ES2968625T3 - Un método para la fijación y retención de vesículas extracelulares, vesículas extracelulares fijadas y un método para diagnosticar una enfermedad - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para fijar vesículas extracelulares. El método incluye proporcionar una muestra que contiene vesículas extracelulares y poner en contacto la muestra con un agente reticulante no reversible y, opcionalmente, un fijador que contiene aldehído. Preferiblemente, el agente reticulante no reversible es 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida. El método también incluye imágenes de las vesículas extracelulares fijadas para la determinación o exclusión de enfermedad o trastorno en una muestra clínica. La presente invención también se refiere a un kit para fijar vesículas extracelulares en una muestra biológica. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Un método para la fijación y retención de vesículas extracelulares, vesículas extracelulares fijadas y un método para diagnosticar una enfermedad

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método de fijación de vesículas extracelulares usando un agente reticulante no reversible y, opcionalmente, un fijador que contiene aldehído. Este método se puede utilizar para la obtención de imágenes de vesículas extracelulares, así como para el diagnóstico o control de enfermedades.

Antecedentes de la invención

El cáncer es una de las principales causas de muerte (Torreet al.,"A. Global Cancer Incidence and Mortality Rates and Trends--An Update",Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.25:16-27 (2016)) y el diagnóstico temprano del cáncer y su adecuada caracterización es esencial para reducir la mortalidad (McPhailet al.,Stage at Diagnosis and Early Mortality from Cancer in England",Br J CancerS108-115 (2015)). Los casos nuevos más comunes de cáncer en hombres son el cáncer de próstata (161.000 personas), pulmón (116.900 personas) y colorrectal (71.000 personas).Id.Para las mujeres, los nuevos casos de cáncer más comunes son el de mama (252.000 personas), pulmón (105.510 personas) y colorrectal (64.000 personas). En 2017, se estima que los nuevos casos de tumores oculares son 3130 y las muertes estimadas son 330.Id.Si bien los tumores intraoculares son sustancialmente menos prevalentes que otros cánceres, el estudio de los tejidos y fluidos oculares es una oportunidad para usar el ojo como sistema modelo para desarrollar técnicas para obtener imágenes de los mediadores estructurales de la metástasis. Una vez establecidas las técnicas, es posible aplicar los métodos a los cánceres más prevalentes.

El diagnóstico temprano es esencial para reducir la mortalidad y el santo grial del diagnóstico del cáncer es una prueba de detección no invasiva. Para la mayoría de los tumores, una biopsia tisular es un desafío debido a los procedimientos quirúrgicos invasivos que exponen al paciente a dolor, mayor coste y riesgo de complicaciones. Además, los perfiles tumorales basados en tejidos son propensos a sesgos de muestreo, proporcionan sólo una instantánea de la heterogeneidad del tumor y no se pueden obtener repetidamente. Una solución a esta limitación técnica es controlar el cáncer mediante el seguimiento de biomarcadores predictivos en la sangre u otros fluidos biológicos y realizando biopsias líquidas. El desarrollo de métodos no invasivos para detectar y controlar tumores continúa siendo un desafío importante en la investigación del cáncer y la oncología. El objetivo de este proyecto es desarrollar una plataforma tecnológica para detectar de forma no invasiva biomarcadores secretados por los cánceres mediante una biopsia líquida (sangre u otros fluidos biológicos) para la detección temprana, el control o el pronóstico de una diversidad de cánceres.

Una fuente potencial de biomarcadores para el cáncer son las vesículas extracelulares (EV, por sus siglas en inglés), que son nanovesículas de transporte natural implicadas en la comunicación intercelular mediante la transferencia de biomoléculas tales como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos de una célula a otra (Gyorgyet al.,"Membrane Vesicles, Current State-of-the-Art: Emerging Role of Extracellular Vesicles",Cell Mol. Life Sci.68:2667-2688 (2011); Tramset al.,"Exfoliation of Membrane Ecto-Enzymes in the Form of Micro-Vesicles",Biochim. Biophys. Acta.645:63-70 (1981); Dvoraket al.,"Tumor Shedding and Coagulation",Science212:923-924, (1981)). Muchos tipos de células secretan exómeros (~35 nm) (Zhanget al.,"Identification of Distinct Nanoparticles and Subsets of Extracellular Vesicles by Asymmetric Flow Field-Flow Fractionation",Nat. Cell Biol.20:332-343 (2018)), exosomas (40-100 nm), microvesículas más grandes (100-10.000 nm) o cuerpos apoptóticos (1-5 pm) (Hristovet al.,"Apoptotic Bodies From Endothelial Cells Enhance the Number and Initiate the Differentiation of Human Endothelial Progenitor CellsIn Vitro", Blood104:2761-2766 (2004)) en fluidos como sangre, líquido cefalorraquídeo y orina (Raposoet al.,"Extracellular Vesicles: Exosomes, Microvesicles, and Friends",J. Cell Biol.200:373-383 (2013); Zhaet al.,"Extracellular vesicles: An Overview of Biogenesis, Function, and Role in Breast Cancer",Tumour Biol39:1010428317691182 (2017)).

Las EV están implicadas en la fisiopatología de varios cánceres (Gattiet al.,"Microvesicles Derived From Human Adult Mesenchymal Stem Cells Protect Against Ischaemia-Reperfusion-Induced Acute and Chronic Kidney Injury",Nephrol Dial Transplant26:1474-1483 (2011); Zomeret al., "In VivoImaging Reveals Extracellular Vesicle-Mediated Phenocopying of Metastatic Behavior",Cell161:1046-1057 (2015)) incluyendo, mama (Lugaet al.,"Exosomes Mediate Stromal Mobilization of Autocrine Wnt-PCP Signaling in Breast Cancer Cell Migration",Cell151:1542-1556 (2012); Choet al.,"Exosomes From Breast Cancer Cells Can Convert Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Into Myofibroblast-Like Cells",Int J Oncol40:130-138 (2012); Leeet al.,"Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Suppress Angiogenesis by Down-Regulating VEGF Expression in Breast Cancer Cells",PLoS One8:e84256 (2013)), próstata (Nilssonet al.,"Prostate Cancer-Derived Urine Exosomes: A Novel Approach to Biomarkers for Prostate Cancer",Br J Cancer100:1603-1607 (2009)), pulmón (Wysoczynskiet al.,"Lung Cancer Secreted Microvesicles: Underappreciated Modulators of Microenvironment in Expanding Tumors",Int J Cancer125:1595-1603 (2009); Janowska-Wieczoreket al.,"Microvesicles Derived From Activated Platelets Induce Metastasis and Angiogenesis in Lung Cancer",Int J Cancer113:752-760 (2005)) y colorrectal (Jiet al.,"Proteome Profiling of Exosomes Derived From Human Primary and Metastatic Colorectal Cancer Cells Reveal Differential Expression of Key Metastatic Factors and Signal Transduction Components",Proteomics13:1672-1686 (2013); Silvaet al.,"Expression and Cellular Localization of MicroRNA-29b and RAX, an Activator of the RNA-Dependent Protein Kinase (PKR), in the Retina of Streptozotocin-Induced Diabetic Rats",Mol Vis17:2228-2240 (2011)), así como trastornos neurodegenerativos (Bellinghamet al.,"Exosomes: Vehicles for the Transfer of Toxic Proteins Associated With Neurodegenerative Diseases?"Front Physiol.3:124 (2012)).

Las EV facilitan la propagación de células cancerosas y participan en las diferentes etapas del proceso metastásico, incluyendo; 1) facilitar el movimiento de las células, 2) promover el microambiente tumoral y 3) establecer el nicho premetastásico en tejidos distantes (Tkachet al."Communication by Extracellular Vesicles: Where We Are and Where We Need to Go",Cell164:1226-1232 (2016)). Además, las EV se están estudiando como biomarcadores en tejidos precancerosos (Lugaet al.,"Exosomes Mediate Stromal Mobilization of Autocrine Wnt-PCP Signaling in Breast Cancer Cell Migration",Cell151:1542-1556 (2012)) y cancerosos (Nilssonet al.,"Prostate Cancer-Derived Urine Exosomes: A Novel Approach to Biomarkers for Prostate Cancer",Br J Cancer100:1603-1607 (2009); Rabinowitset al.,"Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer",Clin Lung Cancer10:42-46 (2009)).

Además de establecer la necesidad de mejorar la obtención de imágenes de EV en fluidos, existe la necesidad de obtener imágenes de EV en tejidosin situ. Los avances recientes en la obtención de imágenes de EV en tejidos de animales vivos incluyen el uso de proteínas de fusión (Laiet al.,"Visualization and Tracking of Tumour Extracellular Vesicle Delivery and RNA Translation Using Multiplexed Reporters",Nat. Commun.6:7029 (2015)), CRE recombinasa con proteínas indicadoras (Ridderet al.,"Extracellular Vesicle-Mediated Transfer of Functional RNA in the Tumor Microenvironment",Oncoimmunology4:e1008371 (2015)), o microscopía multifotónica (Zomeret al., "In VivoImaging Reveals Extracellular Vesicle-Mediated Phenocopying of Metastatic Behavior",Cell161:1046-1057 (2015)). Sin embargo, un desafío técnico importante para comprender la biología de las EV es la incapacidad de obtener imágenes de las EV en tejidos y fluidos biológicosin situ(Tkach et al. "Communication by Extracellular Vesicles: Where We Are and Where We Need to Go",Cell164:1226-1232 (2016)). Identificar y resolver los problemas técnicos que dificultan la obtención de imágenes de EV puede ayudar a dilucidar la estructura y función de las EV en estados normales y enfermos.

El método más común para estudiar la ultraestructura de EV en fluidos es la microscopía electrónica de transmisión (TEM, por sus siglas en inglés) combinada con tinción negativa. Sin embargo, se ha encontrado que esta técnica produce resultados inconsistentes y, a menudo, negativos. Además, al examinar cantidades conocidas de EV aplicadas a una solución, se observó una discrepancia sustancial entre la cantidad de EV aplicadas y las pocas EV de las que finalmente se obtuvieron imágenes. Por ejemplo, se añadieron más de un millón de EV a la superficie de una rejilla de microscopía electrónica para fijación con glutaraldehído, tinción negativa y obtención de imágenes por TEM. Sin embargo, en la etapa final, se observó un número escaso de EV (de 0 a 50), si es que hubo alguna. Sorprendentemente, los resultados fueron inconsistentes entre los lotes de EV; en algunos casos, las réplicas técnicas variarían. Por lo tanto, existe una brecha metodológica que dificulta la obtención de imágenes de EV eficiente, consistente y representativa en las soluciones. Para aprovechar todo el potencial de la obtención de imágenes de EV en fluidos biológicos, o una biopsia líquida, como diagnóstico médico, el método de TEM existente requiere un mayor desarrollo. Por lo tanto, los inventores evaluaron cada etapa del protocolo de obtención de imágenes por TEM de EV e intentaron identificar los puntos en los que se pueden perder las EV.

La presente invención se refiere a superar estas y otras deficiencias en la técnica.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método para fijar vesículas extracelulares. El método de fijación implica proporcionar una muestra que contiene vesículas extracelulares y poner en contacto la muestra con un agente reticulante no reversible en condiciones eficaces para fijar las vesículas extracelulares.

El método de la presente invención puede incluir opcionalmente además poner en contacto la muestra con un fijador que contiene aldehído antes, después o al mismo tiempo que el contacto de la muestra con un agente reticulante no reversible para fijar las vesículas extracelulares.

En una realización de la presente invención, la muestra que se trata con la presente invención para la fijación de vesículas extracelulares es un fluido o tejido biológico.

En otro aspecto de la invención, el agente reticulante no reversible usado para fijar las vesículas extracelulares es 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida. En otro aspecto, la presente invención se refiere a vesículas extracelulares fijadas obtenidas mediante el método de la invención.

Las vesículas extracelulares (EV) son partículas secretoras nanométricas con muchas funciones fisiológicas y una amplia gama de asociaciones patológicas. Las EV son producidas por células y, a menudo, secretadas en fluidos biológicos e influyen en la expresión génica de dianas celulares distantes. Una limitación técnica importante para comprender el papel de las EV en especímenes de fluidos normales y enfermos ha sido la dificultad para visualizar de manera reproducible la ultraestructura de las EV en tejidos y fluidos. En el presente documento, se demuestra que los protocolos de TEM convencionales dan como resultado una unión ineficiente de las EV a la superficie de la rejilla de microscopía electrónica. Además, las EV se pierden después de la fijación con glutaraldehído y con las etapas de lavado. Para unir las EV de manera más eficiente a la superficie de la rejilla, las EV se pueden reticular usando un agente reticulante no reversible, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), que retiene las EV y permite una obtención de imágenes por TEM sólida. Además, está demostrado que este método se puede usar para obtener imágenes de EV en una diversidad de fluidos biológicos, incluyendo sangre (plasma), líquido cefalorraquídeo, líquido de aspirado de pezón, humor acuoso y humor vítreo. Finalmente, se demuestra que este método permite la observación de diferencias morfológicas en EV aisladas de controles sanos (plasma sanguíneo) y diversas muestras de cáncer.

Otra limitación técnica para comprender el papel de las EV en especímenes normales y enfermos ha sido la incapacidad de visualizar la ubicación espacial de las EV en microambientes tisulares. En el presente documento, el tejido ocular bovino y humano, el humor vítreo, se usa como sistema modelo para estudiar la obtención de imágenes de EV. Los tejidos de mamífero reticulados con soluciones de formaldehído convencionales dan como resultado una pérdida significativa de EV, con las consiguientes señales de EV reducidas o negativas; sin embargo, el escape de las EV se puede prevenir mediante una fijación adicional con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), que retiene permanentemente estas partículas nanométricas y permite la visualización de las EV en tejidos normales y cancerososin situ.

Si bien los métodos para obtener imágenes de EV en fluidos son ineficientes, se encontró una brecha técnica similar en la obtención de imágenes de EV en tejidos sanos y enfermos. Para estudiar la ubicación espacial de las EV en los tejidos, se usó el cuerpo vítreo del ojo como sistema modelo. El vítreo, situado entre el cristalino y la retina, es un tejido paucicelular ópticamente transparente y con una función biológica poco conocida (Le Goffet al.,"Adult Vitreous Structure and Postnatal Changes",Eye (Lond)22:1214-1222 (2008)). Se han descrito microARN asociados a EV vítreas (Ragusaet al."miRNA Profiling in Vitreous Humor, Vitreal Exosomes and Serum from Uveal Melanoma Patients: Pathological and Diagnostic Implications",Cáncer Biol. Ther.16:1387-1396 (2015)); sin embargo, aún no se han obtenido imágenes ni se han caracterizado las EV vítreas normales. Se planteó la hipótesis de que el vítreo normal posee EV, pero los repetidos intentos de visualizar las nanopartículas mediante microscopía multifotónica, confocal o de campo amplio fracasaron. Por lo tanto, los esfuerzos se centraron en optimizar la fijación tisular. Los métodos de fijación convencionales usan formalina al 10 % para crear reticulaciones proteína-proteína. Las etapas de procesamiento tisular generalmente se produce a temperatura ambiente o por encima; sin embargo, se sabe que las temperaturas elevadas revierten las reticulaciones proteína-proteína de formalina y ARN-proteína (Shiet al.,"Antigen Retrieval In Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues: An Enhancement Method for Immunohistochemical Staining Based On Microwave Oven Heating of Tissue Sections",J Histochem. Cytochem.39:741-748 (1991); Ikedaet al.,"Extraction and Analysis of Diagnostically Useful Proteins from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue Sections",J. Histochem. Cytochem.46:397-403 (1998); Pena,et al."miRNA In Situ Hybridization in Formaldehyde and EDC-Fixed Tissues",Nat. Methods6:139-141 (2009)). Se planteó la hipótesis de que las EV se pierden en los tejidos fijados con formalina durante las etapas de procesamiento y obtención de imágenes. En el presente documento, se muestra que la fijación estándar con formalina da como resultado la pérdida de EV de los especímenes, mientras que la fijación de proteínas con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) retiene las EV y permite obtener imágenes de EVin situ.

El desafío técnico con la obtención de imágenes de EV en tejidos es que los métodos convencionales basados en la fijación con formalina permiten revertir la reticulación y dan como resultado el escape de EV de los tejidos, lo que genera una señal negativa. Sin embargo, la fijación con EDC-formalina mejora significativamente la retención de EV en los tejidos y permite obtener imágenes sólidas de EVin situ.Este método iluminó una red previamente no identificada de EV funcionales en el humor vítreo normal, un tejido que durante mucho tiempo se consideró que tenía pocas funciones biológicas. Además, el vítreo es un modelo potencial para estudiar EV y ECM. Finalmente, esta técnica de fijación puede aplicarse ampliamente con fines de diagnóstico de enfermedades mediadas por EV tales como el cáncer.

Otra limitación técnica para obtener imágenes de EV en tejidos y fluidos es la incapacidad de determinar la localización espacial de las estructuras asociadas a EV. Por ejemplo, los estudios han demostrado que las EV tumorales modifican la motilidad de las células tumorales y aumentan la capacidad de invasividad (Sunget al.,"Directional Cell Movement Through Tissues Is Controlled by Exosome Secretion",Nat Commun6: (2015)). Para estudiar esto, se usó el humor vítreo como sistema modelo para estudiar la localización espacial de las EV. El cuerpo vítreo (vítreo) del ojo se encuentra entre el cristalino y la retina, y es principalmente tejido acelular. El vítreo está compuesto en gran parte por agua y una matriz de gel extracelular de fibrillas de colágeno predominantemente tipo II en asociación con ácido hialurónico. El vítreo se usó como sistema modelo para resolver el dilema de obtener imágenes de EV en fluidos biológicos.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-F son ilustraciones gráficas y fotomicrografías de microscopía electrónica de transmisión (TEM) que ilustran que las EV preparadas para microscopía electrónica de transmisión con fijación con glutaraldehído muestran pocas EV. Sin embargo, una cantidad sustancialmente mayor de EV permanece adherida a la superficie de la rejilla<de microscopía electrónica cuando se usa un reticulante de carbodiimida no reversible. La figura>1<a es un diagrama>esquemático que muestra las etapas necesarias para obtener imágenes basada en glutaraldehído de EV en líquidos usando microscopía electrónica de transmisión (TEM). (i) Para el procedimiento de tinción se usó una rejilla (disco) de cobre recubierta con formvar (círculo de color negro, carga negativa) y poli-L-lisina (círculo, carga positiva), (ii) una solución de EV vítreas bovinas (círculos pequeños, sin carga) se aplicó sobre la superficie de la rejilla de cobre recubierta con formvar y poli-L-lisina. (iii) Se aspiró el exceso de solución de EV y posteriormente la rejilla se fijó con una solución convencional de fijación con glutaraldehído (Glut). Se eliminó la solución Glut; la rejilla se lavó con agua y (iv) las muestras se tiñeron a continuación con varias aplicaciones de acetato de uranilo (UA, contorno circular de color negro) y citrato de plomo antes de (v) la obtención de imágenes por TEM. La figura 1B son fotomicrografías representativas de EV vítreas bovinos aisladas, fijadas a la rejilla de cobre con Glut y una solución de UA y citrato de plomo posterior, que no muestran EV teñidas negativamente a un aumento bajo (izquierda), medio (central) ni alto (derecha). La figura 1C es un diagrama esquemático que representa el protocolo para la fijación de EV basada en EDC a una rejilla de cobre en la que se aplica EDC a las EV antes de la fijación con glutaraldehído en condiciones por lo demás idénticas. La figura 1D son fotomicrografías de TEM representativas de EV vítreas bovinas aisladas después de la fijación con EDC-glutaraldehído, la tinción negativa y la obtención de imágenes por TEM revelan sustancialmente más EV visualizadas a un aumento de baja potencia (izquierda), media (central) y alta (derecha). La figura 1E es una representación gráfica de la media y ± desviación estándar que muestra significativamente más EV contadas por imagen de especímenes fijados con EDC (350 veces), en comparación con las rejillas fijadas con Glut (n = 3, contadas en promedio siete imágenes por réplica biológica), *p <0,05). Figura 1F. Las microfotografías de TEM representativas de EV vítreas bovinas después de la fijación con EDC-glutaraldehído muestran una tinción negativa que rodea el borde de la EV, en contraste con la señal de fondo observada mediante obtención de imágenes con solución salina tamponada con tris (TBS; el tamaño medio de la señal circular para TBS fue <20 nm), lo que demuestra la diferencia entre la tinción negativa verdadera y la tinción positiva falsa. Las barras de escala son (B) panel izquierdo de 600 nm, panel central de 125 nm y panel derecho de 100 nm; (D) panel izquierdo de 3 pm y panel central de 2 pm; y (F) paneles izquierdo y derecho de 100 nm.

Las figuras 2A-E son diagramas esquemáticos que muestran etapas secuenciales para protocolos de fijación con glutaraldehído diseñados para reticular EV con una rejilla de microscopía electrónica. Se supuso que la pérdida de EV se producía en la superficie de la rejilla hacia el líquido aspirado; y el escape de EV se controló y se cuantificó en una rejilla separada usando el protocolo de fijación con EDC no reversible más sólido, tinción negativa y obtención de imágenes por TEM. La figura 2A es un diagrama esquemático que representa una solución que contiene EV procedentes de humor acuoso aisladas (ultracentrifugadas) (burbuja de color gris, solución; círculos pequeños, EV) que se aplicó a una rejilla de TEM recubierta con formvar y poli-L-lisina (izquierda). Después de la incubación, el fluido se aspiró de la rejilla y se recogió para su análisis (centro). El líquido aspirado se aplicó a una rejilla separada; se sometió a una fijación con EDC no reversible, a continuación se tiñó negativamente y se obtuvieron imágenes mediante TEM. Una microfotografía de TEM representativa muestra una cantidad sustancial de EV (puntas de flecha) que se perdieron en el líquido aspirado en la etapa 1 (derecha). Por lo tanto, las EV en solución no lograron adherirse a la superficie de la rejilla de microscopía electrónica. La figura 2B es un diagrama esquemático que muestra la aplicación de la solución de fijación con glutaraldehído (burbuja) a la superficie de la rejilla de la etapa 1 (izquierda). Después de la incubación, el líquido de glutaraldehído se extrae y se recoge para examinarlo (centro). Una microfotografía de TEM representativa muestra una cantidad sustancial de EV (punta de flecha) que se han filtrado a la solución de fijación con glutaraldehído de la etapa 2 (derecha). La figura 2C es un diagrama esquemático que muestra el lavado con agua aplicado a la rejilla de la etapa 2 (izquierda) y, después de la incubación, la solución de lavado con agua recogida (centro) para su examen. Una microfotografía de TEM representativa de la solución recogida de la etapa 3 y aplicada a una rejilla separada, fijada con una solución de EDC y teñida negativamente, muestra grupos de EV perdidos en el lavado (derecha). La figura 2D es un diagrama esquemático que muestra algunos EV (círculo pequeño) que permanecen reticulados en la rejilla usando el protocolo de fijación con glutaraldehído (etapas 1-4, izquierda). La microfotografía de TEM representativa muestra una única EV de humor acuoso bovina que permanece en la rejilla de cobre después de la fijación convencional con glutaraldehído y la tinción negativa (punta de flecha). La figura 2E es un gráfico que representa la media ± desviación estándar del número de EV (porcentaje del total de EV contadas) que se perdieron en el fluido en las etapas 1 y 2, quedando pocas EV en la rejilla (*p <0,05). Las barras de escala son (A) panel derecho de 500 nm; (B) panel derecho de 100 nm; (C) panel derecho de 400 nm; y (D) 400 nm.

