ES2965642T3 - Papaver somniferum con alta concentración de tebaína - Google Patents
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Abstract
La presente invención está dirigida a una paja de amapola mejorada, un concentrado de paja de amapola y opio de Papaver somniferum para la producción de tebaína que contiene poca o ninguna oripavina, codeína o morfina. La presente invención también proporciona plantas, rodales y semillas de Papaver somniferum y métodos para la producción de tebaína. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Papaver som niferum con alta concentración de tebaína
Referencia cruzada con las solic itudes relacionadas
Esta aplicación reivindica prioridad en las solic itudes provisionales de Estados Unidos núms. de serie 61/034,583 presentada el 7 de marzo de 2008, 61/088,903 presentada el 14 de agosto de 2008 y 61/089,163 presentada el 15 de agosto de 2008.
Cam po de la invención
La presente invención se refiere a la producción m ejorada de tebaína. Más particularm ente, la presente invención se refiere al uso de un m utante de la planta de am apolaPapaver somniferumpara producir tebaína con m ayor rendimiento.
Antecedentes de la invención
Los 14-hidroxim orfinanos, tales com o oxicodona, naloxona, naltrexona, m etobrom uro de naltrexona, nalbufina y nalmefeno, son im portantes derivados opiáceos debido a su com portam iento com o potentes analgésicos y/o antagonistas narcóticos. Las rutas sintéticas más prácticas para la preparación de estos productos farm acéuticos utilizan el alcaloide tebaína com o m aterial de partida. O tros derivados opiáceos importantes, tales com o la hidrocodona y los com puestos con puentes del anillo C, buprenorfina y etorfina, tam bién se preparan de manera más práctica a partir de tebaína.
De acuerdo con un proceso convencional, la tebaína se oxida a 14-hidroxicodeinona mediante el uso de ácido mc loroperbenzoico en una m ezcla de ácido acético/ácido trifluoroacético o m ediante una m ezcla de peróxido de hidrógeno y ácido fórm ico. La 14-hidroxicodeinona se reduce cata líticam ente a oxicodona. Véase el esquem a 1. La oxicodona es un producto que se vende para su uso com o un analgésico y para su producción se consum en
La oxicodona puede, a su vez, O -desm etilarse con tribrom uro de boro para producir oxim orfona. Después de bloquear los grupos hidroxilos con un agente bloqueante adecuado, tal com o grupos acetilo, el derivado de oxim orfona se puede hacer reaccionar con brom uro de cianógeno en una desm etilación de von Braun para producir un derivado de N-cianodih idronorm orfinona que posteriorm ente se hidroliza a 14-hidroxidih idronorm orfinona (noroxim orfona). La noroxim orfona se puede convertir fácilm ente en com puestos finales m ediante N-alquilación con un haluro de alquilo apropiado, o por acilación con un haluro de acilo o anhídrido apropiado, seguido de una reducción. Otro proceso convierte la oxicodona del proceso anterio r en noroxicodona mediante la N-desm etilación de von Braun seguida de la conversión en un com puesto final 3-O -m etil mediante el uso de N-alquilación con un haluro de alquilo apropiado, o m ediante alquilación con un haluro de alquilo apropiado, o acilación con un haluro de acilo o anhídrido apropiado, seguido de una reducción. El com puesto final 3-O -m etil se convierte en un com puesto final mediante O-desm etilación.
En el Esquem a 2 se muestra una síntesis m ediante el uso de tebaína para producir el opiáceo con puente del anillo C, buprenorfina.
En el Esquem a 3 se muestra otra síntesis mediante el uso de tebaína para producir 14-hidroxim orfinano, naltrexona com o representante de los com puestos finales.
Otra síntesis usa tebaína para producir hidrocodona com o se establece en la patente de Estados Unidos núm.
3,812,132.
Aunque estas síntesis son efectivas, la disponib ilidad de tebaína se lim ita por su alto costo. El alto costo de la tebaína contribuye al alto costo de los 14-hidroxim orfinanos que se derivan de ella.
Una de las razones de la disponib ilidad lim itada de tebaína y de su alto costo es que su síntesis total es difícil. Las patentes de Estados Unidos Núms 4,613,668 y 4,795, 813 m uestran la escasez de tebaína y enseñan la síntesis total, o síntesis alternativa, de los 14-hidroxim orfinanos. Sin em bargo, la dem anda de tebaína persiste.
Una segunda razón de la disponib ilidad lim itada de tebaína y de su alto costo es que la fuente principal de tebaína es su extracción a partir de la planta de amapola,Papaver somniferum.La m orfina es el principal alcalo ide que se acum ula en las cápsulas dePapaver somniferum.Por tanto, la oferta de tebaína se limita en gran m edida a una fracción de la dem anda de morfina.
Los alcalo ides se extraen de las cápsulas de am apola dePapaver somniferumpor dos m étodos com erciales. En un método, se corta la cápsula inm adura y se recolecta el látex de la herida. El látex secado al aire es opio que, de acuerdo con el Índice Merck, 11na edición, contiene alcaloides en las cantidades que se m uestran en la Tabla I. En un segundo método, las cápsulas m aduras de am apola y los ta llos de las cápsulas de am apola se recolectan y se trillan para e lim inar las sem illas y form ar una paja. Cuando sea necesario, la paja se seca hasta un contenido de agua más abajo al 16 %. Un solvente o agua se em plea en la extracción para elim inar los a lcalo ides de la paja. Para las variedades dePapaver somniferumque crecen normalmente, la paja, en form a seca, contiene alcalo ides en las cantidades que se m uestran en la Tabla 1.
Tabla 1
Com o puede verse, el rendim iento de la tebaína y la oripavina se confunde con el de otros alcaloides. Una am apola que produzca abundante tebaína, por ejemplo, el 90 % o más del tota l de los alcaloides, perm itiría un proceso de extracción/purificación más simple, lo que daría com o resultado m ayores rendim ientos, m ejor calidad y rendim iento y m enores costos.
Cuando se usa solvente, agua o flu ido supercrítico, tal com o CO 2, la extracción se em plea para elim inar los alcalo ides de la paja; tal método, com o se practica, implica la producción de un "C oncentrado de paja de amapola". El concentrado de paja de am apola (o "CPS") se describe com o "El m aterial que surge cuando la paja de am apola entra en un proceso de concentración de sus alcaloides, cuando dicho m aterial está disponib le en el m ercado" (docum ento M ultilingual d ictionary o f narcotic drugs and psychotrop ic substances under international control, United Nations, Nueva York, 1983). Sin contradecir la descripción anterior, el concentrado de paja de am apola se describe com o "el extracto crudo de paja de am apola en form a líquida, sólida o en polvo que contiene los alcaloides fenantreno de la amapola", Registro federal de Estados Unidos 45 77466, 24 de noviem bre de 1980. Cuando está en form a líquida, el líquido se concentra preferentem ente antes de entrar en el mercado. El concentrado de paja de am apola es generalm ente preferido en la form a de polvo que resulta de retirar el solvente o el agua después de la extracción de la paja de amapola. De acuerdo con la Publicación de las Naciones Unidas "N arcotic Drugs: Estimated W orld Requirem ents for 2007; Statistics for 2005 (E/INCB/2006/2)", el concentrado de paja de am apola es el residuo seco que se obtiene m ediante la extracción de alcalo ides de la paja de amapola. Hasta la segunda mitad de la década de 1990, sólo se fabricaba un concentrado de paja de am apola que contiene m orfina com o alcaloide principal. Desde entonces, se com enzó a fabricar un concentrado de paja de am apola que contiene principalm ente tebaína u oripavina.
Más recientem ente, Fist y otros, en las patentes de Estados Unidos núms. 6,067,749 (la "patente '749"), 6,376,221 y 6,723,894, describ ieron una paja de am apola mejorada de unaPapaver somniferumde reproducción estable para la extracción de tebaína y/u oripavina (la am apola "norm anda"), la paja trillada que tiene la tebaína y oripavina constituye aproxim adam ente el 50 % en peso o más que la com binación de alcalo ides que consiste en morfina, codeína, tebaína y oripavina. La paja de am apola norm anda constituía el 1,68 % de tebaína, 0,74 % de oripavina, 0,05 % de codeína y nada de m orfina com o un por ciento en peso de la paja seca. (Véase la colum na 15, Tabla III de la patente '749). Si bien esto alivió hasta cierto punto la d isponib ilidad lim itada y el alto costo de la tebaína, el problem a de producir oripavina sim ultáneam ente con tebaína contribuyó significativam ente al costo de producir la tebaína.
