ES2964577T3

ES2964577T3 - Papaver somniferum con alta concentración de codeína

Info

Publication number: ES2964577T3
Application number: ES09753338T
Authority: ES
Inventors: Anthony J Fist; James A C Miller; Davina Gregory-Dunsmuir
Original assignee: Tasmanian Alkaloids Pty Ltd
Current assignee: Tasmanian Alkaloids Pty Ltd
Priority date: 2008-05-29
Filing date: 2009-05-28
Publication date: 2024-04-08
Anticipated expiration: 2029-05-28
Also published as: HUE064780T2

Abstract

La presente invención está dirigida a una paja de amapola mejorada, un concentrado de paja de amapola y opio de Papaver somniferum para la producción de codeína que contiene poca o ninguna oripavina, morfina o tebaína. La presente invención también proporciona plantas, rodales y semillas de Papaver somniferum y métodos para la producción de codeína. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Papaver somniferumcon alta concentración de codeína

Campo de la invención

La presente invención se dirige a la producción mejorada de codeína. Más particularmente, la presente invención se refiere al uso de una planta de adormideraPapaver somniferummejorada para producir codeína con mayor rendimiento, lo que permite producir codeína sin la necesidad de cultivar adormideras con morfina.

Antecedentes de la invención

La codeína es un opiáceo usado por sus propiedades analgésicas, antitusivas y antidiarreicas. Es, con diferencia, el opiáceo de más amplio uso en el mundo y, muy probablemente, el fármaco de uso más común en general, de acuerdo con numerosos informes realizados a lo largo de los años por organizaciones tales como la Organización Mundial de la Salud.

La codeína es un alcaloide natural de la planta de amapola adormideraPapaver somniferum L.pero normalmente constituye solo una fracción menor del total de alcaloides, por ejemplo, típicamente solo el 5-20 % del nivel de morfina. Si bien la codeína puede extraerse del opio y de la paja de adormidera, la demanda de codeína supera con creces el suministro natural disponible actualmente, por lo que la mayor parte de la codeína que se fabrica actualmente (el 85-90 por ciento) se obtiene a partir de la morfina a través del proceso de O-metilación. La mayor parte de la producción lícita de morfina en el mundo se destina a soportar la fabricación de codeína. Si la codeína pudiera obtenerse de adormideras que no contienen morfina, disminuiría en gran medida el cultivo de adormideras con morfina, con potencial para el desvío y abuso. La codeína se usa para fabricar ingredientes farmacéuticos activos (API), tales como el fosfato de codeína, el sulfato de codeína, el clorhidrato de codeína y la base de codeína que, a su vez, se usan para fabricar, por ejemplo, formas de dosificación de gran volumen y de venta sin receta para el alivio del dolor (analgésicos) y la tos (antitusivos). La codeína es también el material de partida y el prototipo de una gran clase de opioides, principalmente de leves a moderadamente fuertes, tales como la dihidrocodeína y la hidrocodona y sus derivados, tales como la nicocodeína y la oxicodona. Por tanto, la hidrogenación catalítica de la codeína produce dihidrocodeína (usada para fabricar los API, tal como el tartrato de dihidrocodeína) que, a su vez, puede convertirse mediante oxidación de Oppenauer en dihidrocodeinona (hidrocodona, usada para fabricar los API, tal como el bitartrato de hidrocodona).

La metilación a escala industrial de la morfina, en el grupo hidroxilo fenólico de la posición 3, para dar codeína, usualmente se realiza mediante el uso de agentes metilantes de amonio cuaternario, típicamente cloruro de trimetilfenilamonio, en presencia de diversas bases tales como hidróxidos, alcóxidos o carbonatos/bicarbonatos alcalinos. El uso del agente metilante de amonio cuaternario disminuye en gran medida la metilación competitiva de la función amina terciaria del alcaloide, lo cual es un problema importante con otros agentes metilantes tales como haluros de metilo o sulfato de dimetilo, donde la formación de las sales cuaternarias del alcaloide causa pérdida del rendimiento y la generación de otras impurezas tales como codimetina alfa y beta, a través de la reacción de eliminación de Hofmann. Sin embargo, esta solución al problema de la cuaternización es a expensas de generar el subproducto tóxico y de olor cuestionable, N,N-dimetilanilina (DMA); esto debe eliminarse por completo del producto e impone preocupaciones sobre la eliminación de desechos, la salud y seguridad laboral (OHS) y el medio ambiente. La mayoría de los procedimientos de metilación que usan reactivos de trimetilfenilamonio implican esencialmente la exposición del par iónico de mortinato de trimetilamonio a altas temperaturas (superiores a 90 grados C) en un solvente no polar e inmiscible en agua, tal como tolueno o xileno, donde el par iónico colapsa rápidamente en codeína y d Ma . La necesidad de tales solventes crea cargas ambientales y de OHS adicionales en la fabricación e impone costos asociados con la recuperación y purificación del solvente. En las condiciones vigorosas necesarias, es imperativo que la estequiometría de los reactivos se controle cuidadosamente para evitar, por un lado, la submetilación, que deja demasiada morfina sin reaccionar o, por otro lado, la sobremetilación, que conduce a la formación de codeína-O(6)-metil éter ("metilcodeína"). Ambas situaciones conducen a pérdidas de rendimiento tanto directamente, a través de una menor formación de codeína, como indirectamente a través de pérdidas de codeína adicionales derivadas de la eliminación de la morfina sin reaccionar o de las impurezas de metilcodeína; la morfina es relativamente fácil de eliminar, por ejemplo, mediante el lavado de una solución de codeína en tolueno con álcali acuoso, pero este proceso también sacrifica algo de codeína en los lavados, mientras que la metilcodeína es difícil de eliminar y puede requerir un procesamiento exhaustivo para lograr los límites deseados. Otra impureza problemática creada por la síntesis de la morfina es la dimetilpseudomorfina, creada por la metilación de una impureza común en el concentrado de paja de adormidera que contiene morfina, la pseudomorfina (2,2'-bismorfina). La dimetilpseudomorfina es particularmente difícil de eliminar de la codeína e impone altas pérdidas de rendimiento debido al procesamiento adicional que se requiere.

La fabricación de codeína a partir de morfina requiere, en alguna etapa, un procesamiento exhaustivo para eliminar los conglomerados de colorantes que se originan en el opio o en el concentrado de paja de adormidera que contiene morfina (CPS-M); en este último caso los conglomerados de colorantes derivan del proceso de extracción inicial que produce morfina a partir de la paja de adormidera; las condiciones de extracción que se requieren para recuperar la morfina a partir de la paja de adormidera son tales que hay una extracción considerable e inevitable de materiales coloreados de la adormidera y el CPS-M puede, típicamente, tener varios por cientos de material no alcaloide. Con el opio como insumo, la materia prima es extremadamente impura (por ejemplo, 5-24 % de morfina) y es obligatorio purificar y separar la morfina de los otros alcaloides y conglomerados de colorantes antes de incorporarla a la fabricación de codeína, mientras que con el concentrado de paja de adormidera que contiene morfina, algunos fabricantes mejoran la morfina a calidad técnica antes de fabricar codeína, mientras que otros introducen el material directamente en la metilación y luego lo procesan para eliminar el color después de la metilación; ambos enfoques tienen considerables penalizaciones de costos asociadas con el procesamiento adicional, pérdidas de rendimiento inevitables y costos de capacidad y oportunidad. La codeína es más soluble que la morfina en prácticamente todos los medios comunes y, en consecuencia, es más fácil de extraer a partir de las adormideras y de purificar; por tanto, el rendimiento, la calidad y el costo de la codeína natural obtenida de una adormidera con codeína mejoran con relación a la codeína sintética obtenida a partir de la morfina natural.

Los alcaloides se extraen de las cápsulas de adormideraPapaver somniferummediante dos métodos comerciales. En un método, se corta la cápsula inmadura y se recolecta el látex de la herida. El látex secado al aire es opio que, de acuerdo con el Índice de Merck, 11.a edición, contiene alcaloides en las cantidades que se muestran en la Tabla I. En un segundo método, las cápsulas de adormidera maduras y los tallos de las cápsulas de adormidera se recolectan y se trillan para eliminar las semillas y formar una paja. Cuando es necesario, la paja se seca hasta un contenido de agua más abajo del 16 %. Se emplea la extracción con solvente o agua para retirar los alcaloides de la paja. Para las variedades dePapaver somniferumque se cultivan normalmente, la paja, en forma seca, contiene alcaloides en las cantidades que se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1

Como puede observarse, el rendimiento de codeína se confunde con el de otros alcaloides. Una adormidera que produzca predominantemente codeína, por ejemplo, el 55 % o más del total de alcaloides, permitiría un proceso de extracción/purificación más simple, lo que resultaría en mayores rendimientos, mejor calidad y rendimiento y menores costos.

Cuando se usa solvente, agua o fluido supercrítico, tal como CO<2>, la extracción se emplea para retirar los alcaloides de la paja; tal método, tal como se practica, implica la producción de "concentrado de paja de adormidera". El concentrado de paja de adormidera (o "CPS") se describe como "el material que surge cuando la paja de adormidera ha entrado en un proceso para la concentración de sus alcaloides, cuando tal material está disponible en el comercio" (Multilingual dictionary of narcotic drugs and psychotropic substances under international control, Naciones Unidas, Nueva York, 1983). Sin contradecir la descripción anterior, el concentrado de paja de adormidera se describe como "el extracto crudo de paja de adormidera en forma líquida, sólida o en polvo que contiene los alcaloides fenantreno de la amapola adormidera" 45 Registro Federal de los Estados Unidos 77466, 24 de noviembre de 1980. Cuando está en forma líquida, el líquido se concentra, preferentemente, antes de entrar en el comercio. El concentrado de paja de adormidera que se prefiere generalmente es la forma en polvo que resulta de eliminar el solvente o el agua después de la extracción de la paja de adormidera. De acuerdo con la publicación de las Naciones Unidas 'Narcotic Drugs: Estimated World Requirements for 2007; Statistics for 2005 (E/INCB/2006/2)', el "concentrado de paja de adormidera es el residuo seco que se obtiene a través de la extracción de los alcaloides, a partir de la paja de adormidera. Hasta la segunda mitad de la década de 1990, solo se fabricaba concentrado de paja de adormidera que contenía morfina como alcaloide principal. Desde entonces se comenzó a fabricar concentrado de paja de adormidera que contiene principalmente tebaína u oripavina."

En unos pocos países se producen algunas cantidades relativamente pequeñas de codeína CPS como un subproducto de la extracción de la morfina CPS. Estas cantidades no son significativas en el comercio mundial. La invención que se reivindica ahora proporciona CPS codeína que tiene un gran potencial comercial porque permite la producción de CPS codeína y derivados sin la necesidad de cultivar adormideras que contengan morfina.

Resumen de la invención

La presente invención se dirige a un concentrado de paja de adormidera, obtenido a partir de una paja de adormidera de una planta dePapaver somniferum,dicha planta tiene un rasgo de alto contenido de codeína, en donde la codeína es el alcaloide predominante, y en la paja de adormidera constituye el 40 % o más, en peso, de la combinación de alcaloides que comprende morfina, codeína, tebaína y oripavina, sin que haya sustancialmente oripavina o morfina en la combinación de alcaloides, dicha planta puede obtenerse al:

cruzar una primera planta progenitora deP. somniferumque contiene tebaína con una segunda planta progenitora deP. somniferumque contiene morfina, en donde la primera planta de P.somniferumcontiene una mutación que evita que la tebaína se convierta en neopinona y evita que la oripavina se convierta en morfinona, dicha mutación se designa "TOP1", y una mutación adicional que bloquea la conversión de tebaína en oripavina y también bloquea la etapa metabólica entre la codeína y la morfina, de manera que la primera planta deP. somniferumproduce paja de adormidera que contiene tebaína y no tiene, sustancialmente, oripavina, morfina o codeína, y

producir una generación F2 de plantas mediante autopolinización de plantas F1 obtenidas de dicho cruce y seleccionar las plantas en la generación F2 que contienen altos contenidos de codeína y no tienen, sustancialmente, oripavina o morfina, en donde dichas plantas seleccionadas tienen dicho rasgo de alto contenido de codeína,

en donde la mutación TOP1 es de la semilla depositada con el número de acceso ATCC PTA-9110, y en donde la mutación adicional es la contenida en la semilla del depósito ATCC PTA-9294.

La invención también se refiere a un método para la producción de codeína que comprende las etapas de:

a) cosechar cápsulas de adormidera de una planta dePapaver somniferumpara producir una paja de adormidera, dicha planta tiene un rasgo de alto contenido de codeína, en donde la codeína es el alcaloide predominante y en la paja de adormidera constituye el 40 % o más, en peso, de una combinación de alcaloides que comprende morfina, codeína, tebaína y oripavina, sin que haya sustancialmente oripavina o morfina en la combinación de alcaloides,

dicha planta puede obtenerse al cruzar una primera planta progenitora deP. somniferumque contiene tebaína con una segunda planta progenitora deP. somniferumque contiene morfina,

en donde la primera planta deP. somniferumcontiene una mutación que evita que la tebaína se convierta en neopinona y evita que la oripavina se convierta en morfinona, dicha mutación se designa "TOP1", y una mutación adicional que bloquea la conversión de tebaína en oripavina y también bloquea la etapa metabólica entre la codeína y la morfina,

de manera que la primera planta deP. somniferumproduce paja de adormidera que contiene tebaína y no tiene sustancialmente oripavina, morfina o codeína,

producir una generación F2 de plantas mediante la autopolinización de plantas F1 obtenidas de dicho cruce, y seleccionar plantas en la generación F2 que contienen altos contenidos de codeína y no tienen sustancialmente oripavina o morfina, en donde dichas plantas seleccionadas tienen dicho rasgo de alto contenido de codeína, en donde la mutación TOP1 es de la semilla depositada con el número de acceso ATCC PTA-9110, y

en donde la mutación adicional es la contenida en la semilla del depósito ATCC PTA-9294; y

b) extraer la codeína a partir de la paja de adormidera.

La presente invención también se refiere al uso de un concentrado de paja de adormidera como se describió anteriormente, para la producción de codeína y derivados de la codeína. La invención también se dirige a la paja de adormidera a partir de la cual se obtiene el concentrado de paja de adormidera, como se describió anteriormente. Por tanto, la presente invención se dirige a un concentrado de paja de adormidera, obtenido a partir de una paja de adormidera de una planta dePapaver somniferum,como se describió anteriormente, que, tras la cosecha de sus cápsulas de adormidera producirá una paja de adormidera que tiene codeína que constituye aproximadamente el 40 % (preferentemente aproximadamente el 50 %, con mayor preferencia aproximadamente el 75 %, aún con mayor preferencia aproximadamente el 90 % y con la máxima preferencia, aproximadamente el 96 %) o más, en peso, de la combinación de alcaloides que comprende morfina, codeína, tebaína y oripavina, sin que haya sustancialmente oripavina o morfina en la combinación de alcaloides. Preferentemente, el contenido de codeína es superior al 0,8 % (preferentemente, superior al 2,0 %, con mayor preferencia, superior al 2,5 %, aún con mayor preferencia, superior al 3,0 % y con la máxima preferencia, superior al 3,5 %) en la paja de adormidera en base al peso en seco. En otra modalidad, el contenido de codeína está entre 0,8 % y aproximadamente 4,2 % (preferentemente, entre aproximadamente 2,5 % y aproximadamente 4,2 %, con mayor preferencia, entre aproximadamente 3,0 % y 4,2 %, con la máxima preferencia, entre 3,5%y 4,2 %) en base al peso en seco. En una modalidad de la presente invención, la paja de adormidera de la planta dePapaver somniferumtendrá tebaína que constituye aproximadamente el 40 % (preferentemente aproximadamente el 25 %, con mayor preferencia aproximadamente el 10 % y con la máxima preferencia aproximadamente el 2 %) o menos, en peso, de la combinación de alcaloides y codeína que constituye el 55 % o más, en peso, de la combinación de alcaloides. Un experto en la técnica entenderá que el contenido total de alcaloides en la paja de adormidera o el opio, en cualquiera de las modalidades de la presente invención, totalizará (pero no excederá) el 100 %. En una modalidad preferida, no hay sustancialmente morfina, tebaína u oripavina en la combinación de alcaloides. En otra modalidad de la presente invención, la combinación de alcaloides comprende además salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina y noscapina. En aún otra modalidad, la planta se reproduce de manera estable.