Las figuras 3A-C son fotografías de EV de pacientes con glioma. La figura 3A tiene fotografías representativas de EV aisladas (purificadas por ultracentrifugación) de sangre (plasma) de pacientes con glioma después de la reticulación con EDC y la tinción negativa. Las imágenes de TEM muestran numerosas EV de diversos tamaños a bajo aumento (derecha). Las puntas de flecha representan EV con una señal (color negro) rodeando el perímetro de la EV y una señal inferior (color blanco o gris) en el centro. A un mayor aumento (recuadro, marcado con un cuadro), se observa una EV de gran diámetro (rodeada entre cuatro puntas de flecha) con tinción negativa rodeando el perímetro de la EV (derecha). Se resalta una EV más pequeña (punta de flecha). La figura 3B son fotografías de TEM representativas de segundas EV de glioma humano en plasma de un paciente con glioma que muestran EV relativamente más pequeñas (derecha e izquierda, puntas de flecha). La figura 3C son fotografías de TEM representativas de una tercera muestra de plasma de un paciente que muestra EV procedentes de glioma con la acumulación de señal observada alrededor del borde de la EV (izquierda y derecha, punta de flecha). Las barras de escala son (A) panel izquierdo de 500 nm y panel derecho de 150 nm; (B) panel izquierdo de 500 nm y panel derecho de 200 nm; y (C) paneles izquierdo y derecho de 200 nm.

Las figuras 4A-B son vesículas extracelulares aisladas visualizadas en plasma de pacientes pediátricos y adultos sanos normales después de la fijación con EDC y sometidas a obtención de imágenes con microscopía electrónica de transmisión. Las fotografías muestran EV aisladas teñidas negativamente a partir de plasma donado por pacientes adultos y pediátricos sanos y posteriormente fijadas con una solución de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). Las imágenes muestran que hay pocas EV presentes. Las barras de escala son 200 nm (A) y 100 nm (B).

Las figuras 5A-B son vesículas extracelulares aisladas visualizadas en plasma de pacientes con melanoma después de la fijación con EDC y sometidas a obtención de imágenes con microscopía electrónica de transmisión. Las figuras 5A y B son EV aisladas de plasma de un adulto con melanoma y posteriormente fijadas con una solución de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) que muestran numerosas EV teñidas negativamente sometidas a obtención de imágenes mediante TEM. Las barras de escala son 500 nm (A) y 200 nm (B).

Las figuras 6A-D son imágenes de TEM de EV de pacientes con diferentes tipos de cáncer. La figura 6A es una fotografía típica de EV aisladas del líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con neuroblastoma después de la reticulación con EDC y la tinción negativa. Las imágenes de TEM muestran un denso grupo de EV a bajo aumento (derecha). Las puntas de flecha representan EV con una señal (color negro) rodeando el perímetro de la EV y una señal inferior (color blanco o gris) en el centro. La figura 6B muestra un ejemplo típico de la figura 6A a mayor aumento. Se observa una EV de gran diámetro (puntas de flecha dobles) con tinción negativa rodeando el perímetro de la EV (derecha). La figura 6C es una fotografía de TEM representativa de EV aisladas en LCR de un paciente con sarcoma, fijadas con EDC-glutaraldehído, teñidas negativamente y sometidas a obtención de imágenes con TEM. Las imágenes muestran EV de pequeño diámetro (izquierda, punta de flecha) cuando se visualizan a bajo aumento. La figura 6D muestra un ejemplo típico de una muestra similar de la figura 6C a mayor aumento, se observa la acumulación de señal rodeando el borde de las EV procedentes de sarcoma (izquierda, punta de flecha). Las barras de escala son (A) 2 |jm; (B) 500 nm; (C) 250 nm; panel izquierdo y (D) 50 nm.

La figura 7 es una imagen de vesículas extracelulares visualizadas en el líquido aspirado de pezón obtenido de pacientes con un diagnóstico de cáncer de mama después de la fijación con EDC y sometidas a obtención de imágenes con microscopía electrónica de transmisión. El líquido de aspirado de pezón diluido que contiene EV de un adulto con cáncer de mama y posteriormente fijado con una solución de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida muestra<negativamente una>E<v teñida sometida a obtención de imágenes mediante TEM. La barra de escala es de 100 nm.>

Las figuras 8A-C identifican EV con un tinte de ácido nucleico que permite una tinción positiva. La figura 8A contiene fotografías representativas de EV aisladas de humor acuoso bovino fijadas con EDC-glutaraldehído y posteriormente marcadas con UA y citrato de plomo; que muestran numerosas EV teñidas negativamente (punta de flecha) a baja potencia (izquierda) y alta potencia (derecha). Un ejemplo definitivo de una EV teñida negativamente se muestra como la acumulación de señal (color negro) alrededor del perímetro de un objeto redondo y una señal mínima (color blanco) dentro de la EV (figura 8A, derecha). Cuatro puntas de flecha que rodean la EV marcan la vesícula. Se muestran ejemplos de objetos ambiguos teñidos negativamente (flecha), con una señal indeterminada rodeando el perímetro y una señal inferior (color blanco) en el centro; potencialmente una EV de falso positivo. La figura 8B son imágenes de TEM representativas de EV aisladas de humor acuoso bovino después de la fijación con EDC-glutaraldehído y la incubación con un colorante selectivo de ácido nucleico denso en electrones, naranja de acridina (AO). Las imágenes muestran varias EV "teñidas positivamente" con una cantidad sustancial de señal (color negro) dentro de la EV (figura 8B, punta de flecha) con un fondo claro. Se muestran cientos de EV a baja potencia (izquierda). El colorante de AO marca exosomas grandes (puntas de flecha dobles) y pequeños (flecha) con un fondo mínimo (derecha). La figura 8C, a la izquierda, es una fotomicrografía de TEM representativa de EV teñidas negativamente, aisladas del plasma de un paciente con un glioma, fijadas con EDC-glutaraldehído y teñidas con UA y citrato de plomo. La imagen muestra la tinción negativa rodeando el perímetro de una EV de glioma grande (izquierda, flecha doble) y un exosoma más pequeño (izquierda, flecha). La figura 8C a la derecha es una fotomicrografía de TEM representativa que muestra EV de glioma fijadas con EDC-glutaraldehído y marcadas con colorante de AO, que demuestran una tinción positiva dentro de la EV de glioma. Se muestra una EV más grande (flecha doble), así como un exosoma (flecha). Al comparar la tinción negativa (UA y citrato de plomo) y positiva (AO), las EV teñidas con UA y citrato de plomo (figura 8C, izquierda) son similares en tamaño y forma a las EV teñidas con AO (figura 8C, derecha). Las barras de escala son (A-B) panel izquierdo de 1 jm y panel derecho de 200 nm; y (C) paneles izquierdo y derecho de 500 nm.

Las figuras 9A-E demuestran que el humor vítreo bovino y humano contiene vesículas extracelulares. La figura 9A es una fotomicrografía de microscopía electrónica de transmisión representativa de secciones de tejido vítreo bovino teñidas con acetato de uranilo (UA) y citrato de plomo que muestran un número sustancial de EV que son de tamaño pleomórfico (punta de flecha). El recuadro (esquina superior derecha) es una ampliación del cuadro de área delimitada en la esquina inferior derecha y muestra una EV (punta de flecha). La figura 9B es una microfotografía de TEM representativa de EV aisladas de vítreo bovino y teñidas con la tinción de proteína densa en electrones, CSFE, que<representa la morfología de EV y EV grandes (punta de doble flecha). La figura 9C es una fotomicrografía de t>E<m>representativa de EV aisladas de vítreo bovino y teñidas con la tinción de ácido nucleico densa en electrones naranja de acridina (AO) que muestra numerosas EV que son de tamaño pleomórfico (EV más pequeñas marcadas con punta de flecha, EV más grandes con punta de flecha doble) y que llevan una señal de ácido nucleico positiva. La figura 9D es un vítreo bovino montado completo teñido con bromuro de etidio (EtBr), una tinción de ácido nucleico densa en electrones, que muestra múltiples EV (puntas de flecha). La figura 9E es una fotomicrografía de TEM representativa de EV aisladas de vitreo humanopost mortemy teñidas con AO que muestra EV (punta de flecha) con señal de ácido nucleico positiva. Las barras de escala son (A) 100 nm, (B, D-E) 200 nm y (C) 50 nm.

Las figuras 10A-D son fotografías de EV obtenidas en imágenes directamente (es decir, las EV no se aislaron con ultracentrifugación) del humor acuoso de pacientes sanos y muestran que la dilución del fluido biológico es necesaria para reducir la tinción de fondo no específica y mejorar la señal dada por las EV. La figura 10A es una fotografía que representa un fluido biológico, humor acuoso humano, que no se diluyó, aplicado a una rejilla de TEM recubierta con formvar y poli-L-lisina, fijado con EDC-glutaraldehído, teñido negativamente con acetato de uranilo y sometido a obtención de imágenes con TEM. Las fotografías izquierda y derecha muestran un fondo sustancialmente alto (tinción negra difusa) y no hay evidencia de EV fácilmente identificables (panel izquierdo); y posibles EV en el panel derecho. La figura 10B son fotografías (izquierda y derecha) que representan el humor acuoso diluido 1:1 con una solución salina tamponada y muestran un fondo reducido (tinción negra) y una acumulación de tinción negativa, consistente con la morfología de una EV (punta de flecha). La figura 10C (paneles izquierdo y derecho) son fotografías que representan el humor acuoso diluido 1:2 con una solución salina tamponada y que muestran un fondo reducido y EV (punta de flecha). La figura 10D (paneles izquierdo y derecho) son fotografías que representan el humor acuoso diluido 1:5 con una solución salina tamponada y que muestran un fondo reducido y EV (punta de flecha). Las barras de escala son (figura 10A) panel izquierdo de 1 pm y panel derecho de 500 nm; (figura 10B) panel izquierdo de 1 pm y panel derecho de 500 nm; (figura 10C) panel izquierdo y derecho de 1 pm; y (figura 10D) panel izquierdo de 500 nm y panel derecho de 200 nm.

Las figuras 11A-I demuestran que las vesículas extracelulares escapan de los tejidos vítreos bovinos fijados con formalina y se retienen con fijación con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida-formalina. La figura 11A es un diagrama esquemático que muestra tejido vítreo (Vit) fijado con formalina, sumergido en tampón de lavado (sobrenadante) y calentado a 37 °C, lo que da como resultado el escape de las EV (EV, punta de flecha) y colágeno vítreo (figura 11C, flecha cerrada) al sobrenadante. Las figuras 11B-C son fotomicrografías de TEM representativas del sobrenadante recogido de tejido vítreo bovino fijado con formalina después de la incubación a 37 °C y la tinción con acetato de uranilo (UA) y citrato de plomo que muestran evidencia de hebras de colágeno (figura 11C, flecha cerrada) y numerosas EV (punta de flecha) que estaban presentes en el tampón de lavado obtenidas en imágenes a baja (figura 11B) y alta potencia (figura 11C). La figura 11D son fotomicrografías de TEM representativas del sobrenadante recogido de tejido vítreo bovino fijado mantenido a 4 °C y teñido con metales pesados que revelan pocas hebras de colágeno (figura 11C, flecha cerrada), pero pocas EV. Las figuras 11E-F son imágenes del sobrenadante recogido de tejido vítreo fijado con formalina después de la incubación a 25 °C o más que muestran hebras de colágeno (figura 11C, flecha cerrada) y EV (punta de flecha). La figura 11G es un diagrama esquemático que muestra tejido vítreo (Vit) fijado con EDC-formalina, sumergido en tampón de lavado y calentado a 37 °C, lo que dio como resultado la retención de EV (punta de flecha) en el tejido, sin pérdida de EV y con una pérdida mínima de hebras de colágeno vítreo (figura 11C, flecha cerrada) en el sobrenadante. La figura 11H son fotomicrografías de TEM representativas del sobrenadante de tejido vítreo fijado con EDC-formalina después de la incubación a 37 °C y la tinción con metales pesados que muestran pocas hebras de colágeno (figura 11C, flecha cerrada), pero ninguna EV en el sobrenadante. La figura 11I es una imagen representativa de un control de especificidad, solución salina tamponada con tris (TBS) sola, que no muestra fibras de colágeno ni EV en el sobrenadante, pero sí muestra tinción puntiforme no específica de focos densos en electrones (NS, flecha abierta) que miden menos de 20 nm. Las barras de escala son (B) 4 pm, (C, D) 200 nm, (E) 75 nm, (F) 40 nm y (G-H) 200 nm.

Las figuras 12A-J muestran que la fijación con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)-formalina del vítreo bovino retiene vesículas extracelulares, en comparación con la fijación con formalina sola. La figura 12A es una imagen macroscópica de vítreo bovino colocada en una tarjeta de prueba de visión que demuestra la estructura de tipo gel, altamente transparente. La figura 12B es una fotomicrografía de microscopía multifocal (MPM, por sus siglas en inglés) representativa de especímenes de vítreo bovino de montaje completo fijados con formalina sola y teñidos con CFSE para marcar proteínas y Hoechst para marcar núcleos. Se observa la señal de CFSE rodeando los núcleos (panel izquierdo, flecha abierta), pero no en el espacio extracelular (panel derecho, flecha abierta). La tinción de los núcleos no muestra señal extracelular (panel izquierdo, flecha abierta). La figura 12C son fotomicrografías de MPM representativas de vítreo fijado con EDC-formalina y teñido con CFSE y Hoechst. La superposición de la imagen muestra una señal positiva consistente con los cuerpos celulares (punta de flecha abierta) y focos de señal de proteína extracelular (puntas de flecha cerradas) consistentes en tamaño y forma con las EV. La figura 12D es el recuadro de la figura 12C (cuadro de color blanco), muestra múltiples focos intracelulares redondos (panel izquierdo, punta de flecha abierta) que rodean el área de tinciones nucleares (panel derecho, punta de flecha abierta). También se observan numerosas señales de proteínas extracelulares focales (panel izquierdo, puntas de flecha cerradas), consistentes en tamaño y forma con las EV, y no se observa ADN extracelular. La figura 12E es un gráfico que representa la media ± desviación estándar del número de EV por célula vítrea que muestra que el vítreo fijado con EDC-formalina exhibe significativamente más EV que el vítreo fijado con formalina. *p<0,05. La figura 12F es una representación gráfica de la distribución de frecuencia del diámetro EV vítreas bovinas según lo medido por MPM. La figura 12G son fotomicrografías de TEM representativas de secciones de tejido vítreo bovino teñidas con acetato de<uranilo (UA) y citrato de plomo que muestran un número sustancial de>E<v que tienen un tamaño de población>heterogéneo (punta de flecha). El recuadro (esquina superior derecha) es una ampliación del cuadro de área delimitada en la esquina inferior derecha y muestra una EV (punta de flecha). La figura 12H es una microfotografía de TEM representativa de EV aisladas de vítreo bovino y teñidas con la tinción de proteína densa en electrones, CSFE, que representa la morfología de EV, con EV tanto más pequeñas (punta de flecha) como más grandes (punta de flecha doble). Las figuras 121-J son fotomicrografías de TEM representativas de secciones de ojo humanopost mortemteñidas con UA y citrato de plomo que muestran un número sustancial de EV en la matriz extracelular cerca de la base vítrea (Vit), adyacentes al epitelio no pigmentado (NPE) del cuerpo ciliar (EV más pequeñas marcadas con una punta de flecha, EV más grandes con una punta de flecha doble). Las barras de escala son (A) 1 cm, (B) 40 pm, (C) 50 pm y (D) 10 pm, (G) 100 nm, (H) 200 nm, (I) 2 pm, (J) y 100 nm.

Las figuras 13A-B muestran que el humor vitreo bovino y humano contiene una población heterogénea de vesículas extracelulares. La figura 13A es una representación gráfica de la media (línea) ± error estándar (barras) de la concentración de EV de acuerdo con el diámetro de EV, basada en el análisis de seguimiento de nanopartículas de EV aisladas de vítreo bovino. La figura 13B es una representación gráfica de la distribución de frecuencia del diámetro de EV vítreas humanaspost mortemmedido mediante imágenes por TEM.

Las figuras 14A-C ilustran la fijación de vítreo bovino con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida-formalina reteniendo vesículas extracelulares vítreas y ARN extracelularin situ.Las figuras 14A-B son fotomicrografías fluorescentes confocales representativas de especímenes vítreos bovinos de montaje completo fijados con EDC-formalina y teñidos con yoduro de propidio (PI) para marcar ADN y ARN, Hoechst para visualizar ADN y núcleos, y succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) para teñir proteínas. La figura 14A es una superposición de imágenes de vítreo bovino fijado con EDC-formalina que muestra una señal positiva consistente con cuerpos celulares (figura 14A, flecha abierta) y focos de ARN extracelular (punta de flecha cerrada) y proteína extracelular (punta de flecha cerrada) consistentes en tamaño y forma con las EV. La figura 14B es una fotomicrografía fluorescente confocal representativa de vítreo fijado con EDC-formalina que muestra múltiples focos celulares redondos (ambos paneles, punta de flecha abierta) y numerosas señales focales de ARN extracelular (panel izquierdo, punta de flecha cerrada, tinción con PI) y proteína extracelular (panel derecho, punta de flecha cerrada, tinción con CFSE) entre las células. La figura 14C son fotomicrografías representativas de vítreo bovino de montaje completo fijado con formalina sola que muestran señal de ARN (panel izquierdo, punta de flecha abierta, PI) en el núcleo, similar a la tinción de núcleos (panel central, punta de flecha abierta, Hoechst). El vítreo fijado solo con formalina no muestra focos de señal de ARN extracelular (panel izquierdo). La tinción con CFSE muestra una señal de proteína celular (panel derecho, flecha abierta), pero no una señal de proteína extracelular en forma de EV (panel derecho, no se observa tinción puntiforme entre las flechas abiertas). El tamaño celular parece más pequeño en la fijación solo con formalina, presumiblemente debido a una mejor retención de los ARN citoplasmáticos y proteínas con la fijación con EDC-formalina en comparación con la fijación con formalina sola. Las barras de escala son (A) 25 pm, (B,C) 50 pm.

Las figuras 15A-C muestran el tratamiento con RNasa de vítreo bovino fijado con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida-formalina teñido con yoduro de propidio (PI) que muestra una señal de ácido nucleico extracelular reducida. La figura 15A son fotomicrografías fluorescentes de campo amplio y de baja potencia de especímenes de vítreo bovino de montaje completo reticulados con EDC-formalina y teñidos con PI (figura 15A,panel superior) que muestran la señal en el entorno extracelular del tejido vítreo (indicado con una punta de flecha cerrada,recuadro); se muestran núcleos marcados (figura 15A,panel central, Hoechst, e imágenes fusionadas (panel inferior). Los núcleos de células vítreas se tiñen positivamente con PI y Hoechst; se muestran señales colocalizadas (panel inferior, recuadro). Las células se representan con una flecha abierta (figura 15 A,paneles centraleinferior, recuadro) y los focos de señal de PI extracelular están marcados con una punta de flecha cerrada (paneles superioreinferior,recuadro). Los núcleos se tiñeron y no se observa señal de ADN extracelular (panel inferior). La figura 15B son fotomicrografías de vítreo bovino de montaje completo fijado con EDC-formalina y tratado con RNasa A. Las muestras se tiñeron con PI (panel superior), Hoechst (panel central) y se muestran imágenes fusionadas (panel inferior). Las muestras tratadas con RNasa A no muestran evidencia de ARN extracelulares como lo demuestra la falta de señal entre los cuerpos celulares (paneles superioreinferior) y no muestran señal entre dos núcleos celulares (paneles centraleinferior, flechas abiertas Hoechst). La señal de PI para el ARN citoplasmático en las muestras tratadas con RNasa (figura 15B,paneles superioreinferior) parece más pequeña que para las muestras tratadas previamente con RNasa (figura 15A,paneles superioreinferior), presumiblemente debido a que el EDC-formalina retiene más ARN citoplasmático. La figura 15C es una representación gráfica de la media ± desviación estándar de los focos de señal extracelular para tejidos fijados con EDC-formalina teñidos con PI antes del tratamiento con RNasa y después del tratamiento con RNasa que muestra significativamente menos EV después del tratamiento con RNasa, p<0,001. Las barras de escala son (A, B) 50 pm y (recuadro A, recuadro B) 20 pm.

Las figuras 16A-B muestran imágenes de microscopía epifluorescente de campo amplio de la fijación con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida-formalina de vesículas extracelulares vítreas bovinas. Las figuras 16A-B son fotomicrografías fluorescentes de campo amplio y de baja potencia de especímenes de vítreo bovino de montaje completo reticulados con EDC-formalina (figura 16A) o formalina sola (figura 16B). La figura 16A son fotomicrografías representativas de vítreo bovino fijado con EDC-formalina y teñido con CFSE para marcar proteínas (paneles superiorycentral, color blanco) y Hoechst para marcar núcleos (panel inferior) que muestran múltiples focos celulares redondos (todos los paneles, punta de flecha abierta) con numerosas señales de proteínas extracelulares (paneles superiorecentral, punta de flecha cerrada, CSFE, color blanco) consistentes con las EV. La figura 16B son fotomicrografías de vítreo bovino de montaje completo fijado con formalina que solo muestran tinción nuclear (paneles centraleinferior, Hoechst, color azul) con localización conjunta con CFSE (paneles superiorycentral, color blanco), consistentes con ADN celular y ácido nucleico (todos los paneles, punta de flecha abierta), respectivamente. No hay evidencia de señal de proteína extracelular (panel superiorycentral, CSFE, color blanco). El tamaño de las células teñidas con CFSE parece más pequeño en la fijación solo con formalina (figura 16B,panel central, color blanco) en comparación con la fijación con EDC-formalina (figura 16A,panel central, color blanco), presumiblemente debido a que la fijación con EDC-formalina retiene más proteínas celulares pequeñas en comparación con la fijación con formalina sola. Las barras de escala son (A, B) l0o pm.

Las figuras 17A-D ilustran la fijación con EDC-formalina del cáncer de mama metastásico, lo que permite obtener imágenes del ARN extracelular y del ADN extracelular del tumor. Las figuras 17A-B son fotomicrografías de MPM representativas de una línea celular tumoral de carcinoma mamario de ratón 4T1 fijada con EDC-formalina que se trasplantó en la almohadilla de grasa mamaria de un ratón (injerto singénico) que muestran una señal de ARN extracelular en forma de EV en el espacio extracelular (puntas de flecha cerradas). Los tumores se diseccionaron, se fijaron con EDC-formalina y los ácidos nucleicos se marcaron con PI (solo señal de color blanco), el ADN se tiñó (Hoechst) y se capturaron imágenes cerca de la superficie del tumor dentro de la matriz extracelular (figura 17A, derecha). Una imagen superpuesta muestra la señal de una célula (punta de flecha abierta, Hoechst) y numerosos focos de ARN extracelular (punta de flecha cerrada, PI) entre las células consistentes en tamaño y forma con las EV. Las microfotografías muestran una población heterogénea de EV y se destacan una microvesícula pequeña (punta de flecha única, ~270 nm), una microvesícula mediana (punta de flecha doble, ~850 nm) y un cuerpo apoptótico (punta de flecha con asterisco, ~1,7 pm). La figura 17B son fotomicrografías de MPM representativas de un tumor de carcinoma mamario de ratón 4T1 fijado con EDC-formalina que muestran la señal de la célula (punta de flecha abierta, Hoechst) así como la localización conjunta de PI (ARN y ADN) con la tinción de ADN (Hoechst) en el espacio extracelular (punta de flecha cerrada). La figura 17C es una fotografía de microscopía electrónica de transmisión (TEM) representativa de un tumor de carcinoma mamario de ratón 4T1 fijado con EDC-glutaraldehído que muestra una población heterogénea de EV (punta de flecha) adyacentes a una célula (etiquetada, Célula). Se muestran EV más grandes (punta de flecha doble, ~510 nm) y se marca un exosoma (punta de flecha única, ~146 nm). La figura 17D es una fotografía de TEM representativa que muestra una EV (punta de flecha, ~373 nm) conectada a una membrana celular. Las barras de escala son (A, B) 5 pm, (C) 250 nm y (D) 125 nm.