Desde hace m uchos años, la am apola perennePapaver bracteatumse propuso com o una fuente de tebaína. La tebaína es el alcalo ide predom inante en esta especie, y en cepas seleccionadas puede ser tan alto com o el 98 % del tota l de alcalo ides (docum ento de Palevitch, D y Levy, A 1992 Acta Horticulturae 306,33-52). La tebaína está presente tanto en las raíces así com o tam bién en las cápsulas. G eneralm ente, se requerirían dos años de crecim iento para obtener un buen rendim iento tanto de raíces com o de cápsulas.Papaver bracteatumno alivia el problem a de la disponib ilidad lim itada y el alto costo de la tebaína debido a su lento crecim iento, bajo rendim iento de las cápsulas y los problem as con la cosecha y el procesam iento de las raíces.
Resum en de la invención
La presente invención se refiere a una planta de am apola dePapaver somniferumque tiene un quim iotipo establem ente hereditario de solo tebaína, cuya planta al cosechar sus cápsulas de am apola producirá una paja de am apola que tiene tebaína que constituye el 95 % en peso o más que una com binación de alcaloides, y que tiene oripavina que constituye el 5 % en peso o m enos que la com binación de alcaloides, en donde la com binación de alcalo ides com prende morfina, codeína, tebaína y oripavina; y en donde la tebaína constituye el 3,0%o más de la paja de am apola en base al peso en seco,
en donde el quim iotipo de solo tebaína se proporciona por dos genes independientes, el primero evita que la tebaína se convierta en neopinona y evita que la oripavina se convierta en morfinona,
y el segundo bloquea la ruta entre la tebaína y la oripavina,
en donde dicha planta se puede obtener m ediante
i) polin ización cruzada de una primera planta deP. somniferumprogenitora con una segunda planta deP. somniferumprogenitora dicha primera planta deP. somniferumprogenitora es una planta cultivada a partir de la sem illa ATCC PTA-9109, y dicha segunda planta deP. somniferumprogenitora no tiene el quim iotipo de solo tebaína,
ii) recolectar la sem illa F1 del cruce de la etapa (i),
iii) cultivar una planta F1 y perm itir que dichas plantas F1 se autopolinicen,
iv) reco lectar la sem illa f 2 y cu ltivar una población de plantas F2 a partir de dicha semilla,
v) seleccionar entre la población F2, las plantas que al cosechar sus cápsulas de am apola producirán una paja de am apola que tiene tebaína que constituye el 95 % en peso o más que una com binación de alcaloides, y que tiene oripavina que constituye el 5 % en peso o menos que la com binación de alcaloides, en donde la com binación de alcaloides com prende morfina, codeína, tebaína y oripavina; y en donde la tebaína constituye el 3,0 % o más de la paja de am apola en base al peso en seco,
así com o tam bién sem illas y paja de am apola de esta planta, así com o una población vegetal de tales plantas. La presente invención tam bién se refiere a la progenie dePapaver somniferum,la sem illa de dichaPapaver somniferumque se ha depositado en la Colección Am ericana de Cultivos T ipo bajo la designación ATCC PTA-9109, dicha progenie tiene un quim iotipo de solo tebaína, de m anera que la paja de am apola de dicha progenie tiene tebaína que constituye el 95 % en peso o más que una com binación de alcaloides, y tiene oripavina que constituye el 5 % en peso o menos que la com binación de alcaloides, y en donde la tebaína constituye el 3,0 % o más del contenido de alcalo ides de la paja de am apola en base al peso en seco,
en donde el quim iotipo de solo tebaína se proporciona por dos genes independientes, el primero evita que la tebaína se convierta en neopinona y evita que la oripavina se convierta en morfinona,
y el segundo bloquea la ruta entre la tebaína y la oripavina.
La presente invención tam bién se refiere a un m étodo para la producción de tebaína que com prende las etapas de: a) cosechar cápsulas de am apola de la planta com o se describ ió anteriorm ente para producir una paja de am apola o reco lectar y secar el látex de las cápsulas de am apola inm aduras de la planta para producir opio; y b) extraer quím icam ente la tebaína de la paja de am apola o del opio.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a una paja de am apolaPapaver somniferumde reproducción estable com o se describió anteriorm ente, que tiene tebaína que constituye el 95 % (preferentem ente, el 97 %) en peso o más que una com binación de alcaloides, y que tiene oripavina que constituye el 5 % (preferentem ente, el 1 %, con m ayor preferencia, aproxim adam ente el 0,7 %) en peso o menos que la com binación de alcaloides, en donde la com binación de alcalo ides com prende morfina, codeína, tebaína y oripavina; y en donde m ayor la tebaína constituye el 3,0 % o más de la paja de la am apola en base al peso en seco. En una m odalidad preferida, la tebaína constituye el 3,5 % o más que (preferentem ente, el 4,0 % o más que, con m ayor preferencia el 4,3 % o más) de la paja de am apola en base al peso en seco. En otra modalidad, la oripavina constituye el 0,4 % o m enos que (preferentem ente, el 0,2 % o m enos) de la paja de am apola en base al peso en seco. En otra modalidad de la invención, la oripavina constituye entre el 0,01 y 1,0 % (preferentem ente, entre el 0,02 % y 0,5 %) en peso de la com binación de alcalo ides en la paja de amapola.
La presente invención tam bién proporciona unaPapaver somniferumde reproducción estable com o se describ ió anteriorm ente, que tiene dos rasgos genéticos que controlan la característica de solo tebaína de la planta, un rasgo es el que se describe en la patente de Estados Unidos núm. 6,067,749, y el segundo rasgo regula la etapa entre tebaína y oripavina, lo que resulta en una ausencia sustancial de oripavina.
La presente invención tam bién proporciona una planta dePapaver somniferumde reproducción estable com o se describ ió anteriorm ente, que tras la cosecha de sus cápsulas de am apola producirá una paja de am apola que tiene tebaína que constituye el 95 % (preferentem ente, el 97 %) en peso o más que una com binación de alcaloides, y que tiene oripavina que constituye el 5 % (preferentem ente, el 1 %, con m ayor preferencia, el 0,7 %) en peso o menos que la com binación de alcaloides, en donde la com binación de alcalo ides com prende morfina, codeína, tebaína y oripavina; y en donde la tebaína constituye aproxim adam ente el 3,0 % o más de la paja de am apola en base al peso en seco. La paja de la plantaPapaver somniferumde reproducción estable de la presente invención contiene preferentem ente tebaína que constituye el 3,5 % o más que(preferentem ente, el 4,0 % o más que, con mayor preferencia, el 4,3 % o más) la paja de amapola, en base al peso en seco, y oripavina que constituye el 0,4 % o menos que (preferentem ente, el 0,2 % o m enos) la paja de amapola, en base al peso en seco. En otra modalidad de la invención, la oripavina constituye entre el 0,01 y 1,0%(preferentem ente, entre el 0,02%y 0,5 %) en peso de la com binación de alcaloides en la plantaPapaver somniferumde reproducción estable com o se describió anteriorm ente.
Tam bién se incluye en la invención una planta dePapaver somniferumde reproducción estable com o se describió anteriorm ente, que tras la cosecha de sus cápsulas de am apola producirá una paja de am apola que tiene tebaína que constituye al menos el 3 % (preferentem ente, al m enos el 3,5 %) en base al peso seco, y oripavina que constituye no más del 0,4 % en base al peso seco de dicha paja. Preferentem ente, la tebaína constituye al menos el 4,0 % en base al peso seco, y la oripavina constituye no más del 0,2 % en base al peso seco de dicha paja de la planta.
La presente invención tam bién proporciona una planta dePapaver somniferumde reproducción estable que tras la cosecha de sus cápsulas de am apola producirá una paja de am apola que tiene tebaína que constituye al m enos el 3 % (preferentem ente, el 3,5 %, con m ayor preferencia el 4 %, con la m áxim a preferencia, el 4,3 %) en base al peso seco, y oripavina que constituye el 0,05 a 0,5 % (preferentem ente, 0,05 a 0,2 %) en base al peso seco de dicha paja. Tam bién se incluye en la invención una sem illa de cualquiera de las plantas de am apola de reproducción estable descritas anteriorm ente; preferentem ente, la sem illa es una sem illa ATCC PTA-9109 dePapaver somniferum.Tam bién se incluye en la invención un concentrado de paja de am apola para la extracción de tebaína que com prende un concentrado de paja de am apola de cualquiera de las plantas de am apola de reproducción estable descritas anteriorm ente.