En otra modalidad de la invención, dicho concentrado de paja de adormidera se obtiene a partir de una paja de adormidera, en donde la relación de codeína y tebaína con respecto a una combinación de alcaloides que comprende morfina, codeína, tebaína y oripavina está entre aproximadamente 0,90 y aproximadamente 1,00 (preferentemente entre aproximadamente 0,98 y aproximadamente 1,00, con mayor preferencia entre aproximadamente 0,99 y aproximadamente 1,00). En aspectos adicionales de la invención, la combinación de alcaloides puede comprender además salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina y noscapina, y las plantas dePapaver somniferumse reproducen de manera estable.

En aún otra modalidad de la invención, dicho concentrado de paja de adormidera se obtiene a partir de una paja de adormidera, en donde la relación de codeína con respecto a una combinación de alcaloides que comprende morfina, codeína, tebaína y oripavina es aproximadamente 0,40 o mayor. Preferentemente, la relación está entre aproximadamente 0,65 y aproximadamente 0,97, con mayor preferencia, entre aproximadamente 0,75 y aproximadamente 0,97. En aspectos adicionales de la invención, la combinación de alcaloides puede comprender además salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina y noscapina, y las plantas dePapaver somniferumse reproducen de manera estable.

En una modalidad no reivindicada, la invención también se dirige a un rodal de cualquiera de las plantas de adormidera descritas anteriormente.

También se incluyen, en una modalidad no reivindicada de la invención, semillas de cualquiera de las plantas de adormidera descritas anteriormente. En una modalidad particular, la semilla es una semilla ATCC PTA-9294 dePapaver somniferum.

La invención también proporciona una paja de adormidera, concentrado de paja de adormidera de cualquiera de las plantas dePapaver somniferumdescritas anteriormente.

En otra modalidad de la invención hay un método para la producción de codeína que comprende las etapas de: a) cosechar cápsulas de adormidera de cualquiera de las plantas dePapaver somniferumdescritas anteriormente para producir una paja de adormidera; y b) extraer la codeína a partir de la paja de adormidera.

En aún otra modalidad no reivindicada hay un método para la producción de codeína que comprende las etapas de: a) recolectar y secar el látex de las cápsulas inmaduras de adormidera de cualquiera de las plantas dePapaver somniferumdescritas anteriormente para producir opio e; y b) extraer la codeína a partir del opio.

La invención también incluye una paja de la adormideraPapaver somniferuma partir de la cual se obtiene el concentrado de paja de adormidera descrito anteriormente, que tiene codeína que constituye entre aproximadamente 0,8 % y aproximadamente 4,2 % (preferentemente, entre aproximadamente 2,0 % y aproximadamente 4,2 %, con mayor preferencia, entre aproximadamente 2,5 % y aproximadamente 4,19 %) del contenido de alcaloides de la paja de adormidera, en base al peso en seco.

Otra modalidad de la invención es una paja de la adormideraPapaver somniferuma partir de la cual se obtiene el concentrado de paja de adormidera descrito anteriormente, en donde la relación de codeína con respecto a una combinación de alcaloides que comprende morfina, codeína, tebaína y oripavina está entre aproximadamente 0,40 y aproximadamente 1,00 (preferentemente, entre aproximadamente 0,65 y aproximadamente 0,97, con mayor preferencia, entre aproximadamente 0,75 y aproximadamente 0,97), en base al peso en seco. Preferentemente, la combinación de alcaloides comprende además salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina y noscapina.

La invención también se dirige a una paja de adormidera que comprende una paja de la adormideraPapaver somniferuma partir de la cual se obtiene el concentrado de paja de adormidera descrito anteriormente, en donde la relación de codeína con respecto a una combinación de alcaloides que comprende morfina, codeína, tebaína y oripavina es mayor que 0,4, y la relación de codeína y tebaína con respecto a una combinación de alcaloides que comprende morfina, codeína, tebaína y oripavina está entre aproximadamente 0,90 y aproximadamente 1,00 (preferentemente, entre aproximadamente 0,98 y aproximadamente 1,00, con mayor preferencia, entre aproximadamente 0,99 y aproximadamente 1,00). Preferentemente, la combinación de alcaloides comprende además salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina y noscapina.

También se describe en la presente invención, en una modalidad no reivindicada, un método para mejorar el rendimiento de codeína de unaPapaver somniferum,que se reproduce de manera estable, el método comprende las etapas de:

a) exponer al menos una semilla de la adormideraPapaver somniferuma un agente mutagénico,

b) cultivar al menos una semilla de adormidera mutagenizada para producir una planta que tenga una hoja o una cápsula de adormidera inmadura, opcionalmente a través de múltiples generaciones autofertilizadas, c) tomar muestras de la hoja o cápsula de adormidera (o cualquier otro tejido que contenga látex) de la(s) planta(s) cultivada(s) en b) para determinar la presencia de tebaína, oripavina, morfina y codeína,

d) repetir las etapas a) a c) hasta que se obtiene una planta de adormideraPapaver somniferumque tiene codeína que constituye aproximadamente el 40 % (preferentemente, aproximadamente el 55 %) o más, en peso, y que tiene tebaína que constituye aproximadamente el 40 % o menos, en peso, de la combinación de alcaloides, en donde la combinación de alcaloides comprende morfina, codeína, tebaína y oripavina; y

e) recolectar la semilla de la planta obtenida en "d" y cultivar otra generación de plantas para garantizar que la generación subsecuente reproduzca de manera estable la característica de alto contenido de codeína y bajo contenido de morfina.

La presente invención también describe, en una modalidad no reivindicada, un método para mejorar el rendimiento de codeína de unaPapaver somniferum,que se reproduce de manera estable, el método comprende las etapas de:

a) exponer al menos una semilla de la adormideraPapaver somniferumque contiene la mutación Norman (al menos una semilla de adormidera de una adormidera Norman) a un agente mutagénico,

d) repetir las etapas a) a c) hasta que se obtiene una planta de adormideraPapaver somniferumque tiene tebaína como alcaloide predominante, y no tiene sustancialmente oripavina en la combinación de alcaloides, en donde la combinación de alcaloides comprende morfina, codeína, tebaína y oripavina;

e) recolectar la semilla de la planta obtenida en "d" y cultivar, opcionalmente, otra generación de plantas para garantizar que la generación subsecuente reproduzca de manera estable la característica de alto contenido de tebaína y bajo contenido de oripavina;

f) polinizar de forma cruzada la planta obtenida en "d" (o una planta similar obtenida en generaciones subsecuentes) con una planta dePapaver somniferumque contiene morfina;

g) cultivar una generación F1, permitir que las yemas se autopolinicen y recolectar la semilla producida;

h) cultivar la semilla de la F2 y tomar muestras de la hoja o de la cápsula de adormidera (o de cualquier otro tejido que contenga látex) para determinar la presencia de tebaína, oripavina, morfina y codeína,

i) identificar plantas de adormidera que tienen codeína que constituye aproximadamente el 40 % (preferentemente, aproximadamente el 55 %) o más, en peso, y que tienen tebaína que constituye aproximadamente el 40 % o menos, en peso, de la combinación de alcaloides, en donde la combinación de alcaloides comprende morfina, codeína, tebaína y oripavina y no tiene, sustancialmente, morfina; y

j) recolectar la semilla a partir de la planta obtenida en "i" y cultivar otra generación de plantas para garantizar que la generación subsecuente reproduzca de manera estable la característica de alto contenido de codeína (la codeína constituye aproximadamente el 40 %, preferentemente aproximadamente el 55 %, o más, en peso, de la combinación de alcaloides) y bajo contenido de tebaína (la tebaína constituye aproximadamente el 40 % o menos, en peso, de la combinación de alcaloides) y morfina (no tiene, sustancialmente, morfina).

La presente invención también proporciona un concentrado de paja de adormidera obtenido a partir de una paja de adormidera que tiene un contenido de codeína de aproximadamente 0,81 % a aproximadamente 4,19 %, y que tiene morfina que constituye aproximadamente 0,05 % o menos del peso de la paja, en base al peso en seco cada una. La presente invención proporciona paja de adormidera a partir de la cual se obtiene el concentrado de paja de adormidera descrito anteriormente que, además de los contenidos de codeína presentados anteriormente, contiene tebaína que constituye de aproximadamente el 0,02 % de la paja de adormidera a aproximadamente el 2,24 % de la paja de adormidera en base al peso en seco.

La invención, en una modalidad no reivindicada, también se dirige a la progenie dePapaver somniferumseleccionada del grupo que consiste en ATCC PTA-9147 y ATCC PTA-9294, dicha progenie produce una paja de adormidera que tiene codeína que constituye aproximadamente el 40 % (preferentemente aproximadamente el 55 %) o más, en peso, de una combinación de alcaloides, en donde la combinación de alcaloides comprende morfina, codeína, tebaína y oripavina.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 proporciona un cromatograma que muestra la separación de los alcaloides mediante el uso del método isocrático de UPLC.

La Figura 2 proporciona un cromatograma de la paja de adormidera de la generación M3 de FN1-1242-3. ATA indica la tebaína, ori indica el pico de oripavina, AMA representa la morfina y ACA representa la codeína.

La Figura 3 proporciona un cromatograma de la paja de adormidera de la planta 10 (línea PH08-0010) de la Tabla 12 que muestra un pico de codeína a los 0,78 minutos.

La Figura 4 proporciona un cromatograma del concentrado de paja de adormidera - codeína, preparado a partir de la paja de adormidera de PH08-0026.

Descripción detallada de la invención

Al utilizar las plantas dePapaver somniferummutagenizadas como se describe en la presente descripción, los expertos en la técnica saben fácilmente cómo cultivarlas, reproducirlas, recolectar el látex o la paja seca y purificar el alcaloide deseado, por ejemplo, tebaína, codeína. Como una facilitación de la presente invención, las semillas de las plantas dePapaver somniferummutagenizadas (FN1-1242-3), como se describe en la presente descripción, se depositaron en virtud del Tratado de Budapest en la Colección americana de cultivos tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 20 de marzo de 2008, con el número de acceso ATCC PTA- 9109, y estarán disponibles una vez que esta solicitud se convierta en una patente. En otra facilitación de la presente invención, las semillas de las plantas dePapaver somniferummutagenizadas (FW08-0039), como se describe en la presente descripción, se depositaron en virtud del Tratado de Budapest en la Colección americana de cultivos tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 9 de abril de 2008, con el número de acceso ATCC pTa -9147 y estarán disponibles una vez que esta solicitud se convierta en una patente. En otra facilitación de la presente invención, las semillas de las plantas dePapaver somniferummutagenizadas (PH08-0002), como se describe en la presente descripción, se depositaron en virtud del Tratado de Budapest en la Colección americana de cultivos tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 26 de junio de 2008, con el número de acceso ATCC PTA-9294 y estarán disponibles una vez que esta solicitud se convierta en una patente.

La disponibilidad de estas semillas no debe interpretarse como una licencia para practicar esta invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes o derechos de obtentor. Independientemente de la facilitación proporcionada por este depósito, los expertos en la técnica de semillas mutagenizadas pueden obtener la semilla de la presente descripción al emplear el proceso de mutagénesis como se describe más abajo.

La producción de semillas mutagenizadas se conoce bien en la técnica. Los métodos de mutagénesis de semillas, así como también los mutágenos adecuados para su uso en estos métodos, tales como el metanosulfonato de etilo (EMS), se describen en Manual on Mutation Breeding, 2da ed., I.A.E.A., Viena 1977 o en el documento Plant Breeding, Principles and Prospects, Chapman y Hall, Londres 1993. Para las semillas mutagenizadas por rayos X, las semillas hidratadas pueden tratarse con 20000 rad (a 30 cm de la fuente durante 45 minutos mediante el uso de un filtro). La mutagénesis por rayos X se describe y se compara con la mutagénesis por EMS en el documento de Filippetti, A. y otros, "Improvement of Seed Yield in Vicia Faba L. By Using Experimental Mutagenesis II Comparison of Gamma-Radiation and Ethyl-Methane-Sulphonate (EMS) in Production of Morphological Mutants", Euphytica 35 (1986) 49-59. Las semillas mutagenizadas con DEB, diepoxibutano, pueden obtenerse al remojar las semillas en agua durante toda la noche, luego se remojan en DEB 22 mM durante 4 horas, seguido de un lavado exhaustivo. Los mutágenos adicionales incluyen sulfuro de etil-2-cloroetilo, 2-cloroetil-dimetilamina, óxido de etileno, etilenimina, dimetilsulfonato, dietilsulfonato, propanosulfona, beta-propiolactona, diazometano, N-metil-N-nitrosouretano, naranja de acridina y azida de sodio.

La mutagénesis que utiliza EMS se describe bien en la literatura. En el documento Manual on Mutation Breeding, supra, se informa sobre un proceso preferido de mutagénesis por EMS para semillas de cebada tal como lo practica K. Mikaelson. En este proceso preferido, las semillas se preparan, se remojan previamente, se tratan con el mutágeno y se lavan posteriormente.

La patente de Estados Unidos núm. 6,067,749 describe el uso de EMS para la preparación de una cepa dePapaver somniferumcon una alta concentración de tebaína y oripavina.

También pueden usarse métodos de irradiación, tal como la mutagénesis por neutrones rápidos, para producir semillas mutagenizadas. (Ver documento, Li, X. y otros, A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants, El documento The Plant Journal 27(3), 235-242 (2001)). Los solicitantes emplearon y prefieren la mutagénesis por neutrones rápidos ("FNM") como mutágeno en la presente descripción.

La mutagénesis por neutrones rápidos se describe en los documentos Kodym y Afza (2003), Physical and Chemical Mutagenesis, pág. 189-203, y en Methods in Molecular Biology, volumen 236: Plant Functional Genomics: Methods and Protocols (Ed. E. Grotewold), Humana Press Inc, Totowa, N<j>.

Los rayos gamma (y) son ondas electromagnéticas de longitudes de onda muy cortas y se obtienen mediante la desintegración de radioisótopos de Co o Cs. Las fuentes y pueden instalarse en una celda y, una habitación y o un campo y. Estos se protegen con plomo u hormigón. La mayoría de las fuentes y son adecuadas para la irradiación de semillas, siempre que el tamaño del espacio de irradiación sea suficiente y la tasa de dosis permita tiempos de irradiación prácticos.

Los neutrones rápidos son partículas sin carga de alta energía cinética y se generan en reactores nucleares o en aceleradores. El científico debería evaluar con los operadores la viabilidad de la irradiación de semillas, ya que no todas las instalaciones tienen el equipamiento adecuado y pueden producirse neutrones rápidos con un bajo grado de contaminación con otras radiaciones.

Los dos tipos de radiación difieren en sus propiedades físicas y, por tanto, en su actividad mutágena. Los rayos<y>tienen una efectividad biológica relativa (RBE) menor que los neutrones rápidos, lo que implica que para obtener el mismo efecto biológico debe administrarse una dosis mayor de radiación y. La RBE es principalmente una función de la transferencia lineal de energía (LET), que es la transferencia de energía a lo largo de la pista ionizante. Los rayos y producen unas pocas ionizaciones por micra de trayectoria (LET baja) y pertenecen a la categoría de radiación escasamente ionizante. Los neutrones rápidos (LET alta, radiación densamente ionizante) imparten parte de su alta energía cinética a través de colisiones, en gran parte con protones dentro del material.

