ES2967248T3 - Dispositivo y método para detectar e identificar las vesículas extracelulares en una muestra de dispersión líquida - Google Patents
Dispositivo y método para detectar e identificar las vesículas extracelulares en una muestra de dispersión líquidaInfo
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Abstract
Dispositivo y método para detectar vesículas extracelulares dispersas en una muestra de dispersión líquida, utilizando dicho método un procesador de datos electrónico para clasificar la muestra según tenga o no vesículas extracelulares presentes, comprendiendo el método el uso del procesador de datos electrónico para el entrenamiento previo. un clasificador de aprendizaje automático con una pluralidad de muestras de dispersión líquida de vesículas extracelulares que comprende las etapas de: emitir un láser modulado por una frecuencia de modulación sobre cada muestra; capturar una señal temporal de la luz láser retrodispersada por cada espécimen durante una pluralidad de períodos temporales de una duración predeterminada para cada espécimen; calcular los coeficientes de transformada DCT o Wavelet de la muestra a partir de la señal capturada para cada uno de los períodos temporales; utilizar los coeficientes calculados para entrenar previamente el clasificador de aprendizaje automático; en el que el método comprende además las etapas de: usar un emisor láser que tiene un sistema óptico de enfoque acoplado al emisor para emitir un láser modulado por una frecuencia de modulación sobre la muestra; usar un receptor de luz para capturar una señal de luz láser retrodispersada por la muestra durante una pluralidad de períodos temporales de una duración predeterminada; calcular coeficientes de transformada DCT o Wavelet de muestra a partir de la señal capturada para cada uno de los períodos temporales; utilizando el clasificador de aprendizaje automático previamente entrenado para clasificar los coeficientes de muestra calculados si tienen o no vesículas extracelulares presentes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Dispositivo y método para detectar e identificar las vesículas extracelulares en una muestra de dispersión líquida
Campo técnico
La presente divulgación se refiere a un método y a un dispositivo para la detección de vesículas extracelulares (EV).
Antecedentes
Las vesículas extracelulares (EV) han atraído un creciente interés tanto académico como industrial por su elevado potencial en la comunicación célula a célula y la utilización como biomarcadores traduccionales para el diagnóstico y evaluación de la salud. El término “EV” describe las vesículas membranarias derivadas de células y diámetro comprendido entre 30 y 1000 nm, aunque se cree que la mayoría son de un tamaño entre 100 y 150 nm.
Debido a su pequeño tamaño y complejidad, las técnicas convencionales han encontrado difícil detectar e identificar las EV producidas por las diferentes poblaciones celulares. De hecho, con dimensiones comprendidas entre 100 y 150 nm, el uso de medios ópticos para detectar las EV resulta complicado, ya que es muy inferior al límite de difracción de la luz [1, 2].
Actualmente existe una falta de instrumentos compatibles con la detección de partículas en dichos intervalos de tamaño, y la microscopía electrónica12, la citometría de flujo convencional y de alta resolución12, el análisis de seguimiento de nanopartículas12, son enfoques de referencia (“gold standard”) para la detección y cuantificación de las EV presentes en una muestra.
La detección de vesículas extracelulares (principalmente exosomas) mediante la utilización de citometría de flujo de alta resolución se estima que se utiliza en 90 % de la investigación sobre nanopartículas de origen biológico [1,2]. A pesar de las mejoras de resolución que incluyen estos nuevos métodos respecto a los convencionales, todavía se basan en equipos voluminosos y todavía más caros (que requieren láseres de alta potencia, con un tamaño del punto del haz enfocado más pequeño que con el método convencional, por ejemplo)2. Además, continúan dependiendo del análisis de dos tipos de señales: las dispersadas y las señales de fluorescencia, que exigen caros sistemas computaciones y de control, y que están asociados a una técnica de análisis que requiere mucho tiempo.
La cantidad de luz dispersada por una partícula se ha considerado una técnica de referencia para una caracterización simple de las partículas, dada su dependencia de características cruciales de la dispersión, tales como el diámetro de partícula, el índice de refracción, la forma/geometría, la composición, el tipo de contenido (sintético o biológico) y los tipos de interacción con el medio circundante [3-5]. Las diferentes células u orgánulos celulares con frecuencia son diferentes en términos de sus valores de índice de refracción debido a los tipos de proteína que se expresan y las diferencias de carga intracelular que existen entre ellas [5]. Paiva et al. [6] divulgan un método y un dispositivo para atrapar, manipular y detectar partículas; sin embargo, dicho documento no describe que las partículas se detectan mientras están en dispersión y que resulta necesario inmovilizar, o atrapar, previamente dichas partículas.
Ninguno de dichos documentos enseña un método o un dispositivo que resulte adecuado para la detección de vesículas extracelulares en muestras líquidas. Estos hechos se dan a conocer con el fin de ilustrar el problema técnico al que se refiere la presente divulgación.
Referencias
[1] Steinbichler, T., Dudás, J., Riechelmann, H. y Skvortsova, I. The role of exosomes in cancer metastasis. Seminars in cancer biology 44, 170-181 (2017).
[2] Welsh, J., Holloway, J., Wilkinson, J. y Enlyst, N. Extracellular vesicle flow cytometry analysis and standardization. Frontiers in Cell and Developmental Biology 5, 78 (2017).