Otro aspecto más de la invención es una paja de am apola de cualquiera de las plantas de am apola de reproducción estable descritas anteriorm ente.
Otra modalidad de la invención es un m étodo para la producción de tebaína que com prende las etapas de:
a) cosechar cápsulas de am apola de cualquiera de las plantas de am apola de reproducción estable descritas anteriorm ente para producir una paja de amapola; y
b) extraer quím icam ente la tebaína de la paja de amapola.
Otra modalidad de la invención es un m étodo para la producción de tebaína que com prende las etapas de:
a) reco lectar y secar el látex de las cápsulas de am apola inm aduras de cualquiera de las plantas de am apola de reproducción estable descritas anteriorm ente para producir opio; y
b) extraer quím icam ente la tebaína del opio.
Tam bién se incluye en la invención una población vegetal de cualquiera de las plantas dePapaver somniferumde reproducción estable descritas anteriorm ente.
La presente invención tam bién proporciona una paja de am apola de unaPapaver somniferumde reproducción estable com o se describ ió anteriorm ente que tiene tebaína que constituye al menos el 3 % (preferentem ente, el 3,5 %, con m ayor preferencia, el 4 %, con la m áxim a preferencia, el 4,3 %) en base al peso seco, y oripavina que constituye el 0,05 a 0,5 % (preferentem ente, el 0,05 a 0,2 %) en base al peso seco de dicha paja.
En la paja de amapola, el opio y el concentrado de paja de am apola de la presente invención, la tebaína constituye preferentem ente el 96 % en peso o más que la com binación de alcalo ides y la oripavina constituye el 0,8 % en peso o m enos que la com binación de alcaloides; con m ayor preferencia, la tebaína constituye el 97 % en peso o más que la com binación de alcalo ides y la oripavina constituye el 0,7 % en peso o m enos que la com binación de alcaloides. En las m odalidades preferidas de la presente invención, sustancia lm ente no hay oripavina, m orfina o codeína en la com binación de alcaloides. En otra modalidad de la presente invención, la com binación de alcalo ides com prende adem ás salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina y noscapina.
La presente descripción, en una modalidad no reivindicada, tam bién proporciona plantas dePapaver somniferumy m étodos para producir tales plantas, que tienen paja de am apola con un contenido de tebaína sustancia lm ente m ayor y un contenido de oripavina sustancia lm ente menor, de m anera que los contenidos de tebaína en los cultivos cultivados y cosechados com ercialm ente son aproxim adam ente el 3,0 % o más que, preferentem ente, aproxim adam ente el 3,5 % o más que, con m ayor preferencia, el 4,0 % o más, con la m áxim a preferencia, aproxim adam ente el 4,3 % o más, y los contenidos de oripavina son del orden de aproxim adam ente el 0,4 %, preferentem ente el 0,2 % o menos.
Aspectos adicionales de la presente descripción proporcionan una paja de amapola, un concentrado de paja de am apola y opio, en donde la tebaína constituye aproxim adam ente el 95 % en peso o más que la com binación de alcalo ides y la oripavina constituye entre aproxim adam ente el 0,01 a aproxim adam ente 1,0 % en peso (preferentem ente, entre aproxim adam ente el 0,02 % al 0,6 % en peso, con m ayor preferencia, entre aproxim adam ente el 0,02%al 0,5%en peso) de la com binación de alcaloides.
En una modalidad no reivindicada se describe un m étodo para producir una planta de am apola dePapaver somniferumque tiene un alto contenido de tebaína establem ente heredable (es decir, el alto contenido de tebaína se reproduce de manera estable) y un bajo contenido de oripavina versus un contenido de m orfina y codeína, que com prende el m étodo las etapas de:
a) exponer al m enos una sem illa de am apola dePapaver somniferuma un agente mutagénico,
b) cultivar al menos una sem illa de am apola para producir una planta que porte una hoja o una cápsula de am apola inmadura, opcionalm ente a través de múltiples generaciones autofertilizadas,
c) tom ar m uestras de la hoja o de la cápsula de am apola para detectar la presencia de tebaína, oripavina, m orfina y codeína, y
d) repetir las etapas b) y c) y opcionalm ente la etapa (a) hasta que se obtenga una planta de am apola dePapaver somniferumque produzca una paja de am apola con tebaína que constituya aproxim adam ente el 90 % (preferentem ente, aproxim adam ente el 95 %) en peso o más que la com binación de alcalo ides que consiste en morfina, codeína, tebaína y oripavina, y que tenga oripavina que constituya aproxim adam ente el 10 % (preferentem ente, aproxim adam ente el 5 %). %) en peso o m enos que la com binación de alcaloides, y en donde la tebaína constituye aproxim adam ente el 3,0 % (preferentem ente, aproxim adam ente el 3,5 %, con m ayor preferencia, aproxim adam ente el 4,0 %, con la m áxima preferencia, aproxim adam ente el 4,3 %) o más de la paja de am apola en base al peso en seco.
Preferentem ente, la sem illa dePapaver somniferumexpuesta al agente m utagénico en la etapa (a) de este m étodo es unaPapaver somniferumque produce, tras la cosecha de sus cápsulas de am apola, una paja de am apola que tiene un contenido de tebaína y oripavina que constituye el 50 % en peso o más que la com binación de alcaloides que consiste en morfina, codeína, tebaína y oripavina.
En otra modalidad de este método, la etapa (b) com prende cu ltivar al m enos una sem illa de am apola para producir una planta que porte una hoja o una cápsula de am apola inmadura, y autopolin izarse para producir la semilla, y tom ar la sem illa de esta m anera producida y producir una generación M2 de plantas, y la etapa (c) com prende exam inar las plantas M2 y seleccionar plantas que produzcan una paja de am apola con tebaína que constituya aproxim adam ente el 95 % en peso o más que la com binación de alcaloides que consiste de morfina, codeína, tebaína y oripavina, y que tenga oripavina que constituye aproxim adam ente el 5 % en peso o menos que la com binación de alcaloides, cada uno en base al peso en seco, y en donde la tebaína constituye aproxim adam ente el 3,5 % (preferentem ente, aproxim adam ente el 4,0 %, con m ayor preferencia, aproxim adam ente el 4,3 %) o más de la paja de am apola en base al peso en seco,
En otro aspecto de este método, la sem illa dePapaver somniferumexpuesta al agente m utagénico en la etapa (a) de este m étodo es una sem illa seleccionada ATCC PTA-9110 o ATCC Pt A-9109.
La presente invención tam bién se refiere a la progenie dePapaver somniferumATCC-9109, dicha progenie produce una paja de am apola con tebaína que constituye aproxim adam ente el 95 % en peso o más que una com binación de alcaloides, y que tiene oripavina que constituye el 5 % en peso o m enos que la com binación de alcaloides, y en donde la tebaína constituye el 3,0 % (preferentem ente, el 3,5 %, con m ayor preferencia, el 4,0 %, con la m áxima preferencia, el 4,3 %) o más de la paja de am apola en base al peso en seco, en donde la com binación de alcaloides com prende morfina, codeína, tebaína y oripavina, en donde dicha progenie tiene un quim iotipo de solo tebaína, que proporcionan dos genes independientes, el primero evita que la tebaína se convierta en neopinona y evita que la oripavina se convierta en m orfinona y el segundo bloquea la ruta entre la tebaína y la oripavina.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 proporciona un crom atogram a que muestra la separación de los alcaloides mediante el uso del m étodo UPLC isocrático.
La F igura 2 proporciona un crom atogram a de la paja de am apola de la generación M3 de FN1-1242-3. ATA indica tebaína, ori indica pico de oripavina, A M A representa m orfina y A C A representa codeína.