Las figuras 18A-D muestran los resultados inmunohistoquímicos de la tinción de la proteína TSG-101 específica de vesícula extracelular (EV) en un vítreo bovino normal. La figura 18A muestra microfotografías fluorescentes de campo amplio representativas de especímenes de vítreo bovino de montaje completo fijados con formalina y procesados a temperaturas frías que demuestran la tinción inmunohistoquímica para la proteína asociada a EV, TSG-101, en el espacio extracelular (superiorycentral, punta de flecha, Alexa 488). El recuadro (todos los paneles, arriba a la derecha) es una imagen más ampliada del cuadro en el centro (todos los paneles). Los núcleos están marcados con contratinción de Hoechst (superioreinferior, flecha abierta). Se observaron cientos de señales de proteínas extracelulares puntiformes (superiorycentral, Alexa 488). No se observó evidencia de ADN extracelular (inferior, Hoechst). La figura 18B son fotomicrografías representativas de controles de especificidad para inmunohistoquímica TSG-101: Vítreo bovino normal de montaje completo marcado con anticuerpo IgG no específico. El recuadro (todos los paneles, arriba a la derecha) es una imagen más ampliada del cuadro en el centro (todos los paneles). Se observó la señal rodeando los núcleos (superiorycentral, Alexa 488). Las imágenes no muestran evidencia de señal TSG-101 extracelular (superiorycentral).Los núcleos están marcados(superioreinferior, Hoechst). La figura 18C es una representación gráfica de la media ± error estándar para la señal TSG-101 en espacios extracelulares e intracelulares, *p<0,001. La figura 18D muestra una señal positiva para TSG-101 en el espacio extracelular del vítreo fijado con formalina (izquierda, Alexa 488). Los núcleos están marcados con Hoechst (izquierda) y PI (derecha). No hay evidencia de ARN extracelular en muestras fijadas con formalina (derecha, PI). Las barras de escala son (figuras 18A, B) 40 pm y (figura 18A, figura 18B y figura 18D) 10 pm.

Las figuras 19A-B son imágenes de vítreo bovino acelular después de una centrifugación a baja velocidad. Fotomicrografías de luz de baja potencia representativas de vítreo bovino de montaje completo después de una centrifugación a baja velocidad seguida de tinción con hematoxilina y eosina muestran una señal eosinófila compatible con colágeno vítreo (flecha) sin evidencia de núcleos celulares teñidos con hematoxilina. Las barras de escala son de 50 pm.

Las figuras 20A-D muestran que las vesículas extracelulares vítreas humanas y bovinas pueden transferir ARN endógeno a células cultivadas. La figura 20A son imágenes de microfotografía confocal representativas de células epiteliales pigmentarias de retina humana (ARPE-19) después de 24 h de tratamiento con un bolo de EV vítreas bovinas que se marcaron previamente con la tinción de ácido nucleico naranja de acridina (AO). Las imágenes muestran la captación de<a>R<n>de EV marcado en células ARPE-19 (paneles izquierdoyderecho, AO). Los núcleos están marcados (paneles centralyderecho, Hoechst) y una imagen fusionada (panel derecho) muestra la transfección de células ARPE-19, con señal de AO en el citoplasma. La figura 20B es una representación gráfica de la media ± desviación estándar de la eficiencia de transfección (% de células transfectadas) para células ARPE-19 tratadas con EV vítreas bovinas (n = 3, *p<0,05 frente a controles). La figura 20C son fotomicrografías de baja potencia epifluorescentes de campo amplio representativas de células ARPE-19 tratadas con un bolo de 3 h de EV que se aislaron de vítreo humanopost mortemy se marcaron previamente con AO. Las imágenes muestran la transfección de células (panel izquierdo, AO). Se marcaron los núcleos (panel derecho, Hoechst). La figura 20D es una representación gráfica de la media ± desviación estándar de la eficiencia de transfección (% de células transfectadas) para células ARPE-19 tratadas con EV vítreas (n = 3, *p<0,05 frente a controles). Las barras de escala son (figura 20A) 50 |jm, (figura 20C) 15 |jm y (figura 20D) 100 |jm.

Las figuras 21A-F son imágenes y una representación gráfica del suministro de proteína de albúmina sérica bovina (BSA) recombinante y proteína verde fluorescente (GFP) recombinante mediante vesículas extracelulares de vítreo bovino a células epiteliales pigmentarias de retina humana (ARPE-19) cultivadas. La figura 21A es una microfotografía representativa de células ARPE-19 tratadas con un bolo de EV vítreas bovinas que se había cargado previamente con 1 jg de BSA conjugada con fluoresceína mediante electroporación a 300 V que muestran tinción con fluoresceína (izquierda) en el citoplasma. Los núcleos están marcados (centro, tinción con Hoechst) y una imagen fusionada (derecha) muestra una cantidad sustancial de células transfectadas. La figura 21B son fotomicrografías representativas de células ARPE-19 tratadas con un bolo de EV vítreas bovinas que se habían mezclado con BSA-fluoresceína sin electroporación (0 V, control) que no muestran tinción con fluoresceína (izquierda). Los núcleos están marcados (derecha, tinción con Hoechst). La figura 21C es una representación gráfica de la eficiencia de transfección media ± desviación estándar (% de células transfectadas) de células ARPE-19 tratadas con EV vítreas cargadas con 3 jg , 1 jg o 0,5 jg de BSA-fluoresceína mediante electroporación a 300 V, con EV cargadas con 0,5 jg de BSA-fluoresceína sin electroporación (0 V, control), o con PBS solo sin electroporación (0 V, control). *p <0,005 para cada dosis de BSA-fluoresceína cargada a 300 V frente a cada control a 0 V. La figura 21D son fotomicrografías representativas de células ARPE-19 después de la aplicación de un bolo de EV vítreas bovinas que se había cargado previamente con 1 jg de GFP recombinante mediante electroporación a 300 V que muestran tinción positiva para GFP (izquierda) en el citoplasma. Los núcleos están marcados (centro, tinción con Hoechst) y una imagen fusionada (derecha) muestra una cantidad sustancial de células transfectadas. La figura 21E son fotomicrografías representativas de células ARPE-19 después de la aplicación de un bolo de EV vítreas bovinas que se habían mezclado con GFP sin electroporación (0 V, control) que no muestran tinción con fluoresceína (izquierda). Los núcleos están marcados (derecha, tinción con Hoechst). La figura 21F es una representación gráfica de la media ± desviación estándar de la eficiencia de transfección (% de células transfectadas) de células ARPE-19 después de la aplicación de EV cargadas con 1 jg , 0,5 jg o 0,25 jg de GFP mediante electroporación a 300 V o 1 jg de GFP sin electroporación (0 V, control). *p <0,05 para cada dosis de GFP cargada a 300 V frente a cada control a 0 V. Barras de escala (figuras 21A, B, D, E) de 50 jm . n = 3 para todos los experimentos.

Las figuras 22A-D son las imágenes del estudioin vivode EV vítreas bovinas que se dirigen a la retina y suministran proteína recombinante a la retina de ratón. La figura 22A muestra fotomicrografías confocales representativas de secciones de tejido de retina de ratón después de la inyección de una cantidad diluida de EV bovinas (0,25 jg ) cargadas con albúmina sérica bovina (BSA) recombinante conjugada con fluoresceína el día 3 después de la inyección<que muestran una señal en el vítreo que no penetra en la membrana limitante interna. La figura>22<b son>fotomicrografías confocales representativas de una sección de tejido de retina de ratón 3 semanas después de la inyección de EV cargadas con BSA-fluoresceína que muestran una señal en células que atraviesan la capa de células ganglionares (GCL, por sus siglas en inglés), la IPL (capa plexiforme interna) y la OPL (capa plexiforme externa, punta de flecha). El cuadro insertado de la (figura 22B) se muestra con mayor aumento en la figura 22C, lo que demuestra una tinción positiva en un grupo de células en la GCL y la capa de fibras nerviosas de la retina. La figura 22D son fotomicrografías confocales representativas de tejidos de retina de ratón 3 semanas después de la inyección de control de PBS que no muestran señal de fluoresceína. (Figuras 22A-D) Los núcleos se tiñeron con Hoechst (paneles centrales) y las imágenes se fusionaron en lospaneles derechos. Abreviaturas: capa nuclear externa (ONL) y capa nuclear interna (INL). Las barras de escala son (figura 22A) 30 jm , (figura 22B) 50 jm , (figura 22C) 25 jm y (figura 22D) 40 jm .

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un método para fijar vesículas extracelulares. El método de fijación implica proporcionar una muestra que contiene vesículas extracelulares y poner en contacto la muestra con un agente reticulante no reversible en condiciones eficaces para fijar las vesículas extracelulares.

El método de la presente invención puede incluir opcionalmente además poner en contacto la muestra con un fijador que contiene aldehído antes, después o al mismo tiempo que el contacto de la muestra con un agente reticulante no reversible para fijar las vesículas extracelulares. Además, el método puede incluir obtener imágenes de las vesículas extracelulares fijadas

La expresión "vesícula extracelular" se refiere a una partícula membranosa nanométrica secretada por una célula. Las<vesículas extracelulares, también conocidas como>E<v>,<cuerpos multivesiculares y ectosomas, son nanovesículas de>transporte natural que participan en la comunicación intercelular mediante la transferencia de biomoléculas tales como proteínas, lípidos y ARN de una célula a otra. Como se usan en el presente documento, las vesículas extracelulares pueden incluir exómeros, exosomas, cuerpos multivesiculares, vesículas intraluminales (ILV), endosomas multivesiculares (MVE), oncosomas, microvesículas que varían de tamaño de 20-10.000 nm, cuerpos apoptóticos o vesículas que se originan en la membrana endosomal o plasmática.

En un aspecto de la presente invención, las vesículas extracelulares tienen un tamaño de 20 nanómetros a 10.000 nm.

Las vesículas extracelulares son vesículas rodeadas de membranas liberadas por todas las células. Basándose en la vía de biogénesis, se pueden identificar diferentes tipos de vesículas: (1) los exosomas se forman mediante la gemación interna de endosomas tardíos que forman cuerpos multivesiculares (MVB, por sus siglas en inglés) que a continuación se fusionan con la membrana limitante de la célula liberando de manera concomitante los exosomas; (2) las vesículas desprendidas se forman mediante la gemación externa de la membrana celular limitante seguida de fisión; y (3) cuando una célula muere por apoptosis, la célula se desintegra y divide su contenido celular en diferentes vesículas rodeadas de membrana denominadas cuerpos apoptóticos. Estos mecanismos permiten a la célula desechar material de desecho y, más recientemente, también se ha descubierto que están asociados con la comunicación intercelular. Sus constituyentes principales son lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Están compuestos por una bicapa proteína-lípido que encapsula un núcleo acuoso que comprende ácidos nucleicos y proteínas solubles. La identificación del origen de las vesículas extracelulares típicamente se realiza mediante técnicas de caracterización biomolecular para determinar el contenido de proteínas, ácidos nucleicos y lípidos.

Los términos "fijación" y "fijada" se usan de acuerdo con su significado aceptado en la técnica y se refieren al tratamiento químico (típicamente reticulación) de materiales biológicos tales como proteínas y ácidos nucleicos que se puede lograr mediante una amplia diversidad de protocolos de fijación conocidos en la técnica (véase, por ejemplo,Current Protocols In Molecular Biology,Volumen 2, Unidad 14, Frederick M. Ausubulet al.eds., 1995).

Se cree que la fijación con aldehídos del tejido produce proteínas reticuladas. Esta reticulación está mediada por la reacción de grupos aldehído en el fijador con grupos amino en residuos de aminoácidos de proteínas tisulares, tales como lisina y el grupo a-aminoácido del extremo N. El producto inicial de esta interacción es un conjugado aminoaldehído, ya sea una base imino Schiff (CHR<1>= NR<2>R<3>) o un intermedio amino-metilol (CHR<1>OHNR<2>R<3>). A continuación, el intermedio puede someterse a un ataque nucleófilo por grupos de aminoácidos adyacentes susceptibles, tales como carbonos de a-carbonilmetileno que tienen un protón ácido, heteroátomos nucleófilos o anillos aromáticos ricos en electrones. Los nucleófilos principales incluyen anillos aromáticos tales como la posiciónortodel anillo de fenol de la tirosina, la posición C-2 del anillo de indol de triptófano, y el anillo de imidazol de histidina; los carbonos a adyacentes a los grupos de ácido carboxílico de cadena lateral de glutamato y aspartato; heteroátomos básicos tales como grupos lisil £-amino; y átomos de nitrógeno neutros tales como grupos asparaginilo y glutaminilamida y el nitrógeno del anillo indol de triptófano. Desde el punto de vista formal, todas estas reacciones son tipos de, o al menos similares a, las reacciones de Mannich, al menos en la medida en que el electrófilo reactivo es la especie conjugada amino-aldehído intermedia. Estas reacciones dan como resultado un enlace covalente entre el carbono del aldehído electrófilo y un carbono o heteroátomo nucleófilo.

La reticulación resultante fija las proteínas en una conformación particular y fija todo el tejido formando enlaces covalentes entre proteínas adyacentes. Las proteínas reticuladas resisten la penetración de macromoléculas tales como los anticuerpos. Además, la modificación química de los epítopos (que contienen residuos de amina, amida o aminoácidos aromáticos) produce una estructura alterada irreconocible para un anticuerpo contra ese epítopo.

El fijador de aldehído más común es el formaldehído, que es unifuncional y produce reticulación por contacto directo entre los grupos metilol-amino de la lisina y los residuos de aminoácidos diana susceptibles adyacentes. Sin embargo, se conocen otros aldehídos reticulantes difuncionales o polifuncionales. De estos, el más común es el glutaraldehído, una cadena de cinco carbonos con aldehídos en ambos extremos. Este reactivo difuncional proporciona oportunidades adicionales para la reticulación, ya que la cadena alquilo del reactivo funciona como un espaciador. Se cree que el mecanismo de reacción es similar, independientemente del reactivo de aldehído particular usado para la fijación.

Las reticulaciones conservan la morfología y la integridad del tejido, lo endurecen para el corte y empalme e inhiben el ataque microbiano. La química de la reticulación de aminoácidos y proteínas mediante formaldehído se conoce bien en la técnica y se describe en Harlan y Feairheller, "Chemistry of the Cross-Linking of Collagen During Tanning", y Kelly,et al."Cross-Linking of Amino Acids By Formaldehyde", (1976). El papel de las reacciones de tipo Mannich en la reticulación de grupos amino de proteínas y aminoácidos aromáticos con formaldehído se analiza en Fraenkel-Conrat,et al., J. Biol. Chem.168:99-118 (1947), y Fraenkel-Conratet al., Biol. Chem.174:827-843 (1948). Se encuentran análisis adicionales sobre reacciones de reticulación con aldehído en Fox,J. Histochem. Cytochem.

33:845-855 (1985); Jones, "Reactions of Aldehyde with Unsaturated Fatty Acids During Histological Fixation", en P. J. Stoward, ed.Fixation in Histochemistry,(1973); y Kunkelet al., Mol. Cell. Biochem.34:3 (1981). Las reacciones de tipo Mannich se describen en general en March, "Advanced Organic Chemistry", particularmente en 333.424, 670-672 (1968). Véase la Patente de EE.UU. N.° 5.578.452.

Las muestras fijadas con el método de la presente invención se pueden teñir además para mejorar la obtención de imágenes de la muestra, como es común y bien conocido en la técnica. Se describen tinciones de ejemplo y sus usos comunes, a modo de ejemplo: Compuesto monazo Janus Green B usado para teñir fosfoinosítidos; compuesto disazo ponceau S para teñir proteínas; sal de diazonio Fast red TR para detectar la actividad de esterasa, sal de diazonio Fast blue RR para detectar la actividad de fosfatasa alcalina, esterasa y p-glucouronidasa; compuesto de arilametano Fast green<f>C<f>para teñir y cuantificar colágeno y otras proteínas; compuesto de arilmetano Coomasie azul brillante R250 para teñir proteínas, compuesto de arilmetano aldehído fucsina para teñir proteínas ricas en cisteína y glucoproteínas sulfatadas; hidroxitrifenilmetano; ácido aurín tricarboxílico para la detección de aluminio; compuesto de xanteno eosina Y para la tinción de proteínas; compuesto de xanteno rodamina B para la tinción de queratina y lípidos; compuesto de xanteno pironina Y para detectar la presencia de ARN y ADN y tinción de fosfolípidos; compuesto de xanteno, isotiocianato de fluoresceína, para la reacción con grupos nucleófilos, por ejemplo, grupos amino, hidroxilo y tiol, particularmente grupos reactivos en proteínas y ácidos nucleicos; colorante de acridina, acriflavina, para detectar glucosaminoglucanos sulfatados; compuesto de acridina, naranja de acridina, para teñir ADN y ARN y también gránulos de almidón; compuesto de acridina, fosfina, para la tinción de lípidos y ácidos mucopolisacáridos; compuesto de acridina, quinacrina, para la tinción de ácidos nucleicos; compuesto de fenantridina, bromuro de etidio, para la detección de ácidos nucleicos, particularmente ácidos nucleicos bicatenarios; el compuesto de azina, nigrosina WS, para la detección de proteínas; compuesto de azina, rojo neutro, para la detección de ácidos nucleicos y estructuras lipídicas; compuesto de azina, safranina-O, para la detección de proteoglucanos y glucosaminoglucanos; compuesto de oxazina, rojo del Nilo, para la tinción de lípidos; compuesto de oxazina, galocianina y alumbre de cromo, para la detección de ADN y ARN; compuesto de oxazina, azul del Nilo, para teñir lípidos y compuestos hidrófobos, incluyendo ADN; compuesto de oxazina, azul del Nilo, para teñir lípidos y compuestos hidrófobos, incluyendo ADN; compuesto de tiazina, azure B, para detectar ADN, ARN y mucina (es decir, glucoproteínas altamente glucosiladas); compuesto de tiazina, azul de toluidina, para la tinción de mucinas sulfatadas y proteínas amiloides; compuesto de polieno, calcofluor blanco M2R, para la tinción de quitina y celulosa; compuesto de polieno fluoro-oro, para la detección de ADN y mucopolisacáridos; compuesto de polimetina YO-PRO-1 para la tinción de ADN; compuestos de polimetina DiO, DiI, DiD para la tinción de membranas lipídicas; compuestos de bencimidazol DAPI y Hoechst 33342 para la tinción de ácidos nucleicos; compuesto de tiazol, naranja de tiazol, para la tinción de ácidos nucleicos; compuesto de tiazol, tioflavina T, para la tinción de proteínas amiloides; compuestos flavonoides, hematoxilina y hemateína, y derivados de los mismos que tiñen ácidos nucleicos, fosfolípidos, almidón, celulosa y proteínas musculares; compuesto carbonílico, éster indoxílico y sus derivados para detectar actividades esterasa y gliosidasa; compuesto de antraquinona, rojo de alizarina S, para detectar calcio, particularmente en tejidos calcificados; compuesto de ftalocianina, luxol fast blue MBS, para detectar mielina; compuestos de ftalocianina, azul cuprolínico para teñir ARN y glucosaminoglucanos, y azul alcián 8G para glucosaminoglucanos; tetraóxido de osmio para la tinción de lípidos, incluidas grasas y colesteroles; yodo para la tinción diferencial de almidón, glucógeno y proteínas; ditiooxamida y pdimetilaminobencilidenrodamina para el ensayo de cobre, por ejemplo, para detectar anomalías fisiológicas del metabolismo del cobre; tetraciclina y sus derivados para detectar la presencia de calcio; y diaminobencidina para detectar oxidasas, tales como peroxidasa y catalasa.

Como apreciarán los expertos en la técnica, los compuestos y colorantes tienen aplicaciones para revelar estructuras en células y tejidos además de reacciones con compuestos identificados. La unión de reactivos a estas estructuras celulares y tisulares puede tener lugar a través de diversos componentes dentro del espécimen (por ejemplo, tinción heterocromática) en lugar de a través de un único constituyente celular. Estos colorantes y sus usos se conocen bien en la técnica y se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° US2008/0070324.

En una realización de la presente invención, la muestra que se trata con la presente invención para la fijación de vesículas extracelulares, es un fluido o tejido biológico.

En un aspecto de la presente invención, la muestra es un fluido o tejido biológico. Las muestras de fluidos biológicos preferidas se seleccionan de productos sanguíneos, soles, suspensiones, geles, coloides, fluidos, líquidos, plasmas, sólidos plásticos, suspensión, geles, leche materna, líquido de aspirado de pezón, orina, semen, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, vítreo, humor acuoso, líquido sinovial, linfa, bilis, saliva, bilis, cerumen (cera de oído), quilo, quimo, endolinfa, perilinfa, exudados, heces, eyaculación, ácido gástrico, jugo gástrico, mucosidad, líquido pericárdico, líquido peritoneal, pus en líquido pleural, legañas, sebo (aceite de la piel), fluido seroso, esmegma, esputo, sudor, lágrimas, secreción vaginal, desechos quirúrgicos y vómitos. Las muestras de fluido biológico más preferibles son el humor vítreo o acuoso, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido de aspirado de pezón y productos sanguíneos. En otra realización preferible de la invención, la muestra de fluido biológico es un producto sanguíneo seleccionado del grupo que consiste en sangre entera, plasma sanguíneo, plaquetas sanguíneas y suero sanguíneo.

En un aspecto adicional de la presente invención, la muestra de tejido biológico es un tejido seleccionado de piel, hueso, cartílago, tendón, ligamento, disco vertebral, córnea, lente, menisco, pelo, músculo estriado, músculo liso, músculo cardíaco, tejido adiposo, tejido fibroso, tejido neuronal, tejido conjuntivo, cóclea, testículos, ovario, estómago, pulmón, corazón, hígado, páncreas, riñón, intestino y ojo.

En una realización de la presente invención, el agente reticulante no reversible usado para fijar las vesículas extracelulares se selecciona del grupo que consiste en una carbodiimida soluble en agua, haluro de cianógeno y mezclas de los mismos. Preferentemente, el agente reticulante no reversible es un haluro de cianógeno seleccionado de bromuro de cianógeno, fluoruro de cianógeno, cloruro de cianógeno y yoduro de cianógeno. Mucho más preferentemente, el agente reticulante no reversible es 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida.

Adicionalmente, la invención puede incluir opcionalmente la fijación de vesículas extracelulares con un agente reticulante adicional, independientemente de, y antes, después o al mismo tiempo que se pone en contacto la muestra con el agente reticulante no reversible y el fijador que contiene aldehído. Los agentes reticulantes de ejemplo incluyen di(met)acrilato de etilenglicol, diacrilato de etilenglicol, diacrilato de di(etilenglicol), diacrilato de tetra(etilenglicol), dimetacrilato de etilenglicol, dimetacrilato de di(etilenglicol), dimetacrilato de tri(etilenglicol), derivados de metilenbisacrilamida, N,N-metilenbisacrilamida, N,N-metilenbisacrilamida, N,N(1-,2-dihidroxietileno)bisacrilamida, agentes reticulantes sin formaldehído, N-(1-hidroxi-2,2-dimetoxietil)acrilamida, divinilbenceno, fijadores de formalina, formal calcio, formal solución salina, formalina de cinc (sin tampón), fijador de Zenker, fijador de Helly, fijador B-5, solución de Bouin, solución de Hollande, solución de Gendre, solución de Clarke, solución de Carnoy, Methacarn, formalina alcohólica y alcohol formol acético.

En un aspecto adicional de la presente invención, la obtención de imágenes de las vesículas extracelulares fijadas puede realizarse mediante microscopía electrónica de transmisión, microscopía electrónica de barrido, microscopía crioelectrónica, microscopía estereoscópica binocular, microscopía de campo amplio, microscopía de polarización, microscopía de contraste de fases, microscopía multifotónica, microscopía de contraste de interferencia diferencial, microscopia de fluorescencia, microscopía confocal de barrido láser, microscopía de excitación multifotónica, microscopía de rayos, microscopía ultrasónica, ensayo métrico de color, quimioluminiscencia, espectrofotometría, tomografía por emisión de positrones, tomografía computarizada o imágenes por resonancia magnética.