Cuando la radiación atraviesa el tejido, ocurren eventos físicos tales como ionizaciones (expulsión de electrones de las moléculas) y excitaciones (proceso de elevación de electrones a un estado de mayor energía) que provocan efectos en el ADN, las membranas, los lípidos, las enzimas, etc. En segundo lugar, se inducen eventos químicos que comienzan con la formación de moléculas activadas, los llamados radicales libres (OH y H), que surgen de OH- y H+. Si el oxígeno está presente, reacciona fácilmente con los radicales libres inducidos por la radiación para formar radicales peroxilo. En el caso de una radiación LET baja, se favorece la formación de radicales peroxilo. En la radiación LET alta, se favorece la formación de peróxido de hidrógeno (H<2>O<2>) mediante la recombinación de radicales libres. Todos los radicales y el peróxido de hidrógeno pueden reaccionar con moléculas biológicas. El daño primario causado por la radiación ocurre de forma aleatoria y es tanto fisiológico como genético. La recuperación fisiológica y la reparación del ADN son posibles en cierta medida, ya que las moléculas no dañadas pueden hacerse cargo de los procesos metabólicos y se activan los mecanismos de reparación del ADN.

Antes de comenzar cualquier estudio de inducción de mutaciones, es fundamental seleccionar las dosis adecuadas. Para la inducción de mutaciones se aconseja usar de dos a tres dosis junto con un control. Las dosis aplicables dependerán del objetivo del mejoramiento o de la investigación, el tipo de radiación y el material vegetal en particular. Se sabe que los géneros y especies de plantas y, en menor medida los cultivares, difieren en su radiosensibilidad. La radiosensibilidad (sensibilidad a la radiación) es una medida relativa que da una indicación de la cantidad de efectos reconocibles de la exposición a la radiación en el objeto irradiado. La radiosensibilidad está influenciada por factores biológicos (tales como diferencias genéticas, volumen cromosómico nuclear y de interfase) y por factores modificadores ambientales (oxígeno, contenido de agua, almacenamiento posterior a la irradiación y temperatura).

Los factores modificadores afectan en gran medida la eficiencia mutágena y la reproducibilidad de los resultados. El oxígeno es el principal factor modificador, mientras que el contenido de humedad, la temperatura y el almacenamiento parecen ser secundarios e interactúan con el efecto del oxígeno. El oxígeno muestra una acción sinérgica con la radiación escasamente ionizante, pero los efectos del oxígeno durante la irradiación y el almacenamiento posterior a la irradiación pueden evitarse fácilmente mediante el ajuste del contenido de agua de las semillas al 12-14 % en los cereales y en la mayoría de las demás semillas. En semillas oleaginosas, tales como las adormideras, el contenido de agua de las semillas debe ser menor, alrededor del 7-8 %. La región crítica es el embrión, pero puede suponerse que el contenido de agua de la semilla y del embrión de la mayoría de las especies será similar. Los factores ambientales son menos importantes con la radiación densamente ionizante; por tanto, para la radiación por neutrones rápidos, no es necesario ajustar la humedad de las semillas.

A menos que ya se hayan publicado o se conozcan por experiencia los datos sobre la radiosensibilidad de una planta determinada, el programa de inducción de mutaciones debe ir precedido de una prueba de radiosensibilidad. Esto se hace mediante la irradiación de las semillas con una variedad de dosis y al hacer crecer las plantas en condiciones de invernadero. La radiosensibilidad se evalúa en base a criterios como la reducción de la altura de las plántulas, la fertilidad y la supervivencia en la generación M1. Generalmente se supone que una reducción de la altura de las plántulas del 30-40 % produce un alto rendimiento de mutación. La utilidad de la radiación puede juzgarse por la eficiencia mutágena, que es la producción de cambios convenientes no asociados a cambios inconvenientes. Una dosis alta aumentará la frecuencia de mutación (la frecuencia con la que se encuentra un tipo específico de mutación o mutante en una población de células o individuos), pero irá acompañada de características negativas, tal como la esterilidad. Al seleccionar las dosis, será necesario encontrar un régimen de tratamiento que proporcione una alta eficiencia mutágena.

Para la radiación por neutrones rápidos, deben realizarse mediciones dosimétricas durante cada tratamiento de radiación, por ejemplo, al realizar el método del detector del umbral de azufre, ya que el flujo de neutrones en la unidad de irradiación de semillas no es constante.

El Gray (símbolo Gy), la unidad del SI (Systéme Internationale) usada para cuantificar la dosis de radiación absorbida (1 Gy = 1 J/kg), sustituyó a la antigua unidad rad; 1 Gy = 100 rad o 1 krad = 10 Gy. La tasa de dosis absorbida (Gy/s o Gy/min) indica cuánta energía absorbe el material irradiado durante una unidad de tiempo dada. La duración de la exposición y la tasa de dosis determinan la dosis de radiación. La exposición durante tiempos cortos (s a unas pocas h) a una tasa de dosis alta se denomina aguda y se aplica más en programas de irradiación. Usamos el Instituto de Investigación de Energía Atómica, Konkoly Thebe ut 29/33, X.epulet, H-1121 Budapest, Hungría, para irradiar nuestras semillas.

Se ha demostrado que los neutrones rápidos son un mutágeno muy efectivo. Kornneef y otros (1982) encontraron que se requieren aproximadamente 2500 líneas tratadas con neutrones rápidos a una dosis de 60 Gy para inactivar un gen una vez en promedio (Documento Koornneef, M., Dellaert, L.W.M. y van der Veen, J.H. (1982) EMS- and radiation-induced mutation frequencies at individual loci in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Mutat. Res.93, 109-123). Si el genoma de la planta contiene aproximadamente 25 000 genes, se estima que en cada línea se eliminan, de forma aleatoria, aproximadamente 10 genes.

El FNM ofrece una serie de ventajas sobre el uso de tratamientos químicos tal como el EMS. En particular, el tratamiento se aplica a la semilla seca, que puede sembrarse en una fecha posterior, mientras que con el EMS la semilla debe sembrarse inmediatamente después del tratamiento o volver a secarse cuidadosamente para sembrarla más tarde.

Después de que las semillas se exponen al mutágeno, las semillas se cultivan hasta la madurez en condiciones controladas y se autopolinizan. Se toman las semillas de la planta madura y se planta al menos una semilla para cultivar una generación M2. La generación M2 se criba para determinar la producción de alcaloides. Por supuesto, es posible cribar la generación M1, pero cribar la generación M2 tiene varias ventajas. En primer lugar, el cribado de la generación M2 asegura que el rasgo resultante de la mutagénesis pueda heredarse. En segundo lugar, al cultivar la generación M2, se demuestra la resistencia básica de la planta antes del cribado. En tercer lugar, los rasgos resultantes de la mutagénesis generalmente se heredan como genes recesivos. Típicamente, el gen mutado estará en estado heterocigótico en la generación M1 y, por tanto, la mutación quedará enmascarada por la forma dominante (no mutada) del gen. Sin embargo, en la generación M2, en una proporción de las plantas, el gen estará en estado homocigótico y el efecto de la mutación será evidente. Las plantas M2 pueden cultivarse para producir una cápsula inmadura, pero es posible ahorrar tiempo y mano de obra si las plantas se criban en una etapa anterior del cultivo. Se recomienda cribar las plantas en un punto que comience en la etapa de 6 hojas hasta la etapa de 10 hojas. El cribado en esta etapa temprana permite manejar muchas plantas en un espacio pequeño. El proceso de cribado en sí es el que requiere más mano de obra. Por tanto, para mejorar el rendimiento de la mano de obra, solo deben cribarse las plantas que parezcan saludables.

En el proceso de cribado, el objetivo es medir cada planta para determinar el contenido de morfina, codeína, tebaína y oripavina. Los alcaloides adicionales que también pueden medirse durante el proceso de cribado incluyen salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina y noscapina. Esto puede lograrse al extraer, por ejemplo, una hoja seca en un tampón líquido o al disolver una muestra de látex en un tampón. Las soluciones tampón se colocan en bandejas de 96 pocillos y se alimentan mecánicamente a través de cualquiera de los HPLC de alto rendimiento disponibles en el mercado. En una modalidad preferida, se utiliza un método isocrático de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UPLC), como se describe en la presente descripción, que proporciona un cribado muy rápido del látex.

Se requiere un método de cribado muy rápido y eficiente para poder probar fácilmente suficientes plantas para tener una alta probabilidad de encontrar la mutación requerida. En el método descrito en la presente descripción, el método de muestreo de plantas es muy rápido porque la gota de látex de la muestra de hoja sale al tampón de extracción. No es necesario que el técnico espere a que se salga una muestra de látex de cada hoja, recolecte la gota de látex y la transfiera al tampón como se hizo anteriormente. Además, mediante el uso de Waters Acquity UPLC, el detector UV muy sensible permite cuantificar contenidos de alcaloides muy pequeños, lo que significa que pueden probarse incluso plantas muy pequeñas. Adicionalmente, el método de UPLC muy rápido de 0,8 minutos permite analizar más de 1000 muestras diariamente, lo que significa que toda la parte de cribado del proyecto podría realizarse en unas pocas semanas.

Las plantas con perfiles de alcaloides alterados se cultivan adicionalmente y se examinan con más detalle. De acuerdo con el procedimiento de la presente descripción, se toma una segunda muestra de aproximadamente el 3 % de las plantas para aclarar o confirmar los resultados del cribado inicial. Se usa un método de UPLC de gradiente más preciso, como se describe en la presente descripción, para obtener una identificación y cuantificación de los picos más precisa. Las plantas en las que se confirma un perfil de alcaloides inusual se trasplantan a macetas de 200 mm (aproximadamente 8 pulgadas) para cultivarlas hasta la madurez.

Después de cribar aproximadamente 34 358 plantas, se encontraron veintiún plantas con un alto contenido de tebaína y que no tenían sustancialmente oripavina, morfina o codeína. Cincuenta y dos selecciones con alto contenido de tebaína (que incluyen 9 de las 21 que no tenían, sustancialmente, oripavina, morfina o codeína) se polinizaron de forma cruzada con 3 líneas diferentes de adormideras que contenían morfina. Luego se probó la generación F2 de las plantas de estos cruces y se encontró que muchas contenían altos contenidos de codeína, contenidos variables de tebaína y no tenían sustancialmente oripavina o morfina.

Alternativamente, se podría usar un método más directo para la mutagénesis de una línea de adormidera que contiene morfina y luego usar un método de cribado eficiente como se describió anteriormente (excepto que el cribado seleccionaría plantas sin morfina que contengan altas proporciones de codeína) para producir el mismo resultado. Los proponentes prefieren el método indirecto que comienza con un fenotipo de adormidera Norman porque hay menos picos de alcaloides que separar en el método LC, lo que puede permitir un tiempo de ejecución más rápido.

Como se usa en la presente descripción, el término “paja de adormidera” o “paja” significará el material de paja que resulta cuando las cápsulas de adormidera maduras y los tallos de las cápsulas de adormidera de una planta dePapaver somniferumse recolectan y se trillan para eliminar las semillas y formar una paja.

El término “opio”, como se usa en la presente descripción, se referirá a la exudación lechosa (es decir, el látex), secada al aire, de cápsulas de adormidera inmaduras cortadas de una planta dePapaver somniferum.

Como se usa en la presente descripción, el término “concentrado de paja de adormidera” o “CPS” significará el material que surge cuando la paja de adormidera ha entrado en un proceso para la concentración de sus alcaloides en forma líquida, sólida o en polvo que contiene los alcaloides fenantreno de la amapola adormidera.

La frase “rodal dePapaver somniferum”o “rodal dePapaver somniferumque se reproduce de manera estable”, como se usa en la presente descripción, se refiere a un grupo de dos o más plantas dePapaver somniferumo plantas dePapaver somniferumque se reproducen de manera estable, ubicadas juntas.

Como se usa en la presente descripción, el término “combinación de alcaloides” se referirá a una combinación de alcaloides en donde el alcaloide comprende morfina, codeína, tebaína y oripavina. En otra modalidad de la presente invención, la combinación de alcaloides comprende además salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina y noscapina, además de morfina, codeína, tebaína y oripavina.

Una planta de adormideraPapaver somniferumque “se reproduce de manera estable”, como se describe en la presente descripción, se refiere a una planta de adormidera que se reproduce de manera estable según se requiere para plantar y cosechar semillas de adormidera durante múltiples generaciones, donde cada generación sería adecuada, sin seleccionar las semillas, para la siembra comercial de un cultivo de campo o rodal de plantas que exhiben la características alcaloides deseadas. Una planta de adormidera que se reproduce de manera estable contiene las características alcaloides deseadas como se describe en la presente descripción y, cuando se autopoliniza, o se poliniza de forma cruzada con una planta con los mismos genes que controlan el contenido de alcaloides, produce una generación subsecuente de plantas que tienen todas, sustancialmente, las mismas características alcaloides deseadas que la planta progenitora. Además, en ausencia de polinización con polen de otros quimiotipos (por ejemplo, plantas convencionales que acumulan morfina), la línea continuará para producir plantas similares durante múltiples generaciones, sin necesidad de la selección para mantener la característica alcaloide deseada. Los ejemplos de características alcaloides deseadas que una planta de adormideraPapaver somniferum,que se reproduce de manera estable, puede transmitir a generaciones futuras, incluyen: (a) las características mejoradas de la tebaína (por ejemplo, en donde la tebaína constituye aproximadamente el 90 % (preferentemente, el 95 %, con mayor preferencia, el 96 % y con la máxima preferencia, el 97 %) o más, en peso, y la oripavina constituye aproximadamente el 10 % (preferentemente, el 5 %, con mayor preferencia, el 1 %, aún con mayor preferencia, el 0,8 % y con la máxima preferencia, el 0,7 %) o menos, en peso, de la combinación de alcaloides) y en donde la tebaína constituye aproximadamente el 3,0 % o más de la paja de adormidera en base al peso en seco, y ( b) las características mejoradas de la codeína (por ejemplo, en donde la codeína constituye el 55 % (preferentemente, el 75 %, con mayor preferencia, el 90 % y con la máxima preferencia, el 96 %) o más, en peso, de la combinación de alcaloides, como se describe en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, el término “no tiene sustancialmente”, cuando se refiere al contenido de tebaína significa que la tebaína constituye menos del 5,0 % en peso, preferentemente menos del 2 % en peso, y con la máxima preferencia, menos del 1 % de la combinación de alcaloides de la paja de adormidera, el concentrado de paja de adormidera o el opio.

El término “no tiene sustancialmente”, cuando se hace referencia a la morfina, oripavina, salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina o noscapina, como se usa en la presente descripción, significa que cada uno de los alcaloides especificados constituye menos del 1 % en peso, preferentemente, menos del 0,5 % en peso, con mayor preferencia, menos del 0,3 % en peso, y con la máxima preferencia, entre el 0 % y el 0,2 % en peso de la combinación de alcaloides de la paja de adormidera, el concentrado de paja de adormidera o el opio.

Como se usa en la presente descripción, la “población M1” son las semillas y las plantas resultantes expuestas a un agente mutágeno, mientras que la “población M2” es la progenie de las plantas M1 autopolinizadas, la “población M3” es la progenie de las plantas M2 autopolinizadas, la “población M4” es la progenie de las plantas M3 autopolinizadas y, generalmente, la “población Mn” es la progenie de las plantas Mn-1 autopolinizadas.

El término “rasgo”, como se usa en la presente descripción, significa una característica fenotípica hereditaria distinta.