Descripción detallada de la invención
Mediante el uso de las plantas mutantes dePapaver somniferumtal com o se describ ió en la presente descripción, los expertos en la técn ica saben fácilm ente cóm o cultivar, reproducir, reco lectar el látex o la paja seca y purificar la tebaína. Como una habilitación de la presente invención, las sem illas de las plantas mutantes dePapaver somniferum(FN1-1242-3), com o se describ ió en la presente descripción, se depositaron en virtud del Tratado de Budapest en la Colección Am ericana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 20 de m arzo de 2008, bajo la designación de depósito de patente ATCC PTA-9109®, y estará disponib le una vez que esta solicitud se convierta en patente. La disponib ilidad de estas sem illas no se debe in terpretar com o una licencia para practicar esta invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de cua lquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente o derechos de reproductor. Independientem ente de la habilitación que proporciona por este depósito, los expertos en la técn ica de mutación de sem illas pueden obtener la sem illa en la presente descripción mediante em pleo del proceso de m utagénesis com o se describe más abajo.
La producción de sem illas mutantes es bien conocida en la técnica. Los m étodos de m utagénesis de semillas, así com o tam bién los m utágenos adecuados para su uso en estos métodos, ta les como el m etanosulfonato de etilo (EMS), se describen en el M anual on M utation Breeding, 2da ed., I.A.E.A., V iena 1977 o en Plant Breeding, Principles and Prospects, Chapm an and Hall, Londres 1993. Para las sem illas m utadas por rayos X, las sem illas hidratadas se pueden tra tar con 20 000 rads (a 30 cm de la fuente durante 45 m inutos mediante el uso de un filtro). La m utagénesis por rayos X se describe y se com para con la m utagénesis por EMS en el docum ento Filippetti, A. y otros, "Im provem ent o f Seed Yield in Vicia Faba L. By Using Experim ental M utagenesis II Com parison o f Gam m a-Radiation and Ethyl-M ethane-Sulphonate (EM S) in Production o f M orphological Mutants", Euphytica 35 (1986) 49-59. Las sem illas m utadas con DEB, diepoxibutano, se pueden obtener m ediante remojo de las sem illas en agua durante toda la noche, luego se remojan en DEB 22 mM durante 4 horas, seguido de un lavado exhaustivo. O tros m utágenos incluyen sulfuro de etil-2-cloroetilo, 2-cloroetil-d im etilam ina, óxido de etileno, etilenim ina, dim etilsulfonato, dietilsulfonato, propano sulfona, beta-propio lactona, diazom etano, N -m etil-N-nitrosouretano, naranja de acridina y azida de sodio.
La m utagénesis mediante el uso de EMS está bien descrita en el docum ento The M anual on M utation Breeding, supra, informa sobre un proceso de m utagénesis EMS preferido para sem illas de cebada tal com o lo practica K. M ikaelson. En este proceso preferido, las sem illas se preparan, se remojan previamente, se tratan con el mutágeno y se lavan posteriorm ente.
La patente de Estados Unidos núm. 6,067,749 describe el uso de EMS para la preparación de una cepa dePapaver somniferumcon alta concentración de tebaína y oripavina.
Tam bién se pueden usar m étodos de irradiación, com o la m utagénesis con neutrones rápidos, para producir sem illas mutantes. (Véase el docum ento, Li, X. y otros, A fast neutron deletion m utagenesis-based reverse genetics system for plants, The Plant Journal 27(3), 235-242 (2001 )). Los solic itantes em plearon y prefieren la m utagénesis de neutrones rápidos ("FNM ") com o el m utágeno en la presente descripción.
La m utagénesis de neutrones rápidos se describe en el docum ento de Kodym y Afza (2003), Physical and Chem ical M utagenesis, pp 189-203, en M ethods in M olecular Biology, vol 236: La genóm ica funcional de las plantas: M étodos y protocolos (Ed. E. Grotewold), Hum ana Press Inc, Totowa, NJ.
Los rayos gam m a (y ) son ondas electrom agnéticas de longitudes de onda muy cortas y se obtienen por desintegración de radio isótopos de Co o Cs. Las fuentes y se pueden insta lar en una celda y , una habitación y o un cam po y . Estos están protegidos por plomo u horm igón. La m ayoría de las fuentes y son adecuadas para la irradiación de semillas, siem pre que el tam año del espacio de irradiación sea suficiente y la tasa de las dosis permita tiem pos de irradiación prácticos.
Los neutrones rápidos son partículas no cargadas de alta energía cinética y se generan en reactores nucleares o en aceleradores. El científico debería eva luar con los operadores la v iabilidad de la irradiación de semillas, ya que no todas las insta laciones están equipadas adecuadam ente y pueden producir neutrones rápidos con un grado bajo de contam inación con otras radiaciones.
Los dos tipos de radiaciones difieren en sus propiedades físicas y, por tanto, en su actividad mutagénica. Los rayos Y tienen una efectividad biológica relativa (RBE) m enor que los neutrones rápidos, lo que im plica que para obtener el m ismo efecto biológico se debe adm in istrar una dosis m ayor de radiación Y. La RBE es principalm ente una función de la transferencia lineal de energía (LET), que es la transferencia de energía a lo largo de la pista ionizante. Los rayos Y producen unas pocas ionizaciones por m icra de trayectoria (LET bajo) y pertenecen a la categoría de radiación escasam ente ionizante. Los neutrones rápidos (LET alta, radiación densam ente ionizante) imparten parte de su alta energía cinética a través de colisiones, en gran parte con protones dentro del material.
Cuando la radiación atraviesa el tejido, se producen eventos físicos com o ionizaciones (la expulsión de electrones de las m oléculas) y excitaciones (proceso de elevación de electrones a un estado de m ayor energía) que provocan efectos en el ADN, las membranas, los lípidos, las enzimas, etc. En segundo lugar, se inducen procesos quím icos que com ienzan con la form ación de m oléculas activadas, los llam ados radicales libres (O H y H ) , que surgen de OH- y H+. Si el oxígeno está presente, reacciona fácilm ente con los radicales libres inducidos por la radiación para form ar radicales peroxi. En el caso de una radiación LET baja, la form ación de radicales peroxi se favorece. En una radiación LET alta, la form ación de peróxido de hidrógeno (H 2O2) por recom binación de radicales libres. Todos los radicales y el peróxido de hidrógeno pueden reaccionar con m oléculas biológicas. El daño prim ario causado por la radiación ocurre de form a aleatoria y es tanto fis io lóg ico com o genético. La recuperación fis io lóg ica y la reparación del ADN son posibles hasta cierto punto, ya que las m oléculas no dañadas se pueden hacer cargo de los procesos m etabólicos y se activan los m ecanism os de reparación del ADN.
Antes de in iciar cua lquier estudio de inducción de m utaciones, es fundam ental se leccionar las dosis adecuadas.
Para la inducción de m utaciones se aconseja usar de dos a tres dosis jun to con un control. Las dosis aplicables dependerán del objetivo de reproducción o de la investigación, el tipo de radiación y el m aterial vegetal en particular. Se conoce que los géneros y especies de plantas y, en m enor medida, los cultivares difieren en su radiosensibilidad. La radiosensibilidad (la sensib ilidad a la radiación) es una m edida relativa que da una indicación de la cantidad de efectos reconocibles de la exposición a la radiación en el objeto irradiado. En la radiosensibilidad influyen los factores biológicos (como diferencias genéticas, volum en crom osóm ico nuclear y de interfase) y por factores am bientales m odificadores (oxígeno, contenido de agua, a lm acenam iento posterior a la irradiación y tem peratura). Los factores m odificadores afectan en gran m edida la eficiencia m utagénica y la reproducib ilidad de los resultados. El oxígeno es el principal factor modificador, m ientras que el contenido de humedad, la tem peratura y el alm acenam iento parecen ser secundarios e interactúan con el efecto del oxígeno. El oxígeno m uestra una acción sinérgica con la radiación escasam ente ionizante, pero los efectos del oxígeno durante la irradiación y el alm acenam iento posterior a la irradiación se pueden evitar fácilm ente con el ajuste del contenido de agua de las sem illas al 12-14 % en los cereales y en la m ayoría de las dem ás sem illas. En sem illas oleaginosas com o la am apola, el contenido de agua de las sem illas debe ser menor, a lrededor del 7-8 %. La región crítica es el embrión, pero se puede suponer que el contenido de agua de la sem illa y del embrión de la mayoría de las especies será similar. Los factores am bientales son m enos im portantes con la radiación densam ente ionizante; por lo tanto, para la radiación de neutrones rápidos, no es necesario a justar la hum edad de las semillas.