Los tres tipos de microscopio electrónico comúnmente usados generan imágenes a través de diferentes mecanismos de contraste (Ruska, E., "The Development of the Electron Microscope and of Electron Microscopy",Nobel Lectures, Physics1981-1990 (1986); Reimeret al., Transmission Electron Microscopy: Physics of Image Formation,Springer (2008); Bozzolaet al., Electron Microscopy,Jones y Bartlett (1992)). En la TEM, un haz de electrones estacionario y extendido con una energía de entre 60 y 300 keV irradia una muestra que es más fina (a menudo mucho más fina) de 0,5 |jm. La muestra modifica la fase y amplitud de los electrones transmitidos, de modo que la imagen resultante contiene información sobre la muestra. En la TEM de barrido (STEM), la imagen se registra explorando un haz enfocado sobre la muestra y detectando los electrones transmitidos píxel por píxel. La microscopía electrónica de barrido (SEM) explora un haz enfocado, típicamente con energía entre 500 eV y 30 keV, sobre la superficie de una muestra (a granel), recogiendo electrones retrodispersados o secundarios píxel por píxel. Todos los microscopios electrónicos requieren vacío, tanto para permitir el funcionamiento de la fuente de electrones como para minimizar la dispersión fuera de la muestra. Por lo tanto, las muestras deben ser estables al vacío y, por eso, tradicionalmente se preparan en estado sólido. Sin embargo, se han logrado avances recientes en la obtención de imágenes de muestras de fluidos, lo que se divulga en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2012/0120226. Además, el uso de obtención de imágenes mediante microscopía, fotometría y tomografía se conoce bien en la técnica y se divulga en las Patentes de EE.UU. N.°: 6.831.781 y 5.205.291; así como las Publicaciones de Solicitudes de Patente de EE.UU. N.°: 2009/0091566 y 2012/0208184; y las Solicitudes WO N.° WO2006022342 y WO2012135961.

En una realización de la presente invención, la detección de las vesículas extracelulares fijadas con un agente reticulante no reversible y, opcionalmente, un fijador que contiene aldehído en la muestra biológica se basa en la obtención de imágenes. Además, la muestra biológica puede ser una muestra clínica. La muestra clínica puede ser de un paciente tratado con un fármaco clínico. Adicionalmente, el método de la invención incluye diagnosticar si el sujeto que proporciona la muestra clínica tiene una enfermedad o trastorno basándose en la obtención de imágenes de las vesículas extracelulares fijadas. El paciente puede incluir, pero sin limitación, mamíferos tales como seres humanos, animales, gatos, perros, vacas, ovejas, cabras y caballos.

En otro aspecto de la presente invención, la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en cáncer, enfermedades inflamatorias, infecciones, enfermedades degenerativas, enfermedades causadas por patógenos, enfermedades y trastornos neurológicos y disfunciones internas. En una realización preferida, la enfermedad o trastorno es una disfunción interna seleccionada del grupo que consiste en glaucoma y otras enfermedades oculares.

Los trastornos de glaucoma y las enfermedades oculares que se pueden detectar con la presente invención como se describe en el presente documento incluyen, pero sin limitación, preglaucoma de ángulo abierto con hallazgos límite, ángulo abierto, bajo riesgo, ángulo estrecho anatómico sospechoso de primario de ángulo cerrado, sensible a esteroides, hipertensión ocular, primario de ángulo cerrado sin daño de glaucoma (pas o iop alta sin pérdida de nervio óptico o campo visual), glaucoma de ángulo abierto no especificado, glaucoma primario de ángulo abierto, glaucoma crónico simple, glaucoma por tensión baja, glaucoma pigmentario, glaucoma capsular con pseudoexfoliación del cristalino, etapa residual de glaucoma de ángulo abierto, glaucoma de primario de ángulo cerrado no especificado, ataque de glaucoma de ángulo cerrado agudo, glaucoma de ángulo cerrado crónico, glaucoma de ángulo cerrado intermitente, etapa residual de glaucoma de ángulo cerrado, glaucoma secundario a traumatismo ocular, glaucoma secundario a inflamación ocular, glaucoma secundario a otros trastornos oculares que incluyen oclusiones vasculares de la retina, diabetes tipo 1 complicada, diabetes tipo 2 complicada, trastornos del cristalino, trastornos del cristalino intraocular, trastornos posteriores a otros síntomas oculares, neoplasias, neoplasias benignas o neoplasia maligna. También se incluyen el glaucoma secundario a fármacos, glaucoma con aumento de la presión venosa epiescleral, glaucoma por hipersecreción, glaucoma maligno por mala dirección acuosa, glaucoma en enfermedades clasificadas en otra parte, glaucoma congénito, anomalía de axenfeld, buftalmos, glaucoma de la infancia, glaucoma del recién nacido, hidroftalmos, queratoglobo, glaucoma congénito macrocomea con glaucoma, macroftalmos en glaucoma congénito, megalocórnea con glaucoma y glaucoma absoluto. También se incluyen los efectos adversos de los fármacos y preparados oftalmológicos, conjuntivitis folicular aguda, los efectos adversos de los inhibidores de la anhidrasa carbónica y los efectos adversos de la dosificación insuficiente de fármacos y preparados oftalmológicos.

En la determinación de enfermedades y trastornos, las vesículas extracelulares permanecen intactas y enteras. Al observar las vesículas extracelulares fijadas mediante cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, se pueden usar el tamaño, la morfología, la densidad y cualquier posible recubrimiento de las vesículas para determinar si una muestra proporcionada por un sujeto tiene una enfermedad o trastorno.

En una realización adicional de la presente invención, la enfermedad o trastorno es una disfunción interna caracterizada por una inmunodeficiencia o hipersensibilidad. Las inmunodeficiencias o hipersensibilidades preferidas incluyen artritis reumatoide, artrosis, artritis psoriásica, psoriasis, dermatitis, polimiositis/dermatomiositis, necrólisis epidérmica tóxica, esclerodermia sistémica, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, afecciones alérgicas, eccema, asma, lupus eritematoso (LES), esclerosis múltiple, encefalomielitis alérgica, sarcoidosis, granulomatosis (incluyendo granulomatosis de Wegener), agranulocitosis, vasculitis (incluyendo ANCA), anemia aplásica, anemia de Blackfan-Diamond, anemia hemolítica inmune, anemia perniciosa, aplasia pura de glóbulos rojos (PRCA, por sus siglas en inglés), deficiencia en factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmunitaria, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican la diapédesis leucocitaria, síndrome de lesión multiorgánica, miastenia gravis, enfermedades mediadas por complejos antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, neuritis alérgica, enfermedad de Bechet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, rechazo al trasplante de órganos sólidos, enfermedad de injerto contra huésped (GVDH, por sus siglas en inglés), penfigoide ampolloso, pénfigo, poliendocrinopatías autoinmunitarias, enfermedad de Reiter o síndrome de Guillain-Barré.

En otra realización de la presente invención, la enfermedad o trastorno diagnosticado basándose en la obtención de imágenes de las vesículas extracelulares fijadas con un agente reticulante no reversible y un fijador que contiene aldehído es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en leucemia granulocítica aguda, leucemia linfocítica aguda (ALL, por sus siglas en inglés), leucemia mielógena aguda (AML, por sus siglas en inglés), adenocarcinoma, adenosarcoma, cáncer suprarrenal, carcinoma adrenocortical, cáncer de ano, astrocitoma anaplásico, angiosarcoma, cáncer de apéndice, astrocitoma, carcinoma de células basales, linfoma de linfocitos B, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer de médula ósea, cáncer de intestino, cáncer de cerebro, glioma del tronco encefálico, tumor cerebral, cáncer de mama, tumores carcinoides, cáncer de cuello del útero, colangiocarcinoma, condrosarcoma, leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en inglés), leucemia mielógena crónica, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craneofaringioma, linfoma cutáneo, melanoma cutáneo, astrocitoma difuso, carcinoma ductalin situ(DCIS, por sus siglas en inglés), cáncer de endometrio, ependimoma, sarcoma epitelioide, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing, cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer ocular, cáncer de las trompas de Falopio, fibrosarcoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, cáncer gastrointestinal, cáncer carcinoide gastrointestinal, tumores del estroma gastrointestinal (GIST, por sus siglas en inglés), tumor de células germinales, enfermedad trofoblástica gestacional, glioblastoma multiforme (GBM, por sus siglas en inglés), glioma, tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, hemangioendotelioma, linfoma de Hodgkin, enfermedad de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, carcinoma ductal infiltrante (IDC, por sus siglas en inglés), carcinoma lobulillar infiltrante (ILC, por sus siglas en inglés), cáncer de mama inflamatorio (IBC, por sus siglas en inglés), cáncer de intestino, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de mama invasivo/infiltrante, cáncer de células de los islotes, cáncer de mandíbula, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leiomiosarcoma, metástasis leptomeníngeas, leucemia, cáncer de labios, liposarcoma, cáncer de hígado, carcinoma lobulillarin situ,astrocitoma de bajo grado, cáncer de pulmón, cáncer de ganglios linfáticos, linfoma, cáncer de mama masculino, carcinoma medular, meduloblastoma, melanoma, meningioma, carcinoma de células de Merkel, condrosarcoma mesenquimal, mesenquimatoso, mesotelioma, cáncer de mama metastásico, melanoma metastásico, cáncer de cuello escamoso metastásico, gliomas mixtos, cáncer de boca, carcinoma mucinoso, melanoma de mucosas, mieloma múltiple, micosis fungoide, síndrome mielodisplásico, cáncer de la cavidad nasal, cáncer nasofaríngeo, cáncer de cuello, neuroblastoma, tumores neuroendocrinos (NET, por sus siglas en inglés), linfoma no Hodgkin (NHL, por sus siglas en inglés), cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de células en avena, cáncer ocular, melanoma ocular, oligodendroglioma, cáncer bucal, cáncer de la cavidad oral, cáncer orofaríngeo, sarcoma osteogénico, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinales ováricas, carcinoma peritoneal primario de ovario, tumor del estroma del cordón sexual de ovario, enfermedad de Paget, cáncer de páncreas, carcinoma papilar, cáncer de seno paranasal, cáncer paratiroideo, cáncer de pelvis, cáncer de pene, cáncer de nervio periférico, cáncer peritoneal, cáncer de faringe, feocromocitoma, astrocitoma pilocítico, tumor de la región pineal, pineoblastoma, tumores de hipófisis, linfoma primario del sistema nervioso central (SNC), cáncer de próstata, cáncer rectal, carcinoma de células renales, cáncer de pelvis renal, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma, sarcoma (hueso), sarcoma (tejido blando), sarcoma (útero), cáncer sinusal, cáncer de piel, cáncer de pulmón microcítico (SCLC, por sus siglas en inglés), cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, cáncer vertebral, cáncer de columna vertebral, cáncer de médula espinal, tumor espinal, carcinoma escamocelular, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, linfoma de linfocitos T, cáncer de testículos, cáncer de garganta, timoma/carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de lengua, cáncer de amígdalas, cáncer de células transicionales (vejiga), cáncer de células transicionales (riñón), cáncer de células transicionales (ovario), cáncer de mama triple negativo, cáncer de trompas, carcinoma tubular, cáncer no diagnosticado, cáncer del uréter, adenocarcinoma de útero, cáncer de útero, sarcoma de útero, cáncer de vagina y cáncer de vulva. En una realización más preferible, el cáncer es cáncer ocular.

En una realización adicional, la enfermedad o trastorno diagnosticado basándose en la obtención de imágenes de las vesículas extracelulares fijadas con un agente reticulante no reversible y, opcionalmente, un fijador que contiene aldehído es una enfermedad neurológica seleccionada del grupo que consiste en enfermedades desmielinizantes, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Creutzfeld-Jakob, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Wilson, atrofia muscular espinal, enfermedad de cuerpos de Lewy, ataxia de Friedreich, autismo, trastornos del espectro autista, densidad sináptica asociada con la enfermedad y esclerosis lateral amiotrófica (ALS, por sus siglas en inglés).

En otra realización más, la enfermedad o trastorno que se diagnostica incluye trastornos neurológicos tales como trastornos relacionados con el abuso de sustancias, trastornos por consumo de alcohol, trastornos por consumo de anfetaminas, trastornos por consumo de cannabis, trastornos inducidos por cafeína, trastornos por consumo de cocaína, trastornos por consumo de inhalantes, trastornos por consumo de opioides, trastornos por alucinógenos, trastornos por consumo de sedantes, consumo de hipnóticos o consumo de ansiolíticos, trastornos por consumo de múltiples sustancias, disfunciones sexuales, trastorno de la excitación sexual, trastorno eréctil masculino, trastorno hipoactivo masculino, trastorno hipoactivo femenino, trastornos de la conducta alimentaria, trastorno por sobreingesta, bulimia nerviosa, anorexia nerviosa, ansiedad, síndromes de trastorno obsesivo compulsivo, ataques de pánico, trastorno de estrés postraumático, agorafobia, conducta obsesiva-compulsiva, trastornos del control de los impulsos, ludopatía, trastorno explosivo intermitente, cleptomanía, piromanía, trastornos de la personalidad, trastorno de personalidad esquizoide, trastorno de personalidad paranoica, trastorno de personalidad esquizotípico, trastorno límite de la personalidad, trastorno de personalidad narcisista, trastorno de personalidad histriónica, trastorno de personalidad obsesiva-compulsiva, trastorno de personalidad evasiva, trastorno de personalidad dependiente y trastorno de personalidad antisocial, subtipos de esquizofrenia, trastorno esquizoafectivo, esquizofrenia indiferenciada, trastorno delirante, trastorno ciclotímico, trastorno somatomorfo, hipocondriasis, trastorno disociativo y trastorno de despersonalización.

En otra realización de la presente invención, la enfermedad o trastorno diagnosticado basándose en la obtención de imágenes de las vesículas extracelulares fijadas con un agente reticulante no reversible y, opcionalmente, un fijador que contiene aldehído es una cardiopatía.

Otro aspecto de la invención incluye el diagnóstico de una enfermedad o trastorno realizando dos o más ensayos para marcadores de enfermedad.

Las infecciones de ejemplo que pueden diagnosticarse incluyen la proteína de la matriz de la gripe A, H3N2 de la gripe, H1N1 de la gripe (estacional), H1N1 de la gripe (novedosa), gripe B,Streptococcus pyogenes(A),Mycobacterium Tuberculosis, Staphylococcus aureus(MR),Staphylococcus aureus(RS),Bordetella pertussis(tos ferina),Streptococcus agalactiae(B), H5N1 de la gripe, H7N9 de la gripe, adenovirus B, adenovirus C, adenovirus E, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis delta,Treponemapallidum,HSV-1, HSV-2, HIV-1, HIV-2, dengue 1, dengue 2, dengue 3, dengue 4, malaria, virus del Nilo occidental, virus del Ébola, virus de Marburgo, cuevavirus,Trypanosoma cruzi(Chagas),Klebsiella pneumoniae (Enterobacteriaceaespp),Klebsiella pneumoniae carbapenemase(KPC), virus de Epstein Barr (mono), rhinovirus, virus de la parainfluenza (1), virus de la parainfluenza (2), virus de la parainfluenza (3), virus de la parainfluenza (4a), virus de la parainfluenza (4b), virus respiratorio sincitial (VRS) A, virus respiratorio sincitial (VRS) B, coronavirus 229E, coronavirus HKU1, coronavirus OC43, coronavirus NL63, nuevo coronavirus, bocavirus, metapneumovirus humano (HMPV),Streptococcus pneumoniae(R a penic.),Streptococcus pneumoniae(S),Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Bordetella parpertussis, Haemophilus influenzae(R a ampic.),Haemophilus influenzae(S a ampic.),Moraxella catarrhalis, Pseudomonasspp (aeruginosa),Haemophilus parainfluenzae,Enterobacter cloacae(Enterobacteriaceaespp),Enterobacter aerogenes(Enterobacteriaceaespp),Serratia marcescens(Enterobacteriaceaespp),Acinetobacter baumanii,Legionella spp.,Escherichia coli,Candida,Chlamydia trachomatis,virus del papiloma humano,Neisseria gonorrhoeae, plasmodiumyTrichomonas(vagina).

En una realización, el diagnóstico incluye proporcionar una imagen estándar de una muestra clínica que contenga vesicales extracelulares fijadas con un agente reticulante no reversible. Esta imagen es de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno particular. A continuación, la imagen se usa en comparación con la imagen de la muestra clínica del sujeto. Las vesículas extracelulares fijadas de las que se obtienen imágenes se comparan en cuanto a tamaño, densidad, morfología y/o distribución espacial. A continuación, esta comparación se usa para determinar si el sujeto tiene la enfermedad o trastorno particular. Opcionalmente, este método puede incluir además poner en contacto todas las muestras con un fijador que contiene aldehído antes, después o al mismo tiempo que el contacto de las muestras con un agente reticulante no reversible para fijar las vesículas extracelulares. Adicionalmente, el método puede incluir además la administración de un agente terapéutico al sujeto basándose en la etapa de determinar si el sujeto tiene la enfermedad o trastorno particular.

Las EV, tales como exómeros, exosomas, ectosomas (aquí denominados microvesículas, MV) y los cuerpos apoptóticos, existen en diversos tamaños, y sus características tales como tamaño, morfología, concentración y localización espacial se pueden utilizar para la caracterización de las EV. Las variaciones en la morfología de las EV pueden representar condiciones normales o patológicas, y los métodos que permiten una caracterización fiable de las propiedades de las EV pueden ayudar a determinar el origen de la EV. La primera etapa es determinar si la obtención de imágenes de EV se puede usar como un biomarcador fiable. Es importante diferenciar las EV procedentes de pacientes sanos y las EV presentes en enfermedades. En el presente documento, se muestra que el plasma de múltiples pacientes con glioma contiene numerosas EV que se agrupan en grupos con materiales densos en electrones circundantes, como se muestra en la figura 3A-C. Esta morfología y localización espacial de las EV en relación entre sí es sustancialmente diferente a la morfología y el tamaño de las EV aisladas del plasma de pacientes de control sanos en la figura 4A-B. En los pacientes de control sanos, las EV se observaron con menos frecuencia y sin agrupamiento. Estos datos sugieren que las EV procedentes de una enfermedad difieren del control sano, lo que sugiere que este método se puede usar como diagnóstico para identificar la enfermedad con respecto a lo normal.

Otra cualidad importante de una posible prueba de biopsia líquida es diferenciar una enfermedad de otra. Se plantea la hipótesis de que la morfología, el tamaño y la localización espacial de las EV podrían facilitar el diagnóstico de enfermedades. Para probar esto, se examinaron diversas neoplasias malignas, se visualizaron las EV aisladas del plasma y se comparó su morfología. En pacientes con melanoma sistémico, se observó una señal densa en electrones que se asemeja a las EV (figura 5A-B); aunque con una morfología diferente en comparación con las EV de pacientes con glioma (figura 3A-C) o controles sanos (figura 4A-B). Además, se analizaron otros cánceres y otros fluidos, como líquido cefalorraquídeo, para determinar si la morfología de las EV difería en diversas enfermedades. Por lo tanto, se extrajeron muestras del líquido cefalorraquídeo de pacientes con diagnóstico de neuroblastoma y sarcoma; se obtuvieron imágenes de las EV mediante fijación con EDC-glutaraldehído y fue posible identificar EV en ambos trastornos (figura 6A-D). Los datos muestran que las EV obtenidas en imágenes de pacientes con neuroblastoma<contienen EV grandes que están agrupadas. Sin embargo, cuando se visualizaron las>E<v del líquido cefalorraquídeo>de pacientes con sarcoma, las EV eran más pequeñas que las observadas en el LCR de neuroblastoma. Estos datos implican que la morfología de las EV difiere en cada biopsia líquida ensayada para detectar diversos cánceres. Se espera que el método de fijación con EDC-glutaraldehído sea ampliamente aplicable para obtener imágenes de EV asociadas con otros especímenes de fluidos biológicos (plasma, líquido cefalorraquídeo y líquido ductal) de pacientes con una diversidad de otros cánceres altamente prevalentes. Además, esta tecnología básica permitirá el estudio de la estructura de las EV en fluidos oculares, plasma, LCR y fluido ductal. A continuación, se puede comparar la morfología de las EV en diversas enfermedades y en controles sanos. Esta información puede ser útil para el diagnóstico, la exclusión, el pronóstico del cáncer o como indicador del potencial metastásico.

El diagnóstico también puede implicar el control de la progresión o regresión de una enfermedad o trastorno en un sujeto. Esto se logra proporcionando una imagen previa de una muestra clínica de un sujeto que contiene vesículas extracelulares fijadas con un agente reticulante no reversible, y comparándola con una imagen de una muestra clínica de un sujeto que contiene vesículas extracelulares fijadas con un agente reticulante no reversible. Las vesículas extracelulares se comparan en cuanto a tamaño, densidad, morfología y/o distribución espacial y se determina si la enfermedad o trastorno está progresando o retrocediendo basándose en la comparación. Opcionalmente, este método puede incluir además poner en contacto las muestras con un fijador que contiene aldehído antes, después o al mismo tiempo que el contacto de las muestras con un agente reticulante no reversible para fijar las vesículas extracelulares. Adicionalmente, este método puede incluir además la administración de un agente terapéutico al sujeto basándose en la etapa de determinar si la enfermedad o trastorno está progresando o retrocediendo.

Un kit usado en el método de la presente invención incluye un sustrato de soporte para contener la muestra, un fijador que contiene aldehído y un agente reticulante no reversible. El agente reticulante no reversible usado en el método de la presente invención se selecciona de una carbodiimida soluble en agua, haluro de cianógeno y mezclas de los mismos. Mucho más preferentemente, el agente reticulante no reversible es 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida.

El sustrato de soporte del kit puede incluir un soporte sólido, tal como un portaobjetos, microplaca, matriz de columnas, tiras reactivas, membrana, partícula (por ejemplo, una perla o una nanopartícula) o un pocillo de una placa de microvaloración.

Ejemplos

Los ejemplos a continuación pretenden ilustrar la práctica de las realizaciones de la divulgación, pero de ningún modo pretenden limitar el alcance de la misma.

Ejemplo 1: Preparación y procesamiento de muestras de fluido

Los especímenes de humor acuoso o vítreo recogidas para el aislamiento de EV se procesaron inmediatamente sin fijación. Las EV se aislaron de humor vítreo humano o bovino, humor acuoso, líquido aspirado de pezón en plasma o líquido cefalorraquídeo (LCR) mediante protocolos de ultracentrifugación que se describen a continuación. Los pacientes con diagnóstico de diversos melanomas o gliomas donaron plasma y las EV se aislaron usando los métodos descritos. Los pacientes con diagnóstico de neuroblastoma o sarcoma donaron líquido cefalorraquídeo y las EV se aislaron. Las pacientes con diagnóstico de cáncer de mama donaron líquido aspirado de pezón y las EV se aislaron.

Ejemplo 2: Aislamiento de vesículas extracelulares y purificación de muestras de fluido

Se adaptaron métodos para aislar vesículas extracelulares de fluidos (Waldet al.,"The Light Reaction in the Bleaching of Rhodopsin",Science111:179-181 (1950). Para este estudio, el objetivo era tener especímenes de humor vítreo, humor acuoso, líquido de aspirado de pezón, plasma y líquido cefalorraquídeo (LCR) acelulares. El vítreo se eliminó con una serie de centrifugaciones a baja velocidad. Para el humor vítreo o acuoso bovino, se colocaron aproximadamente 8 ml de vítreo (o 100 pl de humor acuoso) en tubos de 15 ml y se centrifugaron en una cubeta oscilante Sorvall legend RT (Sorvall) a razón de 2.000 g (2500 rpm) a 4 °C durante 30 minutos. A continuación, el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de 15 ml. A continuación, se repitió la etapa de centrifugación. A continuación, el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se centrifugó a 10.000 g en una centrífuga Sorvall RC-58 (Sorvall) usando un rotor SS-34 (DuPont) durante 30 min a 4 °C. A continuación, el sobrenadante se transfirió y se repitió la etapa. La muestra se transfirió a un tubo de ultracentrífuga (Beckman) y a un rotor de cubeta oscilante (SW-41, Beckman) y se centrifugó a 100.000 g en una ultracentrífuga L7-55 (Beckman) a 4 °C durante 1 hora. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. La etapa se repitió. Las muestras se resuspendieron en 50 pl de solución salina tamponada con tris (TBS, pH 8) estéril y se colocaron en un tubo siliconado. Las muestras para la obtención de imágenes se procesaron inmediatamente y la muestra restante se congeló a -80 °C.