[3] Mei, Z., Wu, T., Pion-Tonachini, L., Qiao, W., Zhao, C., Liu, Z. y Lo, Y., "Applying an optical space-time coding method to enhance light scattering signals in microfluidic devices," Biomicrofluidics 5(3), 034116 (2011).
[4] Wu, T., Cho, S., Chiu, Y. y Lo, Y., "Lab-on-a-Chip Device and System for Point-of-Care Applications," Handbook of Photonics for Biomedical Engineering , 87-121 (2017).
[5] Welsh, J., Holloway, J., Wilkinson, J. y Englyst, N., "Extracellular vesicle flow cytometry analysis and standardization," Frontiers in cell and developmental biology 5, 78 (2017).
[6] JOANA PAIVA ET AL: "Single Particle Differentiation through 2D Optical Fiber Trapping and Back-Scattered Signal Statistical Analysis: An Exploratory Approach", SENSORS, vol. 18, n.° 3, 27 de febrero de 2018 (2018 02-27), DOI: 10.3390/s18030710
Descripción general
Un objeto principal de la presente divulgación es un método y un dispositivo para la detección de vesículas extracelulares (EV) en una muestra de dispersión líquida.
El método y el dispositivo propuestos pueden detectar la presencia de nanopartículas biológicas complejas (por ejemplo, tipos específicos de exosomas de cáncer) en soluciones líquidas complejas. El método y dispositivo divulgados cubren una gama de tamaños de detección entre 30 nm y 24 pm.
La presente divulgación resulta extremadamente útil para diferenciar el tipo de EV en formas de realización rápidas y simples.
En una forma de realización particular, dicho dispositivo puede estar incluido en microchips de microfluidos para el diagnóstico clínico rápido o para la integración en un sistema automatizado de producción de alimentos para la separación y selección de levaduras/otros microcompuestos de acuerdo con criterios de producto específicos. Es divulgado un dispositivo para la detección de vesículas extracelulares en una muestra de dispersión líquida, en el que dicho dispositivo comprende un emisor de láser, un sistema óptico de enfoque acoplado al emisor, un receptor de luz infrarroja y un procesador de datos electrónico dispuestos para clasificar la muestra de acuerdo con la presencia o no de vesículas extracelulares utilizando un clasificador de aprendizaje automático (“machine learning”) que ha sido preentrenado utilizando una pluralidad de especímenes de dispersión líquida de vesículas extracelulares, mediante un método que comprende:
emitir un láser modulado en una frecuencia de modulación, que incide sobre cada espécimen;
capturar una señal temporal procedente de la luz láser retrodispersada por cada espécimen en una pluralidad de periodos temporales de una duración predeterminada para cada espécimen;
calcular los coeficientes DCT o de transformada de ondícula (“wavelet”) de los especímenes a partir de las señales capturadas en cada uno de los periodos temporales;
utilizar los coeficientes calculados para preentrenar el clasificador de aprendizaje automático;
en el que el procesador de datos electrónico está dispuesto además para:
utilizar el emisor de láser para emitir un láser modulado por una frecuencia de modulación sobre la muestra; utilizar el receptor de luz para capturar una señal procedente de la luz láser retrodispersada por la muestra para una pluralidad de periodos temporales de una duración predeterminada;
calcular los coeficientes DCT o de transformada de ondícula a partir de las señales capturadas en cada uno de los periodos temporales;
utilizar el clasificador de aprendizaje automático preentrenado para clasificar los coeficientes de muestra calculados como presencia o no presencia de vesículas extracelulares.
Se da a conocer, además, un método para la detección de vesículas extracelulares en una muestra de dispersión líquida, en el que dicho método utiliza un procesador de datos electrónico para clasificar la muestra según la presencia o no de vesículas extracelulares,
en el que el método comprende la utilización del procesador de datos electrónico para el preentrenamiento de un clasificador de aprendizaje automático con una pluralidad de especímenes de dispersión líquida de vesículas extracelulares, que comprende las etapas de:
emitir un láser modulado en una frecuencia de modulación, que incide sobre cada espécimen;
capturar una señal temporal procedente de la luz láser retrodispersada por cada espécimen en una pluralidad de periodos temporales de una duración predeterminada para cada espécimen;
calcular los coeficientes DCT o de transformada de ondícula de los especímenes a partir de las señales capturadas en cada uno de los periodos temporales;
utilizar los coeficientes calculados para preentrenar el clasificador de aprendizaje automático; en el que el método comprende, además, las etapas de:
utilizar un emisor de láser que presenta un sistema óptico de enfoque acoplado al emisor para emitir un láser modulador en una frecuencia de modulación, que incide en la muestra;
utilizar un receptor de luz para capturar la señal de la luz láser retrodisperada por la muestra en una pluralidad de periodos temporales de una duración predeterminada;
calcular los coeficientes DCT o de transformada de ondícula a partir de las señales capturadas en cada uno de los periodos temporales;
utilizar el clasificador de aprendizaje automático preentrenado para clasificar los coeficientes de muestra calculados como presencia o no presencia de vesículas extracelulares.
En una forma de realización, el procesador de datos electrónico está organizado adicionalmente para clasificar, en caso de estar presentes, las vesículas extracelulares en una pluralidad de clases de tipo de vesícula extracelular mediante la utilización del clasificador de aprendizaje automático que ha sido preentrenado utilizando una pluralidad de clases de tipo de espécimen en dispersión líquida de vesícula extracelular.