A menos que se conozcan por experiencia o se publicaron los datos sobre la radiosensibilidad de una planta determ inada, el program a de inducción de m utaciones debe ir precedido de una prueba de radiosensibilidad. Esto se hace mediante la irradiación de las sem illas con un intervalo de dosis y se hacen crecer las plantas en condiciones de invernadero. La radiosensibilidad se evalúa según criterios ta les com o la altura reducida de las plántulas, la fertilidad y la supervivencia en la generación M1. G eneralm ente se supone que una reducción de la altura de las plántulas del 30-40 % produce un alto rendim iento de mutación. La utilidad de la radiación se puede ju zga r por la eficiencia mutagénica, que es la producción de cam bios convenientes libres de asociación con cam bios indeseables. Una dosis alta aum entará la frecuencia de m utación (la frecuencia con la que se encuentra un tipo específico de m utación o m utante en una población de células o individuos), pero irá acom pañada de características negativas, tal com o la esterilidad. Al seleccionar las dosis, será necesario encontrar un régimen de tratam iento que proporcione una alta eficiencia mutagénica.
Para la radiación de neutrones rápidos, se deben realizar m ediciones dosim étricas durante cada tratam iento de radiación, por ejemplo, mediante la realización del m étodo del detector de umbral de azufre, ya que el flujo de neutrones en la unidad de irradiación de sem illas no es constante.
El G ray (sím bolo Gy), la unidad SI (S istem a Internacional) usada para cuantificar la dosis de radiación absorbida (1 Gy = 1 J/kg), sustituyó a la antigua unidad rad; 1 Gy = 100 rads o 1 krad = 10 Gy. La tasa de dosis absorbida (Gy/s o G y/m in) indica cuánta energía absorbe el material irradiado durante una unidad de tiem po determ inada. La duración de la exposición y la tasa de dosis determ inan la dosis de radiación. La exposición durante períodos cortos de tiem po (segundos a unas pocas horas) a una tasa de dosis alta se denom ina aguda y se aplica más en program as de irradiación.
Usam os el Instituto de investigaciones de energía atómica, Konkoly Thebe ut 29/33, X.epulet, H-1121 Budapest, Hungría para irradiar nuestras semillas.
Se ha dem ostrado que los neutrones rápidos son un m utágeno muy efectivo. Kornneef y otros (1982) descubrieron que se necesitan alrededor de 2500 líneas tratadas con neutrones rápidos a una dosis de 60 Gy para inactivar un gen una vez en prom edio (docum ento Koornneef, M., Dellaert, L.W.M y van der Veen, J.H. (1982) EM S- and radiation-induced mutation frequencies at individual loci in A rabidopsis tha liana (L.) Heynh. Mutat. Res.93, 109-123). Si el genom a de la planta contiene a lrededor de 25 000 genes, se estima que en cada línea se elim inan aleatoriam ente unos 10 genes.
FNM ofrece una serie de ventajas m ediante el uso de tratam ientos quím icos ta les como EMS. Notablem ente, el tratam iento se aplica a la sem illa seca, que se puede sem brar en una fecha posterior, m ientras que con EMS la sem illa se debe sem brar inm ediatam ente después del tratam iento o vo lver a secarse cuidadosam ente para sem brarla más tarde.
Después de que las sem illas se exponen al mutágeno, las sem illas se cultivan hasta la m adurez en condiciones contro ladas y se autopolinizan. Las sem illas de la planta madura se tom an y se planta al menos una sem illa para que crezca una generación M2. La generación M2 se exam ina para la producción de alcaloides. Por supuesto, es posible exam inar la generación M1, pero exam inar la generación M2 tiene varias ventajas. En prim er lugar, el cribado de la generación M2 garantiza que el rasgo resultante de la m utagénesis se pueda heredar. En segundo lugar, al cultivar la generación M2, se dem uestra la resistencia básica de la planta antes del cribado. En te rcer lugar, los rasgos resultantes de la m utagénesis generalm ente se heredan com o genes recesivos. T íp icam ente, el gen m utado estará en estado heterocigoto en la generación M1 y, por tanto, la mutación quedará enm ascarada por la form a dom inante (no m utada) del gen. Sin em bargo, en la generación M2, en una proporción de las plantas el gen estará en estado hom ocigótico y el efecto de la m utación será evidente. Las plantas M2 se pueden cultivar para producir una cápsula inmadura, pero es posible ahorrar tiem po y trabajo si las plantas se exam inan en una etapa anterior del crecim iento. Las plantas se recom ienda exam inarlas en un punto que com ience en la etapa de 6 hojas hasta la etapa de 10 hojas. La detección en esta etapa tem prana perm ite m anejar m uchas plantas en un espacio pequeño. El proceso de selección en sí es el que requiere un traba jo más intensivo. Por lo tanto, para m ejorar el rendim iento del trabajo, sólo se deben exam inar las plantas que parezcan saludables.
En el proceso de selección, el objetivo es m edir el contenido de morfina, codeína, tebaína y oripavina de cada planta. Los alcaloides adicionales que tam bién se pueden m edir durante el proceso de selección incluyen salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina y noscapina. Esto se puede lograr con la extracción, por ejemplo, una hoja seca en un tam pón líquido o al disolver una m uestra de látex en un tam pón. Las soluciones tam pón se colocan en bandejas de 96 pocillos y se alim entan m ecánicam ente a través de cualquiera de los HPLC de alto rendim iento disponib les com ercialm ente. En una modalidad preferida, se utiliza un m étodo isocrático de crom atografía líquida de ultra alto rendim iento (UPLC), com o se describe en la presente descripción, que proporciona una detección de látex muy rápida.
Las plantas con contenidos de alcalo ides interesantes se siguen cultivando y se exam inan con más detalle. De acuerdo con el procedim iento en la presente descripción, se tom a una segunda m uestra de aproxim adam ente el 3 % de las plantas para aclarar o confirm ar los resultados del análisis inicial. Se usa un m étodo UPLC de gradiente más preciso, com o se describe en la presente descripción, para obtener una identificación y cuantificación de picos más precisa. Las plantas que se confirm an que tienen un perfil de alcalo ides inusual se trasplantan a m acetas de 200 mm (aproxim adam ente 8 pulgadas) para que crezcan hasta la madurez. Después de exam inar aproxim adam ente 34 358 plantas, se encontraron veintiún plantas con un alto contenido de tebaína y sustancia lm ente nada de oripavina, m orfina o codeína.
Com o se usa en la presente descripción, el térm ino "paja de am apola" o "paja" significará el m aterial de paja que resulta cuando las cápsulas de am apola m adura y los tallos de las cápsulas de am apola de una planta dePapaver somniferumse recolectan y se trillan para e lim inar las sem illas y form ar una paja.
El térm ino "opio", com o se usa en la presente descripción, se referirá a la exudación lechosa (es decir, el látex) secada al aire de las cápsulas de am apola inm aduras cortadas de una planta dePapaver somniferum.
Com o se usa en la presente descripción, el térm ino "concentrado de paja de am apola" o "CPS" significará el material que surge cuando la paja de am apola entra en un proceso de concentración de sus alcalo ides en form a líquida, sólida o en polvo que contiene los alcalo ides de fenantreno de la amapola.
La frase "población vegetal dePapaver somniferum"o "población vegetal dePapaver somniferumde reproducción estable", com o se usa en la presente descripción, se refiere a un grupo de dos o más plantas dePapaver somniferumo plantas dePapaver somniferumde reproducción estable ubicadas juntas.
Com o se usa en la presente descripción, el térm ino "com binación de alcalo ides" se referirá a una com binación de alcalo ides en donde el alcalo ide com prende morfina, codeína, tebaína y oripavina. En otra modalidad de la presente invención, la com binación de alcalo ides com prende adem ás salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina y noscapina adem ás de morfina, codeína, tebaína y oripavina.