Los rasgos deseados, es decir, alto contenido de tebaína frente al contenido de oripavina, morfina o codeína, o alto contenido de codeína frente al contenido de oripavina, morfina o tebaína, una vez establecidos, se heredan de manera consistente por, sustancialmente, toda la progenie. Para mantener los rasgos deseados, se debe tener cuidado de evitar la polinización cruzada con plantas normales, a menos que tal polinización cruzada sea parte de un programa de mejoramiento controlado.

Los rasgos deseados pueden transferirse a las líneas de adormidera que tengan otras características (por ejemplo, diferente altura, madurez temprana o tardía o resistencia a enfermedades) mediante la polinización cruzada de la planta con alto contenido de tebaína con la segunda planta progenitora, se recolectan las semillas de la F1, se cultiva una planta F1 que pueda autopolinizarse y se recolecta la semilla de la F2. Luego se cultivaría la semilla de la F2 y podrían seleccionarse las plantas individuales que tengan la característica de alto contenido de tebaína o codeína de acuerdo con los métodos de la presente descripción, junto con las otras características deseadas tales como la resistencia a enfermedades. Luego, si se desea, podría ocurrir una selección adicional en la F3 y/o en las generaciones subsecuentes para producir líneas altamente uniformes. Alternativamente, puede usarse una planta con alto contenido de codeína como primer progenitor en un programa de cruzamiento. Un operador experto podrá aplicar variaciones a este método, como se conoce en el mejoramiento vegetal.

La realización de cruces de prueba con plantas de genotipo conocido puede proporcionar información sobre los cambios genéticos introducidos a través de la mutación. Las características de la generación F1 producida mediante el cruzamiento con un progenitor normal (tipo salvaje) indicarán si un rasgo se hereda como gen recesivo o dominante. La autopolinización de las plantas F1 y la determinación de los fenotipos de la población subsecuente de plantas F2 proporcionarán información sobre el número de genes responsables de características particulares.

La teoría, según la cual se ha encontrado que la mutagénesis es capaz de elevar el contenido de tebaína dePapaver somniferumcon relación al contenido de oripavina, morfina y codeína, no es capaz de brindar una explicación determinada o definitiva en este momento. La mutagénesis podría haber modificado la ruta biosintética de varias maneras para minimizar la producción de oripavina. A pesar de que ahora no se dispone de respuestas definitivas, hay buenas razones para creer que se conoce la respuesta correcta.

Se postula quePapaver somniferumtiene dos rutas biosintéticas para convertir la tebaína en morfina, como se muestra en el Esquema 1. La ruta A, a través de la neopinona, codeinona y codeína, la propuso Parker, H. I., J. Am. Chem. Soc., 94, 1276-1282 (1972). La ruta B, a través de la oripavina y morfinona, la propuso Brochmann-Hanssen, E., Planta Med., 50, 343-345 (1984). Se cree que la enzima codeinona reductasa (NADPH) está activa en ambas rutas, y reduce la codeinona a codeína y la morfinona a morfina. Adicionalmente, la mutación TOP1 (Documento Millgate y otros, Morphine-pathway block in top1 poppies. Nature, volumen 431, 413-414, 2004) afecta a ambas rutas, al evitar que la tebaína se convierta en neopinona en la ruta A y evitar que la oripavina se convierta en morfinona en la ruta B. La mutación TOP1 parece bloquear la desmetilación del éter enólico que convierte la tebaína en neopinona, así como también la desmetilación del mismo éter enólico en oripavina.

Mediante los métodos de la presente descripción, se obtuvieron plantas dePapaver somniferumque tienen un alto contenido de tebaína y no tienen sustancialmente oripavina, morfina o codeína. Tanto la ruta A como la ruta B fueron inoperantes para producir morfina o cualquier otro alcaloide, aguas abajo de la tebaína y la oripavina, en la línea progenitora con la mutación TOP1. La etapa más probable que se afectó por la mutación es la etapa de O-desmetilación fenólica entre la tebaína y la oripavina. Por tanto, se cree que, para las plantas dePapaver somniferumdescritas en la presente descripción, la producción o actividad de la enzima O-desmetilasa fenólica, que convierte la tebaína en oripavina, se inhibe sustancialmente. LasPapaver somniferumque se reproducen de manera estable, de acuerdo con la presente invención, también puede obtenerse mediante técnicas de ADN recombinante. En particular, después del aislamiento y secuenciación del gen que codifica la tebaína desmetilasa, el gen puede modificarse o eliminarse para inhibir o evitar la producción de la tebaína desmetilasa. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas para modificar la actividad génica, tales como el ARNi, antisentido y otras técnicas. Una vez que se establece la codificación del gen, puede usarse una técnica TILLING para recuperar los mutantes de las poblaciones de manera más eficiente (Documento Henikoff, S., Till, B.J. y Comai, L. (2004) TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiology 135, 630-636).

Mediante los métodos de la presente descripción, también se obtuvieron plantas dePapaver somniferumque tienen codeína como alcaloide predominante y no tienen sustancialmente oripavina o morfina. También se obtuvieron plantas que tienen codeína como alcaloide predominante y no tienen sustancialmente oripavina, morfina, tebaína o cualquier otro alcaloide. Estas plantas se derivaron de plantas que contienen tebaína y que no tienen sustancialmente oripavina, morfina o codeína, al cruzar dichas plantas con plantas dePapaver somniferumque contienen morfina. Aunque no podemos estar seguros del motivo por el que las nuevas plantas acumulan codeína, la referencia a la ruta metabólica sugiere que se ha bloqueado, sustancialmente, la etapa entre la codeína y la morfina. Esto sugiere que el gen que controla la etapa entre la tebaína y la oripavina, que parece haberse bloqueado en la adormidera con alto contenido de tebaína descrita anteriormente, también es responsable de la conversión de codeína en morfina. Por lo tanto, cuando el gen responsable de producir adormideras que solo contienen tebaína junto con la mutación TOP1 o Norman se introduce en plantas que carecen de esa mutación, se produce un fenotipo de codeína. Al conocer que existen medios genéticos para reducir la conversión de tebaína en oripavina y codeína en morfina en las adormideras y que, ahora que hemos demostrado que estas adormideras se pueden lograr y son viables, en última instancia incluso pueden usarse enfoques de mejoramiento convencionales para desarrollar tales plantas.

Esquema 1

Oripavina Morfinona

Rutas b ios in té ticas postu ladas enPapaver som nife rum

A; Parker y otros, 1972

B; Brochmann-Hanssen, 1984

Un experto en la técnica del mejoramiento vegetal podrá aumentar adicionalmente el contenido de codeína y variar el contenido de otros alcaloides en las plantas de esta invención, mediante el uso de métodos de mejoramiento vegetal bien conocidos. Por ejemplo, mediante el cruzamiento con una amplia variedad de líneas de adormidera y las pruebas de la progenie en las generaciones F2 o F3 o subsecuentes, es probable que pueda seleccionarse la progenie que tenga un mayor contenido de codeína en la paja, a través de la incorporación de genes del nuevo progenitor, que contribuyen de alguna manera a la acumulación de codeína.

Recuperar el alcaloide deseado, por ejemplo, tebaína o codeína, ya sea a partir de la paja seca o del opio dePapaver somniferumes un proceso bien establecido en la técnica. Hasta ahora, la tebaína se ha extraído de esta especie de planta, ya sea como parte del proceso de extracción de morfina y codeína o, más recientemente, como parte del proceso de extracción de tebaína y oripavina.

En un proceso, la paja se trata con una pequeña cantidad de cal y agua para ablandar las cápsulas y formar una base libre de los alcaloides. La extracción a contracorriente de la paja ablandada con metanol, etanol u otro solvente adecuado forma un extracto de solvente/agua o "miscela" que contiene los alcaloides, con la morfina a una concentración de aproximadamente 1 g/l cuando la paja es dePapaver somniferum estándar.El volumen de la miscela se reduce al vacío aproximadamente 30 x para producir un concentrado acuoso. La tebaína se extrae a partir del concentrado acuoso mediante el uso de la extracción líquido/líquido con tolueno, y se ajusta el pH para lograr la mejor separación de la tebaína. La tebaína se recupera a partir del tolueno. Por supuesto, la recuperación de la tebaína a partir de laPapaver somniferummejorada, proporcionada en la presente descripción, se facilitará por el hecho de que la concentración de tebaína en la miscela será mucho mayor que la de otros alcaloides y, por tanto, podrá recolectarse más fácilmente mediante precipitación. Además, en ausencia sustancial de oripavina, morfina y codeína, la tebaína podría extraerse directamente a partir de la paja mediante el uso de tolueno, xileno u otro solvente orgánico en el que la tebaína sea soluble.

En el caso de la codeína, cualquier tebaína podría separarse de la codeína mediante una o más etapas de partición, mediante el uso de un solvente orgánico (por ejemplo, tolueno o xileno), lo que deja a la codeína en la fase acuosa. Luego podría precipitarse el CPS codeína a partir de la fase acuosa mediante un ajuste del pH.

Un medio alternativo para producir alcaloides es cultivar células vegetales u órganos vegetales, tales como brotes o raíces, en cultivo. El cultivo celular o el cultivo de órganos son medios para producir alcaloides que no están sujetos a las fluctuaciones del clima y otras incertidumbres asociadas con la producción de cultivos. Los métodos generales para establecer cultivos celulares, cultivos de raíces y cultivos de brotes con el fin de producir alcaloides, se proporcionan en M.F. Roberts, documento Production of alkaloids in plant cell culture. En el documento de Alkaloids, Biochemistry, Ecology, and Medicinal Applications, editado por Roberts y Wink, Plenum Press, Nueva York 1998, páginas 159-197. La primera etapa en la producción de cultivos celulares es establecer el crecimiento del callo. Una forma de lograrlo paraPapaver somniferumse proporciona en el documento de Chitty y otros (2003). (Genetic transformaron in commercial Tasmanian cultivars of opium poppy, Papaver somniferum L., and movement of transgenic pollen in the field. Functional Plant Biology 30: 1045-1058.) En este método, la superficie de las semillas se esteriliza con un lavado de 30-60 segundos en etanol al 70 %, luego en una solución de hipoclorito sódico al 1 % (p/v), más 1-2 gotas de Tween 20, esterilizado en autoclave, durante 20 minutos con agitación. Luego, las semillas se enjuagan de tres a cuatro veces en agua destilada estéril, o hasta que no quede olor a lejía, y se colocan en medio agar B50 (Documento de Gamborg y otros 1968 Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research 50, 151-158). Las placas se sellan con Parafilm y la imbibición ocurre a 4 °C durante 24 a 48 horas. Las semillas se germinan a 24 °C en un ciclo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Los hipocótilos se escinden de las plántulas después de 7-8 días de cultivo, se cortan en piezas de 3-6 mm (usualmente 1-3 explantes por plántula) y se colocan en medios de cultivo de callos. Los medios de cultivo consisten en macronutrientes, micronutrientes, sales de hierro y vitaminas B50 (Gamborg y otros, 1968) y sacarosa a 20 g/l. El pH puede ajustarse con KOH 1 M a pH 5,6 y puede usarse agar Sigma al 0,8 % (A1296) como agente gelificante.

Todos los medios deben esterilizarse en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. El medio B50 no contiene reguladores del crecimiento y se usa para germinar las semillas asépticamente, mantener callos embriogénicos y regenerar brotes y plántulas. El medio de cultivo de callos (CM) es medio B50 más ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 1 mg/l, añadido antes de esterilizar el medio en la autoclave.

Para generar un cultivo en suspensión celular (método en el documento de Staba y otros, 1982, Alkaloid production from Papaver tissue cultures, Journal of Natural Products, 43,256-262), los cultivos de callo pueden transferirse a matraces Erlenmeyer de 125 ml que contienen 25 ml de medio RT líquido (documento de Khanna y Khanna 1976, Ind J Exp Biol 14,628) complementado con 5 ppm de BA para el crecimiento de los brotes o 0,1 ppm de 2,4-D para el desarrollo de las suspensiones celulares. Los cultivos pueden cultivarse a 28 °C en un agitador orbital (78 rpm) con 15 horas de luz al día. Los cultivos celulares pueden cultivarse como un cultivo discontinuo, donde las células se multiplican en un medio líquido que se agita continuamente para mantener las células como pequeños agregados y mantener los niveles de oxígeno. Típicamente, después de la inoculación inicial hay una fase de adaptación, seguida de una fase de crecimiento exponencial, a la que sigue una fase estacionaria en la que el crecimiento se limita por la falta de algunos componentes del medio. A menudo, los productos vegetales secundarios, tales como los alcaloides, se acumulan mientras el cultivo está en la fase estacionaria. Para algunos productos, la producción de alcaloides puede inducirse al añadir inductores, tales como extractos de células fúngicas. También hay sistemas de cultivo continuo o semicontinuo, donde se añade medio fresco de forma continua o semicontinua mientras que las células o el medio se retira, igualmente, para recuperar los alcaloides. Para el éxito de cualquier sistema de cultivo celular es fundamental el establecimiento de líneas celulares de alto rendimiento. Generalmente, se requiere la selección para seleccionar plantas individuales o cultivos celulares individuales que produzcan el alcaloide requerido. Para la producción de codeína, podría modificarse un método rápido de HPLC o UPLC, tales como los descritos en esta solicitud, para probar las líneas celulares para determinar la producción de codeína.

Las técnicas tales como el cultivo de raíces, que incluyen el cultivo de raíces peludas, donde las raíces se transforman conAgrobacterium rhizogenes,también pueden ser un medio viable para producir codeína en cultivo. Un método para la transformación de cultivos dePapaver somniferumconA. rhizogenesse proporciona en Yoshimatsu y Shimomura (1992) (documento Transformation of opium poppy (Papaver somniferum L.) with Agrobacterium rhizogenes MAFF 03-01724. Plant Cell Reports 11,132-136. Un experto en la técnica del cultivo de células y órganos también podría concebir otros medios para cultivar células vegetales derivadas de las plantas descritas en esta solicitud, para producir codeína.

Los siguientes ejemplos se exponen para ayudar a comprender la invención y no pretenden ni deben interpretarse como que limitan de ninguna manera la invención expuesta en las reivindicaciones que siguen a continuación.

Ejemplo 1

Planta de tebaína

Una selección de la adormideraPapaver somniferum,WF03-0802, se usa como material de partida. Esta línea contiene la mutación TOP1 y, por lo tanto, se caracteriza por contener tebaína y oripavina en su paja de adormidera y opio, y no tiene sustancialmente morfina y codeína. Las semillas de WF03-0802 se depositaron en virtud del Tratado de Budapest en la Colección americana de cultivos tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 2209, el 20 de marzo de 2007, con el número de acceso ATCc PTA-9110, y estarán disponibles una vez que esta solicitud se convierta en patente. La disponibilidad de estas semillas no debe interpretarse como una licencia para practicar esta invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes o derechos de obtentor.

Se prepararon seis muestras de semillas de 10 g cada una. Se retuvo una muestra como control. Después de obtener las inspecciones y permisos necesarios, las 5 muestras se enviaron al Instituto de Investigación de Energía Atómica de Budapest, Hungría, para su irradiación. En el instituto, las muestras se retiraron de sus viales, se envasaron en bolsas de plástico y soportes de cadmio y se irradiaron con neutrones rápidos. Las tasas de dosis y los tiempos de exposición fueron los siguientes:

Tratamiento 1 10 Gy 13 minutos 17 segundos

Tratamiento 2 20 Gy 26 minutos 30 segundos

Tratamiento 3 25 Gy 33 minutos 16 segundos

Tratamiento 4 35 Gy 46 minutos 27 segundos

Tratamiento 5 50 Gy 66 minutos 13 segundos

Los parámetros informados de la irradiación fueron los siguientes:

Geometría de irradiación en BIF de BRR en AERI: 2Y/Cd, rotado Monitoreado por U-235, cámaras de fisión Th-232 y contador GM.