Ejemplo 3: Análisis de seguimiento de nanopartículas para muestras líquidas

Se usó el sistema NanoSight NS300 (Malvern) para realizar análisis de seguimiento de nanopartículas para caracterizar partículas de 30-800 nm en solución. Se resuspendieron vesículas extracelulares aisladas de humor vítreo, humor acuoso, plasma o LCR en 100 pl de solución salina tamponada con tris (TBS, pH 7,0) a una concentración de aproximadamente 2,5 pg de proteína por ml y, a continuación, la muestra se diluyó hasta un volumen final de 2 ml en TBS para análisis. Se cargaron partículas, se enfocó la cámara y se capturaron 5 vídeos de 60 s cada uno. Los videos se grabaron y a continuación se analizaron usando el software NanoSight (Versión 3.0) para determinar la distribución de tamaño y la concentración de partículas de las EV. Se crearon gráficos. El movimiento browniano de cada partícula se rastrea entre fotogramas, lo que en última instancia permite calcular el tamaño mediante la aplicación de la ecuación de Stokes-Einstein.

Ejemplo 4: Fijación solo con glutaraldehído convencional de muestras líquidas para microscopía electrónica

Las soluciones de EV que se procesaron con métodos de fijación de TEM convencionales se denominan "solo glutaraldehído" o "solo Glut". Las EV se obtuvieron y se resuspendieron en una solución tamponada como se ha descrito anteriormente. Se recubrió la superficie de rejillas de EM recubiertas de formvar/carbono (Electron Microscopy Sciences) con una solución de poli-L-lisina (%, Sigma Aldrich). Se aplicaron aproximadamente 15 pl de poli-L-lisina a la superficie recubierta de formvar/carbono de la rejilla de EM y la muestra se incubó en una cámara humidificada durante 15 min a temperatura ambiente. La solución de poli-L-lisina se eliminó con una pipeta y la rejilla se dejó secar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, se añadieron mediante pipeteo 5 pl de una solución que contenía EV sobre una rejilla de EM recubierta de poli-L-lisina-formvar/carbono y se incubaron en una cámara humidificada durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, la solución de EV se eliminó con una pipeta. Las muestras se fijaron en una "solución de fijación con glutaraldehído"; que consistía en glutaraldehído al 2,5 %, paraformaldehído al 4 %, ácido pícrico al 0,02 % en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M. Se añadieron mediante pipeteo 15 pl de una solución de glutaraldehído en la rejilla de EM y la muestra se incubó durante 15 min a temperatura ambiente (Faivreet al.,"In Frame Fibrillin-1 Gene Deletion in Autosomal Dominant Weill-Marchesani Syndrome",J. Med. Genet.40:34-36 (2003)). Posteriormente, la solución de fijación con glutaraldehído se eliminó con una pipeta. Las rejillas se lavaron con 15 pl de agua bidestilada durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se lavaron 2 veces durante 5 min cada una a temperatura ambiente. Las muestras se secaron a temperatura ambiente y se visualizaron en un microscopio electrónico t Em 1400 (JEOL, EE.UU., Inc.) como se describe a continuación. Los especímenes fijados con EDC-formalina se procesaron adicionalmente como se describe a continuación.

Ejemplo 5: Preparación de la solución de EDC-ETT

Los métodos para la fijación de la solución de EDC se adaptaron a partir de informes anteriores (Reardonet al.,"Identification in Vitreous and Molecular Cloning of Opticin, a Novel Member of the Family of Leucine-Rich Repeat Proteins of the Extracellular Matrix", J.Biol. Chem.275:2123-2129 (2000); Wheatleyet al.,"Immunohistochemical Localization of Fibrillin in Human Ocular Tissues. Relevance to the Marfan Syndrome",Arch. Ophthalmol.113:103-109 (1996). Se preparó una solución tampón de 1-metilimidazol 0,1 M (1-metilimidazol 0,1 M, NaCl 300 mM, con un pH ajustado a 8,0 con NaOH 12 N) y la solución se almacenó hasta durante 3 meses a temperatura ambiente. La solución de EDC se preparó de nuevo para cada experimento. Se midieron 0,96 ml de solución tampón de 1-metilimidazol 0,1 M y se añadieron 13 mg de 5-(etiltio)-1H-tetrazol (ETT, Sigma Aldrich, la concentración final fue de 0,1 M). El pH se ajustó a 8,0 con NaOH 12 N. A continuación, se añadieron 19,2 mg de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) (Sigma Aldrich, concentración final de 0,10 M) y, a continuación, el pH se ajustó de nuevo a 8,0 usando HCl 12 M. La solución de EDC-ETT se colocó en hielo hasta su uso.

Ejemplo 6: Fijación con EDC-glutaraldehído de muestras líquidas en microscopía electrónica

Todas las EV aisladas se resuspendieron en 20 pl de TBS (pH 8,0) y se mantuvieron a 4 °C. Se recubrió la superficie de rejillas de EM recubiertas de formvar/carbono (Electron Microscopy Sciences) con una solución de poli-L-lisina (%, Sigma Aldrich). Se aplicaron aproximadamente 15 pl de poli-L-lisina a la superficie recubierta de formvar/carbono de la rejilla de EM y la muestra se incubó en una cámara humidificada durante 15 min a temperatura ambiente. La solución de poli-L-lisina se eliminó con una pipeta y la rejilla se apartó en una cámara humidificada hasta que estuvo lista para su uso. A continuación, se combinaron partes iguales de solución de EDC/ETT recién preparada y la solución de EV añadiendo 5 j l de una solución de EDC/ETT enfriada con hielo con 5 j l de EV enfriadas con hielo suspendidas en TBS (pH 8,0) en un tubo siliconado enfriado previamente de 1,5 ml. La muestra se incubó durante 30 min en hielo. Se aplicaron 10 j l de la solución de EV de EDC/ETT a la superficie de las rejillas de EM recubiertas de formvar/carbono y la muestra se incubó durante 30 min a 4 °C en una cámara humidificada. Para activar la capacidad de reticulación del reactivo de EDC, las muestras se colocaron en una cámara humidificada en una incubadora durante 3 h a 50 °C. Las muestras se retiraron de la incubadora y la solución de EDC se eliminó usando una pipeta. Las muestras se fijaron con una fijación secundaria usando una solución reticulante a base de glutaraldehído que contenía; glutaraldehído al 2,5 %, paraformaldehído al 4 %, ácido pícrico al 0,02 % en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. La solución de glutaraldehído se eliminó pipeteando la burbuja de la rejilla de EM. La rejilla se lavó colocando 15 j l de agua bidestilada sobre la rejilla e incubando durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el agua y se lavó una segunda vez. Finalmente, las muestras se tiñeron negativamente o se tiñeron para detectar ADN, ARN y proteínas como se describe a continuación. Para la tinción negativa, las muestras se contrastaron sucesivamente en acetato de uranilo al 2 %, a pH 7, y metilcelulosa al 2 %/acetato de uranilo al 0,4 %, pH 4. Para la tinción positiva, las muestras se tiñeron con naranja de acridina o CFSE como se describe a continuación. Después de la tinción con la tinción o tinciones respectivas, las rejillas EM se montaron a continuación para obtener imágenes en el microscopio electrónico como se describe a continuación.

Ejemplo 7: Obtención de imágenes mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM) de muestras de fluido

Todas las rejillas de EM se visualizaron en un microscopio electrónico JEM 1400 (JEOL, EE.UU., Inc.) que funcionaba a 100 kV. Las imágenes digitales se capturaron con una cámara CCD Veleta 2K x 2K (Olympus-SIS). Se registraron y se analizaron imágenes de microscopía electrónica para determinar el tamaño y la frecuencia de las EV usando el software ImageJ.

Ejemplo 8: Tinción de ácidos nucleicos de muestras de fluidos para TEM

Para la tinción de TEM de ácidos nucleicos, se incubó una solución de tinción de naranja de acridina (etiqueta fluorescente de ARN de exosoma Exo-Red, System Biosciences) con 5 j l de EV purificadas por ultracentrífuga durante 30 min a 25 °C. Para las EV teñidas con bromuro de etidio (EtBr), se mezclaron 5 jg/m l de solución de EtBr con 5 j l de EV purificadas por ultracentrífuga durante 30 min a 25 °C. Para la tinción de proteínas en TEM, se mezcló CFSE 500 jM diluido en TBS (pH 7,4) con 5 j l de EV purificadas por ultracentrífuga durante 30 min a 25 °C. A continuación, todas las muestras anteriores se fijaron, se montaron y se obtuvieron imágenes con TEM como anteriormente.

Ejemplo 9: Microscopía electrónica de transmisión de humor vítreo y tejidos oculares

Se obtuvo tejido vítreo humano o bovino como se ha descrito anteriormente. Las muestras se eliminaron de las células con centrifugación a baja velocidad y los especímenes de montaje completo se ensayaron con tinción de H y E y obtención de imágenes como se describe a continuación. Para el vítreo, se añadieron mediante pipeteo 2 j l sobre un bloque y se fijaron en una solución de glutaraldehído al 2,5 %, paraformaldehído al 4 %, ácido pícrico al 0,02 % en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M y se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente (Faivreet al.,"In Frame Fibrillin-1 Gene Deletion in Autosomal Dominant Weill-Marchesani Syndrome",J. Med. Genet.40:34-36 (2003)). Los especímenes se lavaron con un exceso de volumen de tampón (pH 7,3) durante 5 minutos cada vez a temperatura ambiente. Las muestras se fijaron posteriormente con OsO4 al 1 %-K-ferricianuro al 1,5 % (acuoso) durante 60 min a temperatura ambiente (Hubmacheret al.,"Human Eye Development is Characterized by Coordinated Expression of Fibrillin Isoforms",Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.55:7934-7944 (2014). Las muestras se lavaron con tampón 3 veces durante 5 min cada una a temperatura ambiente. Las muestras se colocaron en bloque y se tiñeron con acetato de uranilo al 1,5 % durante 60 min a temperatura ambiente. Las muestras se deshidrataron mediante una serie de etanol graduada y se sometieron a transición a través de acetonitrilo. Las muestras se infiltraron y se incluyeron en resina Embed 812 (Electron Microscopy Sciences). Las secciones de tejido se cortaron a 60-65 nm usando un cuchillo de diamante Diatome (Diatome) en un ultramicrotomo Leica Ultracut T (Leica Microsystems). Las secciones se contrastaron con citrato de plomo (Sakumaet al.,"Isolation and Characterization of the Human X-Arrestin Gene",Gene224:87-95 (1998) y se visualizaron en un microscopio electrónico JEM 1400 (JEOL, EE.UU., Inc.) que funcionaba a 100 kV. Las imágenes digitales se capturaron con una cámara CCD Veleta 2K x 2K (Olympus-SIS). Se registraron y se analizaron imágenes de microscopía electrónica para determinar el tamaño y la frecuencia de las EV usando el software ImageJ. Para la tinción de<t>E<m>de ácidos nucleicos, se incubó una solución de tinción de naranja de acridina (etiqueta fluorescente de ARN de exosoma Exo-Red, System Biosciences) con 5 j l de EV purificadas por ultracentrífuga durante 30 min a 25 °C. Para las EV teñidas con bromuro de etidio (EtBr), se mezclaron 5 jg/m l de solución de EtBr con 5 j l de EV purificadas por ultracentrífuga durante 30 min a 25 °C. Para la tinción de proteínas en TEM, se mezcló CFSE 500 jM diluido en TBS (pH 7,4) con 5 j l de EV purificadas por ultracentrífuga durante 30 min a 25 °C. A continuación, todas las muestras anteriores se fijaron, se montaron y se obtuvieron imágenes con TEM como anteriormente.

Para la visualización por TEM de vesículas vítreas, se aislaron vesículas de vítreo humano o bovino mediante ultracentrifugación como se ha descrito anteriormente, se resuspendieron en formaldehído, se cargaron en rejillas de EM recubiertas de formvar/carbono, se fijaron posteriormente en glutaraldehído al 1%y se contrastaron sucesivamente en acetato de uranilo al 2 %, a pH 7, y metilcelulosa al 2 %/acetato de uranilo al 0,4 %, a pH 4, o naranja de acridina o CFSE.

Ejemplo 10: Preparación y procesamiento de tejido a partir de muestras oculares post mortem

Se obtuvieron ojos humanospost mortemsin enfermedad (The Eye-Bank for Sight Restoration, Nueva York, NY). La Weill Cornell Medicine Institutional Review Board otorgó la exención de la aprobación del IRB para el uso de ojos del banco de ojospost mortempara este estudio de investigación. Se adquirieron ojos bovinospost mortemen una carnicería local (Green Village Packing, Green Village, Nueva Jersey). Para los procedimientos de disección, los ojos se colocaron en una placa de Petri de plástico de 100 mm sobre hielo para evitar la degradación del ARN y las proteínas. Usando un microscopio de disección estéreo SZX-16 (Olympus), se extirparon la grasa orbitaria y los músculos extraoculares adheridos al globo. El globo se aclaró con 5 ml de solución salina tamponada con Tris (TBS) enfriada con hielo que contenía Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM (pH 8,0) durante 1 minuto a 4 °C. El vítreo se diseccionó haciendo una incisión de esclerotomía de 4 mm u 8 mm posterior al limbo (ojo humano y bovino, respectivamente) usando una aguja de 16g y a continuación haciendo una incisión sagital circunferencial con tijeras para separar el globo en una copa anterior y posterior. Se usaron tijeras para cortar y extirpar el vítreo formado y para cortar las adherencias entre el vítreo y las estructuras oculares. Se tuvo cuidado de evitar la contaminación del vítreo por tejido uveal o retina neural. Las muestras de tejido se aclararon con TBS (pH 8,0) durante 1 min a 4 °C. Los especímenes extraídos para microscopía electrónica y aislamiento de EV se procesaron inmediatamente sin fijación como se describe a continuación. Las muestras usadas para inmunohistoquímica, transferencia de Western o fijación con formalina EDC se colocaron en tubos de centrífuga de 15 ml y se sumergieron en 10 ml de formalina al 4 % (también conocida como formaldehído, paraformaldehído (PFA)) diluida en TBS (pH 8,0) durante al menos 24 h a 4 °C. Los tejidos que eran "solo formalina", se lavaron tres veces en TBS (pH 80) durante 5 min a 4 °C y no se procesaron ni fijaron con EDC. Se usaron tejidos solo con formalina para inmunohistoquímica, transferencia de Western o ácido nucleico y obtención de imágenes de proteínas. Los especímenes fijados con EDC-formalina se procesaron adicionalmente como se describe a continuación.

Ejemplo 11: Modelo de tumor de carcinoma mamario de ratón 4T1 y procesamiento de tejido

Se obtuvo la línea celular de cáncer de mama de ratón 4T1 (ATCC) y se mantuvo según las instrucciones del proveedor. Se recogieron células 4T1 en crecimiento exponencial y se centrifugaron durante 5 min a 900 rpm a temperatura ambiente. El sedimento se resuspendió en PBS. Se inyectó por vía ortotópica una suspensión de 50 ul que contenía 5 x 104 células 4T1 en la almohadilla de grasa mamaria de ratones hembra BALB/c de 8 semanas de edad. A las 2 semanas, los animales se sedaron y se sacrificaron de acuerdo con las directrices de Bienestar Animal de los NIH. El tumor y el tejido circundante se diseccionaron, se aclararon con TBS (pH 8,0) durante 1 min a 4 °C y se fijaron en 10 ml de formalina al 4 % diluida en TBS (pH 8,0) durante al menos 24 h a 4 °C. Se seccionaron los tejidos (1 mm de grosor). Los especímenes fijados con EDC-formalina se procesaron adicionalmente como se describe a continuación y posteriormente se tiñeron y se obtuvieron imágenes usando MPM como se describe a continuación.

Ejemplo 12: Fijación de tejido con EDC-formalina

Los métodos para la fijación con EDC-formalina se adaptaron a partir de informes anteriores (Penaet al.,"miRNA in situ Hybridization in Formaldehyde and EDC-Fixed Tissues",Nat Methods6:139-141 (2009), Renwicket al.,"Multiplexed miRNA Fluorescence in situ Hybridization for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues",Methods Mol Biol1211:171-187 (2014)). Se aisló tejido vítreo como se ha descrito anteriormente y se examinó bajo el microscopio para garantizar que la muestra estuviera libre de tejidos contaminantes como la retina o la coroides. Se aislaron tumores de cáncer de mama de ratón como se ha descrito anteriormente. El tejido se colocó en una placa de Petri de plástico de 100 mm y se lavó dos veces en 5 ml de TBS (pH 8,0) durante 5 min a 4 °C, y a continuación se sumergió en 5 ml de formalina al 4 % diluida en TBS (pH 8,0) durante 24 h y se almacenó en una cámara humidificada a 4 °C. Las muestras se lavaron tres veces en TBS enfriado con hielo (pH 8,0) durante 5 min a 4 °C. Para eliminar el fosfato residual del tejido, la muestra se incubó en 10 ml de una solución tampón de 1-metilimidazol 0,1 M recién preparada (1-metilimidazol 0,1 M, NaCl 300 mM, con un pH ajustado a 8,0 con NaOH 12 N) durante 30 min a 4 °C. A continuación, se preparó la solución de fijación con EDC. Primero, se prepararon 9,6 ml de una solución tampón de 1-metilimidazol 0,1 M y se añadieron 130 mg de 5-(etiltio)-1H-tetrazol (ETT, Sigma Aldrich, la concentración final fue de 0,1 M). El pH se ajustó a 8,0 con NaOH 12 N. A continuación, se añadieron 192 mg de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) (Sigma Aldrich, concentración final de 0,10 M) y a continuación el pH se ajustó de nuevo a 8,0 usando HCl 12 M. El tejido (1 cm x 1 cm) se transfirió a una placa de Petri de plástico de 35 mm y se añadieron 2 ml de solución de fijación con EDC. Las muestras se colocaron en una cámara humidificada y los especímenes se incubaron durante 3 h a 37 °C. Después de la incubación, se eliminó la solución de EDC-ETT y los especímenes se lavaron en 5 ml de glicina al 0,2 % (p/v) diluida en TBS (pH 7,4). Las muestras se lavaron dos veces en TBS (pH 7,4). Finalmente, las muestras se tiñeron para detectar ADN, ARN y proteínas como se describe a continuación.

Ejemplo 13: Tinción para detectar ADN, ARN y proteínas

Los tejidos fijados solo con formalina al 4 %, o EDC-formalina, como se ha descrito anteriormente, se tiñeron. A continuación, los tejidos se sumergieron en diversos colorantes para marcar ADN, ARN o proteínas. Para marcar el ADN, el tejido (1 cm x 1 cm) se colocó en una placa de Petri de 35 mm y se sumergió en 1 ml de 0,5 |jg/ml de solución de tinción Hoechst 33342 (Sigma Aldrich). Las muestras se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente y a continuación los tejidos se lavaron con 5 ml de 1 x TBS (pH 7,4) durante 3 min a temperatura ambiente. Las etapas de lavado se repitieron dos veces. Las muestras se tiñeron con un marcador secundario o se montaron para obtener imágenes. Para marcar tanto el ADN como el ARN con un único colorante, se usó yoduro de propidio (PI, Sigma Aldrich), que se intercala entre las bases del ADN y también se une al ARN con menor afinidad (Suzukiet al.,"DNA Staining for Fluorescence and Laser Confocal Microscopy",J Histochem Cytochem45:49-53 (1997)). Se encontró que una solución de 50 jg/m l de PI diluida en TBS (pH 7,4) era la concentración óptima de PI para teñir conjuntamente ADN y ARN en muestras vitreas de montaje completo. Por lo tanto, los tejidos se colocaron en una placa de Petri de 35 mm y a continuación se sumergieron en 1 ml de solución de 50 jg/m l de PI (diluido en TBS) durante 24 h a 37 °C en una cámara humidificada. Las muestras se lavaron con TBS (pH 7,4) tres veces. Las muestras se tiñeron con otro marcador o se montaron para obtener imágenes. Para diferenciar entre ADN y ARN, todos los tejidos teñidos con Pi se tiñeron con una solución de tinción Hoechst 33342 como se ha descrito anteriormente. Hoechst tiene una fuerte afinidad por el ADN y no marca el ARN. Para las muestras teñidas con Hoechst y PI, la señal de ARN se determinó excluyendo la señal de Hoechst. Para marcar proteínas celulares y extracelulares en el vitreo de montaje completo, una célula permeable y densa en electrones (Griffithet al,"Epithelial-Mesenchymal Transformation During Palatal Fusion: Carboxyfluorescein Traces Cells at Light and Electron Microscopic Levels",Development116:1087-1099 (1992)) se usó tinción con succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE, Sigma Aldrich) (Bronner-Fraser M., Alterations in Neural Crest Migration by a Monoclonal Antibody That Affects Cell Adhesion",J Cell Biol101:610-617 (1985)), que se une covalentemente a aminas intracelulares. El tejido se colocó en una placa de Petri de plástico de 35 mm y a continuación se sumergió en 1 ml de CFSE 500 jM diluido en TBS (pH 7,4) y la muestra se incubó durante 24 h a 37 °C en una cámara humidificada. Después de la incubación, la solución de CFSE se eliminó y los tejidos se colocaron en una placa de Petri de plástico de 100 mm. Los tejidos se lavaron en 5 ml de glicina al 0,2 % (p/v) diluida en TBS (pH 7,4) durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, los tejidos se lavaron en 10 ml de TBS (pH 7,4) durante 5 min a temperatura ambiente y las etapas de lavado se repitieron dos veces. Finalmente, las muestras se contratiñeron con Hoescht o PI como se ha descrito anteriormente. Después de la tinción con el colorante o colorantes respectivos, las muestras se montaron a continuación en cámaras personalizadas para obtener imágenes en el microscopio fluorescente multifotónico, confocal o de campo amplio como se describe a continuación.

Ejemplo 14: Digestión con RNasa de ARN extracelular in situ

Los tejidos vitreos se fijaron con EDC-formalina y se sumergieron en 2 ml de tampón Rnasa (Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM) que contenía 100 jg/m l de RNasa A (Sigma Aldrich), y a continuación se incubaron durante 16 h a 42 °C. A continuación, la solución de RNasa se eliminó y las muestras se lavaron, se tiñeron con PI como se ha descrito anteriormente y se obtuvieron imágenes con microscopía fluorescente de campo amplio.

Ejemplo 15: Microscopía óptica, microscopía confocal y procesamiento de imágenes

Las imágenes en color de campo brillante se capturaron en un microscopio vertical Nikon eclipse e600 (Nikon) equipado con una cámara en color axiocam 105 (Zeiss), y las imágenes se procesaron con el software Zen (Zeiss, versión 4.3). Los tejidos se montaron en una placa con fondo de vidrio de 60 mm (área de visualización de 20 mm, MatTek) para estudios de imágenes fluorescentes. Se usó un microscopio invertido Axio Observer Z1 (Zeiss) con los siguientes conjuntos de filtros: Conjunto de filtros Ziess 49 (Ziess) para Hoechst; conjunto de filtros Ziess 38 (Ziess) para Alexa 488, proteína verde fluorescente (GFP) y fluoresceína; y conjunto de filtros Ziess 45 (Ziess) para PI. La obtención de imágenes confocal se realizó en un Zeiss LSM 880 con un objetivo de inmersión en aceite NA de 25x/0,8 (Weill-Cornell Medicine Imaging Core Facility).