En una forma de realización, el láser es un láser de luz visible o un láser de infrarrojos, o una combinación, en particular un láser de infrarrojos, y el receptor es un receptor de luz visible e infrarrojos.
En una forma de realización, el láser está adicionalmente modulado en una o más frecuencias de modulación adicionales.
En una forma de realización, la frecuencia de modulación de espécimen y la frecuencia de modulación de muestra son idénticas.
En una forma de realización, la duración predeterminada de espécimen y la duración predeterminada de muestra son idénticas.
En una forma de realización, la pluralidad capturada de periodos temporales de una duración predeterminada se obtiene mediante la división de una señal temporal capturada de una duración más larga que la duración predeterminada.
En una forma de realización, los periodos temporales divididos son periodos temporales solapantes.
En una forma de realización, la duración temporal predeterminada se selecciona de entre 1,5 y 2,5 segundos, en particular 2 segundos.
En una forma de realización, el procesador de datos electrónico está dispuesto además para preentrenar y clasificar a partir de la señal capturada utilizando características derivadas del histograma de dominios temporales o de los estadísticos de dominio temporal, en particular las características siguientes: wNakagami, pNakagami, entropía, desviación estándar o combinaciones de las mismas.
En una forma de realización, el sistema óptico de enfoque es una lente convergente.
En una forma de realización, el sistema óptico de enfoque es una lente convergente que es un fotoconcentrador polimérico dispuesto en la punta de una fibra óptica o guía de ondas.
En una forma de realización, el sistema óptico de enfoque es un sistema óptico de enfoque adecuado para proporcionar un patrón de gradiente de campo, en particular una lente polimérica, una fibra con estrechamiento gradual, placas de Fresnel de amplitud o fase, o cualquiera de ellas con una o más películas de oro añadidas que presentan un grosor y nano- o microorificios o una matriz de orificios para conseguir efectos plasmónicos.
En una forma de realización, la lente presente un punto de enfoque correspondiente a una cintura de haz de entre 1/3 y 1/4 del diámetro de base de la lente.
En una forma de realización, la lente presenta una apertura numérica (AN) superior a 0,5.
En una forma de realización, la lente presenta un diámetro de base de entre 5 y 10 pm, en particular de entre 6 y 8 pm.
En una forma de realización, la lente es esférica y presenta una longitud de entre 30 y 50 |jm, en particular de entre 37 y 47 jm .
En una forma de realización, la lente presente un radio de curvatura de entre 2 y 5 jm , en particular de entre 2,5 y 3,5 jm .
En una forma de realización, el receptor de luz infrarroja es un fotorreceptor que comprende un ancho de banda de entre 400 y 1000 nm.
En una forma de realización, el cálculo de los coeficientes de transformada comprende seleccionar un subconjunto mínimo de coeficientes de transformada, de manera que la transformada conserva un porcentaje predeterminado de la energía total de la señal.
En una forma de realización, el número del subconjunto mínimo de coeficientes de transformada DCT se selecciona de entre 20 y 40, o de 20, 30 o 40.
En una forma de realización, la captura de señal se lleva a cabo por lo menos con una frecuencia de muestreo de por lo menos cinco veces la frecuencia de modulación.
En una forma de realización, la captura de señal comprende un filtro de paso alto.
En una forma de realización, la frecuencia de modulación es igual o superior a 1 kHz.
En una forma de realización, las vesículas extracelulares presentan un tamaño de partícula en cualquier dirección de partícula inferior a 1 jm o de entre 30 nm y 30 jm .
Es divulgado, además, un medio de almacenamiento no transitorio que incluye instrucciones de programa para implementar un método para la detección de vesículas extracelulares en una muestra de dispersión líquida, en el que las instrucciones de programa incluyen instrucciones ejecutables por un procesador de datos electrónico para llevar a cabo el método de cualquiera de las formas de realización divulgadas.
Alternativamente a la transformada DCT o de ondícula, pueden utilizarse tanto transformaciones DCT como de ondícula, u otra transformada de reducción de la dimensionalidad de las series temporales, o pueden utilizarse múltiples transformaciones de reducción de la dimensionalidad de las series temporales.
En una forma de realización, la transformada de reducción de la dimensionalidad de las series temporales es la transformada de coseno discreta (DCT).
En una forma de realización, la transformada de reducción de la dimensionalidad de series temporales es la transformada de ondícula.
En una forma de realización, los tipos de ondícula son Haar y Daubechies (Db10).
La divulgación puede explicarse por la diferente respuesta de los distintos tipos de nanopartícula a un potencial electromagnético altamente enfocado. Dos tipos de fenómeno pueden contribuir a esta diferente respuesta de los diferentes tipos de nanoestructura: el patrón de movimiento browniano en dispersión líquida y/o la diferente polarizabilidad óptica, correlacionada intrínsecamente con el índice de refracción a escala microscópica. Por lo tanto, el patrón de movimiento browniano y/o la polarizabilidad óptica se ponen de manifiesto mediante los parámetros DCT y derivados de ondícula que se extraen de la luz retrodispersada, que son utilizados por dicho clasificador de aprendizaje automático preentrenado para la clasificación de las vesículas extracelulares.