La homogeneidad de la dosis dentro de un empaque es mejor que el 1 %.

La incertidumbre general de la dosis es menor al 5 %.

Actividad gamma superficial total de las muestras después de la irradiación: ~695 BGND

Actividad gamma superficial total de las muestras el 20 de octubre de 2005: <2 BGND

(1 BGND (fondo) es ~90 nGy/h)

El instituto devolvió las semillas a los solicitantes, se volvieron a pesar y se encontró que habían perdido una masa promedio del 1,1 %. Esto es compatible con su transferencia dentro y fuera de las bolsas de plástico, así como también con la pérdida de algo de humedad durante la irradiación.

Se colocaron muestras de semillas sobre papel de filtro húmedo en una placa de Petri. Después de 3 y 7 días, se examinaron las semillas. Los tratamientos 1 a 4 germinaron bien, mientras que el tratamiento 5 tuvo radículas muy cortas y solo un pequeño porcentaje de plantas con brotes.

Se cultivó una ensayo en maceta para evaluar el efecto del tratamiento FNM sobre el crecimiento de las plantas. Se sembraron dos macetas con 10 semillas de cada uno de los tratamientos 1,2,3,5 y control. Se observó la emergencia y el crecimiento de las plantas en estas macetas. La irradiación redujo la emergencia y supervivencia de las plantas de una media de 9 plantas por maceta en el tratamiento de control a 8,5 plantas en el tratamiento 1, 7,5 plantas en el tratamiento 2, 7 plantas en el tratamiento 3 y 4 plantas en el tratamiento 5. El desarrollo también se retrasó al aumentar la dosis y la altura de la planta se redujo aproximadamente 10 % en el tratamiento 1, 20 % en el tratamiento 2 y 40 % en el tratamiento 3.

Las semillas de los tratamientos 2 y 3 se sembraron en macetas de 200 mm rellenas con mezcla para macetas del vivero de la Comisión Forestal de Perth, Tasmania. Se sembraron 10 semillas por maceta, y se cubrieron con vermiculita. Las plantas se cultivaron hasta su madurez en un invernadero. Se redujo el número de las plantas a 6 adormideras por maceta cuando las adormideras estaban en la etapa de cotiledón a dos hojas. Se aplicó un baño de fungicida (Previcur) unos días y cinco semanas después de la siembra a una tasa de 15 ml por 72 macetas para la protección contraPythiumspp. y otras enfermedades fúngicas. Se aplicó una solución nutritiva de 3-4 veces durante la temporada de cultivo para proporcionar todos los nutrientes esenciales a las plantas. Se usó riego por aspersión durante las primeras cuatro semanas de cultivo de las plantas y posteriormente se usó riego por goteo y cada gotero de salida múltiple suministraba 8 macetas. El invernadero se mantuvo entre 15 y 25 °C mediante el uso de una combinación de ventilación y calefacción.

Todas las flores se autopolinizaron mediante la transferencia del polen de las anteras al disco estigmático. Las cápsulas maduras se cosecharon en grandes bolsas de papel etiquetadas con el número de tratamiento, y los diferentes tratamientos se mantuvieron separados. Cuando había 2 o más cápsulas en una planta, se recolectaron en una pequeña bolsa de papel para que permanecieran juntas. Las plantas distintivas se cosecharon en bolsas separadas y se tomaron notas sobre su apariencia. Las cápsulas cosechadas se almacenaron durante alrededor de una semana para garantizar que la semilla se secara al aire.

La semilla se separó de las cápsulas en el laboratorio y se pesó en sobres de papel etiquetados con FN1-X, donde FN1 se refiere al experimento de neutrones rápidos 1 y X es el número de secuencia de la muestra de semilla. Las semillas de múltiples cápsulas de la misma planta se combinaron en una sola muestra.

Se cosecharon semillas de un total de 8495 plantas. 7280 de estas, eran del tratamiento de radiación 2. El peso medio de las semillas cosechadas por planta M1 fue de 0,41 g.

Cultivo y cribado de la generación M2

Cultivo de las plantas

Las plantas M2 se cultivaron en un invernadero en bandejas, cada una con 288 celdas. Se sembraron 12 celdas con semillas de cada planta M1. Se sembraron dos semillas en cada celda y se redujo su número hasta una planta por celda después de 1-2 semanas. Las plantas se sembraron en lotes de 4-17 bandejas cada semana para distribuir la carga de trabajo en 17 semanas. Las plantas se regaron mediante riego por aspersión y el invernadero se mantuvo a 15-25 °C.

Muestreo de hojas

Cuando las plantas tenían aproximadamente 6 semanas de edad, se analizaron para determinar el perfil de alcaloides mediante el uso del látex de la hoja más joven completamente expandida (YFEL). Se añadieron 240 j l de solución de extracción de látex (23 g de NH<4>H<2>PO<4>disuelto en 800 ml de agua desionizada (DI), completado hasta 1 litro con etanol) a los pocillos de placas de 96 pocillos con filtro (placa de 96 con filtro, membrana GHP, 0,2 jm, carcasa natural, 350 j l PN S5045, Pall AcroPrep<™>(Pall Corporation, East Hills, Nueva York)). Se retiró la punta de la YFEL de cada planta y se colocó en un pocillo de la placa con filtro mediante el uso de unas pinzas finas. Se requirieron tres placas con filtro para tomar muestras de las plantas en una bandeja. Las placas se dejaron reposar durante aproximadamente 30 minutos después del muestreo para permitir que el látex saliera de las hojas a la solución de extracción. Luego se filtró la solución en una placa de recolección de 96 pocillos, que se selló con un sello adhesivo de papel de aluminio para PCR ABgene<®>(ABgene, parte de ThermoFisher Scientific, Rockford, Illinois) para eliminar la evaporación.

Método de UPLC

El método isocrático de UPLC usado para la primera etapa de cribado se describe en el Ejemplo 2. Las áreas de los picos se exportaron a un archivo de Excel (Microsoft Corporation, Seattle, Washington) para el análisis de datos. No se aplicó ninguna corrección para la absorción diferencial de UV entre los picos de alcaloides. La absorción relativa de la oripavina y la tebaína, los principales picos de interés, fue, en cualquier caso, muy similar en la longitud de onda usada.

Análisis de datos

Se calcularon las áreas relativas de los picos para todos los alcaloides identificados. Luego se ordenaron los archivos de datos de Excel para identificar plantas que tenían un alto contenido de tebaína y un bajo contenido de oripavina con relación a todos los alcaloides identificados que se extrajeron.

Se revisaron los cromatogramas de las plantas identificadas como de interés para garantizar que los picos de interés estuvieran integrados correctamente.

Confirmación

Luego se volvieron a tomar muestras de las plantas identificadas en el primer cribado para confirmar el perfil de alcaloides y garantizar que se ubicara la planta correcta antes del trasplante. Las plantas seleccionadas se marcaron con un alambre recubierto de plástico cuando se volvieron a probar, de modo que pudieran identificarse de manera confiable para el trasplante. En la prueba de confirmación se usó un sistema de UPLC de gradiente con un tiempo de ejecución de 2,5 minutos (descrito en el Ejemplo 2) para obtener una identificación e integración más precisa de los picos.

Trasplante

Las plantas confirmadas como de interés se trasplantaron a macetas de 200 mm y se etiquetaron con un código que indicaba la línea de semillas M1 de la que derivaban. Por ejemplo, si se hicieron dos selecciones de la muestra de semilla M1 etiquetada FN1-1234, estas selecciones se etiquetaron FN1-1234-1 y FN1-1234-2. Se trasplantaron hasta 5 plantas en cada maceta.

La Tabla 2, que aparece más abajo, muestra el número de plantas analizadas, el número de selecciones hechas y el número de selecciones confirmadas. Durante el proyecto, se probaron 34358 plantas M2 (de 4176 líneas M1) y se seleccionaron 1049 para pruebas adicionales. 549 de estas se confirmaron y trasplantaron a macetas. De las 549 trasplantadas, 366 se seleccionaron en base a su alto contenido de tebaína y bajo contenido de oripavina.

Tabla 2

La Tabla 3, que aparece más abajo, enumera las 366 selecciones hechas en base al alto contenido de tebaína y bajo contenido de oripavina en el látex de las muestras de hojas. El perfil de alcaloides se basa en el área del pico, no en la concentración de alcaloides.

Tabla 3

Pruebas del contenido de alcaloides de la paja de adormidera en la generación M2

Las cápsulas se cosecharon del invernadero a medida que maduraban. Se retiraron las semillas y se pesaron en sobres para semillas. La paja de adormidera se colocó en tubos BD Falcon™ de 50 ml (BD Biosciences, San José, California) sin moler y se secó en la mesa de laboratorio durante varios días a temperatura ambiente o en el horno de laboratorio a 50 °C durante 3 horas. Cuando las cápsulas eran grandes, solo se usó una porción de la cápsula para el análisis y se descartó el resto.

Para el análisis, se pesó la paja de adormidera y se añadieron 5 ml o 10 ml de extractante ácido (etanol al 5 % ("EtOH"), ácido fosfórico al 0,17 %), en dependencia de si las muestras de paja pesaban menos o más de 0,2 g respectivamente. Las muestras se agitaron con un agitador orbital Ratek (Ratek Instruments, Boronia, Victoria, Australia) durante 3 horas. Luego la fase líquida se filtró mediante el uso de placas de 96 con filtro Pall AcroPrep™ (PN S5045) y el filtrado se analizó para determinar los alcaloides mediante el uso de un sistema Waters Acquity UPLC® (Waters Corporation, Milford, Massachusetts). El método de UPLC usado fue el mismo método de 2,5 minutos que se usó para las muestras de hojas. Se transfirió extractante adicional a pocillos de 1,2 ml en placas de 96 pocillos, se sellaron y se congelaron en caso de que se requiriera un análisis adicional.

Los contenidos y perfiles de alcaloides se calcularon a partir de los resultados de la UPLC y los datos de peso. Cuando el peso era <0,1 g, el peso se consideró 0,1 g.

Las semillas se dejaron secar en la mesa de laboratorio, se catalogaron y almacenaron.

De las 549 plantas M2 seleccionadas originalmente, 434 sobrevivieron y produjeron al menos una cápsula para la cosecha (79 %). Se cosecharon 6 cápsulas adicionales, mal etiquetadas, por lo que se desconocían sus progenitores M1. 395 plantas produjeron algo de semilla, aunque 58 tuvieron < 0,06 g de semilla y solo 171 plantas produjeron más de 1 g de semilla.

Debido a la posible falta de precisión con los datos del contenido de alcaloides (debido a los bajos pesos de las cápsulas y los grandes tamaños de las partículas), estos datos se analizaron adicionalmente solo después de la conversión a los perfiles de alcaloides: es decir, los contenidos de alcaloides en comparación con el contenido total de alcaloides.

Cuando se cosecharon múltiples cápsulas a partir de una planta, la media se determinó mediante el uso del software estadístico Minitab 14 (Minitab Inc., State College, Pensilvania).

La Tabla 4, que aparece más abajo, muestra los resultados de 133 selecciones M2 a partir de 92 plantas M1 independientes que tenían un alto contenido de tebaína (>90 % de los alcaloides) y un bajo contenido de oripavina (<10 %). Treinta y seis selecciones M2 de 27 plantas M1 independientes tenían más del 95 % del alcaloide de la paja como tebaína. Veintiún selecciones de 16 plantas M1 independientes tenían más del 96 % del alcaloide de la paja como tebaína. Ocho selecciones de 6 plantas M1 independientes tenían más del 97 % del alcaloide de la paja como tebaína. Se identificó una selección, FN1-900-5, que tenía más del 98 % de su alcaloide presente como tebaína. Puede observarse que el contenido de oripavina en la paja de estas plantas fue muy bajo, y varias selecciones tenían menos del 1 % de la combinación de alcaloides, y algunas con menos del 0,5 % de la combinación de alcaloides. Sin embargo, todas las plantas que "solo contienen tebaína", contenían una pequeña proporción de oripavina en su paja de adormidera.

Tabla 4

Cultivo y evaluación de la generación M3.

Se seleccionaron dos de las líneas con contenido de tebaína más alto para aumentarlas en un invernadero durante el invierno de 2007 para proporcionar datos que confirmen su composición de alcaloides y su estabilidad genética. Por tanto, las plantas cultivadas en este experimento fueron la generación M3.

Las macetas se sembraron en el invernadero el 11 de abril de 2007 en hileras dobles, con 120 macetas en cada hilera doble. En cada maceta se redujo el número a 6 plantas. Las condiciones del invernadero fueron las usadas anteriormente excepto que se usaron luces de alta intensidad para mantener intensidades de luz de aproximadamente 9900 lux durante 12 horas por día.

En la etapa de cápsula verde, se tomaron muestras de látex de 24 plantas elegidas de forma aleatoria a partir de cada línea. Las muestras se obtuvieron a partir de los discos estigmáticos mediante la técnica de punción de rayos. Se retiró un rayo estigmático de cada planta y se dejó caer en una solución de extracción ácida (EtOH al 5 %, H<3>PO<4>al 0,17 %) en una placa con filtro (placa de 96 con filtro, GHP, 0,2 pm, NTRL, 350 pl Pall AcroPrep<™>). El resto del procedimiento fue el mismo que para las pruebas del látex de las hojas. Un ensayo separado estableció que no hubo diferencias significativas en los resultados de tebaína u oripavina atribuibles al uso de una solución de extracción ácida en lugar de una solución de extracción de látex como se usó anteriormente.

Cuando las cápsulas se secaron, las plantas se cosecharon a mano. Las cápsulas cosechadas se pesaron y luego se trillaron y tamizaron para separar las semillas y la paja. Se tomaron submuestras de la paja y se molieron hasta 2 mm.

La paja se extrajo por duplicado mediante el uso de una solución de extracción ácida (EtOH, al 5 %, H<3>PO<4>al 0,17 %), y se analizó mediante el uso de Waters Acquity ULPC<®>para determinar el contenido de alcaloides frente a soluciones de alcaloides estándar en base al peso en seco. La pérdida por secado (LOD) de la paja se determinó al calentar una muestra a 88 °C durante 9 minutos mediante el uso de una balanza de infrarrojos (iR) (A&D Company Ltd Model AD4717, Japón).

Se usaron los datos del área del pico para calcular la concentración de alcaloides en la paja de acuerdo con el siguiente cálculo:

Contenido de alcaloides (%) = 0,1 x SPLA x STDC x (EV LOD% x SW) x STDI

STDA 100 SPLI

SW x (100-LQD%)

100

donde SPLA es el área bajo el pico de interés de la muestra

STDC es la concentración del alcaloide estándar en mg/ml

STDA es el área bajo el pico estándar

EV es el volumen de extractante en ml.

LOD% es la pérdida por secado de la paja, expresada como porcentaje

SW es el peso de la paja extraída en gramos.

STDI es el volumen de estándar inyectado en microlitros.

SPLI es el volumen de muestra inyectada en microlitros.

FN1-900-1 tenía un vigor notablemente bajo. El vigor de FN1-1242-3 parecía normal. Las diferencias de vigor se hicieron evidentes mucho después del establecimiento, lo que indica que no se trataba de un efecto de la calidad de la semilla.

La Tabla 5 muestra los resultados de las pruebas de látex en la etapa de cápsula verde para la generación M3. Todas las plantas probadas tenían el mismo perfil de alcaloides con alto contenido de tebaína y no tenían sustancialmente oripavina o morfina.

�� La Tabla 6 muestra la pérdida por secado de la paja y el contenido medio de alcaloides de las muestras de paja duplicadas, según se determinó mediante UPLC.

�� Los resultados muestran que la paja de adormidera en las dos líneas FN1-900-1 y FN1-1242-3 tiene un contenido muy alto de tebaína y muy bajo (0,01 % y 0,02 %, respectivamente, en contenido de oripavina). No se detectaron otros alcaloides (es decir, morfina, codeína, salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina y noscapina) mediante el uso del método descrito.