Ejemplo 16: Obtención de imágenes multifotónica de una muestra tisular

El tejido de montaje completo fijado con EDC-formalina o formalina sola y marcado con ADN, ARN y/o proteína teñida como se ha descrito anteriormente se montó en una cámara especializada hecha de silicona y un cubreobjetos de vidrio, y se colocó encima de la cámara. El cubreobjetos se sumergió en 1 ml de 1 x TBS y a continuación se tomaron imágenes mediante microscopía multifotónica (Olympus FV1000MPE, usando un objetivo de inmersión en agua NA especializado de 25x/1,05, Weill-Cornell Medicine Imaging Core Facility). A continuación se obtuvieron imágenes del tejido en sectores. Las imágenes se capturaron, se ensamblaron pilas en z y se construyó una reconstrucción bidimensional (software Fiji (Schneideret al.,"NIH Image to ImageJ: 25 Years of Image Analysis",Nat Methods9:671-675 (2012); Schindelinet al.,"Fiji: An Open-Source Platform for Biological-ImageAnalysis",Nat. Methods9:676-682 (2012)) y el software Imaris (Bitplane), 6 regiones fotografiadas por espécimen, n = 3). Los datos se analizaron para determinar la tinción de proteína extracelular. Las EV y las células se midieron y se contaron como se describe a continuación.

Ejemplo 17: Diferenciación de células vítreas de vesículas extracelulares en una muestra tisular

El objetivo era identificar EV y ARN extracelular en el tejido vítreo. Para ello, las células vítreas (presuntos hialocitos) y las EV se diferenciaron mediante el siguiente método. Se obtuvieron imágenes multifotónicas o confocales de vítreo bovino fijado con EDC-formalina teñido conjuntamente con Hoechst y CFSE como se ha descrito anteriormente. Usando estas imágenes, se identificaron células vitreas identificando los núcleos mediante la señal de Hoechst y a continuación identificando los cuerpos celulares mediante la señal de CFSE. El diámetro de los cuerpos celulares se midió en más de 100 células (n = 3 muestras biológicas, 6 fotogramas de imagen por muestra) usando el software ImageJ (Schneideret al.,"NIH Image to ImageJ: 25 Years of Image Analysis",Nat. Methods9:671-675 (2012)). Se calcularon el diámetro promedio de los cuerpos celulares vítreos y la desviación estándar (D.E.) y los datos se presentaron gráficamente. Se encontró que el tamaño promedio de las células vitreas era de 10,5 pm ± 1,77 pm y se distribuía normalmente. Por lo tanto, un diámetro límite superior de 2 D.E. por encima de la media (14 pm) abarcaría aproximadamente el 97,5 % de las células. Por lo tanto, en el software ImageJ, se dibujó un círculo de 14 pm centrado en los núcleos y la señal positiva se consideró dentro de este círculo como proteína intracelular. La señal fuera de este círculo de 14 pm se consideró extracelular. Se usaron dos asistentes de investigación independientes y con ocultación para contar las EV. Los criterios para contar las EV incluían forma redonda, ubicación fuera del radio de la celda y tamaño superior a 100 nm y más pequeño que las células. Los datos se normalizaron dividiendo el número de EV contadas por fotograma por el número de celdas en el fotograma. Los datos se representan gráficamente. El tamaño de las EV vítreas bovinas también se midió usando técnicas similares (n = 4 y 3 réplicas biológicas).

Ejemplo 18: Microscopía electrónica de humor vitreo y tejidos oculares

Se obtuvo tejido vítreo humano o bovino como se ha descrito anteriormente. Las muestras se eliminaron de las células con centrifugación a baja velocidad y los especímenes de montaje completo se ensayaron con tinción de H y E y obtención de imágenes como se describe a continuación. Para el vítreo, se añadieron mediante pipeteo 2 pl sobre un bloque y se fijaron en una solución de glutaraldehído al 2,5 %, paraformaldehído al 4 %, ácido pícrico al 0,02 % en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M y se incubaron durante 60 min a temperatura ambiente (Itoet al.,"Formaldehyde-Glutaraldehyde Fixatives Containing Trinitro Compounds",J Cell Biol39:A168 (1968), que se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad). Los especímenes se lavaron con un exceso de volumen de tampón (pH 7,3) durante 5 minutos cada vez a temperatura ambiente. Las muestras se fijaron posteriormente con OsO4 al 1 %-K-ferricianuro al 1,5 % (acuoso) durante 60 min a temperatura ambiente (de Bruijn W.C., "Glycogen, Its Chemistry and Morphologic Appearance in the Electron Microscope. I. A Modified OsO4 Fixative Which Selectively Contrasts Glycogen",J Ultrastruct Res42:29-50 (1973)). Las muestras se lavaron con tampón 3 veces durante 5 min cada una a temperatura ambiente. Las muestras se colocaron en bloque y se tiñeron con acetato de uranilo al 1,5 % durante 60 min a temperatura ambiente. Las muestras se deshidrataron mediante una serie de etanol graduada y se sometieron a transición a través de acetonitrilo. Las muestras se infiltraron y se incluyeron en resina Embed 812 (Electron Microscopy Sciences). Las secciones de tejido se cortaron a 60-65 nm usando un cuchillo de diamante Diatome (Diatome) en un ultramicrotomo Leica Ultracut T (Leica Microsystems). Las secciones se contrastaron con citrato de plomo (Venableet al.,"A Simplified Lead Citrate Stain for Use in Electron Microscopy",J Cell Biol25:407-408 (1965)) y se visualizaron en un microscopio electrónico JEM 1400 (JEOL, EE.UU., Inc.) que funcionaba a 100 kV. Las imágenes digitales se capturaron con una cámara CCD Veleta 2K x 2K (Olympus-SIS). Se registraron y se analizaron imágenes de microscopía electrónica para determinar el tamaño y la frecuencia de las EV usando el software ImageJ. Para la tinción de proteínas en TEM, se mezcló CFSE 500 pM diluido en TBS (pH 7,4) con 5 pl de EV purificadas por ultracentrífuga durante 30 min a 25 °C. A continuación, todas las muestras anteriores se fijaron, se montaron y se obtuvieron imágenes con TEM como anteriormente. Para la visualización por TEM de EV vítreas, se aislaron vesículas de vítreo humano o bovino mediante ultracentrifugación como se describe a continuación, se resuspendieron en formaldehído, se cargaron en rejillas de EM recubiertas de formvar/carbono, se fijaron posteriormente en glutaraldehído al 1 % y se contrastaron sucesivamente en acetato de uranilo al 2 %, a pH 7, y metilcelulosa al 2 %/acetato de uranilo al 0,4 %, a pH 4, o CFSE.

Ejemplo 19: Aislamiento de vesículas extracelulares y purificación de muestras tisulares

Se adaptaron métodos para aislar vesículas extracelulares de fluidos (Theryet al.,Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids",Curr Protoc Cell BiolCapítulo 3, Unit 3:22 (2006)). En este estudio, el objetivo era tener especímenes vítreos acelulares. Por lo tanto, el vítreo se eliminó con una serie de centrifugaciones a baja velocidad. Se colocaron aproximadamente 8 ml de vítreo en tubos de 15 ml y se centrifugaron en una cubeta oscilante Sorvall legend RT (Sorvall) a razón de 2.000 g (2500 rpm) a 4 °C durante 30 minutos. A continuación, el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de 15 ml. A continuación, se repitió la etapa de centrifugación. A continuación, el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se centrifugó a 10.000 g en una centrífuga Sorvall RC-58 (Sorvall) usando un rotor SS-34 (DuPont) durante 30 min a 4 °C. Para cada alícuota de humor vítreo o acuoso, se realizó la tinción con hematoxilina y eosina (H y E) de montaje completo para examinar las células como se describe a continuación (figura 18). A continuación se obtuvieron imágenes de los portaobjetos de montaje completo y se procesaron adicionalmente todas las muestras acelulares. A continuación, el sobrenadante se transfirió y la etapa se repitió. La muestra se transfirió a un tubo de ultracentrífuga (Beckman) y a un rotor de cubeta oscilante (SW-41, Beckman) y se centrifugó a 100.000 g en una ultracentrífuga L7-55 (Beckman) a 4 °C durante 1 hora. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. La etapa se repitió. Las muestras se resuspendieron en 50 pl de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,5) estéril y se colocaron en un tubo siliconado. Las muestras para la obtención de imágenes se procesaron inmediatamente y la muestra restante se congeló a -80 °C.

Ejemplo 20: Tinción histoquímica del vitreo para confirmar la acelularidad de las muestras

Para optimizar las técnicas de aislamiento de EV vitreas, se aplicaron tinciones histoquímicas después de una centrifugación a baja velocidad para excluir muestras vítreas contaminadas por células. Las muestras vítreas se diseccionaron y se recogieron como se ha indicado anteriormente. La acelularidad se confirmó mediante el montaje completo del vítreo centrifugado en portaobjetos de vidrio y a continuación sometiendo el espécimen a tinción histoquímica con H y E. Se colocó aproximadamente 1 ml de sobrenadante vítreo en portaobjetos de vidrio SuperFrost Plus (Thermo Fisher Scientific) y a continuación se secó en una cámara durante 16 horas a 4 °C. Los portaobjetos secos se aclararon con 5 ml de 1 x TBS durante 3 min a temperatura ambiente y a continuación se lavaron de nuevo. A continuación, los portaobjetos se tiñeron con H y E usando procedimientos estándar. Los portaobjetos se conservaron montando cubreobjetos de vidrio y a continuación se sellaron. Las muestras se analizaron con microscopía óptica como se describe a continuación. Los especímenes con células teñidas con hematoxilina se sometieron a centrifugación repetida o se descartaron. Por lo tanto, todas las fracciones vítreas usadas para experimentos adicionales estaban libres de células vítreas contaminantes.

Ejemplo 21: Análisis de seguimiento de nanopartículas

Se usó el sistema NanoSight NS300 (Malvern) para realizar análisis de seguimiento de nanopartículas para caracterizar partículas de 30-800 nm en solución. Se resuspendieron vesículas extracelulares aisladas de vítreo bovino en 100 |jl de solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,0) a una concentración de aproximadamente 2,5 |jg de proteína por ml, y a continuación la muestra se diluyó hasta un volumen final de 2 ml en PBS para análisis. Se cargaron partículas, se enfocó la cámara y se capturaron 5 vídeos de 60 s cada uno. Los videos se grabaron y a continuación se analizaron usando el software NanoSight (Versión 3.0) para determinar la distribución de tamaño y la concentración de partículas de las EV. Se crearon gráficos. El movimiento browniano de cada partícula se rastreó entre fotogramas, lo que en última instancia permite calcular el tamaño mediante la aplicación de la ecuación de Stokes-Einstein.

Ejemplo 22: Evaluación de la pérdida de vesículas extracelulares de tejido fijado con formalina

Se colocó vítreo bovino entero microdiseccionado como se ha descrito anteriormente en un tubo cónico de 50 ml y a continuación se sumergió en 10 ml de formalina al 4 % diluido en TBS (pH 7,4) y se incubó durante 24 h a 4 °C. Después de la fijación, los tejidos se diseccionaron en hielo en secciones de aproximadamente 1 cm x 1 cm y se registró el peso de la sección vítrea. A continuación, los tejidos se colocaron en tubos de centrífuga de 15 ml. Los tejidos se sumergieron en 250 j l de TBS y las muestras y el tampón de lavado (o sobrenadante) suprayacente se incubaron a 37 °C durante 1 h (n = 3). Los sobrenadantes se recogieron y se obtuvieron imágenes con tinción negativa para TEM y UA para estudios adicionales.

Ejemplo 23: Inmunohistoquímica de proteínas marcadoras de exosomas en vítreo

La inmunohistoquímica (IHC) se realizó en vítreo bovino fijado con formalina al 4 % de montaje completo. Para evitar que se reviertan las reticulaciones de formalina y así reducir la tasa de pérdida de EV, todos los experimentos se realizaron a 4 °C durante la duración del experimento, excepto para las imágenes microscópicas epifluorescentes de campo amplio. El humor vítreo bovino se cortó en trozos de aproximadamente 1 cm x 1 cm y a continuación el espécimen se aclaró en 5 ml de TBS enfriado con hielo (pH 7,4) durante 3 minutos a 4 °C. Las etapas de lavado se repitieron dos veces. A continuación, los especímenes se examinaron con un microscopio de disección (SZX-16 Olympus) para eliminar los tejidos potencialmente contaminantes. A continuación, las muestras se sumergieron en 500 j l de tampón de bloqueo (suero de cabra al 10 % diluido en TBS) durante 1 h a 4 °C. Las muestras se lavaron brevemente en 5 ml de TBS durante 3 min a 4 °C. Se usó anticuerpo monoclonal de conejo anti TSG-101 (Abcam PLC, diluido 1:500) para inmunoteñir el vítreo bovino durante una noche a 4 °C. Las muestras se lavaron en 5 ml de TBS durante 3 min a 4 °C. Las etapas de lavado se repitieron dos veces. La tinción IHC se visualizó usando un anticuerpo secundario, IgG de cabra anti conejo conjugado con Alexa Fluor 488 (Abcam PLC). Las muestras se lavaron tres veces. El vítreo bovino se contratiñó con tinción de Hoechst (como se ha descrito anteriormente) para marcar los núcleos y a continuación se lavó dos veces en 5 ml de TBS durante 5 min a 4 °C. A continuación, inmediatamente se obtuvieron imágenes del vítreo y se registraron microfotografías. Para los controles negativos, se sustituyó el anticuerpo primario (solo anticuerpo secundario) por suero de cabra normal (dilución 1:1000).

Ejemplo 24: Análisis del proteoma vítreo

Se eliminaron las células de las muestras de vítreo bovino usando el protocolo anterior y se determinó que las muestras de montaje completo eran acelulares mediante tinción con H y E de montaje completo y mediante obtención de imágenes posteriores como se ha descrito anteriormente. A continuación se seleccionaron muestras acelulares para análisis proteómico. Se aislaron vesículas extracelulares como se ha descrito anteriormente. La proteína de la fracción de vesículas extracelulares o de la fracción vítrea acelular se desnaturalizó en urea 8 M y las cisteínas se redujeron con ditiotreitol (Sigma Aldrich) antes de la alquilación con yodoacetamida (Sigma Aldrich). Las proteínas se digirieron con LysC (Wako Chemicals) seguido de tripsina (Promega) y se desalinizaron con Empore Cl8 STaGETips (3M) (Ishihamaet al.,"Modular Stop and go Extraction Tips with Stacked Disks for Parallel and Multidimensional Peptide Fractionation in Proteomics".J Proteome Res5:988-994 (2006)). Se inyectó un jg de proteína total para el análisis nano-LC-MS/MS (Q-Exactive Plus, Thermo Scientific). Los péptidos se separaron usando una columna C18 de 12 cm x 75 |jm (Nikkyo Technos Co., Ltd. Japón) a un caudal de 200 nl/min, con un gradiente del 5-40 % durante 160 minutos (tampón A de ácido fórmico al 0,1 %, tampón B de ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo). El Q-Exactive Plus funcionó en modo dependiente de los datos, con un método de los 20 mejores. Los datos de Nano-LC-MS/MS se analizaron usando MaxQuant (versión 1.6) (Coxet al.,"MaxQuant Enables High Peptide Identification Rates, Individualized p.p.b.-Range Mass Accuracies and Proteome-Wide Protein Quantification",Nat Biotechnol26:1367-1372 (2008)) y el software Perseus (versión 1.4) (Tyanovaet al.,"The Perseus Computational Platform for Comprehensive Analysis of (Prote)omics Data",Nat Methods(2016)), buscando en una base de datos UniprotBos taurusdescargada en julio de 2014) (UniProt C, "UniProt: A Hub for Protein Information",Nucleic Acids Res43:D204-212 (2015)), permitiendo la oxidación de metionina y la acetilación del extremo N de proteínas, y filtrando a una tasa de descubrimiento falso del 2 % en el péptido y del 1 % a nivel de proteína. Las proteínas se cuantificaron usando valores iBAQ. Se comparó el enriquecimiento de proteínas entre la fracción de vesículas extracelulares vitreas y la fracción vitrea entera acelular.

Ejemplo 25: Cultivo de células ARPE-19

Se cultivaron células epiteliales pigmentadas de retina humana, ARPE-19 (ATCC) en medio DMEM:F12 (ThermoFisher Scientific) complementado con suero bovino fetal al 10 % y penicilina y estreptomicina. Todas las células se incubaron a 37 °C en aire al 95 % y CO<2>al 5 % y se mantuvieron usando técnicas estériles estándar.

Ejemplo 26: Carga de proteínas recombinantes en vesículas extracelulares

Las EV vítreas bovinas aisladas, como se ha descrito anteriormente, se midieron para determinar la concentración de proteínas total (kit de ensayo de proteínas BCA Pierce™, Thermo Fisher Scientific). Se usaron 4 jg de EV vítreas para tratamientosin vitroy 0,025 jg de EV vítreas bovinas para inyeccionesin vivojunto con las siguientes concentraciones de BSA-fluoresceína (3 jg , 1 jg y 0,5 jg ) o GFP (0,25 jg , 0,5 jg y 1 jg). La proteína recombinante y las EV se mezclaron en 300 j l de tampón de electroporación (BioRad) y se sometieron a electroporación en una cubeta de 4 mm. La electroporación de las EV se realizó usando un programa de onda cuadrada en las siguientes condiciones; tensión a 300 V, duración del pulso de 35 ms, con un número de pulsos de 2 y un intervalo de pulso de 0,1 s. Para los controles, se mezclaron las mismas concentraciones de EV con la concentración óptima de proteína recombinante sin electroporación (0 V). Para los estudiosin vivo,las muestras se desalinizaron después de resuspenderlas en 5 volúmenes de solución salina equilibrada y a continuación se concentraron con filtros de exclusión por tamaño centrífugos (Amicon, Millipore Sigma). El volumen de resuspensión en solución salina equilibrada (BSS) fue de 75 j l y se usaron 0,5 j l por inyección.

Ejemplo 27: Aplicación in vitro de vesículas extracelulares a células cultivadas

Se aislaron EV vítreas bovinas o humanospost mortemy se cargaron con proteína recombinante mediante electroporación como se ha descrito anteriormente. Las células ARPE-19 se cultivaron en una placa de 12 pocillos y aproximadamente un 70 % de confluencia en el momento del tratamiento de EV. A continuación, se añadieron 100 j l de la solución de EV electroporada a 1 ml de medio completo. Las células se incubaron durante 16 h en condiciones de cultivo estándar y a continuación el medio se eliminó y se reemplazó con medio completo. 48 h después del tratamiento, el medio celular se eliminó y los cultivos se sumergieron en 1 ml de tinción de Hoechst y se incubaron durante 15 min a 37 °C. Se eliminó la tinción y las células se lavaron con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato y se fijaron con 2 ml de formalina al 4 % diluida en PBS durante 10 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron con 2 ml de PBS durante 5 min. El lavado se repitió dos veces. Se evaluó la eficacia de transfección de las células mediante microscopía fluorescente de campo amplio.

Ejemplo 28: Inyección in vivo de vesículas extracelulares vítreas

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las directrices de los NIH y se aprobaron por el Cornell Medicine's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Se mantuvieron ratones macho C57BL/6J de 6 semanas de edad (Jackson Labs) en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h en el Weill Cornell Medical College's Research Animal Resource Center (RARC). Las inyecciones intravítreas de ojos de ratón se produjeron a las 8 semanas de edad en todas las variables experimentales (n > 3). Los animales se sedaron con un cóctel de ketamina y xilazina de acuerdo con las directrices de Bienestar Animal de los NIH. Se dilataron las pupilas de los animales con 1 gota de fenilefrina al 2,5 %, 1 gota de tropicamida al 1 % y a continuación se aplicó un ungüento oftálmico lubricante. Después de 15 min, los animales se prepararon para la inyección. Se eliminó el ungüento oftálmico con un hisopo de algodón y los ojos se aclararon con 10 gotas de 1X TBS. Bajo un microscopio estereoscópico de disección (Olympus SZX50), se hizo un recorrido guía en el ojo colocando una aguja de calibre 32 en el limbo y a continuación se atravesó desde la esclerótica hasta la cámara posterior. Se tuvo cuidado de no alterar el cristalino. A continuación, se retiró la aguja guía y el microinyector (picobomba neumática, PV830, World Precision Instruments) se posicionó en el recorrido de la aguja guía y se insertó la punta de la pipeta de vidrio en el segmento posterior evitando la retina. Se inyectaron 500 nl de solución de EV o soluciones de control. Después de completar la inyección, se mantuvo un intervalo de 10 s antes de retirar la pipeta de vidrio. Se retiró la pipeta de vidrio y se aplicó un ungüento antibiótico oftálmico en el ojo inyectado inmediatamente después del procedimiento de inyección intravítrea. A continuación, los animales se monitorizaron para determinar la recuperación de la anestesia y a continuación se devolvieron a las instalaciones RARC de Weill Cornell Medicine.

Ejemplo 29: Evaluación de la biodistribución de vesículas extracelulares inyectadas por vía intravítrea o controles en ojos de roedores

La biodistribución de la inyección intravítrea de EV se analizó el día 3, la semana 1 y la semana 3 después de la inyección (n > 3). Los animales se sedaron y se sacrificaron de acuerdo con las directrices de Bienestar Animal de los NIH. Los ojos se enuclearon y se colocaron en 5 ml de formalina al 4% en 1X TBS durante 16 h a 4 °C y a continuación se sumergieron en 5 ml de sacarosa 0,5 M diluida en TBS durante 12 h a 4 °C. Los tejidos se montaron en compuesto OCT (Tissue-Tek), se congelaron en un baño de hielo seco/etanol en un Cryomold (Tissue-Tek), se seccionaron inmediatamente en serie de 5 a 40 pm con un criostato (Leica 3050 S, Leica) y se montaron en un portaobjetos de vidrio SuperFrost Plus (Thermo Fisher Scientific). Las muestras se contratiñeron con 1 ml de tinción de Hoechst durante 15 min a temperatura ambiente. Los portaobjetos se aclararon en 5 ml de TBS (pH 7,4) durante 5 min a temperatura ambiente. Las etapas de lavado se repitieron dos veces. A continuación se añadieron 300 pl de medio de montaje y se colocó encima un cubreobjetos (VWR International LLC). Se obtuvieron imágenes de los portaobjetos con microscopía fluorescente de campo amplio para BSA-fluoresceína. Los especímenes sin procesar y los portaobjetos montados se almacenaron a -80 °C.

Ejemplo 30: Análisis estadístico

La visualización de gráficos y los cálculos se realizaron usando Excel (versión 2011, Microsoft). Todos los experimentos, a menos que se indique de otro modo, se realizaron con n > 3 de muestras experimentales distintas. Para el análisis de seguimiento de nanopartículas, el tamaño, la concentración y la distribución de las partículas se calcularon usando la ecuación de Stokes-Einstein. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba de la t de Student para datos independientes usando el software SPSS, y los valores de p <0,05 se consideraron significativos.