En esta caso, la divulgación utiliza las claras fluctuaciones dependientes del tiempo de la intensidad de dispersión causadas por interferencia constructiva y destructiva que resulta tanto del movimiento browniano relativo de las nanopartículas en la dispersión líquida, dictado por la difusividad de las partículas en la dispersión (parámetro que únicamente depende del tamaño de partícula) como de la respuesta al potencial electromagnético altamente enfocado, que depende de la polarizabilidad óptica de la partícula. La superposición de estos dos efectos permite distinguir las EV del mismo tamaño, lo que no resulta posible utilizando los métodos basados en la dispersión de la luz del estado de la técnica.
La divulgación es aplicable a nanopartículas o micropartículas que muestran claras fluctuaciones dependientes del tiempo de la intensidad de dispersión causadas por interferencia constructiva y destructiva que resultan del movimiento browniano relativo de las nanopartículas en la muestra de dispersión líquida que afectan a la luz retrodispersada y las diferentes polarizabilidades ópticas (o índices de refracción a escala microscópica).
La divulgación detecta e identifica nanopartículas de diámetro, y/o índice de refracción y/o polarizabilidad óptica predeterminadas.
La divulgación es aplicable, además, a células individuales, en las que el dispositivo puede utilizarse para detectar una célula individual en una muestra de dispersión líquida. Además, la divulgación asimismo es aplicable a la clasificación de una célula individual en una muestra de dispersión líquida. Éstas preferentemente pueden atraparse para la medición. La célula puede ser una célula individualizada, en particular una célula humana individualizada, o un microorganismo unicelular. Por ejemplo, las pinzas de fibra óptica con capacidades de detección son capaces de proporcionar información significativa y específica sobre una partícula diana individualizada, atrapada establemente durante la medición.
En particular, la divulgación es aplicable a la detección de modificaciones postraduccionales, por ejemplo, incidentes de fosforilación o glucosilación como O-glicanos más cortos o truncados, los cuales se consideran marcadores predictivos de mal pronóstico en determinados cánceres. Estos fenómenos están frecuentemente asociados a una síntesis incompleta de glicanos durante la glucosilación celular.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras siguientes proporcionan formas de realización preferidas para ilustrar la descripción y no deben considerarse limitativas del alcance de la invención, como se expone en las reivindicaciones independientes.
Figura 1: representación esquemática de la configuración óptica según una forma de realización.
Figura 2: representación esquemática del concentrador óptico según una forma de realización.
Figura 3: representación esquemática del flujo de procesamiento de señales según una forma de realización.
Figura 4: representaciones gráficas de la distribución 2D de las dos características derivadas por DCT más significativas, extraídas de las señales retrodispersadas de EV tipo a y EV de tipo b simuladas (cruces frente a círculos).
Figura 5: representación esquemática según una forma de realización de cómo los datos se dividen para el entrenamiento y las pruebas, considerando un ejemplo de un experimento que incluye tres clases de partículas, en donde “n” pretende representar el número de tandas de evaluación/número de diferentes combinaciones entre grupos de entrenamiento y de prueba.
Figura 6: gráficos de señales para un experimento con soluciones complejas que contienen nanopartículas biológicas complejas.
Descripción detallada
La divulgación se describe con mayor detalle a continuación.
En la figura 1, se ilustra una configuración óptica (100). En la configuración óptica se incluyó un láser de 980 nm con fibrapigtail(500 mW, Lumics, ref. LU0980M500) (105). Para conectar dos inputs se utilizó un acoplador de fibra 50/50 con una topología 1x2 (110): el láser (105) y el fotodetector (115) (módulo de adquisición de señal retrodispersada). A continuación, se dividió la punta (120) de la fibra óptica a la salida del acoplador de fibra (110) y se insertó en un capilar metálico (125) controlado por el micromanipulador motorizado (130). Esta configuración permitió tanto la guía con luz láser a la punta (120) de la fibra óptica a través de la fibra óptica como la adquisición de la señal retrodispersada a través del fotodetector (PDA 36A-EC, Thorlabs) (115). Además del fotodetector, el módulo de adquisición de la señal retrodispersada asimismo estaba compuesto por una placa de adquisición análoga-a-digital (National Instruments DAQ) (135), que se conectó al fotodetector (115) para la transmisión de la señal adquirida al ordenador portátil, en donde se almacenó para el procesamiento posterior (145). Asimismo se conectó una salida digital-a-análoga del DAQ (135) al láser para modular su señal utilizando una señal sinusoidal con una frecuencia fundamental de 1 KHz. Se cargó una muestra líquida (140) sobre un cubreobjetos de vidrio y se insertó en la muestra una fibra con el fotoconcentrador (120) en la punta.
El tipo de fotoconcentrador se presenta en la figura 2 y consiste en una lente polimérica fabricada mediante un método de fotopolimerización de onda guiada. Este fotoconcentrador se caracteriza por una lente esférica convergente con una AN>0,5, capaz de enfocar el haz láser en un punto altamente enfocado correspondiente a una cintura de haz de entre aproximadamente 1/3 y 1/4 del diámetro de la base de la lente. Además, un diámetro de base de entre 6 y 8 pm (205) y un radio de curvatura de entre 2 y 3,5 pm asimismo resultan una solución adecuada. La punta de la fibra con el fotoconcentrador se sumerge en la muestra líquida y se adquiere la señal retrodispersada considerando diferentes localizaciones de la punta en la solución.
