C (0,05%), H (7,02%), N (5,35%). (B) CFl-1 (obtenido como se define en la realización ejemplar (II)): C (0,08%), H (6,92%), N (5,33%).
Análisis de XPS o espectroscopía fotoelectrónica excitada por rayos X:
(A) CFl-1 (obtenido como se define en la realización ejemplar (I)): P (16,4%), Mg (19,1%), N (4,2%), O (60,3%), proporción P/Mg = 0,9. (B) CFl-1 (obtenido como se define en la realización ejemplar (II)): P (16,9%), Mg (16,7%), N (5,0%) and 0 (61,3%), proporción P/Mg = 1,0.
Tamaño (nm) y carga superficial (potencial zeta, mV):
(A) CFI-1 (obtenido como se define en la realización ejemplar (I)): muestra un valor de tamaño de nanopartículas de 310,3, ± 56,9 nm; y un potencial zeta de -21,8 ± 5,8 mV. (B) CFl-1 (obtenido como se define en la realización ejemplar (II)) : muestra un valor de tamaño de nanopartículas de 449,6 ± 116,6 nm; y un potencial zeta de -20,0 ± 5,1 mV.
Análisis espectroscópico de fluorescencia de rayos X (XRF):
(A) CFI-1 (obtenido como se define en la realización ejemplar (I)): PO4 (55,06%), Mg (16,88%), NH4 (27,68), proporción PO^Mg = 3,36. (B) CFI-1 (obtenido como se define en la realización ejemplar (II)): PO4 (56,43%), Mg (17,61%), NH4 (25,13), proporción PO^Mg = 3,02.
Patrón de difracción de rayos X (XRD)
La Figura 20 muestra claramente que el CFl-1-PIBR-2017 (A), obtenido como se define en la realización ejemplar (I), presenta las mismas características de difracción cristalina que el CFl-1 etanolamina (B), obtenido como se define en la realización ejemplar (II). La Figura 20C muestra la superposición de las dos figuras de XRD.

Claims (2)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Compuestos NH<4>MgPO<4>x 6H2O, (NH<4>)<2>MgH<2>(PO<4>)<2>x 4H2O, (NH<4>)<2>Mg<3>(HPO<4>)<4>x 8H2O y NH<4>MgPÜ<4>x H2O asociados o no a enzimas hidrolíticas para su uso en el tratamiento del cáncer.
  2. 2. Compuestos NH4MgPO4 x 6H2O, (NH4)2MgH2(PO4)2 x 4H2O, (NH4)2Mg3(HPO4)4 x 8H2O y NH4MgPO4 x H2O asociados o no a enzimas catalíticas para su uso de acuerdo con la reivindicación 1,CARACTERIZADOS porqueson para usarse en el tratamiento de los cánceres de próstata, vejiga, colorrectal, mastocitoma y linfoma.
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BRPI0801803A2 (pt) 2008-02-08 2010-07-27 Iseu Da Silva Nunes combinação de substáncias para o tratamento de doenças infecciosas bacterianas, parasitárias, fungais e virais compreendendo a associação de um imunomodulador e substáncias com ação antibacteriana, antiparasitária, antifungal ou antiviral
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US20140341940A1 (en) 2011-11-09 2014-11-20 Iseu da Silva Nunes Immunomodulator for the treatment of cancerous tumors in the epithelial tissue lining surfaces inside or outside body organs
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