Para optimizar los procedimientos establecidos de TEM y tinción negativa para muestras de fluidos, se usaron EV aisladas del humor vítreo (matriz de tipo gel, ubicada en el ojo) y del humor acuoso como sistema modelo. El cuerpo vítreo (vítreo) del ojo se encuentra entre el cristalino y la retina, y es principalmente tejido acelular. El vítreo está compuesto en gran parte por agua y una matriz de gel extracelular de fibrillas de colágeno predominantemente tipo II en asociación con ácido hialurónico. Primero, el humor vítreo se diseccionó de la cámara posterior del ojo, se homogeneizó la muestra, las EV se aislaron mediante ultracentrifugación y la muestra se resuspendió en solución salina tamponada. A continuación, se cuantificó el número y el tamaño de las EV mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y se encontraron 3,98 x 108 de EV por ml. Para visualizar la ultraestructura de las EV vítreas suspendidas en un fluido, se siguieron protocolos de obtención de imágenes por TEM convencionales a base de glutaraldehído (figura 1 A) (Stradleighet al.,"Fixation Strategies for Retinal Immunohistochemistry",Progressin Retinal and Eye Research48:181-202 (2015)). Se aplicaron aproximadamente 4 x 106 EV a una rejilla de microscopía electrónica, después de la incubación se eliminó la muestra, se aplicó fijación con glutaraldehído, la muestra se lavó y a continuación se realizó una tinción negativa con una solución de acetato de uranilo (figura 1A). La obtención de imágenes posterior de los especímenes usando TEM detectó muy pocas EV (figura 1B). Usando la fijación con glutaraldehído, se observó un promedio de 0,033 (±0,182) EV por campo micrográfico de alta potencia de 25.000x (n = 3 réplicas biológicas y 10 fotografías capturadas de igual tamaño), lo que parece incongruente con la carga de más de 4 millones de EV. Estos datos sugirieron que las EV se destruyeron durante el procesamiento del espécimen o se<perdieron en el líquido aspirado. Por lo tanto, para adherir permanentemente las>E<v a la rejilla, se añadió una etapa>de fijación adicional usando EDC, una carbodiimida que crea una reticulación no reversible entre las cadenas laterales del grupo amino cargadas positivamente y los grupos carboxilo de las proteínas.

Para ensayar la hipótesis de que la EDC repararía irreversiblemente las EV, se mezcló EDC inactiva (fría, (4 °C)) con 4 millones de EV vítreas bovinas que se resuspendieron en solución salina tamponada, y a continuación se aplicó la solución enfriada con hielo a la superficie de una rejilla de microscopía electrónica formvar recubierta de poli-1-lisina (figura 1C). A continuación, la solución de EDC se activó aplicando calor y posteriormente se añadió glutaraldehído, se lavó la muestra, y se realizó una tinción negativa. Las imágenes mostraron una gran cantidad de EV vítreas bovinas que sometieron a obtención de imágenes con tinción negativa (figura 1D). Las muestras de humor acuoso fijadas con EDC mostraron 16,5 EV (±16,9) por campo de alta potencia de 25.000x en condiciones equivalentes. De manera significativa, se identificaron más EV (357 veces) en muestras de fluidos fijados con EDC, en comparación con las muestras fijadas con glutaraldehído (p<0,05, n = 3), (figura 1E), lo que sugiere que la fijación con EDC de EV suspendidas en fluidos biológicos es superior a la fijación convencional con glutaraldehído. Estos datos muestran que para obtener imágenes de EV en un fluido, la fijación con EDC-glutaraldehído es significativamente superior en comparación con la fijación con glutaraldehído sola. En resumen, los protocolos de TEM estándar y tinción negativa dan como resultado un fallo sustancial de las EV para adherirse a la superficie de las rejillas de microscopía electrónica. Sin embargo, la fijación de proteínas con EDC-glutaraldehído actúa para retener las EV y permite obtener imágenes sólidas de las EV en fluidos biológicos. Además, esta tecnología representa una mejora sustancial en los métodos de obtención de imágenes de EV.

Para explicar la discrepancia en la cantidad de EV obtenidas en imágenes usando la técnica de fluido fijado con EDCglutaraldehído y el espécimen fijado con glutaraldehído solo convencional, se examinó cada etapa del procedimiento del protocolo a base de glutaraldehído para determinar la posible causa de la pérdida de EV. Se planteó la hipótesis de que las EV estaban ubicadas en la superficie de la rejilla o en el tampón de lavado aspirado. Por lo tanto, el contenido de EV en el líquido aspirado se examinó mediante obtención de imágenes del aspirado usando una rejilla separada y fijación con EDC-glutaraldehído. Para ensayar la pérdida de EV, se aplicó a la rejilla una solución de EV de humor acuoso bovino aislado y a continuación se incubó. A continuación, el contenido aspirado se mantuvo y se sometió a obtención de imágenes en una rejilla separada usando fijación con EDC-glutaraldehído. Se observó que había una cantidad considerable de EV presentes en la solución aspirada (figura 2A), lo que sugiere que las EV no se adhirieron a la superficie de la rejilla. A continuación, también se encontró que las EV se perdieron durante la fijación con glutaraldehído (figura 2B) y las etapas de lavado (figura 2C); con solo unas pocas EV restantes en la rejilla durante la obtención de imágenes por TEM (figura 2D). Se cuantificó la cantidad de pérdida en cada etapa y los datos mostraron que la mayoría de las EV no se adherían a la rejilla en la etapa inicial, quedando muy pocas restantes en la etapa de obtención de imágenes final (figura 2E). En general, estos datos muestran que la obtención de imágenes de EV suspendidas en un fluido usando TEM convencional y protocolos de tinción negativa da como resultado un fallo masivo de las EV para adherirse a la rejilla y la posterior pérdida de EV durante las etapas de fijación con glutaraldehído y lavado. Además, la TEM convencional y la tinción negativa dan como resultado una población no representativa de EV, lo que sugiere que el método convencional es ineficiente e inconsistente para obtener imágenes de EV en líquidos.

Para ampliar el alcance de esta técnica, se examinaron otros fluidos biológicos clínicamente relevantes. Se sabe que las EV están presentes en concentraciones más altas en la sangre de pacientes con cáncer y se cree que las EV procedentes de tumores desempeñan un papel importante en el crecimiento y la metástasis de los tumores. Por lo tanto, se buscó obtener imágenes de EV en plasma (producto sanguíneo) de pacientes con tumores del sistema nervioso central. Se obtuvo el plasma de pacientes con un diagnóstico de glioma, las EV se aislaron con ultracentrifugación y a continuación se realizó la fijación con EDC-glutaraldehído, seguida de tinción negativa y obtención de imágenes por TEM. Los datos mostraron que varios pacientes con glioma contienen numerosas EV (figuras 3A-C), que tienen una morfología, abundancia y tamaño significativamente diferentes en comparación con el plasma de pacientes de control sanos (figuras 4A-B). Para examinar otras neoplasias malignas, se visualizaron las EV aisladas del plasma de pacientes con melanoma sistémico. Se observó una señal densa en electrones que se asemeja a las EV en el plasma de pacientes con melanoma sistémico (figuras 5 A-B), aunque con una morfología diferente en comparación con las EV de pacientes con glioma (figuras 3A-C) o controles sanos (figuras 4A-B). Estos datos sugieren que la fijación con EDC-glutaraldehído modificada permite la identificación de EV procedentes de tumor en el producto sanguíneo de pacientes con cáncer. Además, estos datos sugieren que este método puede ser una herramienta útil para el diagnóstico y pronóstico del cáncer o un indicador del potencial metastásico.

A continuación, se examinaron los biomarcadores secretados en el fluido biológico de los tumores del sistema nervioso central mediante la inspección del contenido de EV en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de los pacientes. Por lo tanto, el LCR se obtuvo de pacientes con neuroblastoma, un tumor que surge de las células progenitoras del sistema nervioso simpático y el tumor sólido pediátrico más común (Brodeur, "Neuroblastoma: Biological Insights Into A Clinical Enigma",Nat Rev Cáncer3:203-216 (2003)). Las EV se aislaron, las muestras se fijaron con fijación con EDC-glutaraldehído, se realizó una tinción negativa y a continuación se obtuvieron imágenes de las muestras con TEM. Las imágenes mostraron que las EV procedentes de neuroblastoma son de mayor tamaño y contienen una sustancia densa en electrones que rodea las EV (figuras 6A-B). Para ampliar el alcance de esta técnica a otros tumores, se examinaron las EV aisladas del LCR donado por un paciente con diagnóstico de sarcoma (figuras 6C-D), un tumor derivado de células mesenquimales, tal como tejido muscular, óseo o vascular. De nuevo, la fijación con EDC-glutaraldehído permitió la identificación de EV en el LCR que eran más pequeñas y morfológicamente distintas en comparación con las EV aisladas de pacientes con neuroblastoma (figuras 6A-B). Estos datos sugieren que el LCR es otra fuente de fluidos biológicos de los que se pueden obtener imágenes mediante esta técnica. Además, los resultados sugieren que la fijación con EDC-glutaraldehído es útil para más de un fluido biológico y biomarcadores de imágenes de diversos cánceres. Finalmente, estos hallazgos pueden tener implicaciones importantes para la aplicación de obtención de imágenes de EV en cánceres que implican el sistema nervioso central.

Finalmente, se examinaron biomarcadores usando biopsia líquida de pacientes con el tipo de cáncer más prevalente, pacientes con carcinoma (Siegel,et al.,"Cancer Statistics, 2017",CA Cáncer J Clin67:7-3C (2017)). Para ello, se recogió líquido de aspirado de pezón (NAF, por sus siglas en inglés) (Harriset al."American Society of Clinical Oncology 2007 Update of Recommendations for the Use of Tumor Markers in Breast Cancer",J Clin Oncol25:5287-5312 (2007)) de pacientes con diagnóstico de cáncer de mama o controles sanos, y se realizó una fijación con EDC-glutaraldehído, seguida de tinción negativa y obtención de imágenes por TEM. Los datos mostraron una señal que se asemejaba a las EV del líquido aspirado de pezón (figura 7). Estos datos sugieren que el método de fijación con EDC-glutaraldehído es capaz de detectar EV en el carcinoma y que el líquido aspirado de pezón es otra fuente de fluido biológico que puede usarse para la biopsia líquida.

Para optimizar aún más la técnica de obtención de imágenes de líquido por TEM, se mejoraron los métodos para teñir las EV. La obtención de imágenes por TEM convencional de EV requiere tinción negativa, lo que permite la acumulación de tinción de acetato de uranilo densa en electrones alrededor de los bordes de la EV, produciendo una señal en el borde de la vesícula y un núcleo central menos denso en electrones (figura 8A y figura 9A). En el presente documento, se propone usar una "tinción positiva" que muestre una señal densa en electrones que resalte la propia EV. Se sabe que los exosomas contienen ARN (Valadiet al.,"Exosome-Mediated Transfer of mRNAs and MicroRNAs is a Novel Mechanism of Genetic Exchange Between Cells",Nat Cell Biol9:654-659 (2007)); por lo tanto, el humor vítreo bovino se tiñó con un colorante selectivo de ácido nucleico y denso en electrones, naranja de acridina, que mostró tinción positiva en las EV (figura 8B). Es posible teñir negativamente las EV del plasma de un paciente con glioma (figura 8<c>, panel izquierdo) y a continuación teñir positivamente la muestra con naranja de acridina como se muestra en la figura 8C, panel derecho. A continuación, las proteínas del vítreo bovino de montaje completo se marcaron con una célula permeable y densa en electrones (Griffithet al.,"Epithelial-Mesenchymal Transformation During Palatal Fusion: Carboxyfluorescein Traces Cells at Light and Electron Microscopic Levels",Development116:1087-1099 (1992)), tinción de succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) (Bronner-Fraser, M., "Alterations in Neural Crest Migration by a Monoclonal Antibody That Affects Cell Adhesion",J. Cell Biol.101:610-617 (1985)), que se une covalentemente a aminas intracelulares. A continuación, las proteínas de los especímenes se marcaron con CSFE y se sometieron a obtención de imágenes con TEM (figura 9B) y las imágenes de microscopía electrónica muestran una cantidad abundante de vesículas con tinción intravesicular. Las EV vítreas bovinas aisladas se marcaron con AO, mostrando tinción positiva (figura 9C). A continuación, el vítreo bovino de montaje completo se tiñó con bromuro de etidio (EtBr), una tinción de ácido nucleico densa en electrones, y se observaron múltiples EV (puntas de flecha) en una rejilla de colágeno (figura 9D). Las EV también se aislaron del vítreo humanopost mortemy se tiñeron con AO (figura 9E). Los datos sugieren que las EV pueden marcarse con diversos colorantes densos en electrones y etiquetarse con una "tinción positiva".

El objetivo final era obtener imágenes de la localización espacial de las EV tal como existen normalmente dentro de un pequeño volumen de fluido biológico, o visualizar EVin situ.Por lo tanto, se intentaron detectar EV sin usar protocolos de purificación para intentar detectar EV directamente en su entorno nativo del fluido biológico. Se obtuvo una muestra diminuta de humor acuoso humano (2,5 j l ) y el fluido sin diluir se aplicó a la superficie de la rejilla, se realizó una fijación con EDC-glutaraldehído seguida de tinción negativa y a continuación obtención de imágenes con TEM. Para el fluido acuoso sin diluir, las fotografías mostraron una gran cantidad de fondo (figura 10A, izquierda y derecha, señal de color negro) sin EV fácilmente identificables. Para mejorar la relación señal/ruido, la muestra se diluyó en solución salina tamponada y se repitió el procedimiento. Se apreció que se observó sustancialmente menos fondo después de diluir la muestra, lo que permite la identificación de más EV en el espécimen diluido (figura 10B-D). Estos datos muestran que es posible obtener imágenes de EV directamente a partir de una pequeña cantidad de fluido de una biopsia líquida humana; que puede servir como biomarcador para diagnóstico, pronóstico, o influir en la terapia para enfermedades relacionadas con EV, o excluir enfermedades en el humor acuoso o en otros fluidos biológicos.

En resumen, se muestra que los protocolos convencionales para obtener imágenes de EV con tinción negativa y TEM dan como resultado una pérdida masiva de EV suspendidas en solución, lo que da como resultado imágenes inconsistentes, subestimación de la abundancia de EV o resultados negativos. Por el contrario, la reticulación de EV mediante fijación con EDC-glutaraldehído mejora significativamente la retención de EV, permite obtener imágenes sólidas de la ultraestructura de EV en fluidos biológicos y permite una representación mejorada de la población heterogénea de EV. Adicionalmente, este método de fijación puede aplicarse ampliamente a técnicas de diagnóstico basadas en EV, incluida la biopsia líquida. Finalmente, esta técnica permite obtener imágenes de los mediadores estructurales de la metástasis en muchos tipos de cánceres. Se espera que el método de fijación con EDC-glutaraldehído sea ampliamente aplicable para obtener imágenes de EV asociadas con otros especímenes de fluidos biológicos (plasma, líquido cefalorraquídeo y líquido ductal) de pacientes con una diversidad de otros cánceres altamente prevalentes. Además, esta tecnología básica permitirá el estudio de la estructura de las EV en fluidos oculares, plasma, LCR y fluido ductal y puede ayudar a dilucidar los mecanismos básicos que subyacen a la progresión y la metástasis del cáncer. En resumen, la fijación con EDC combinada con TEM puede servir como una nueva tecnología para la biopsia líquida que puede ayudar a distinguir, evaluar y monitorizar los estadios y la progresión del cáncer.

A continuación, este método se aplicó a las EV de estudio en los tejidos y se usó el cuerpo vítreo del ojo como sistema modelo. El vítreo, situado entre el cristalino y la retina, es un tejido paucicelular ópticamente transparente con abundante matriz extracelular (MEC) y una función biológica poco conocida (Le Goffet al.,"Adult Vitreous Structure and Postnatal Changes",Eye (Lond)22:1214-1222 (2008)). Se han descrito microARN asociados a EV vítreas (Ragusaet al.,"miRNA Profiling in Vitreous Humor, Vitreal Exosomes and Serum From Uveal Melanoma Patients: Pathological and Diagnostic Implications",Cancer Biol. Ther.16:1387-1396 (2015)); sin embargo, aún no se han obtenido imágenes ni se han caracterizado las EV vítreas normales. Se plantea la hipótesis de que el vítreo normal posee EV, sin embargo, los repetidos intentos de visualizar las nanopartículas usando microscopía multifotónica, confocal o de campo amplio fracasaron. Aquí, se muestra que la fijación estándar con formalina da como resultado la pérdida de EV del tejido, mientras que la fijación de proteínas con 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) retiene las EV y permite obtener imágenes de EVin situ.

A continuación, el estudio se centró en optimizar la fijación tisular. Los métodos de fijación convencionales usan formalina al 10 % para crear reticulaciones proteína-proteína. Las etapas de procesamiento tisular generalmente se produce a temperatura ambiente o por encima; sin embargo, se sabe que las temperaturas elevadas revierten las reticulaciones proteína-proteína de formalina y ARN-proteína (Shiet al.,"Antigen Retrieval in Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues: an Enhancement Method for Immunohistochemical Staining Based on Microwave Oven Heating of Tissue Sections",J. Histochem. Cytochem.39:741-748 (1991); Ikedaet al.,"Extraction and Analysis of Diagnostically Useful Proteins from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue Sections",J. Histochem. Cytochem.46:397-403 (1998); Penaet al.,"miRNA In Situ Hybridization in Formaldehyde and EDC-Fixed Tissues",Nat. Methods6:139-141 (2009). Se plantea la hipótesis de que las EV se pierden en los tejidos fijados con formalina durante las etapas de procesamiento y obtención de imágenes (figura 11A). Para examinar la pérdida de EV de los tejidos fijados con formalina, se sumerge vítreo bovino fijado con formalina en tampón de lavado a 37 °C y a continuación se recoge el sobrenadante. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) de este sobrenadante reveló un número sustancial de EV perdidos del tejido (figura 11B-C). La pérdida de EV se observó en todas las temperaturas ensayadas, con menos EV perdidas a 4 °C (figura 11D) y una pérdida considerable a temperaturas elevadas (figura 11E-F). Para retener permanentemente las EV dentro del tejido, se añadió fijación con EDC para crear una reticulación no reversible entre las cadenas laterales del grupo amino cargadas positivamente y los grupos carboxilo de las proteínas. En condiciones similares, la fijación con EDC-formalina no mostró pérdida de EV en el tampón de lavado (figura 11G-H). Se observó materia particulada en el sobrenadante de EDC-formalina, así como en el control del tampón de lavado (figura 11I). Estos datos sugieren que la pérdida de EV de los especímenes fijados con formalina y que la fijación con EDC-formalina retiene las EV en los tejidos.

Para visualizar las EV en el espacio extracelular del tejido vítreo (figura 12A), se comparó la fijación convencional (formalina sola) con la fijación con EDC-formalina, y a continuación se intentó la visualización de las EVin situ.Se sabe que las EV contienen proteínas; por lo tanto, las proteínas se marcaron en especímenes de montaje completo con colorante fluorescente de succinimidil éster de carboxifluoresceína (CFSE) (Bronner-Fraser, M., "Alterations in Neural Crest Migration by a Monoclonal Antibody That Affects Cell Adhesion",J. Cell Biol.101:610-613 (1985)) en especímenes de montaje completo y a continuación se sometieron a obtención de imágenes con microscopía multifotónica. El vítreo fijado con formalina mostró una señal proteica dentro de las células pero no mostró señal extracelular (figura 12B, n = 4), lo que sugiere que las EV estuvieron ausentes o se perdieron durante el procesamiento. Por el contrario, el vítreo fijado con EDC-formalina muestra una señal proteica sólida en forma de EV en la ECM (figura 12C-D). Se identificaron significativamente más EV en tejidos fijados con EDC-formalina (143,2 con D.E. ± 23,8 EV contadas por imagen, n = 4) frente a tejidos fijados con formalina (1,2 con D.E. ± 0,9 EV contadas por imagen, n = 4), como se muestra en la figura 12E. Las EV vítreas muestran un tamaño de EV de población heterogénea basándose en la obtención de imágenes por MPM (figura 12F). Para correlacionar los hallazgos de la microscopía ópticain situcon otros métodos usados para visualizar las EV, se estudió la ultraestructura de EV vítreas usando TEM (Raposoet al.,"B Lymphocytes Secrete Antigen-Presenting Vesicles",J. Exp. Med.183:1161-1172 (1996); Consortiumet al.,"EVTRACK: Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research",Nat. Methods14:228-232 (2017)). Las secciones de tejido vítreo bovino mostraron una cantidad sustancial de EV en la ECM del vítreo (figura 12G). A continuación, se aislaron EV vítreas bovinas y se tiñeron con CFSE, un colorante denso en electrones (Griffithet al.,"Epithelial-Mesenchymal Transformation During Palatal Fusion: Carboxyfluorescein Traces Cells at Light and Electron Microscopic Levels",Development116:1087-1099 (1992)), y se observó una abundancia de EV con una señal de proteína intravesicular (figura 12H). El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) (Dragovicet al.,"Sizing and Phenotyping of Cellular Vesicles Using Nanonarticle Trackins Analysis."Nanomedicine7:780-788 (2011)) reveló una concentración de EV de al menos 2,98 x 107 partículas por ml (s.e.m. ± 8,98 x 106, figura 13A). El tamaño de las EV medido por NTA difería del tamaño de las EV observadoin situpor MPM (figura 12F), lo que probablemente sea el resultado de métodos de aislamiento basados en ultracentrifugación que eliminan las EV más grandes del fluido que se analiza (van der Polet al.,"Recent Developments in the Nomenclature, Presence, Isolation, Detection and Clinical Impact of Extracellular Vesicles", J.Thromb. Haemost.14:48-56 (2016)). Se realizó TEM en ojos humanospost mortemy se identificaron numerosas EV en la ECM cerca de la base del vítreo y el cuerpo ciliar (figura 121-J). La distribución del tamaño de EV vítreas humanas aisladas se muestra en la figura 13B. Estos datos sugieren que las EV están presentes en la ECM del vítreo y que a obtención de imágenes ultraestructural se correlaciona con la obtención de imágenes óptica del tejido fijado con EDC-formalina. Además, se ha demostrado que la fijación con EDC-formalina es superior a la fijación con formalina para obtener imágenes de EVin situ.

Se sabe que las EV contienen ARN extracelular (Valadiet al.,"Exosome-Mediated Transfer of mRNAs and MicroRNAs is a Novel Mechanism of Genetic Exchange Between Cells",Nat. Cell Biol.9:654-659 (2007)); por lo tanto, los ácidos nucleicos vítreos bovinos se tiñeron con yoduro de propidio (PI), que marca el ADN y el ARN (Suzukiet al.,"DNA Staining for Fluorescence and Laser Confocal Microscopy",J. Histochem. Cytochem.45:49-53 (1997)). La obtención de imágenes de microscopía confocal del vítreo fijado con EDC-formalina muestran señales positivas para ARN extracelular y proteína extracelular (figura 14A-B). Por el contrario, la fijación con formalina sola dio como resultado una señal de proteína y ARN extracelular sustancialmente menor (figura 14C). La pérdida de ARN de tejidos fijados con formalina es consistente con estudios previos (Penaet al.,"miRNA In Situ Hybridization in Formaldehyde and EDC-Fixed Tissues",Nat. Methods6:139-141 (2009)). Para verificar que la señal de PI extracelular era ARN, el vítreo fijado con EDC-formalina se trató con RNasa y se observó una reducción significativa en la señal extracelular (p<0,001; figura 15A-C). Se observaron hallazgos similares usando microscopía fluorescente de campo amplio estándar (figura 16A-B). Curiosamente, las EV vítreas normales expresan ARN, pero no muestran señal de ADN. Estos datos sugieren que la fijación con EDC-formalina permite la evaluación de la expresión diferencial de ARN o ADN dentro de las EVin situ.