Ejemplo 2

Extracción de látex

Reactivo

Tampón de extracción de látex: Se disolvieron 23 g de dihidrogenofosfato de amonio en aproximadamente 750 ml de agua desionizada y se añadieron 200 ml de etanol y se completó hasta 1 litro con agua desionizada.

Método

Método isocrático:

Una placa de 96 pocillos con filtro, GHP, 0,2 pm Pall AcroPrep™, se colocó sobre una placa de recolección de 96 pocillos y 350 pl. Se etiquetaron las placas con filtro y de recolección y se añadieron 280 pl de tampón en cada pocillo de la placa con filtro mediante el uso de una multipipeta. Mediante el uso de pinzas, se arrancó una punta, de aproximadamente 5 mm x 5 mm, de la hoja de la planta a probar y se añadió al extractante. El látex saldrá a la solución con el tiempo.

La muestra se dejó incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. La muestra se filtró mediante el uso de un colector de vacío (producto núm. 5017 de Pall Corporation). La placa de recolección se cubrió con un sello adhesivo de papel de aluminio para PCR ABgene® (Cat #: AB-0626) para evitar la evaporación. La placa de recolección puede almacenarse en el refrigerador o en el congelador hasta que se realice el análisis.

Método de análisis

Instrumento:

Waters Acquity UPLC®, con organizador de muestras y detector ultravioleta sintonizable (TUV)

Columna Waters Acquity UPLC, partículas híbridas con puente de etileno (BEH), C18, 1,7 pm, 2,1 x 50 mm Detector TUV, longitud de onda 284 nm

Temperatura de la columna 50 °C

Reactivos:

Fase móvil A: metanol al 9 %, ácido fórmico al 0,1 %, ajustado con amoniaco a pH=9,6

Fase móvil B: metanol al 91 %, ácido fórmico al 0,1 %, ajustado con amoniaco a pH=9,6

Lavado débil - metanol al 10 %

Lavado fuerte - metanol al 100 %

La opción "Cargar adelante" del administrador de muestras se usó para ahorrar tiempo entre muestras. Con esta opción, cada muestra se aspiraba lista para su inyección mientras se ejecutaba la anterior.

Tabla 7. Confi uración de la fase móvil

Las muestras se inyectaron automáticamente (volumen de inyección 2,0 o 3,5 pl) y se les realizó una cromatografía mediante Acquity UPLC® junto con los alcaloides estándar de referencia. Después de que se ejecutara el conjunto de muestras en el Acquity UPLC®, los picos se identificaron mediante la comparación con los estándares que se ejecutaron en el conjunto de muestras. Los tiempos de retención típicos fueron los siguientes:

Las separaciones obtenidas mediante el uso de este método se muestran en la Figura 1. Aunque las formas y separaciones de los picos no son perfectas, son bastante adecuadas para un método de cribado muy rápido.

Se usó el software Empower (Waters Corporation, Milford, Massachusetts) para identificar los picos y calcular sus áreas. Luego, los datos se exportaron a una hoja de cálculo de Excel donde se usaron los datos del área del pico para determinar qué adormideras tenían perfiles de alcaloides inusuales.

Método de gradiente:

Para un análisis de repetición más preciso de las muestras, se usó un método de UPLC con gradiente de 2,5 minutos. Es igual a como se describió anteriormente, excepto que se usaron las siguientes condiciones de gradiente. La Figura 2 proporciona un cromatograma de la paja de adormidera de la generación M3 de FN1-1242-3. El volumen de inyección de la muestra en la Figura 2 fue de 2,0 pl. ATA indica la tebaína, ori indica el pico de oripavina, AMA representa la morfina y ACA representa la codeína.

Ta l . D ll l in r m n r l m r i n 2 min

Ejemplo 3

Planta de codeína

Parte 1 - Realizar cruces

Se usaron como material de partida las selecciones de la adormideraPapaver somniferum,como se describe en el Ejemplo 1 anterior, que acumulan tebaína como alcaloide predominante y no tienen sustancialmente oripavina, codeína o morfina. Las selecciones usadas incluyeron las siguientes:

FN1-900-3, FN1-900-5, FN1-900-7*, FN1-900-11*, FN1-900-12*, FN1-1242-2, FN1-1242-3, y FN1-1242-6*.

Las selecciones marcadas con * fueron plantas M2 adicionales seleccionadas de una plantación adicional de semillas M2, después de que se identificara que estas líneas daban lugar a plantas que solo contienen tebaína. La lista completa de las selecciones con alto contenido de tebaína que se usaron se muestra en la Tabla 9, que aparece más abajo.

Las líneas de adormidera enumeradas anteriormente se usaron como progenitores masculinos en los cruces con tres líneas de adormidera que producen morfina como alcaloide predominante. Estas líneas fueron FW04-0183, PH01-0019 y WF03-1935. Las semillas de plantas de adormidera que producen morfina como alcaloide predominante se encuentran ampliamente disponibles.

Estas plantas se cultivaron en macetas en un invernadero y se manejaron como se describe para la generación M3 en el Ejemplo 1. Las yemas de los progenitores femeninos se castraron en la etapa temprana de gancho, lo que garantizaba que no hubiera polen en las anteras. Se colocaron bolsas de papel kraft sobre las yemas florales para evitar la contaminación con polen extraño. Se recolectó el polen de los progenitores masculinos y se aplicó a los discos estigmáticos de los progenitores femeninos cuando estaban receptivos. Se etiquetaron los cruces y se dejaron las bolsas puestas durante alrededor de diez días para excluir otro polen. Al llegar a la madurez, las cápsulas se cosecharon y luego se abrieron y la semilla se transfirió a sobres de papel. A cada cruce individual se le asignó un número X07 (Tabla 9).

Tabla 9. Esta tabla enumera los cruces producidos y las líneas de progenitores implicadas. Cruce Progenitor femenino Progenitor masculino

X07-0001 WF03-1935 FN1-1270-1

X07-0002 WF03-1935 FN1-2199-1

X07-0003 WF03-1935 FN1-1571-6

X07-0004 WF03-1935 FN1-1242-3

X07-0005 WF03-1935 FN1-1242-2

X07-0006 WF03-1935 FN1-1534-2

X07-0007 WF03-1935 FN1-900-5

X07-0008 WF03-1935 FN1-900-4

X07-0009 WF03-1935 FN1-1242-1

X07-0010 WF03-1935 FN1-1573-1

X07-0011 WF03-1935 FN1-1571-9

X07-0012 WF03-1935 FN1-846-2

X07-0013 WF03-1935 FN1-1571-2

X07-0014 WF03-1935 FN1-1571-4

X07-0015 WF03-1935 FN1-1432-1

X07-0016 WF03-1935 FN1-1447-1

X07-0017 WF03-1935 FN1-1567-1

X07-0018 WF03-1935 FN1-1600-1

X07-0019 WF03-1935 FN1-1419-1

X07-0020 WF03-1935 FN1-1402-1

X07-0021 WF03-1935 FN1-1719-1

X07-0022 WF03-1935 FN1-1571-1

X07-0023 WF03-1935 FN1-2152-2

X07-0024 WF03-1935 FN1-2199-2

X07-0025 WF03-1935 FN1-1533-1

X07-0026 WF03-1935 FN1-2152-3

X07-0027 WF03-1935 FN1-1519-1

X07-0028 WF03-1935 FN1-7355-1

X07-0029 WF03-1935 FN1-1771-2

X07-0030 WF03-1935 FN1-7584-1

X07-0031 WF03-1935 FN1-2152-4

X07-0032 WF03-1935 FN1-2175-1

X07-0033 WF03-1935 FN1-7386-1

X07-0034 WF03-1935 FN1-7400-1

X07-0105 FW04-0183 FN1-900-11*

X07-0106 FW04-0183 FN1-1571-9

X07-0107 FW04-0183 FN1-1571-5

X07-0108 FW04-0183 FN1-1270-2*

X07-0109 FW04-0183 FN1-900-5

X07-0110 FW04-0183 FN1-900-3

X07-0111 FW04-0183 FN1-900-12*

X07-0112 FW04-0183 FN1-1571-7

X07-0113 FW04-0183 FN1-900-7*

X07-0114 FW04-0183 FN1-1242-2

X07-0115 FW04-0183 FN1-1571-9

X07-0116 FW04-0183 FN1-1571-2

X07-0117 FW04-0183 FN1-1242-3

X07-0118 FW04-0183 FN1-1242-9*

X07-0119 FW04-0183 FN1-1571-1

X07-0120 FW04-0183 FN1-1600-6*

X07-0121 FW04-0183 FN1-900-7*

X07-0122 PH01-0019 FN1-1571-2

X07-0123 PH01-0019 FN1-1571-10

X07-0124 PH01-0019 FN1-1571-10

X07-0125 PH01-0019 FN1-1571-7

X07-0126 PH01-0019 FN1-900-1

X07-0127 PH01-0019 FN1-1242-1

X07-0128 PH01-0019 FN1-900-8*

X07-0129 PH01-0019 FN1-1571-13'

X07-0130 PH01-0019 FN1-1571-3

X07-0131 PH01-0019 FN1-1270-11

X07-0132 PH01-0019 FN1-809-5*

X07-0133 FW04-0183 FN1-1242-6*

X07-0134 FW04-0183 FN1-1600-10'

Las selecciones marcadas con * fueron plantas M2 adicionales seleccionadas de una plantación adicional de semillas M2, después de que se identificara que estas líneas daban lugar a plantas que solo contienen tebaína._______________________________________________________

Parte 2. Cultivo de la generación F1

Se sembraron dos macetas (de 200 mm de diámetro) de adormideras con cada una de las líneas de semillas F1 enumeradas en la Tabla 9 anterior. Se establecieron hasta seis plantas en cada maceta, al reducir su número poco después de la emergencia. Las flores se autopolinizaron y las plantas se cultivaron hasta la madurez. Se tomó muestra de una planta de cada maceta en la etapa de cápsula verde al retirar una pieza de un rayo estigmático y extraerla con un extractante ácido, antes de filtrarla y analizarla mediante el uso del método de UPLC, como se describe en el Ejemplo 5. Esto demostró que todas las plantas F1 contenían morfina, oripavina, codeína y tebaína. (Esto era de esperarse porque se cree que las mutaciones implicadas son recesivas). Al llegar a la madurez, se recolectaron las semillas de las plantas y se designaron las semillas de cada planta como una línea separada.

Parte 3. Cultivo de la generación F2

Las semillas recolectadas de las plantas F1 (semillas F2) se sembraron en el invernadero en quince bandejas Speedling® de 288 celdas. (Speedling Incorporated, PO Box 7238 Sun City FL 33586-7238). Se estableció una hilera de hasta 12 plantas para cada línea, y se cultivaron hasta 6 líneas para cada cruce. Cuando las plantas estaban en la etapa de 6 hojas, se realizó un análisis de los alcaloides presentes en el látex de las hojas para determinar los quimiotipos de las plantas F2 individuales.

La prueba de látex se hizo de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 6. En base a las pruebas de látex se identificaron cuatro quimiotipos en las poblaciones:

Morfina: morfina presente típicamente con tebaína y codeína Norman: tebaína y oripavina presentes, morfina ausente

Solo contiene tebaína: tebaína presente, oripavina y morfina ausentes

Codeína: morfina ausente y codeína presente.

Se identificó alguna planta que tenía oripavina, codeína y tebaína, pero poca o ninguna morfina. Generalmente, se trataba de plantas muy pequeñas cuyo perfil de alcaloides cambiaba para encajar en una de las cuatro categorías a medida que se desarrollaban.

Las concentraciones de alcaloides se calcularon a partir de las áreas de los picos con referencia a soluciones de alcaloides estándar, y cada alcaloide se convirtió en un porcentaje del alcaloide morfinano total (morfina, codeína, tebaína y oripavina) para determinar el quimiotipo de la planta. Se estableció un conjunto de reglas incorporadas en sentencias "IF" anidadas para determinar el quimiotipo. Las reglas, aplicadas secuencialmente, fueron las siguientes: Si la concentración total de morfina, codeína, tebaína y oripavina fue menor que 5 ug/ml en la solución inyectada, sin resultados.

Si el porcentaje de tebaína es >95, quimiotipo = solo contiene tebaína Si el porcentaje de tebaína oripavina >95, quimiotipo = Norman

Si tebaína codeína >95, quimiotipo = codeína

Si el porcentaje de morfina es >2, quimiotipo = morfina

De cualquier otra manera, quimiotipo = OCT (oripavina, codeína, tebaína)

La Tabla 10 muestra el número de plantas de cada quimiotipo en la progenie de cada cruce. Aproximadamente el 14 % de las plantas probadas se clasificaron como quimiotipo de codeína. Todos menos tres de los 57 cruces probados produjeron al menos una planta clasificada como quimiotipo de codeína.

Después de clasificar los datos de las plantas con los contenidos de alcaloides más altos en el látex y los contenidos de codeína más altos, se seleccionaron 69 plantas de las 1047 plantas analizadas en las primeras 4 bandejas. Algunas de estas plantas seleccionadas contenían morfina, pero se incluyeron porque su contenido relativo de codeína era alto. Inicialmente se seleccionaron sesenta y una de las 69 plantas en base al fenotipo de codeína. Las 69 plantas se volvieron a probar el 30 de octubre de 2007 al trasplantarlas a macetas de 200 mm y se cultivaron en el invernadero 3. Se tomaron muestras adicionales de sus hojas los días 12 y 27 de noviembre. En otro muestreo, el 12 de diciembre, se usó látex de la cápsula en lugar de las puntas de las hojas. En la prueba de hojas y la prueba de cápsulas se usaron los métodos descritos en los Ejemplos 6 y 5, respectivamente.

Se trasplantaron al suelo aproximadamente 65 plantas que tenían fenotipo de codeína, seleccionadas de las Bandejas 5-15 (parte inferior de la Tabla 10) y se cultivaron hasta la madurez (Ver Ejemplo 4).

Plantas Seleccionadas

Los orígenes de las 69 plantas seleccionadas se muestran en la Tabla 11A. La Tabla 11B muestra el quimiotipo de cada planta seleccionada mediante las reglas enumeradas anteriormente. Después de los cinco muestreos, se había probado, de manera consistente, que 51 plantas tenían fenotipo de codeína. Estas provenían de 11 cruces diferentes que implicaron a 10 progenitores diferentes que solo contenían tebaína, a partir de 3 líneas M1 diferentes (FN1-900, FN1-1242 y FN1-2199).

De las 51 plantas de codeína seleccionadas, varias tenían una proporción más alta de codeína que las demás (Tabla 11B). La relación de codeína se definió como:

contenido de codeína

Relación de codeína -contenido de codeína contenido de tebaína

Esto expresa el contenido de codeína en comparación con el total de los alcaloides predominantes, siendo la tebaína el único otro alcaloide importante. Produce el mismo resultado independientemente de si se usan proporciones de alcaloides o cantidades absolutas. Las plantas 10, 39, 50 y 62 tenían una relación de codeína superior a 0,98 en la fecha del muestreo final, lo que indica que el contenido de tebaína era muy bajo en comparación con la codeína. Muchas de las plantas con una relación alta de codeína tuvieron una relación alta, de manera consistente, durante toda la vida de la planta (por ejemplo, plantas 10, 26, 29, 37, 50, 59 y 60).

Tabla 11A - Listado de plantas seleccionadas, que muestra el cruce del que provienen (ver Tabla 9).

Tabla 11B - Se muestra la clasificación del quimiotipo para los 5 muestreos de látex, así como también la relación de codeína en cada fecha de muestreo.

Quimiotipos: C, codeína; M, morfina; N, Norman, T, solo contiene tebaína, NR, sin resultado.