Se hace referencia a la figura 3 para explicar la adquisición y el procesamiento de la señal. Se adquirió la señal en bruto retrodispersada mediante un fotodetector (PDA 36A-EC, Thorlabs) conectado a un conversor analógico-adigital (National Instruments DQ) a una tasa de muestreo de 5 kHz para todos los experimentos (I-VII). Tras cada adquisición, se pasó la señal original a través de etapas de procesamiento. Durante el procesamiento de la señal, en primer lugar, se filtró la señal, utilizando un filtro de paso alto Butterworth de 500 Hz de segundo orden (350), ya que la radiación láser de entrada estaba modulada utilizando una señal sinusoidal de 1 kHz, y para eliminar componentes de baja frecuencia ruidosos en la señal adquirida (por ejemplo, el componente de 50 Hz de la red eléctrica). A continuación, la señal entera adquirida para cada partícula y condición se dividió en épocas de 2 segundos (310). La puntuación z de cada porción de señal de 2 segundos se calculó para eliminar las épocas de señal ruidosas (315). Las porciones de señal de 2 segundos con puntuación z que en magnitud excedían el valor umbral de entre 5 y 10 fueron eliminadas (315). Tras realizar dichas etapas, resultó posible obtener un conjunto de datos de porciones de señal de 2 s con una relación de señal a ruido (RSR) razonable para que resultase posible la identificación del tipo de EV (320).
Se extrajo una pluralidad de características (figura 3, 325), por ejemplo 54 características, a partir de la señal retrodispersada a fin de caracterizar cada clase que podía separarse en dos tipos principales: características de dominio temporal y características de dominio de frecuencia. El primer conjunto puede dividirse en dos subconjuntos: estadísticos de dominio temporal y características derivadas de histograma de dominio temporal. El conjunto de dominio de frecuencia asimismo se dividió en dos grupos: características derivadas mediante transformada de coseno discreta (DCT) y características de ondícula.
Se extrajeron los estadísticos de dominio temporal siguientes de cada porción de señal de 2 segundos: desviación estándar (SD), valor cuadrático medio (RMS), asimetría(Skew),kurtosis(Kurt),intervalo intercuartil(IQR),entropía (E), considerando su idoneidad para diferenciar con significancia estadística entre partículas sintéticas de diferentes tipos y células de levadura. Considerando que la distribución de Nakagami se ha utilizado ampliamente para describir el eco retrodispersado en términos estadísticos, principalmente en el campo biomédico, asimismo se consideran los parámetros Nâkagami y Nakagami derivados de la función de densidad de probabilidad (PDF) que mejor aproximan la distribución de cada porción de señal de 2 segundos a la distribución de Nakagami. En la clasificación se consideraron los parámetros derivados de histograma de dominio temporal. En total, se utilizaron ocho características obtenidas mediante análisis de dominios temporales de la señal retrodispersada mediante el método propuesto. Considerando la capacidad de capturar periodicidades mínimas de la señal analizada, al no estar correlacionados los coeficientes asociados, y debido al hecho de que, en contraste con la transformada de Fourier rápida (FFT), no inyecta artefactos de alta frecuencia en los datos transformados, se aplicó la transformada de coseno discreta (DCT) en las porciones de señal a corto plazo originales para extraer la información derivada de la frecuencia. Considerando que los primeros n coeficientes de la DCT de la señal eco dispersada se definen mediante la ecuación siguiente:
en la que £i es la envolvente de la señal estimada utilizando la transformada de Hilbert; mediante la ordenación de los coeficientes de DCT de valor de magnitud más alto a más bajo, y obteniendo el vector siguiente:
en el queEDCTi[ l1]representa el coeficiente de DCT de magnitud más alta, resulta posible determinar el porcentaje de la cantidad total de la energía de la señal representado por cada grupo de coeficientes (ordenados de más alto a más bajo). Cada valor de porcentaje referido a cada grupo de coeficientes (del primer al noveno coeficiente) puede obtenerse mediante división de la norma del vector formado por el primer coeficiente hasta el n-ésimo coeficiente por la norma del vector compuesto por la totalidad de losncoeficientes. De esta manera, se utilizaron las características derivadas de DCT siguientes para caracterizar cada porción de señal de 2 s: el número de coeficientes necesario para representar aproximadamente 98 % de la energía total de la señal original(Ndct),los primeros 20, 30 o 40 coeficientes de DCT extraídos del vector definido en (2), la superficie bajo la curva (AUC) del espectro de DCT para todas las frecuencias (de 0 a 2,5 kHz)(AUCdct),la amplitud máxima del espectro de DCT(Pícodct)y el espectro de potencias de la señal obtenido mediante la DCT considerando todos los valores dentro del intervalo de frecuencias analizado (de 0 a 2,5 kHz)(Pdct)(consultar la tabla 1).
Las 12 características restantes se extrajeron tras la descomposición en porciones de señal de 2 segundos utilizando ondículas 21 (consultar la tabla 1). Se seleccionaron dos ondículas madre(HaaryDaubechies(Db10)) para caracterizar cada porción de señal retrodispersada. Por lo tanto, se extrajeron seis características para cada tipo de ondícula madre basándose en la potencia relativa de la señal reconstruida que se había derivado del paquete de ondículas (uno a seis niveles) a partir de cada señal a corto plazo de 2 segundos.