Para ampliar la utilidad de esta técnica para otros tejidos, se usó un enfoque en la obtención de imágenes de EV secretadas por tejidos cancerosos (Beckeret al.,"Extracellular Vesicles in Cancer: Cell-to-Cell Mediators of Metastasis",Cancer Cell30:836-848 (2016); D'Souza-Schoreyet al.,"Tumor-Derived Microvesicles: Shedding Light on Novel Microenvironment Modulators and Prospective Cáncer Biomarkers",Genes Dev.26:1287-1299 (2012); Peinadoet al.,"The Secreted Factors Responsible for Pre-Metastatic Niche Formation: Old Sayings and New Thoughts",Semin. Cáncer Biol.21:139-146 (2011). Por lo tanto, se estudió un modelo murino de cáncer de mama metastásico. Para ello, se trasplantaron células tumorales de carcinoma mamario de ratón 4T1 en la almohadilla mamaria de un ratón (Pulaskiet al.,"Mouse 4T1 Breast Tumor Model",Curr. Protoc. Immunol.capítulo 20, Unit 20:22 (2001), el tumor se diseccionó, la muestra se fijó con EDC-formalina y los ácidos nucleicos se marcaron. A continuación, se estudió la superficie del tumor usando MPM y los datos mostraron una señal de ARN extracelular en la ECM, revelando una población heterogénea de EV (figura 17A). Además, se detectó ADN extracelular dentro de una subpoblación de EV más grandes (figura 17B), lo que coincide con los hallazgos de otros laboratorios de que el ADN extracelular está presente dentro de EV procedentes de tumor (D'Souza-Schoreyet al.,"Tumor-Derived Microvesicles: Shedding Light on Novel Microenvironment Modulators and Prospective Cancer Biomarkers",Genes Dev.26:1287-1299 (2012); Thakuret al.,"Double-Stranded DNA in Exosomes: A Novel Biomarker in Cancer Detection",Cell Res.24:766-769 (2014)). Estos datos sugieren que la técnica de fijación con EDC-formalina permite la localización espacial de la expresión de ácidos nucleicos en una subpoblación de EV dentro de un tejido. El análisis ultraestructural de tejidos tumorales mamarios fijados con EDC y glutaraldehído también se realizó mediante TEM. Los datos muestran una población heterogénea de EV en la ECM cerca de la célula tumoral (figura 17C-D). Las imágenes respaldan que la fijación con EDC-formalina retiene las EV y permite obtener imágenes de las EV en la ECM de especímenes de cáncer.

Para determinar si las EV vítreas expresaban proteínas asociadas a exosomas, se realizó un análisis proteómico mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) comparando el vítreo bovino completo con la fracción aislada de EV. Los datos de la Tabla 1 muestran que las proteínas asociadas a EV, como TSG-101, se enriquecieron en la fracción de EV. La tabla muestra marcadores de exosomas que están enriquecidos en la fracción de EV identificada mediante análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas. La fracción vítrea acelular se obtuvo mediante centrifugación en serie a baja velocidad, y la fracción enriquecida en EV (fracción de vesículas extracelulares) se obtuvo mediante ultracentrifugación en serie de vítreo acelular. El análisis proteómico muestra que los marcadores de proteínas del exosoma conocidos se enriquecieron en la fracción de EV (columna izquierda). Se enumera la diferencia log2 de la fracción de EV en comparación con la fracción vítrea acelular, en función de la cantidad de proteínas cuantificadas mediante la intensidad de la cuantificación sin etiquetas (LFQ, por sus siglas en inglés) en la fracción enriquecida con EV (tercera columna) y la fracción vítrea acelular. La intensidad total de las proteínas está representada por el valor de iBAQ (Schwanhausseret al.,"Global Quantification of Mammalian Gene Expression Control",Nature473:337-342 (2011); Volobouevaet al.,"(R)-Alpha-Lipoic Acid Protects Retinal Pigment Epithelial Cells from Oxidative Damage",Invest Ophthalmol Vis Sci46:4302-4310 (2005); Vlassovet al.,"Exosomes: Current Knowledge of Their Composition, Biological Functions, and Diagnostic and Therapeutic Potentials",Biochim Biophys Acta1820:940-948 (2012)). La columna de la derecha hace referencia a estudios anteriores que identificaron los marcadores de exosoma, ectosoma o EV (Vlassovet al.,"Exosomes: Current Knowledge of Their Composition, Biological Functions, and Diagnostic and Therapeutic Potentials",Biochim Biophys Acta1820:940-948 (2012); Conde-Vancellset al.,"Characterization and Comprehensive Proteome Profiling of Exosomes Secreted by Hepatocytes",J Proteome Res7:5157-5166 (2008); Higashiyamaet al.,"The Membrane Protein CD9/DRAP 27 Potentiates the Juxtacrine Growth Factor Activity of the Membrane-Anchored Heparin-Binding EGF-Like Growth Factor",J Cell Biol128:929-938 (1995); Keerthikumaret al.,"ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo",J Mol Biol428:688-692 (2016); Theryet al.,"Molecular Characterization of Dendritic Cell-Derived Exosomes. Selective Accumulation of the Heat Shock Protein hsc73",J Cell Biol147:599-610 (1999)). Adicionalmente, la tabla muestra el nombre de la proteína, el número de acceso y el símbolo del gen, además de la cantidad de péptidos equivalentes (todos y únicos) y la cobertura de secuencia. Cada experimento ha enumerado el valor de iBAQ (cuantificación absoluta basada en la intensidad) transformado log2 asociado agrupado de acuerdo con los grupos de percentiles (percentiles). Para la fracción vítrea acelular los percentiles iBAQ de 0,90, 0,75, mediana, 0,25 y 0,10 fueron: 24,4, 22,3, 21,2, 19,1 y 17,5, respectivamente. Para la fracción enriquecida en vesículas extracelulares los números correspondientes fueron: 29,1, 26,8, 25,2, 22,5 y 21,1.

Tabla 1.Proteínas marcadoras de vesículas extracelulares seleccionadas enriquecidas con vesículas extracelulares vítreas

continuación

Referencias de la Tabla 1: (1) Jiet al.,"Proteome Profiling of Exosomes Derived From Human Primary and Metastatic Colorectal Cancer Cells Reveal Differential Expression of Key Metastatic Factors and Signal Transduction Components",Proteomics13:1672-1686 (2013); (2) Koppenet al.,"Proteomics Analyses of Microvesicles Released by Drosophila Kcl67 and S2 Cells",Proteomics11:4397-4410 (2011); (3) Baiettiet al.,"Syndecan-Syntenin-ALIX Regulates the Biogenesis of Exosomes",Nat Cell Biol14:677-685 (2012); (4) Kimet al.,"Proteomic Analysis of Microvesicles Derived From Human Mesenchymal Stem Cells",J Proteome Res11:839-849 (2012); (5) Schwanhausseret al.,"Global Quantification of Mammalian Gene Expression Control",Nature473:337-342 (2011); (6) Vlassovet al.,"Exosomes: Current Knowledge of Their Composition, Biological Functions, and Diagnostic and Therapeutic Potentials",Biochim BiophysActa1820:940-948 (2012); (7) Higashiyamaet al.,"The Membrane Protein CD9/DRAP 27 Potentiates the Juxtacrine Growth Factor Activity of the Membrane-Anchored Heparin-Binding EGF-Like Growth Factor",J Cell Biol128:929-938 (1995); (8) Keerthikumaret al.,"ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo",J Mol Biol428:688-692 (2016); (9) Keerthikumaret al.,"Proteogenomic Analysis Reveals Exosomes are More Oncogenic Than Ectosomes",Oncotarget6:15375-15396 (2015), (10) Inuiet al.,"Annexin VI Binds to a Synaptic Vesicle Protein, Synapsin I",J Neurochem63:1917-1923 (1994); (11) Mallawaaratchyet al.,"Comprehensive Proteome Profiling of Glioblastoma-Derived Extracellular Vesicles Identifies Markers for More Aggressive Disease",J Neurooncol131:233-244 (2017); (12) Wolferset al.,"Tumor-Derived Exosomes are a Source of Shared Tumor Rejection Antigens for CTL Cross-Priming",Nat Med7:297-303 (2001); (13) Raposoet al.,"B Lymphocytes Secrete Antigen-Presenting Vesicles",J Exp Med183:1161-1172 (1996).

Para confirmar que las señales de proteínas extracelulares observadas en el vítreo fijado con EDC-formalina eran de hecho EV, se realizó la inmunohistoquímica (IHC) para TSG-101. La fijación con EDC-formalina era incompatible con la IHC; y la señal de TSG-101 no se detectó de manera fiable en tejidos fijados con formalina procesados a temperatura ambiente, presumiblemente debido a la pérdida de EV en el tampón de lavado. Dado que la reversión de la reticulación de formalina depende de la temperatura (Tkachet al."Communication by Extracellular Vesicles: Where We Are and Where We Need to Go",Cell164:1226-1232 (2016), la IHC se realizó a 4 °C y a continuación las muestras se sometieron a obtención de imágenes inmediatamente con el microscopio a temperatura ambiente. Se visualizaron señales puntiformes positivas para TSG-101 en el espacio extracelular (figura 18A), de acuerdo con la distribución espacial de las EV teñidas con CFSE en tejidos fijados con EDC-formalina. Los controles de especificidad no mostraron ninguna señal extracelular (figura 18B). TSG-101 fue 136 veces más prevalente en el espacio extracelular que dentro de los cuerpos celulares (p<0,001; figura 18C). Cabe destacar que la señal para TSG-101 se perdió en cuestión de minutos durante la obtención de imágenes a temperatura ambiente, probablemente debido a la reversión dependiente de la temperatura de las reticulaciones de formalina. A diferencia del vítreo fijado con EDC-formalina (figura 14A-B), las muestras fijadas con formalina procesadas a 4 °C no mostraron señal de ácido nucleico extracelular (figura 18D), presumiblemente tampoco a partir de la reversión de las reticulaciones de ácido nucleico de formalina. Estos datos muestran que las EV vítreas contienen marcadores consistentes con estudios de EV ya establecidos (Consortiumet al.,"EV-TRACK: Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research",Nat. Methods14:228-232 (2017)).

La Tabla 2 muestra las proteínas implicadas en la fisiología y fisiopatología ocular que están enriquecidas en la fracción de EV, según lo identificado mediante análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (nano-LC-MS/MS, Q-Exactive Plus, Thermo Scientific). La fracción vítrea acelular se obtuvo mediante centrifugación en serie a baja velocidad, y la fracción enriquecida en EV se obtuvo mediante ultracentrifugación en serie de vítreo acelular. El análisis proteómico muestra proteínas conocidas específicas del ojo que están enriquecidas en la fracción de EV (columna izquierda). El análisis proteómico muestra que los marcadores de proteínas del exosoma conocidos se enriquecieron en la fracción de EV (columna izquierda). Se enumera la diferencia log<2>de la fracción enriquecida con EV en comparación con la fracción vítrea acelular, en función de la cantidad de proteínas cuantificadas mediante la intensidad de la cuantificación sin etiquetas (LFQ) en la fracción enriquecida con EV (tercera columna) y la fracción vítrea acelular (datos no mostrados). La columna de la derecha hace referencia a estudios anteriores que identificaron estas proteínas en fisiología y fisiopatología ocular. Se muestran el nombre de la proteína, el número de acceso y el símbolo del gen, además del número de péptidos equivalentes (todos y únicos) y la cobertura de la secuencia. Para cada experimento se enumera el valor de íbAq (cuantificación absoluta basada en la intensidad) transformado log<2>asociado agrupado de acuerdo con los grupos de percentiles (percentil). Para la fracción vítrea acelular los percentiles iBAQ de 0,90, 0,75, mediana, 0,25 y 0,10 fueron: 24,4, 22,3, 21,2, 19,1 y 17,5, respectivamente. Para la fracción enriquecida en vesículas extracelulares los números correspondientes fueron: 29,1, 26,8, 25,2, 22,5 y 21,1.

Tabla 2:Proteínas conocidas es ecíficas del oo enri uecidas con la fracción de vesícula extracelular vítrea

continuación

Referencias de la Tabla 2: (1) Saariet al.,"Photochemistry and Stereoselectivity of Cellular Retinaldehyde-Binding Protein from Bovine Retina",J Biol Chem262:7618-7622 (1987); (2) Mawet al.,"Mutation of the Gene Encoding Cellular Retinaldehyde-Binding Protein in Autosomal Recessive Retinitis Pigmentosa",Nat Genet17:198-200 (1997); (3) Crabbet al.,"Structural and Functional Characterization of Recombinant Human Cellular Retinaldehyde-Binding Protein",Protein Sci7:746-757 (1998); (4) den Hollanderet al.,"A Homozygous Missense Mutation in the IRBP Gene (RBP3) Associated with Autosomal Recessive Retinitis Pigmentosa",Invest Ophthalmol Vis Sci50:1864-1872 (2009), (5) Liet al.,"Secretory Defect and Cytotoxicity: The Potential Disease Mechanisms for the Retinitis Pigmentosa (RP)-Associated Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein (IRBP)",J Biol Chem288:11395-11406 (2013); (6) Friedmanet al.,"Protein Localization in the Human Eye and Genetic Screen of Opticin",Hum Mol Genet11:1333-1342 (2002); (7) Reardonet al.,"Identification in Vitreous and Molecular Cloning of Opticin, A Novel Member of the Family of Leucine-Rich Repeat Proteins of the Extracellular Matrix",J Biol Chem275:2123-2129 (2000); (8) Stoneet al.,"Missense Variations in the Fibulin 5 Gene and Age-Related Macular Degeneration",N Engl J Med351:346-353 (2004); (9) Faivreet al.,"In Frame Fibrillin-1 Gene Deletion in Autosomal Dominant Weill-Marchesani Syndrome",J Med Genet40:34-36 (2003); (10) Hubmacheret al.,"Human Eye Development Is Characterized by Coordinated Expression of Fibrillin Isoforms",Invest Ophthalmol Vis Sci55:7934-7944 (2014); (11) Wheatleyet al.,"Immunohistochemical Localization of Fibrillin in Human Ocular Tissues. Relevance to the Mafan Syndrome",Arch Ophthalmol113:103-109 (1995); (12) Sakumaet al.,"Isolation and Characterization of the Human X-Arrestin Gene",Gene224:87-95 (1998); (13) Dryjaet al.,"A Point Mutation of the Rhodopsin Gene in one Form of Retinitis Pigmentosa",Nature343:364-366 (1990); (14) Waldet al.,"The Light Reaction in the Bleaching of Rhodopsin",Science111:179-181 (1950); (15) Dryjaet al.,"Mutations Within the Rhodopsin Gene in Patients with Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa",NEngl J Med323:1302-1307 (1990); (16) Lidenet al.,"Biochemical Defects in 11-cis-Retinol Dehydrogenase Mutants Associated With Fundus Albipunctatus",J Biol Chem276:49251-49257 (2001); (17) Yamamotoet al.,"Mutations in the Gene Encoding 11-cis Retinol Dehydrogenase Cause Delayed Dark Adaptation and Fundus Albipunctatus",Nat Genet 22:188-191 (1999); (18) Moiseyevet al.,"RPE65 Is an Iron(II)-Dependent Isomerohydrolase in the Retinoid Visual Cycle",J Biol Chem281:2835-2840 (2006); (19) Nicoletti et al., "Molecular Characterization of the Human Gene Encoding an Abundant 61 kDa Protein Specific to the Retinal Pigment Epithelium",Hum Mol Genet4:641-649 (1995); (20) Carteret al.,"Mapping of the Human CP49 Gene and Identification of an Intragenic Polymorphic Marker to Allow Genetic Linkage Analysis in Autosomal Dominant Congenital Cataract",Biochem Biophys Res Commun270:432-436 (2000); (21) Merdeset al.,"The 47-kD Lens-Specific Protein Phakinin is a Tailless Intermediate Filament Protein and an Assembly Partner of Filensin",J Cell Biol123, 1507-1516 (1993).

Los inventores intentaron caracterizar las EV vitreas y determinar si estas EV pueden transferir su carga de ARN y proteínas a las células diana (Valadiet al.,"Exosome-Mediated Transfer of mRNAs and MicroRNAs is a Novel Mechanism of Genetic Exchange Between Cells",Nat. Cell Biol.9:654-659 (2007); Skoget al.,"Glioblastoma Microvesicles Transport RNA and Proteins That Promote Tumour Growth and Provide Diagnostic Biomarkers",Nat. Cell Biol.10:1470-1476 (2008)). Para lograr esto, se marcó ARN de EV vitreas bovinas o humanas con naranja de acridina, la fracción de EV se purificó (figuras 19A-B) y a continuación se expusieron células del epitelio pigmentario de la retina (ARPE-19) a un bolo de las EV marcadas. Se observó una tasa de transfección de hasta el 96,2 % a las 48 horas con EV vitreas bovinas (figuras 20A-B). Las EV vitreas humanas aisladas de muestras oculares postmortem muestran una tasa de transfección del 96 % a las 24 horas (figura 20C-D), las cuales fueron significativamente mayores que los controles (p<0,05). También se sabe que las EV funcionan como vectores para suministrar proteínas recombinantes. Por lo tanto, se cargó albúmina sérica bovina (BSA, proteína de 66 kD) conjugada con fluoresceína en EV vítreas bovinas mediante electropermeabilización. A continuación, se trataron células cultivadas del epitelio pigmentario de la retina (ARPE-19) y se observó que las células se transfectaron hasta en un 97,6 %. Los controles, PBS solo o EV mezcladas con BSA-fluoresceína sin electroporación, no dieron como resultado la transfección de células ARPE-19 (figuras 21A-C, p<0,005, n = 3). Los controles demostraron que la absorción de BSA-fluoresceína depende de las EV. Para evaluar si las EV vítreas pueden transfectar una proteína funcional, que debe conservar su estado conformacional para emitir fluorescencia, se cargó proteína fluorescente verde recombinante (GFP, 26,9 kD) en EV vitreas bovinas. Los datos mostraron que las células ARPE-19 se transfectaron hasta un 88,3%(figuras 21D-F), significativamente más que los controles (p<0,05, n = 3). Estos datos muestran que las EV vítreas son capaces de transferir ARN y proteínas recombinantesin vitro.

Finalmente, se estudió la transfección de EV vítreasin vivo.Se administró una concentración diluida de EV cargadas con BSA-fluoresceína a ojos de roedores mediante inyección intravítrea. El día 3, las EV no mostraron evidencia de penetración en la retina (figura 22A). A las 3 semanas, se observó la transfección de múltiples capas de células de la retinain vivo(figuras 22B-C). Los controles de especificidad, PBS solo (figura 22D) o muestras de EV mezcladas con BSA-fluoresceína sin electropermeabilización fueron negativos. Estos datos muestran que las EV vítreas funcionan como un vector para el suministro de proteínas recombinantesin vivo.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un método para fijar vesículas extracelulares, comprendiendo dicho método:

proporcionar una muestra que contiene vesículas extracelulares y

poner en contacto la muestra con un agente reticulante no reversible en condiciones eficaces para fijar las vesículas extracelulares.

2. El método de la reivindicación 1 que comprende además:

poner en contacto dicha muestra con un fijador adicional antes, después o al mismo tiempo que dicho contacto de la muestra con el agente reticulante no reversible,

en donde el fijador adicional es un fijador que contiene aldehído, preferentemente en donde el fijador que contiene aldehído es glutaraldehído o paraformaldehído; o

en donde el fijador adicional es uno de di(met)acrilato de etilenglicol, diacrilato de etilenglicol, diacrilato de di(etilenglicol), diacrilato de tetra(etilenglicol), dimetacrilato de etilenglicol, dimetacrilato de di(etilenglicol), dimetacrilato de tri(etilenglicol), N,N-metilenbisacrilamida, N,N(1-,2-dihidroxietileno)bisacrilamida, agentes reticulantes sin formaldehído, N-(1-hidroxi-2,2-dimetoxietil)acrilamida, divinilbenceno, fijadores de formalina, formal calcio, formal solución salina, formalina de cinc (sin tampón), fijador de Zenker, fijador de Helly, fijador B-5, solución de Bouin, solución de Hollande, solución de Gendre, solución de Clarke, solución de Camoy, methacam, formalina alcohólica y alcohol formol acético.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde dichas vesículas extracelulares se seleccionan del grupo que consiste en exómeros, exosomas, cuerpos multivesiculares, vesículas intraluminales (ILV),

endosomas multivesiculares (MVE), oncosomas, microvesículas, cuerpos apoptóticos y vesículas que se originan en membranas endosomales o plasmáticas, en donde las vesículas extracelulares varían en tamaño de 20 nanómetros a 10.000 nanómetros.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra es un fluido o tejido biológico, preferentemente, en donde el fluido biológico se selecciona del grupo que consiste en productos sanguíneos, humor vítreo o acuoso, líquido cefalorraquídeo o líquido de aspirado de pezón, y preferentemente, en donde el tejido biológico es un tejido seleccionado del grupo que consiste en piel, hueso, cartílago, tendón, ligamento, disco vertebral, córnea, lente, menisco, pelo, músculo estriado, músculo liso, músculo cardíaco, tejido adiposo, tejido fibroso, tejido neuronal, tejido conjuntivo, cóclea, testículos, ovario, estómago, pulmón, corazón, hígado, páncreas, riñón, intestino y ojo.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el agente reticulante no reversible se selecciona del grupo que consiste en una carbodiimida soluble en agua, haluro de cianógeno y mezclas de los mismos, preferentemente, en donde el agente reticulante no reversible es 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida, bromuro de cianógeno, fluoruro de cianógeno, cloruro de cianógeno o yoduro de cianógeno.

6. Vesículas extracelulares fijadas obtenidas mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. El uso de un agente reticulante no reversible en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para detectar vesículas extracelulares en la muestra biológica mediante imágenes de las vesículas extracelulares fijadas.

8. El uso de la reivindicación 7, en donde dicha obtención de imágenes se realiza mediante microscopía electrónica de transmisión, microscopía electrónica de barrido, microscopía crioelectrónica, microscopía estereoscópica binocular, microscopía de campo amplio, microscopía de polarización, microscopía de contraste de fases, microscopía multifotónica, microscopía de contraste de interferencia diferencial, microscopia de fluorescencia, microscopía confocal de barrido láser, microscopía de excitación multifotónica, microscopía de rayos, microscopía ultrasónica, ensayo métrico de color, ensayo de quimioluminiscencia, espectrofotometría, tomografía por emisión de positrones, tomografía computarizada o imágenes por resonancia magnética.

9. El uso de un agente reticulante no reversible en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para detectar biomarcadores en la muestra.

10. El uso de la reivindicación 9, en donde los biomarcadores son vesículas extracelulares, proteínas, ARN o ADN.

11. Un método para diagnosticar si un primer sujeto tiene una enfermedad particular, comprendiendo el método: fijar vesículas extracelulares de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la muestra se toma de dicho primer sujeto;

obtener imágenes de las vesículas extracelulares fijadas; y

diagnosticar si dicho sujeto tiene la enfermedad particular basándose en dicha obtención de imágenes, en donde dicho diagnóstico comprende

proporcionar una imagen estándar de una muestra clínica que contiene vesículas extracelulares fijadas con el agente reticulante no reversible de un segundo sujeto al que se le ha diagnosticado la enfermedad particular; comparar la imagen de la muestra del primer sujeto con la imagen estándar con respecto al tamaño, densidad, morfología o distribución espacial de las vesículas extracelulares fijadas; y determinar si el sujeto tiene una enfermedad o trastorno basándose en dicha comparación.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en cáncer, enfermedades inflamatorias, infecciones, enfermedades degenerativas, enfermedades causadas por patógenos, enfermedades neurológicas y disfunciones internas.

13. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra es una muestra biológica y el método se realiza usando un kit que comprende:

un sustrato de soporte para sostener la muestra; y

un agente reticulante no reversible, en donde el agente reticulante no reversible se selecciona del grupo que consiste en una carbodiimida soluble en agua, haluro de cianógeno y mezclas de los mismos, preferentemente, en donde el agente reticulante no reversible es 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida.

14. El método de la reivindicación 13, en donde el kit comprende además un fijador adicional, en donde

el fijador adicional es un fijador que contiene aldehído, glutaraldehído, paraformaldehído, di(met)acrilato de etilenglicol, diacrilato de etilenglicol, diacrilato de di(etilenglicol), diacrilato de tetra(etilenglicol), dimetacrilato de etilenglicol, dimetacrilato de di(etilenglicol), dimetacrilato de tri(etilenglicol), N,N-metilenbisacrilamida, N,N-metilenbisacrilamida, N,N-(1,2-dihidroxietileno)bisacrilamida, agentes reticulantes sin formaldehído, N-(1-hidroxi-2,2-dimetoxietil)acrilamida, divinilbenceno, fijadores de formalina, formal calcio, formal solución salina, formalina de cinc (sin tampón), fijador de Zenker, fijador de Helly, fijador B-5, solución de Bouin, solución de Hollande, solución de Gendre, solución de Clarke, solución de Camoy, methacam, formalina alcohólica y alcohol formol acético.