Tabla 11A:

Tabla 11B:

Al llegar a la madurez, todas las cápsulas se cosecharon individualmente y las semillas y la paja de adormidera se separaron en el laboratorio. La paja se secó durante 24 horas a 60 °C y luego se molió en un pequeño molinillo de café eléctrico (Breville Modelo CG-2, China).

Los alcaloides se extrajeron de la paja molida y se analizaron de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 7. Cuando había más de una cápsula en una planta, se calcularon las medias (Tabla 12). Cuando se hace referencia a las relaciones de alcaloides a lo largo de esta solicitud, "c/total" se refiere a la relación de codeína con respecto al total de alcaloides (morfina oripavina codeína reticulina tebaína laudanosina noscapina papaverina), "ct/total" se refiere a la relación de codeína tebaína con respecto al total de alcaloides (morfina oripavina codeína reticulina tebaína laudanosina noscapina papaverina), "ct/cmot" se refiere a la relación de codeína tebaína con respecto a codeína morfina oripavina tebaína, "c/cmot" se refiere a la relación de codeína con respecto a codeína morfina oripavina tebaína, y "c/ct" se refiere a la relación de codeína con respecto a codeína tebaína.

Tabla 12 Contenido de alcaloides en la paja de adormidera (% en base al peso en seco). No se detectó papaverina n nin n m r .

En la Figura 3 se muestra un ejemplo de un cromatograma producido a partir de la planta 10. Este resultado es significativo ya que contiene una alta concentración de codeína (con un pico a los 0,78 minutos) y cantidades muy pequeñas de todos los demás alcaloides. Si excluimos las plantas que murieron, o que produjeron muy poca paja para permitir la prueba, de las 54 plantas que se seleccionaron originalmente como fenotipo de codeína mediante las pruebas del látex de la hoja en etapa temprana, 52 de estas (96 %) se confirmaron mediante el análisis de la paja. Mediante pruebas subsecuentes se determinó que la Planta 5 era quimiotipo Norman y se determinó que la Planta 28 era quimiotipo de morfina.

Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que la mutación que determinó el fenotipo que solo contiene tebaína también controló la etapa entre codeína y morfina. Por tanto, cuando se eliminó la mutación Norman o TOP1 mediante el cruzamiento con plantas con un fenotipo de morfina, las plantas con el nuevo fenotipo se segregaron. La ruta sintética usada por las adormideras con codeína, de acuerdo con nuestra hipótesis es, por tanto, muy sencilla: Tebaína ^ Neopinona ^ Codeinona ^ Codeína (ver Esquema 1).

La variedad de progenitores masculinos y femeninos que se usaron para producir adormideras con codeína muestra que el método es altamente reproducible. Al menos tres eventos de mutación independientes estuvieron implicados en la producción de progenitores masculinos que solo contienen tebaína, y los tres progenitores con morfina dieron origen, exitosamente, a las plantas con codeína.

Ejemplo 4

Plantas con codeína cultivadas en el campo

Se sembraron semillas de PPW07-0772, PW07-0668, PW07-0650, PW07-0617 y WF03-2024 en un campo en Westbury, Tasmania. La Tabla 13, que aparece más abajo, muestra los orígenes de estas líneas.

T l 1. Lín m r n r l m n W r

En este ensayo de campo y en los experimentos de campo descritos en otros ejemplos, que aparecen más abajo, se usaron los mismos métodos generales de cultivo de adormidera. Debajo de las semillas se aplicó en bandas fertilizante completo que contenía nitrógeno, fósforo y potasio. Las semillas se sembraron 5-10 mm más abajo de la superficie del suelo. En todos los ensayos de campo se utilizaron aspersiones de herbicidas para controlar las malas hierbas, aspersiones de fungicidas para el control de enfermedades y se irrigaron según se requirió.

Las plantas eran de la generación F2 y, por tanto, se segregaban en las cuatro categorías descritas en el Ejemplo 3. Cuando las plantas alcanzaron la etapa de 6-8 hojas, se probaron de acuerdo con el método mostrado en el Ejemplo 6 para determinar el perfil de alcaloides. Se eliminaron las plantas que no tenían un fenotipo de codeína y el resto de las plantas se cultivaron hasta la madurez. El establecimiento de estas plantas fue deficiente debido a la etapa tardía de la temporada y ninguna planta de las líneas PW07-0668 o PW07-0650 alcanzó la madurez.

También se trasplantaron al campo aproximadamente 65 plantas que se habían identificado en el Ejemplo 3 como un quimiotipo de codeína. Estas fueron plantas seleccionadas a partir de las Bandejas 5-15 (ver Tabla 10). Aproximadamente la mitad de estas plantas crecieron hasta la madurez.

La Tabla 14, que aparece más abajo, muestra el contenido de alcaloides en la paja de adormidera de las plantas cultivadas en el campo. El método usado para determinar el contenido de alcaloides se muestra en el Ejemplo 7. Cuando se analizó más de una muestra de paja de una planta, el resultado que se muestra en la Tabla 14 es la media de las muestras analizadas.

Tabla 14. Contenido de alcaloides en la paja de adormidera (en base al peso en seco) de las plantas seleccionadas cultivadas en el cam o.

En ninguna muestra se detectó noscapina ni papaverina.

Nota: los trasplantes se originaron a partir de las bandejas 5-15 (ver Tabla 10)

* La paja de la planta FW08-0039 se extrajo con un extractante ácido (ver Ejemplo 7). Se usó diclorometano (DCM) para extraer la codeína de la solución extractante a pH 9,3. Después de lavar con agua desionizada, se dejó que el DCM se evaporara y el residuo se secó adicionalmente a 40 °C al vacío. El residuo (núm. de muestra CLN42-106, 32 mg) se envió para análisis de NMR y MS. Los resultados de ambos análisis fueron totalmente consistentes con que la muestra fuera codeína.

Ejemplo 5

Análisis del látex en las cápsulas.

Reactivo

Extractante ácido: Una probeta de 1 litro se rellenó hasta la mitad con agua desionizada. Se añadió 1 ml de ácido fosfórico conc. y 50 ml de etanol y el volumen se completó hasta 1 litro con agua desionizada.

Método

Método isocrático:

Una placa de 96 pocillos con filtro, GHP, 0,2 pm Pall AcroPrep™, se colocó sobre una placa de recolección de 96 pocillos y 350 pl. Se etiquetaron las placas con filtro y de recolección y se añadieron 280 pl de extractante ácido en cada pocillo de la placa con filtro mediante el uso de una multipipeta. Se arrancó la punta de un rayo estigmático de la cápsula verde de cada planta que se iba a probar y se añadió al extractante. El látex sale a la solución con el tiempo.

Las muestras se dejaron incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Las muestras se filtraron mediante el uso de un colector de vacío (producto núm. 5017 de Pall Corporation). La placa de recolección se cubrió con un sello adhesivo de papel de aluminio para PCR ABgene® (Cat #: AB-0626) para evitar la evaporación. La placa de recolección puede almacenarse en el refrigerador o en el congelador hasta que se realice el análisis.

Método de análisis

Las muestras se analizaron mediante el uso del mismo instrumento, reactivos, configuración de la fase móvil y estándares de referencia, como se describe en el Ejemplo 2 para el método isocrático.

Se usó el software Empower (Waters Corporation, Milford, Massachusetts) para identificar los picos y calcular sus áreas. Luego, los datos se exportaron a una hoja de cálculo de Excel donde se usaron los datos del área del pico para determinar los perfiles de alcaloides.

Ejemplo 6

Análisis del látex de las hojas.

Reactivo

Método

Una placa de 96 pocillos con filtro, GHP, 0,2 pm Pall AcroPrep™, se colocó sobre una placa de recolección de 96 pocillos y 350 pl. Se etiquetaron las placas con filtro y de recolección y se añadieron 280 pl de extractante ácido en cada pocillo de la placa con filtro mediante el uso de una multipipeta. Se arrancó una punta de la hoja más joven completamente expandida de cada planta que se iba a probar y se añadió al extractante. El látex sale a la solución con el tiempo.

Método de análisis

Las muestras se analizaron mediante el uso del mismo instrumento, reactivos y detalles del instrumento (ver Tabla 8), como se describe para el método de gradiente en el Ejemplo 2.

Las muestras se inyectaron automáticamente y se les realizó una cromatografía mediante el Acquity UPLC® junto con los alcaloides estándar de referencia. Después de que se ejecutara el conjunto de muestras en el Acquity UPLC®, los picos se identificaron mediante la comparación con los estándares que se ejecutaron en el conjunto de muestras. Se usó el software Empower (Waters Corporation, Milford, Massachusetts) para identificar los picos y calcular sus áreas. Luego, los datos se exportaron a una hoja de cálculo de Excel donde se usaron los datos del área del pico para determinar los perfiles de alcaloides.

Ejemplo 7

Análisis de alcaloides de la paja de adormidera.

Reactivo

Método

Se pesó un gramo del material de paja de adormidera molida en un tubo Falcon™ de 50 ml (BD Biosciences, San José, California) y se añadieron 20 ml de extractante ácido. Cuando las muestras de paja tenían menos de 1 g, se añadió, proporcionalmente, menos extractante. Las muestras se agitaron con un agitador orbital Ratek (Ratek Instruments, Boronia, Victoria, Australia) durante 2 horas. Luego la fase líquida se filtró mediante el uso de placas de 96 con filtro Pall AcroPrep™ (PN S5045) y el filtrado se analizó para determinar los alcaloides mediante el uso de un sistema Waters Acquity UPLC® (Waters Corporation, Milford, Massachusetts).

La pérdida por secado (LOD) de la paja se determinó después de secar las muestras de paja en un horno a 130 °C durante 3 horas.

El método de UPLC usado fue el mismo que se usó en el Ejemplo 2, excepto que el tiempo de ejecución se redujo a 2 minutos, como se muestra en la Tabla 15.

Ta l 1. D ll l in r m n r l m r i n 2 min

Contenido de alcaloides (%) = 0,1 x SPLA x STDC x (EV LOD% x SW) x STDI

STDA 100 SPLI

SWx f100-LQD%)

100

donde SPLA es el área bajo el pico de interés de la muestra

STDC es la concentración del alcaloide estándar en mg/ml

STDA es el área bajo el pico estándar

EV es el volumen de extractante en ml.

LOD% es la pérdida por secado de la paja, expresada como porcentaje

SW es el peso de la paja extraída en gramos.

STDI es el volumen de estándar inyectado en microlitros.

SPLI es el volumen de muestra inyectada en microlitros.

Ejemplo 8

Análisis de alcaloides de la paja de adormidera.

Este método proporciona una determinación más precisa del contenido de alcaloides que el Ejemplo 7. Se recomienda su uso con muestras en las que puede haber otros alcaloides que eluyen cerca de los picos de interés y donde se requiere una mejor separación para determinar la identidad del pico con la mayor precisión posible.

Reactivo

Extractante de ácido acético (ácido acético al 2 % y etanol al 10 % en agua desionizada); Mezclar 20 ml de ácido acético glacial y 100 ml de etanol en una probeta y completar hasta 1 l con agua desionizada.

Método

Se pesó la paja de adormidera molida (2+/- 0,05 g) en tubos Falcon de 50 ml. Se añadieron 40 ml de extractante de ácido acético a cada tubo y los tubos se agitaron con un agitador orbital Ratek (Ratek Instruments, Boronia, Victoria, Australia) durante 1 hora. Después de agitar, los tubos se dejaron reposar durante aproximadamente 15 minutos para permitir que las partículas sedimentaran. Luego se filtró la fase líquida mediante el uso de placas de 96 con filtro Pall AcroPrepTM (PN S5045) y la placa de recolección se cubrió con un sello adhesivo de papel de aluminio para PCR ABgene® (Cat #: AB-0626) para evitar la evaporación.

Método de análisis

Instrumento:

Waters Acquity UPLC®

Columna Waters Acquity UPLC, partículas híbridas con puente de etileno (BEH), C18, 1,7 |jm, 1,0 * 100 mm Detector TUV, longitud de onda 240 nm

Reactivos:

Fase móvil A - 1,32 g/l de formiato de amonio, ajustado con amoniaco a pH=9,6

Fase móvil B - acetonitrilo

Lavado débil - 10 % de acetonitrilo/agua

Lavado fuerte - 0,1 % v/v de ácido fórmico

Tabl 1. D ll l in r m n r l m r i n 2 minutos

Temperatura del horno 60° C

Volumen de inyección 0,4 j l

Las muestras se inyectaron automáticamente y se les realizó una cromatografía mediante el Acquity UPLC® junto con los alcaloides estándar de referencia. Después de que se ejecutara el conjunto de muestras en el Acquity UPLC®, los picos se identificaron mediante la comparación con los estándares que se ejecutaron en el conjunto de muestras. Los tiempos de retención típicos fueron los siguientes:

Se usó el software Empower (Waters Corporation, Milford, Massachusetts) para identificar los picos y calcular sus áreas.

Contenido de alcaloides (%) = 0,1 x SPLA x STDC x (EV LOD% x SW)

STDA 100

SWx (10Q-tQD%)

100

donde SPLA es el área bajo el pico de interés de la muestra

STDC es la concentración del alcaloide estándar en mg/ml

STDA es el área bajo el pico estándar

EV es el volumen de extractante en ml.

LOD% es la pérdida por secado de la paja, expresada como porcentaje

SW es el peso de la paja extraída en gramos.

Ejemplo 9

Estabilidad de la característica de alto contenido de codeína.

Se sembraron en un invernadero semillas de diversas líneas seleccionadas del Ejemplo 3. Cuando las plantas tenían aproximadamente 6 semanas de edad, se tomaron muestras del látex de sus hojas de acuerdo con el procedimiento dado en el Ejemplo 6. Los quimiotipos se asignaron mediante el uso de las reglas dadas en el Ejemplo 3, parte 3 anterior. La Tabla 17 muestra el número de quimiotipos de cada tipo en las poblaciones probadas.

Tabla 17. Quimiotipos observados en plantas jóvenes de poblaciones F3.

Como se muestra en la Tabla 11, esta prueba en la etapa temprana no es completamente confiable para predecir el quimiotipo de la planta madura, por lo que se requiere la confirmación en la etapa de paja. Según los datos presentados, la herencia de los rasgos de codeína de las plantas 12, 25, 29, 39 y 56 fue completamente estable desde la generación F2 a la F3. Además, las plantas 16 y 62 parecen segregarse para la mutación TOP1, lo que indica que la planta F2 era heterocigótica para esta mutación, lo que es de esperar en una proporción de las selecciones. Probamos la progenie de la planta 16 porque esta planta tenía una relación de codeína relativamente baja, lo que nos hizo sospechar que podría ser heterocigótica para la mutación Norman. La progenie de las Plantas 5, 10, 26 y 37 no se comportaba como se esperaba. Sabemos por experiencia previa que las plantas clasificadas como OCT terminarán como uno de los otros quimiotipos, por lo que es muy probable que toda la progenie de la planta 37 tenga fenotipo de codeína. La progenie de las otras 3 plantas contenía, cada una, una planta con fenotipo de morfina. Se requerirá un trabajo adicional para determinar por qué ha ocurrido esto.

Ejemplo 10: generación F3

Se cultivaron dieciocho líneas (generación F3) en un invernadero durante el invierno de 2008. Las selecciones cultivadas se muestran en la Tabla 18, que aparece más abajo.

Tabla 18. Selecciones cultivadas en el invernadero (generación F3). Las líneas con el prefijo PH08 se originaron en el invernadero en el verano 07/08 (Ejemplo 3), mientras que las líneas con el prefijo FW08 se originaron en el campo en Westbur Tasmania Eem lo 4.

Las plantas se sembraron en macetas y se mantuvieron como se describe para la generación M3 en el Ejemplo 1.