La divulgación es capaz de detectar e identificar diferentes tipos de vesícula extracelular debido a que extrae características derivadas de la frecuencia a partir de la señal retrodispersada que son sensibles a las dimensiones de las partículas, a la polarizabilidad óptica y al índice de refracción a escala microscópica.
Tal como se indica en la ecuación 3, el movimiento de las nanopartículas es influido tanto por la difusividadDcomo por la respuesta de las partículas al potencial óptico ejercido sobre ellas por el campo electromagnético altamente enfocado. Por lo tanto, la variabilidad de las posiciones de las partículas durante el tiempo viene dada por la ecuación 3:
En la quekpotenciaidetermina la respuesta de las partículas al potencial óptico y depende de la polarizabilidad de las partículas, a, que se presenta en la ecuación 4:
En la que V/representa el gradiente del campo electromagnético en 1D y x es la coordenada de un punto dado en 1D sometido a las fuerzas ejercidas por el campo electromagnético aplicado. La polarizabilidad de las partículas, a, se define como:
En la que np es el índice de refracción a escala microscópica de las partículas y nm es el índice de refracción del medio.
Las ecuaciones 3 y 4 contrastan con la formulación “más simple” utilizada para describir el movimiento browniano de las nanopartículas en los métodos del estado de la técnica (por ejemplo, la dispersión dinámica de la luz), que dependen exclusivamente de la difusividad D de las partículas en la dispersión. Este movimiento browniano simple es proporcionado por la variabilidad de la posición de las partículas durante el tiempo (o(t)):
o(t) = 2 Dt. (5)
y D:
En la quekBes la constante de Boltzmann,Tes la temperatura absoluta,nes la viscosidad del fluido yres el radio de partícula. De esta manera, dicha formulación matemática del movimiento browniano afirma que la posición de las partículas durante el tiempo (o(t)) únicamente depende del radio de las nanopartículas.
Se hace referencia a la figura 4 para ilustrar los resultados obtenidos para la intensidad de la luz dispersada por un conjunto de dos poblaciones de diferentes EV de aproximadamente el mismo tamaño (poblaciones a y b) utilizando simulaciones teóricas. Se utilizaron dos poblaciones EV a y b y se caracterizaban por: ra=100 nm, rb=120 nm, y una proporción entre kpotencial,a y kpotencial,b de 2. La figura 4 subraya el papel esencial de considerar la polarizabilidad óptica y el índice de refracción a escala microscópica junto con las dimensiones de las partículas para obtener una separación perfecta entre dos clases diferentes de EV (figura 4A), recapitulando los resultados experimentales obtenidos en el laboratorio (figura 4B). No se consiguió separar las clases al considerar únicamente el movimiento browniano simple (figura 4C).
Se utilizó un algoritmo de clasificación para detectar las EV en muestras líquidas, es decir, el clasificador de bosques aleatorios.
Se hace referencia a la figura 5 para explicar el procedimiento de exclusión uno a uno (“Leave-One-Out'9 (400), que se llevó a cabo para garantizar que los datos utilizados para evaluar el rendimiento de un clasificador pertenecían a un sujeto/entidad que no había participado en ningún momento en el entrenamiento. De esta manera, si un conjunto de datos está compuesto por datos densujetos/entidades, el conjunto de prueba se divide ennrondas de prueba, en donde, en cada ronda, los datos de un sujeto se utilizan para pruebas y los datos de los n-1 sujetos restantes se utilizan para el entrenamiento del clasificador. En la siguiente ronda, el subconjunto de datos de otro sujeto que se ha seleccionado para el entrenamiento en la ronda previa se utiliza por separado para someter a prueba al clasificador. A continuación, se determina el rendimiento del clasificador basándose en los valores medios obtenidos tras lasnrondas de prueba.
El método y el dispositivo anteriormente mencionados se utilizaron en varios experimentos para demostrar su viabilidad y potencial para el objetivo deseado. De esta manera, los experimentos II, IV, V, VI y VII se diseñaron para no individualizar una partícula específica e identificarla, sino, por el contrario, para detectar la presencia de un tipo dado de nanopartícula en solución; el método basado en la exclusión de uno se modificó ligeramente. El factor que diferenciaba las porciones de señal de 2 segundos adquiridas durante los experimentos que incluían nanopartículas y micropartículas era el lugar en donde se habían obtenido entre adquisiciones. De esta manera, las porciones de señal utilizadas para las pruebas se adquirieron en localizaciones diferentes de las consideradas para el entrenamiento durante los experimentos con nanopartículas, un modo de evitar efectos de sobreajuste. Se observó que, en estos casos, no era posible individualizar las partículas debido a sus dimensiones a nanoescala y a la incapacidad de nuestras herramientas de fibra de atraparlas.