Una planta de am apolaPapaver somniferum"de reproducción estable" com o se describe en la presente descripción se refiere a una planta de am apola que se reproduce de m anera estable, según se requiere, para p lantar y cosechar sem illas de am apola durante múltiples generaciones donde cada generación sería adecuada, sin selección de semillas, para la siem bra com ercial de un cultivo de cam po o población vegetal de plantas que exhiben la características alcaloides deseadas. Una planta de am apola de reproducción estable contiene las características de alcalo ides deseadas com o se describe en la presente descripción, y cuando se autopoliniza, o se poliniza de form a cruzada con una planta con los m ism os genes que controlan el contenido de alcaloides, produce subsecuentem ente una generación de plantas que sustancia lm ente todas tienen sem illas que cuando se cultivan producen plantas con las m ismas características de alcalo ides deseadas que la planta progenitora. Adem ás, en ausencia de polinización con polen de otros quim iotipos (por ejemplo, plantas convencionales que acum ulan morfina), la línea continuará la producción de plantas sim ilares durante múltiples generaciones, sin necesidad de selección para m antener la característica alcalo ide deseada. Un ejem plo de una característica alcalo ide deseada que se puede transm itir a las generaciones futuras mediante una planta de am apolaPapaver somniferumde reproducción estable incluye las características m ejoradas de tebaína (por ejemplo, en donde la tebaína constituye el 95 % (preferentem ente, el 96 % y con m ayor preferencia, el 97 %) en peso o más, y la oripavina constituye el 1 % (preferentem ente, el 0,8 % y con m ayor preferencia el 0,7 %) en peso o m enos que la com binación de alcaloides).
Com o se usa en la presente descripción, la "población M1" son las sem illas y las plantas resultantes expuestas a un agente mutagénico, m ientras que la "población M2" es la progenie de plantas M1 autopolin izadas, la "población M3" es la progenie de plantas M2 autopolin izadas, la "población M4" es la progenie de plantas M3 autopolin izadas y, generalm ente, la "población Mn" es la progenie de plantas Mn-1 autopolinizadas.
Com o se indicó anteriorm ente, m ediante la presente invención se obtiene una paja de amapola, un concentrado de paja de am apola u opio que tiene tebaína que constituye el 95 % en peso o más y oripavina que constituye el 5 % en peso o menos de una com binación de alcaloides que com prende morfina, codeína, tebaína y oripavina. Preferentem ente, la tebaína constituye el 96 % (con m ayor preferencia, el 97 %) en peso o más, y la oripavina constituye el 1 % (preferentem ente, el 0,8 % y con la m áxima preferencia, el 0,7 %) en peso o menos que la com binación de alcalo ides que com prende morfina, codeína, tebaína y oripavina. En una modalidad preferida, la com binación de alcalo ides com prende adem ás salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina y noscapina. Con m ayor preferencia, sustancia lm ente no hay oripavina, m orfina o codeína en la com binación de alcaloides, y con la m áxima preferencia, sustancia lm ente no hay oripavina, morfina, codeína, salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina o noscapina en la com binación de alcaloides.
Com o se usa en la presente descripción, el térm ino "sustancia lm ente no" cuando se refiere al contenido de oripavina significa que la oripavina constituye menos del 0,6 % en peso, preferentem ente, menos del 0,5 % en peso, con m ayor preferencia, menos del 0,4 % en peso, y con la m áxima preferencia, entre 0 % y 0,2 % en peso de la com binación de alcalo ides de la paja de amapola, concentrado de paja de am apola u opio.
El térm ino "sustancia lm ente no", cuando se hace referencia a la morfina, codeína, salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina o noscapina, com o se usa en la presente descripción, significa que cada uno de los alcaloides especificados constituyen menos del 1 % en peso, preferentem ente, m enos del 0,5 % en peso, con mayor preferencia, menos del 0,3 % en peso, y con la m áxima preferencia, entre el 0 % y el 0,2 % en peso de la com binación de alcalo ides de la paja de amapola, concentrado de paja de am apola u opio.
El térm ino "rasgo", tal como se usa en la presente descripción, significa una característica fenotíp ica hereditaria distinta. Los rasgos deseados, es decir, alto contenido de tebaína versus contenido de oripavina, m orfina o codeína, una vez establecidos, son altam ente hereditarios. Para m antener los rasgos deseados, se debe evitar la polin ización cruzada con plantas normales, a menos que dicha polinización cruzada sea parte de un program a de reproducción controlada.
Los rasgos deseados se pueden transfe rir a líneas de am apola que tengan otras características (por ejemplo, diferente altura, m adurez tem prana o tardía o resistencia a enferm edades) m ediante la polin ización cruzada de la planta con alto contenido de tebaína con la segunda planta progenitora, recolección de la sem illa F1, cultivo de una planta F1 que se deje autopolin izar y recolección de la sem illa F2. La sem illa F2 se cultivaría luego y se podrían seleccionar las plantas individuales que tengan la característica alta en tebaína, de acuerdo con los m étodos en la presente descripción, jun to con las otras características deseadas tales com o resistencia a enferm edades. Un operador experto podrá ap licar variaciones a este m étodo como se conoce en el fitom ejoram iento.
La realización de cruces de prueba con plantas de genotipo conocido puede proporcionar inform ación sobre los cam bios genéticos que se introducen mediante la mutación. Las características de la generación F1, producida al cruzarse con un progenitor normal (tipo salvaje), indicarán si un rasgo se hereda com o gen recesivo o dom inante. La autopolin ización de las plantas F1 y la determ inación de los fenotipos de la posterior población de plantas F2 proporcionarán información sobre la cantidad de genes responsables de características particulares.
De manera que la teoría que m uestra que la m utagénesis es capaz de aum entar el contenido de tebaína dePapaver somniferumcon relación al contenido de oripavina, m orfina y codeína no se puede dar com o una explicación cierta o definitiva en este momento. La m utagénesis podría m odificar la ruta de biosíntesis de varias m aneras para m inim izar la producción de oripavina. A pesar de que actualm ente no se dispone de respuestas definitivas, hay buenas razones para creer que se conoce la respuesta correcta.
Se postula quePapaver somniferumtiene dos rutas biosintéticas desde la tebaína hasta la morfina, com o se muestra en el Esquem a 4. La ruta A mediante neopinona, codeinona y codeína fue propuesta por Parker, H. I., J. Am. Chem. Soc., 94, 1276-1282 (1972). La ruta B a través de oripavina y m orfinona fue propuesta por Brochm ann-Hanssen, E., Planta Med., 50, 343-345 (1984). La enzim a codeinona reductasa (NADPH) se cree que está activa en am bas rutas, que reducen la codeinona a codeína y la m orfinona a morfina. Adem ás, la m utación TOP1 (M illgate y otros, Nature, Vol. 431, 413-414, 2004) afecta a am bas rutas, evita que la tebaína se convierta en neopinona en la vía A y evita que la oripavina se convierta en m orfinona en la ruta B. La mutación TOP1 parece bloquear la desm etilación del éter enólico que convierte la tebaína en neopinona, así com o tam bién la desm etilación del m ismo enol é ter en oripavina.
Mediante los m étodos en la presente descripción, plantas dePapaver somniferumse obtuvieron sustancia lm ente sin oripavina, m orfina o codeína. Tanto la ruta A com o la ruta B no fueron operativas para producir m orfina en la línea progenitora mediante el uso de la m utación TOP1. La etapa más probable que se observa afectada por la mutación es la etapa de O -desm etilación fenólica entre tebaína y oripavina. Así, se cree que, para las plantas dePapaver somniferumdescritas en la presente descripción, la producción o actividad de la enzim a O-desm etilasa fenólica que convierte la tebaína en oripavina se inhibe sustancialm ente. LaPapaver somniferumde reproducción estable de acuerdo con la presente invención tam bién se puede obtener mediante técn icas de a D n recom binante. En particular, después del a islam iento y secuenciación del gen que codifica la tebaína desm etilasa, el gen se puede m odificar o e lim inar para inhib ir o prevenir la producción de tebaína desm etilasa. Las técn icas para m odificar la actividad genética tales com o ARNi, antisentido y otras técn icas se conocen bien para los expertos en la técnica. Una vez que se establece la codificación del gen, puede usarse una técn ica T ILLING para recuperar mutantes de poblaciones de manera más eficiente (docum ento Henikoff, S., Till, B.J. y Comai, L. (2004) TILLING. Traditional m utagenesis meets functional genom ics. Plant Physiology 135, 630-636).
Sabiendo que existen medios genéticos para reducir la conversión de tebaína en oripavina en las amapolas, y que ahora que se dem ostró que estas am apolas son alcanzables y viables, en última instancia incluso se pueden usar en enfoques de m ejoram iento convencionales para desarro llar ta les plantas.
Esquema 4
Oripavina Morfinona
Rutas biosintéticas postuladas en Papaver somniferum
A: Parker y otros, 1972
B: Brochmann-Hanssen, 1984
Recuperar tebaína de la paja seca o del opio dePapaver somniferumes un proceso bien establecido en la técnica. Hasta ahora, la tebaína se extrae de esta especie vegetal ya sea com o parte del proceso de extracción de m orfina y codeína o, más recientem ente, com o parte del proceso de extracción de tebaína y oripavina.