Se probó el perfil de alcaloides en el látex de todas las plantas cuando alcanzaron la etapa de roseta (5-8 semanas después de la siembra). Se volvieron a probar todas las macetas que contenían una planta con un quimiotipo distinto de la codeína y se eliminaron estas plantas. Esto se hizo para eliminar cualquier planta que se originara a partir de semillas cruzadas. Se encontró que las líneas PH08 eran muy puras, pero las líneas FW08 (que se polinizaron abiertamente en la generación anterior) tenían una serie de plantas con morfina que indicaban que se habían cruzado en el campo.

Cuando las plantas alcanzaron la etapa de floración, se autopolinizaron mediante la transferencia del polen de las anteras al disco estigmático. Al llegar a la madurez, las cápsulas se cosecharon a mano y la semilla se separó de la paja. La paja se molió hasta <2 mm mediante el uso de un molino de corte Retsch SM 2000 (Retsch GmbH, Haan, Alemania).

La pérdida por secado (LOD) de la paja sin procesar de cada línea se determinó después de secar las muestras de paja en un horno a 130 °C durante 3 horas.

Luego se extrajeron los alcaloides de la paja molida y se analizaron como se describe en el Ejemplo 7.

El contenido de alcaloides de cada línea se muestra en la Tabla 19. La línea PH08-0046 contenía el contenido de codeína más alto, con un 4,13 %. FW08-0039 contenía 87,9 % de codeína como porcentaje del total y contenía el contenido más bajo de tebaína de todas las líneas (0,35 %).

Estos resultados se compararon con los resultados producidos a partir de las cápsulas cultivadas en el Invernadero 3 (Tabla 12) y en el campo durante el verano 07/08 (Tabla 14). Se realizaron pruebas t pareadas para determinar si había diferencias significativas entre los resultados de verano e invierno. Se encontró que no hubo una diferencia estadísticamente significativa (a P = <0,05) entre el verano y el invierno para el contenido de codeína de la paja. Sin embargo, hubo una diferencia significativa entre el verano y el invierno para el contenido de tebaína y para el porcentaje de codeína del total de alcaloides (P<0,05).

Tabla 19. Contenido de alcaloides en la paja de adormidera de las selecciones (generación F3) cultivadas en el invernadero.

Ejemplo 11: Resultados del ensayo (generación F4)

Se seleccionaron cinco líneas de las selecciones cultivadas en el invernadero. Estos fueron PH08-0026, PH08-0043, PH08-0046, PH08-0065, y PH08-0067. Las semillas producidas en el invernadero se sembraron en un ensayo de campo replicado en Wesley Vale, en el norte de Tasmania, el 10 de septiembre de 2008, junto con semillas de dos líneas de control. Todas las líneas se sembraron en repeticiones de tres bloques en parcelas de 5 m de largo por 1,6 m de ancho. Se usaron prácticas comerciales estándar para cultivar el ensayo, como se describe en el Ejemplo 4. No se usaron aspersiones de reguladores del crecimiento. El ensayo se cosechó el 6 de febrero de 2009 mediante recolección manual de todas las cápsulas dentro de cuadrantes de 2 m2 dentro de cada parcela. Las muestras se trillaron y se pesó la paja de adormidera. Después de molerla hasta <2 mm, la paja de adormidera se extrajo y se analizó mediante el uso del método descrito en el Ejemplo 8. Se usó el software estadístico Minitab 14 (Minitab Inc., State College, Pensilvania) para determinar las medias, el error estándar (SE) de la media y el análisis de varianza. Los rendimientos y contenidos de alcaloides se muestran en las Tablas 20-22.

La Tabla 20 muestra que los rendimientos de las cápsulas y la paja logrados por las líneas de adormidera con alto contenido de codeína fueron similares a los logrados por una línea comercial de morfina (WF03-2024) y la línea progenitora Norman WF03-0802. La Tabla 21 muestra los contenidos de alcaloides. Dos de las líneas tenían más del 4 % de codeína, en base al peso en seco, en su paja de adormidera. Este es considerablemente más alto que el contenido de morfina de la línea de control de morfina. La Tabla 22 muestra que pueden lograrse rendimientos, por hectárea de codeína, extremadamente altos, de aproximadamente 60 kg/ha.

Tabla 20. Rendimiento de las cápsulas y la paja, contenidos de alcaloides y rendimiento de alcaloides para el ensa o de cam o cultivado en Wesle Vale.

T l 21. n ni l l i n l rmi r r l n m liv n W l V l

Tabla 22. Rendimiento de alcaloides en kilogramos de alcaloides por hectárea para el ensayo de campo cultivado en Wesle Vale.

Ejemplo 12. Resultados del cultivo de ensayo (generación F4)

Se sembraron cinco cultivos de ensayo mediante el uso de las semillas cosechadas del invernadero (ver Ejemplo 10). Se sembraron en tres propiedades del noroeste de Tasmania, como se indica en la Tabla 23. En los tres sitios se usaron prácticas agrícolas comerciales estándar como se describió anteriormente.

Tabla 23. Detalles de los sitios de los cultivo de ensa o.

Cuando los cultivos estuvieron listos para la cosecha, se recolectó a mano un área cercana al centro de cada parcela. Las cápsulas se trillaron para separar la paja de adormidera de las semillas. Luego se molió una submuestra de la paja hasta <2 mm mediante el uso de un molino de corte Retsch SM 2000 y se analizó por duplicado mediante el uso del método descrito en el Ejemplo 8.

Los resultados se muestran en la Tabla 24.

Tabla 24. Pesos de la paja y las semillas cosechadas a mano y contenido de alcaloides en la paja de adormidera cultivada en los cultivos de ensa o.

Los altos contenidos de codeína y los bajos contenidos de morfina indican que ha habido una herencia estable de la característica de alto contenido de codeína de las plantas F2 a estas plantas F4. Los contenidos de morfina más altos que se observaron en el Ejemplo 11 (Tabla 21) son consistentes con que hay un pequeño número de plantas casuales de tipo morfina que crecen en el sitio del ensayo. Las ubicaciones de los cultivos de ensayo usados en el Ejemplo 12 se eligieron cuidadosamente como prados en los que nunca se habían cultivado adormideras o se habían cultivado adormideras muchos años antes y no tenían plantas de adormidera casuales.

Ejemplo 13

Preparación de la muestra de codeína CPS y confirmación de la identidad de la codeína mediante LCMS:

A 250 g de paja de adormidera con codeína (cosechada a máquina PH08-0026, carga 0895, cultivada en el campo, 2009) se añadió etanol al 43 % v/v en agua (1500 ml). Se agitó y se añadió hidróxido de calcio (15 g). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se filtró al vacío a través de un filtro Whatman #52. El solvente residual de la paja húmeda se extrajo mediante el uso de una prensa hidráulica (Labox). No se intentó extraer cuantitativamente el alcaloide, con una sola pasada y sin enjuague de la "torta" de paja prensada. Al filtrado combinado (miscela, ~ 1 l) se le añadió ácido fosfórico conc. hasta obtener un pH de 5,1. Después de reposar durante toda la noche, se formó un ligero residuo y se eliminó por filtración antes de concentrar la miscela hasta un volumen de 250 ml mediante el uso del evaporador rotatorio (80 °C). La miscela concentrada se analizó mediante UPLC (mediante el uso del método de análisis descrito en el Ejemplo 8) y se encontró que contenía codeína: 5,65 g (2,26 % p/p); tebaína: 0,86 g (0,34 %); un desconocido con un tiempo de retención relativo (RRT) para codeína de 2,41 (identificado provisionalmente como un dímero de codeinona-tebaína MW 606): 2,34 % con relación a la codeína, por área del pico.

La miscela concentrada se dividió 3 veces mediante el uso de 0,20 vol (50 ml) de tolueno cada vez, a 20 °C y pH 6,5 (ajustado con hidróxido de potasio al 40 %). Después de la división, el análisis de UPLC dio como resultado 5,29 g de codeína (2,12 % p/p); 0,28 g de tebaína (0,11 % p/p); RRT 2,41: <0,01 % con relación a la codeína.

Los alcaloides se extrajeron 3 veces en tolueno a 50 °C y pH 12,6 (2 x 0,22 vol., 1 x 0,10 vol.) y el tolueno se extrajo nuevamente con agua a 20 °C y pH 6,5 (2 x 0,22 vol.). El análisis de UPLC de los nuevos extractos a pH 6,5 dio como resultado:

Extracto #1. Codeína: 3,86 g; tebaína: 0,033 g

Extracto #2. Codeína: 0,48 g; tebaína: 0,006 g

Los nuevos extractos se combinaron y se ajustaron lentamente a pH 11 a 50 °C con hidróxido de sodio al 20 %. La codeína salió de la solución en forma de aceite. La mezcla se enfrió lentamente y se agitó durante toda la noche, durante la cual el aceite se convirtió en un sólido fino de color blanquecino.

El sólido se aisló con un enjuague con agua fría (10 ml) y se secóal vacío a40 °C para proporcionar la muestra de codeína CPS 0905060.

Masa seca: 3,51 g. Ensayo: 97,8 % (se supone LCD de 0 %); tebaína: 0,6 % con relación a la codeína p/p; RRT 2,41: 0,01 % por área del pico. Rendimiento general de la miscela concentrada: 61 %. La Figura 4 muestra un cromatograma de la muestra de codeína CPS después de disolverla en ácido fórmico al 1 % a 1 g/l, mediante la utilización del método de análisis de UPLC descrito en el Ejemplo 8.

La muestra de codeína CPS 0905060 se analizó mediante LCMS para una determinación precisa de la masa, mediante la utilización del método de análisis de UPLC descrito en el Ejemplo 8. El instrumento usado para el trabajo de MS fue un espectrómetro de masas Waters Micromass Q-ToF Premier API. Estaba equipado con una sonda de electropulverización y se operó en modo de iones positivos. El LCMS se operó a través del software MassLynx versión 4.1

Se usó un estándar de identificación de codeína, 0903343, para comparar con la muestra de CPS codeína. Tanto la muestra como el estándar se prepararon para el análisis al disolverlos en ácido fórmico al 1 % a 1 g/l.

El tiempo de retención del pico principal observado en la muestra de codeína CPS 0905060, coincidió con el tiempo de retención del pico de codeína observado en el estándar de identificación de codeína, y ambos tuvieron un tiempo de retención de 6,72 minutos.

En la Tabla 25 se muestra un resumen de los datos de masa precisos obtenidos para la muestra de codeína CPS 0905060 y el estándar de identificación de codeína, 0903343. Tanto las cifras del estándar de identificación de codeína como las de la muestra de codeína CPS están dentro de un intervalo de error aceptable, en ppm, de la masa precisa teórica de codeína que tiene valores de error en ppm de <10 ppm.

T l 2 . D l m ^ r i .

Si bien la descripción anterior ilustra los principios de la presente invención, con ejemplos proporcionados con fines ilustrativos, se debe entender que la práctica de la invención abarca todas las variaciones, adaptaciones y/o modificaciones usuales, como vienen dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un concentrado de paja de adormidera, obtenido a partir de una paja de adormidera de una planta dePapaver somniferum,dicha planta tiene un rasgo de alto contenido de codeína

en donde la codeína es el alcaloide predominante

y en la paja de adormidera constituye el 40 % o más, en peso, de la combinación de alcaloides que comprende morfina, codeína, tebaína y oripavina,

sin que haya sustancialmente oripavina o morfina en la combinación de alcaloides, dicha planta puede obtenerse al:

cruzar una primera planta progenitora de P.somniferumque contiene tebaína

con una segunda planta progenitora de P.somniferumque contiene morfina,

en donde la primera planta de P.somniferumcontiene una mutación que evita que la tebaína se convierta en neopinona y evita que la oripavina se convierta en morfinona, dicha mutación se designa "TOP1", y una mutación adicional que bloquea la conversión de tebaína en oripavina y también bloquea la etapa metabólica entre la codeína y la morfina,

de manera que la primera planta de P.somniferumproduce paja de adormidera que contiene tebaína y no tiene sustancialmente oripavina, morfina o codeína, y

producir una generación F2 de plantas mediante autopolinización de las plantas F1 obtenidas a partir de dicho cruce y seleccionar las plantas en la generación F2 que contengan altos contenidos de codeína y no tengan sustancialmente oripavina o morfina.

en donde dichas plantas seleccionadas tienen dicho rasgo de alto contenido de codeína,

2. El concentrado de paja de adormidera de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la paja de adormidera tiene codeína que constituye el 55 % o más, en peso, de la combinación de alcaloides, y tebaína que constituye el 40 % o menos, en peso, de la combinación de alcaloides.

3. El concentrado de paja de adormidera de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la paja de adormidera tiene codeína que constituye el 75 % o más, en peso, de la combinación de alcaloides, y tebaína que constituye el 25 % o menos, en peso, de la combinación de alcaloides.

4. El concentrado de paja de adormidera de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la paja de adormidera tiene codeína que constituye el 90 % o más, en peso, de la combinación de alcaloides y tebaína que constituye el 10 % o menos, en peso, de la combinación de alcaloides.

5. El concentrado de paja de adormidera de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la paja de adormidera tiene codeína que constituye el 96 % o más, en peso, de la combinación de alcaloides y tebaína que constituye el 2 % o menos, en peso, de la combinación de alcaloides.

6. El concentrado de paja de adormidera de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde, en la paja de adormidera, no hay sustancialmente tebaína en la combinación de alcaloides.

7. El concentrado de paja de adormidera de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde, en la paja de adormidera, no hay oripavina ni morfina en la combinación de alcaloides

8. El concentrado de paja de adormidera de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde, en la paja de adormidera, la relación de codeína y tebaína con respecto a la combinación de alcaloides que comprende morfina, codeína, tebaína y oripavina está entre 0,90 y 1,00.

9. El concentrado de paja de adormidera de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la paja de adormidera tiene un contenido de codeína superior al 0,8 % en base al peso en seco.

10. El concentrado de paja de adormidera de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la paja de adormidera tiene un contenido de codeína superior al 2,0 % en base al peso en seco

11. El concentrado de paja de adormidera de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la combinación de alcaloides comprende además salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina y noscapina.

12. El concentrado de paja de adormidera de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que puede obtenerse al concentrar los alcaloides a partir de la paja de adormidera en forma líquida, sólida o en polvo.

13. El concentrado de paja de adormidera de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que es un extracto crudo de paja de adormidera en forma líquida, sólida o en polvo.

14. Uso de un concentrado de paja de adormidera de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la producción de codeína y derivados de la codeína.

15. Un método para la producción de codeína que comprende las etapas de:

dicha planta puede obtenerse al cruzar una primera planta progenitora deP. somniferumque contiene tebaína con una segunda planta progenitora de P.somniferumque contiene morfina,

de manera que la primera planta de P.somniferumproduce paja de adormidera que contiene tebaína y no tiene sustancialmente oripavina, morfina o codeína,

producir una generación F2 de plantas mediante autopolinización de las plantas F1 obtenidas de dicho cruce, y seleccionar plantas en la generación F2 que contienen altos contenidos de codeína, y no tienen sustancialmente oripavina o morfina, en donde dichas plantas seleccionadas tienen dicho rasgo de alto contenido de codeína, en donde la mutación TOP1 es de la semilla depositada con el número de acceso ATCC PTA-9110, y en donde la mutación adicional es la contenida en la semilla del depósito ATCC PTA-9294; y

b) extraer la codeína a partir de la paja de adormidera.

16. Un método para la producción de concentrado de paja de adormidera-codeína que comprende las etapas de concentrar los alcaloides de la paja de adormidera de la planta deP.somniferumque tiene el rasgo de alto contenido de codeína, como se mencionó en la reivindicación 1 o 2, en forma líquida, sólida o en polvo.

17. La paja de adormidera a partir de la cual se obtiene el concentrado de paja de adormidera de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.