La tasa de clasificación más exacta para cada uno de los experimentos/problemas y la n-ésima tanda de evaluación se obtuvo mediante la determinación de la combinación más adecuada de valores entre los tres parámetros (figura 5; 405): el número de árboles, el número de predictores que se deben muestrear y el tamaño de hoja mínimo; consultar la tabla 1. Por lo tanto, esta combinación produce un clasificador entrenado mediante la consideración de esa combinación de valores (figura 5, 405). A continuación, se determinó la combinación más eficaz de dichos parámetros utilizando la validación cruzada cinco veces (figura 5, 405), para cada experimento y tanda de evaluación, durante la etapa de entrenamiento. Sin embargo, las muestras de entrenamiento se normalizaron. Se restó el valor medio de las muestras de entrenamiento para cada característica de cada muestra de datos de esa característica, y después se dividió por la desviación estándar correspondiente de la característica. Las muestras de entrada de prueba asimismo debían normalizarse de acuerdo con este procedimiento, utilizando la media de entrenamiento y desviación estándar obtenidas previamente para cada característica. Lo anterior permitió localizar los nuevos vectores de características a prueba en el espacio de características de entrenamiento.
Tabla 1: lista de parámetros ajustados durante el estadio de entrenamiento del clasificador para la optimización del modelo. N: número; Mín.: mínimo.
Las dos estirpes celulares seleccionadas y sus EV utilizadas en los experimentos II, VI y VII derivaron de la estirpe celular de cáncer gástrico MKN45:HST6,modificada genéticamente para presentar O-glicanos más cortos/truncados en su superficie, debido a la sobreexpresión de la sialiltransferasa ST6GalNAc1, yMock,es decir, las células de control correspondientes transfectadas con el vector vacío, que no inducía ningún cambio en los O-glicanos. Las estirpes celularesMocky de cáncerHST6indicadas solo diferían en los O-glicanos (carbohidratos) unidos a su superficie.
Los O-glicanos más cortos o truncados se consideran marcadores predictivos de mal pronóstico en determinados cánceres. Estos fenómenos están frecuentemente asociados a una síntesis incompleta de los glicanos durante la glucosilación celular, en comparación con la ruta celular bajo condiciones de salud.
El experimento II sometió a ensayo la identificación y clasificación de células eucarióticas en solución tamponada con fosfato (PBS) en un problema de cuatro clases. Se prepararon tres tipos de solución para someter a ensayo el método propuesto de identificación de células individuales. Dos de ellos estaban compuestos por las células de cáncer glucosiladas de manera diferente indicadas posteriormente(MockyHST6),suspendidas en PBS (solución tamponada con fosfato, 1x). La tercera solución contenía microesferas sintéticas de poliestireno (PS) de 8 pm asimismo suspendidas en PBS (1x).
El experimento IV sometió a ensayo la identificación y clasificación de células bacterianas en PBS en un problema de tres clases: (1) “ninguna partícula atrapada”, (2) “bacterias del yogurLactobacillus acidophilusatrapadas” y (3) “bacterias del yogurStreptococcus thermophilusatrapadas” (dimensiones de las dianas: 1,5 a 0,6 pm).
Los experimentos VI y VII sometieron a ensayo la identificación y clasificación de vesículas extracelulares producidas por célulasHST6yMock.
El experimento VI sometió a ensayo exosomas derivados deMockyHST6suspendidos en PBS mediante el método y dispositivo propuestos; clases consideradas: “clase 1: ausencia de exosomas (únicamente solución de blanco)”; “clase 2: presencia de exosomas derivados deMock,en suspensión” y “clase 3: presencia de exosomas derivados deHST6,en suspensión”.
El experimento VII se llevó a cabo bajo condiciones de reto utilizando PBS suplementado con suero de feto bovino (FBS) para resuspender las EV, un medio líquido complejo con elevadas concentraciones de proteínas, azúcares y lípidos. Se trató este FBS para eliminar las EV nativas. La figura 6 muestra las señales retrodispersadas que se obtuvieron con tres tipos diferentes de muestra: FBS sin EV con medio de cultivo celular (A); FBS sin EV suplementado con EV deMockcon medio de cultivo celular (B) y sin EV-FBS suplementado con EV deHST6con medio de cultivo celular (C).
La tabla 2 resume los resultados experimentales obtenidos en la presente divulgación, en particular los resultados referidos al rendimiento de la diferenciación entre células o EV mediante el método y el dispositivo propuestos.
La expresión “que comprende” cuando aparezca en la presente memoria pretende indicar la presencia de las características, números enteros, etapas y componentes indicados, aunque sin excluir la presencia o la adición de una o más otras características, números enteros, etapas, componentes o grupos de los mismos. La divulgación no debe considerarse en modo alguno limitada a las formas de realización descritas, y el experto ordinario en la materia podrá concebir muchas posibilidades de modificación de las mismas. Las formas de realización anteriormente descritas son combinables. Las reivindicaciones, a continuación, explican adicionalmente formas de realización particulares de la divulgación.
Tabla 3. Diferencias de rendimiento de identificación de EV considerando una fibra óptica perpendicularmente cortada y expuesta y una fibra óptica con el fotoconcentrador en la punta.