En un proceso, la paja se trata con una pequeña cantidad de cal y agua para ab landar las cápsulas y form ar una base libre de alcaloides. La extracción a contracorriente de la paja ablandada con metanol, etanol u otro solvente adecuado form a un extracto de solvente/agua o "m icela" que contiene los alcaloides, con m orfina a una concentración de aproxim adam ente 1 g/l cuando la paja es estándar dePapaver somniferum.El volum en de la m icela se reduce aproxim adam ente 30 veces al vacío para producir un concentrado acuoso. La tebaína se extrae del concentrado acuoso mediante el uso de una extracción líquido/líquido con tolueno, con ajuste del pH para lograr la m ejor separación de la tebaína. La tebaína se recupera del tolueno. Por supuesto, la recuperación de tebaína a partir de laPapaver somniferumm ejorada proporcionada en la presente descripción, se verá facilitada por el hecho de que la concentración de tebaína en la m icela será mucho m ayor que la de otros alcalo ides y, por tanto, se podrá reco lectar más fácilm ente mediante precipitación. Adem ás, en ausencia sustancia l de oripavina, m orfina y codeína, la tebaína se podría extraer directam ente de la paja mediante el uso de tolueno, xileno u otro solvente orgánico en el que la tebaína sea soluble.
Los siguientes ejem plos se exponen para ayudar a com prender la invención y no pretenden ni se deben interpretar com o que lim itan de ninguna manera la invención expuesta en las re ivindicaciones que siguen a continuación.
Ejemplo 1
Una selección de la am apolaPapaver somniferumW F03-0802, se usa com o m aterial de partida. Esta línea contiene la m utación TOP1 y por lo tanto tiene las características de contener tebaína y oripavina en su paja de am apola y opio, y está sustancia lm ente libre de m orfina y codeína. Las sem illas de W F03-0802 se depositaron en virtud del Tratado de Budapest en la Colección Am ericana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 20 de marzo de 2008, bajo la designación de depósito de patente ATCC PTA-91 10, y estará disponib le una vez que esta solicitud se convierta en patente. La disponib ilidad de estas sem illas no se debe interpretar como una licencia para practicar esta invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente o derechos de reproductor.
Se prepararon seis muestras de sem illas de 10 g cada una. Una m uestra se retuvo com o control. Después de obtener las inspecciones y perm isos necesarios, las 5 m uestras se enviaron al Instituto de Investigación de Energía A tóm ica de Budapest, Hungría, para su irradiación. En el Instituto, las muestras se sacaron de sus viales, se envasaron en bolsas de plástico y soportes de cadm io y se irradiaron con neutrones rápidos. Las tasas de dosis y los tiem pos de exposición fueron los siguientes:
Tratam iento 1 10 Gy 13 m inutos 17 segundos
Tratam iento 2 20 Gy 26 m inutos 30 segundos
Tratam iento 3 25 Gy 33 m inutos 16 segundos
Tratam iento 4 35 Gy 46 m inutos 27 segundos
Tratam iento 5 50 Gy 66 m inutos 13 segundos
Los parám etros inform ados de la irradiación fueron los siguientes:
G eom etría de la irradiación en BIF de BRR en AERI: 2Y/Cd, girado
M onitoreo por cám aras de fisión U-235, Th-232 y contador GM.
La hom ogeneidad de la dosis dentro de un em paque es m ejor que el 1 %
La incertidum bre general de la dosis es inferior al 5 %.
La actividad gam m a superficial tota l de las m uestras después de la irradiación: -695 BGND
La actividad gam m a superficial tota l de las m uestras el 20 de octubre de 2005: <2 BGND
(1 BGND (fondo) es ~90 nGy/h)
El Instituto devolvió las sem illas a los solicitantes, las volvió a pesar y se encontró que habían perdido una masa prom edio del 1,1 %. Esto es com patib le con su transferencia dentro y fuera de las bolsas de plástico, así como tam bién con la pérdida de algo de humedad durante la irradiación.
Las muestras de sem illas se colocaron sobre papel de filtro húm edo en una placa de Petri. Después de 3 y 7 días, las sem illas se exam inaron. Los tratam ientos del 1 al 4 germ inaron bien, m ientras que el tratam iento 5 tuvo radículas muy cortas y solo un pequeño porcentaje de plantas con brotes.
Se cultivó una prueba en maceta para eva luar el efecto del tratam iento FNM sobre el crecim iento de las plantas. Se sem braron dos macetas con 10 sem illas de cada uno de los tratam ientos 1, 2, 3, 5 y control. Se observó la em ergencia y el crecim iento de las plantas en estas macetas. La irradiación redujo la em ergencia y supervivencia de las plantas de una media de 9 plantas por maceta en el tratam iento control a 8,5 plantas en el Tratam iento 1; a 7,5 plantas en el tratam iento 2; a 7 plantas en el tratam iento 3 y a 4 plantas en el tratam iento 5. El desarro llo tam bién se retrasó al aum entar la dosis y la altura de la planta, se redujo aproxim adam ente un 10 % en el tratam iento 1, un 20% en el tratam iento 2 y un 40 % en el tratam iento 3.
Las sem illas de los tratam ientos 2 y 3 se sem braron en macetas de 200 mm rellenadas con m ezcla para macetas del vivero de la Com isión Forestal de Perth, Tasm ania. Se sem braron 10 sem illas por maceta, las cuales se recubrieron con verm iculita. Las plantas se cultivaron hasta su m adurez en un invernadero. Todas las flores se autopolin izaron por transferencia de polen de las anteras al disco estigm ático. Las cápsulas m aduras se cosecharon en bolsas grandes de papel, etiquetadas con el núm ero de tratam iento, m anteniendo los d iferentes tratam ientos separados. Cuando habían 2 o más cápsulas en una planta, se recogieron en una bolsa de papel para que perm anecieran juntas. Se cosecharon plantas d istintivas en bolsas separadas y se tom aron notas sobre su apariencia. Las cápsulas cosechadas se alm acenaron durante aproxim adam ente una sem ana para garantizar que la sem illa se secara al aire.
La sem illa se separó de las cápsulas en el laboratorio y se pesó en sobres de papel etiquetados con FN1-X donde FN1 se refiere al experim ento 1 de neutrón rápido y X es el número de secuencia de la m uestra de semilla. La sem illa de múltiples cápsulas de la m isma planta se com binó en una sola muestra.
Se cosecharon las sem illas de un total de 8495 plantas. 7280 de ellas fueron del tratam iento 2 por radiación. El peso medio de las sem illas cosechadas por planta M1 fue de 0,41 g.
Crecim iento y selección de la generación M2
Cultivo de plantas
Las plantas M2 se cultivaron en un invernadero en bandejas cada una con 288 células. Se sem braron 12 celdas con sem illa de cada planta M1. En cada celda se sem braron dos sem illas y se adelgazaron hasta obtener una planta por celda después de 1-2 semanas. Las plantas se sem braron en lotes de 4-17 bandejas cada sem ana para d istribu ir la carga de trabajo en 17 semanas.
M uestreo de las hojas
Cuando las plantas tenían aproxim adam ente 6 sem anas de edad, se analizó el perfil de alcalo ides mediante el uso del látex de la hoja más joven com pletam ente expandida (YFEL). Se añadieron 240 pL de solución de extracción de látex (23 g de NH4H2PO4 disueltos en 800 ml de agua desionizada (DI), com pletado hasta 1 litro con etanol) a los 96 pocillos de una placa de filtro (placa de filtro de 96 pocillos Pall AcroPrep™ de m em brana GHP de 0,2 pm, carcasa natural, 350 pL PN S5045, (Pall Corporation, East Hills, Nueva York)). Se retiró la punta del YFEL de cada planta y se colocó en un pocillo de la placa de filtro m ediante el uso de unas pinzas finas. Se necesitaron tres placas de filtro para tom ar las muestras de las plantas en una bandeja. Las placas se dejaron reposar durante aproxim adam ente 30 m inutos después del m uestreo para perm itir que el látex se filtrara de las hojas a la solución de extracción. Luego se filtró la solución en una placa de recolección de 96 pocillos, que se selló con unos sellos adhesivos de lámina de PCR ABgene® (Abgene, parte de Therm oFisher Scientific, Rockford, Illinois) para evitar la evaporación.