Claims (13)
1. Método para detectar las vesículas extracelulares mientras están dispersadas en una muestra de dispersión líquida, utilizando dicho método un procesador de datos electrónico para clasificar la muestra como presentando, o no presentando, vesículas extracelulares presentes,
comprendiendo el método la utilización del procesador de datos electrónico para preentrenar un clasificador de aprendizaje automático con una pluralidad de especímenes de dispersión líquida de vesículas extracelulares, mientras están dispersados, comprendiendo el método las etapas de:
emitir un láser modulado por una frecuencia de modulación sobre cada espécimen;
capturar una señal temporal a partir de la luz láser retrodispersada por cada espécimen para una pluralidad de periodos temporales de una duración predeterminada para cada espécimen;
calcular los coeficientes de transformada de coseno discreta (DCT) o de transformada de ondícula de espécimen a partir de la señal capturada para cada uno de los periodos temporales;
utilizar los coeficientes calculados para preentrenar el clasificador de aprendizaje automático;
en el que el método comprende además las etapas de:
utilizar un emisor de láser que presenta un sistema óptico de enfoque acoplado al emisor para emitir un láser modulado por una frecuencia de modulación sobre la muestra;
utilizar un receptor de luz para capturar una señal a partir de la luz láser retrodispersada por la muestra para una pluralidad de periodos temporales de una duración predeterminada;
calcular los coeficientes de transformada de coseno discreta (DCT) o de transformada de ondícula de muestra a partir de la señal capturada para cada uno de los periodos temporales;
utilizar el clasificador de aprendizaje automático preentrenado para clasificar los coeficientes de muestra calculados como presentando, o no presentando, vesículas extracelulares presentes;
en el que las vesículas extracelulares presentan un tamaño de partícula, en cualquier dirección de partícula, inferior a 1 |jm.
2. Método según la reivindicación anterior para detectar e identificar las vesículas extracelulares en una muestra de dispersión líquida, que comprende además el procesador de datos electrónico que clasifica, si están presentes, las vesículas extracelulares en una de una pluralidad de clases de tipo de vesícula extracelular utilizando el clasificador de aprendizaje automático que ha sido preentrenado utilizando una pluralidad de clases de tipo de espécimen de dispersión líquida de vesícula extracelular.
3. Método según la reivindicación anterior, en el que los periodos temporales divididos son periodos temporales solapantes.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el procesador de datos electrónico está dispuesto además para preentrenar y clasificar utilizando unas características derivadas de histogramas de dominio temporal o derivadas de estadísticas de dominio temporal a partir de la señal capturada, en particular las características: WNakagam¡; jUNakagam¡; entropía; desviación estándar; o combinaciones de las mismas.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sistema óptico de enfoque es una lente convergente, siendo en particular un fotoconcentrador polimérico dispuesto en la punta de una fibra óptica o guía de ondas.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cálculo de los coeficientes de transformada comprende seleccionar un subconjunto mínimo de coeficientes de transformada de manera que un porcentaje predeterminado de la energía total de la señal es conservado por la transformada.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende la captura de señal de por lo menos una frecuencia de muestreo de por lo menos cinco veces la frecuencia de modulación.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la frecuencia de modulación es igual o superior a 1 kHz.
9. Dispositivo para detectar vesículas extracelulares mientras están dispersadas en una muestra de dispersión líquida, comprendiendo dicho dispositivo un emisor de láser; un sistema óptico de enfoque acoplado al emisor; un receptor de luz infrarroja; y un procesador de datos electrónico dispuesto para clasificar la muestra como presentando, o no presentando, unas vesículas extracelulares presentes utilizando un clasificador de aprendizaje automático que ha sido preentrenado utilizando una pluralidad de especímenes de dispersión líquida de vesículas extracelulares, mientras están dispersados, mediante un método que comprende:
emitir un láser modulado por una frecuencia de modulación sobre cada espécimen;
capturar una señal temporal de luz láser retrodisperasda por cada espécimen para una pluralidad de periodos temporales de una duración predeterminada para cada espécimen;
calcular los coeficientes de transformada de coseno discreta (DCT) o de transformada de ondícula de espécimen a partir de la señal capturada para cada uno de los periodos temporales;
utilizar los coeficientes calculados para preentrenar el clasificador de aprendizaje automático;
en el que el procesador de datos electrónico está dispuesto además para:
utilizar el emisor de láser para emitir un láser modulado por una frecuencia de modulación sobre la muestra; utilizar el receptor de luz para capturar una señal de luz láser retrodispersada por la muestra para una pluralidad de periodos temporales de una duración predeterminada;
calcular los coeficientes de transformada de coseno discreta (DCT) o de transformada de ondícula de muestra a partir de la señal capturada para cada uno de los periodos temporales;
utilizar el clasificador de aprendizaje automático preentrenado para clasificar los coeficientes de muestra calculados como presentando, o no presentando, vesículas extracelulares presentes;
en el que las vesículas extracelulares presentan un tamaño de partícula, en cualquier dirección de partícula, inferior a 1 pm.
10. Dispositivo según la reivindicación 9, en el que el láser es un láser de infrarrojos.
11. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 9 a 10, en el que el sistema óptico de enfoque es una lente convergente, en particular en el que la lente presenta un punto de enfoque correspondiente a una cintura de haz de 1/3 a 1/4 de un diámetro de base de la lente.
12. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el sistema óptico de enfoque es un sistema óptico de enfoque adecuado para proporcionar un patrón de gradiente de campo.
13. Medio de almacenamiento no transitorio que incluye instrucciones de programa para implementar un método para detectar vesículas extracelulares en una muestra de dispersión líquida, incluyendo las instrucciones de programa unas instrucciones que cuando son ejecutadas en un dispositivo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, llevarán a cabo el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
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2019
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