M étodo UPLC
El m étodo UPLC usado para la prim era etapa de selección se describe en el Ejemplo 2. Las áreas de pico se exportaron a un archivo Excel (M icrosoft Corporation, Seattle, W ashington) para el análisis de los datos. No se aplicó ninguna corrección para la d iferencia de absorción UV entre los picos de alcaloides. La absorción relativa de oripavina y tebaína, los principales picos de interés, fue en cua lquier caso muy sim ilar en la longitud de onda usada. Análisis de los datos
Las áreas de pico relativas se calcularon para todos los a lcalo ides identificados. Luego se ordenaron los archivos de datos de Excel para identificar plantas que tenían un alto contenido de tebaína y un bajo contenido de oripavina con relación a todos los alcaloides extraídos identificados. Los crom atogram as de las plantas identificadas com o de interés se revisaron para garantizar que los picos de interés estuvieran integrados correctam ente.
Confirm ación
Luego se volvieron a tom ar muestras de las plantas identificadas en la primera selección para proporcionar la confirm ación del perfil de a lcalo ides y garantizar que se localizara la planta correcta antes del trasplante. Las plantas seleccionadas se m arcaron con un alam bre recubierto de plástico cuando se volvieron a analizar para que se pudieran identificar de m anera confiable para el trasplante. En la prueba de confirm ación se usó un sistem a UPLC de gradiente con un tiem po de ejecución de 2,5 m inutos (descrito en el E jem plo 2) para obtener una identificación e integración de picos más precisa.
Trasplante
Las plantas confirm adas como de interés se trasplantaron a m acetas de 200 mm y se etiquetaron con un código que indicaba la línea de sem illas M1 de la que derivaban. Por ejemplo, si se hicieron dos selecciones de la m uestra de sem illa M1 etiquetada com o FN1-1234, estas selecciones se etiquetaron FN1-1234-1 y FN1-1234-2. Se trasplantaron hasta 5 plantas en cada maceta.
La Tabla 2, más abajo, muestra el número de plantas analizadas, el núm ero de selecciones realizadas y el número de selecciones confirm adas. Durante el proyecto, se probaron 34 358 plantas M2 (de 4176 líneas M1) y se seleccionaron 1049 para pruebas adicionales. De estas 549 fueron confirm adas y trasplantadas a macetas. De las 549 trasplantadas, 366 fueron seleccionadas por su alto contenido de tebaína y bajo contenido de oripavina.
Tabla 2
La Tabla 3, más abajo, enum era las 366 selecciones realizadas en base al alto contenido de tebaína y bajo contenido de oripavina en el látex de las m uestras de las hojas. El perfil de a lcalo ides se basa en el área del pico, no en la concentración de los alcaloides.
Tabla 3
Pruebas del contenido de los a lcalo ides de la paja de am apola en la generación M2
Las cápsulas se cosecharon del invernadero a m edida que m aduraban. Las sem illas se extrajeron y se pesaron en sobres para semillas. La paja de am apola sin tritu rar y secar se colocó en tubos BD Falcon™ de 50 ml (BD Biosciences, San Jose, Californ ia) y se dejaron sobre la mesa de laboratorio durante varios días a tem peratura am biente o en el horno del laboratorio a 50 °C durante 3 horas. Cuando las cápsulas eran grandes, sólo se usó una porción de la cápsula para el análisis y se descartó el resto.
Para el análisis, se pesó la paja de am apola y se añadieron 5 ml o 10 ml de extractante ácido (5 % de etanol ("EtOH"), 0,17 % de ácido fosfórico), en dependencia de si las m uestras de paja pesaban m enos o más de 0,2 g, respectivam ente. Las muestras se agitaron con un ag itador orbital Ratek (Ratek Instruments, Boronia, Victoria, A ustra lia) durante 3 horas. Luego la fase líquida se filtró m ediante el uso de placas de filtro de 96 pocillos Pall AcroPrep™ (PN S5045) y el filtrado se analizó en busca de los a lcalo ides m ediante el uso de un sistem a UPLC W aters Acquity® (W aters Corporation, Milford, M assachusetts). El m étodo UPLC usado fue el m ismo m étodo de 2,5 m inutos usado para las muestras de las hojas. Se añadió 1,2 ml adicional de extractor a los pocillos de las placas de 96 pocillos, se sellaron y se congelaron en caso de que fuera necesario un análisis adicional.
Los contenidos y perfiles de los a lcalo ides se calcularon a partir de los resultados de UPLC y los datos del peso. Cuando el peso era <0,1 g, el peso se consideró 0,1 g.
Las sem illas se dejaron secar en la mesa del laboratorio, se catalogaron y alm acenaron.
De las 549 plantas M2 seleccionadas originalm ente, 434 sobrevivieron y produjeron al m enos una cápsula para la cosecha (79 %). Se cosecharon otras 6 cápsulas mal etiquetadas, por lo que se desconocían sus progenitores M1.
395 plantas produjeron algo de semilla, aunque 58 tuvieron <0,06 g de sem illa y sólo 171 plantas produjeron más de 1 g de semilla.
Debido a la posible falta de precisión con los datos del contenido de los a lcalo ides (debido a los bajos pesos de las cápsulas y los grandes tam años de las partículas), estos datos se analizaron más a fondo sólo después de la conversión a perfiles de los alcaloides: es decir, los contenidos de los alcalo ides en com paración con el contenido tota l de los alcaloides.
Cuando se cosecharon múltiples cápsulas de una planta, la media se determ inó mediante el uso del software estadístico M initab 14 (M initab Inc., State College, Pennsylvania).
La Tabla 4, más abajo, muestra los resultados de 133 selecciones M2 de 92 plantas M1 independientes que tenían un alto contenido de tebaína (>90 % de los a lcalo ides) y un bajo contenido de oripavina (<10 %). Trein ta y seis selecciones M2 de 27 plantas M1 independientes tenían más del 95 % del alcalo ide de la paja com o tebaína. Veintiún selecciones de 16 plantas M1 independientes tenían más del 96 % del alcaloide de la paja com o tebaína. Ocho selecciones de 6 plantas M1 independientes tenían más del 97 % del alcalo ide de la paja como tebaína. Se identificó una selección, FN1-900-5, que tenía más del 98 % de su alcalo ide presente com o tebaína. Se puede observar que el contenido de oripavina en la paja de estas plantas fue muy bajo, varias selecciones tienen menos del 1 % de la com binación de alcaloides, y algunas m enos del 0,5 % de la com binación de alcaloides. Sin embargo, todas las plantas "solo tebaína" contenían una pequeña proporción de oripavina en su paja de amapola.
Tabla 4
Crecim iento y evaluación de la generación M3
Se seleccionaron dos de las líneas con más alta tebaína para aum entarlas en un invernadero durante el invierno de 2007 para proporcionar datos que confirm en su com posición de alcalo ides y su estabilidad genética. Por tanto, las plantas cultivadas en este experim ento fueron de la generación M3.
Las m acetas se sem braron en el invernadero el 11 de abril de 2007 en hileras dobles, con 120 m acetas en cada hilera doble. Cada maceta se redujo a 6 plantas. Las condiciones del invernadero fueron las usadas anteriorm ente excepto que se usaron luces de alta intensidad para m antener intensidades de luz de aproxim adam ente 9900 lux durante 12 horas por día.
En la etapa de cápsula verde, se tom aron de cada línea muestras de látex de 24 plantas seleccionadas al azar. Las muestras se obtuvieron de los discos estigm áticos mediante el uso de la técn ica de punción de rayos. Se tom ó un rayo estigm ático de cada planta y se introdujo en una solución de extracción ácida (5 % de EtOH, 0,17 % H3PO4 ) dentro de una placa de filtro (Pall AcroPrep™ placa de filtro de 96 pocillos, GHP de 0,2 jm , NTRL, 350 j L). El resto del procedim iento fue el m ismo que para las pruebas de látex de las hojas. Un ensayo separado estableció que no hubo diferencias significativas en los resultados de tebaína u oripavina que se atribuyeran al uso de una solución de extracción ácida en lugar de una solución de extracción de látex com o se usó anteriorm ente.
La Tabla 5 muestra los resultados de las pruebas de látex en la etapa de cápsula verde para la generación M3. El número de plantas m uestreadas y analizadas al azar se m uestran com o "N". Todas las plantas analizadas tenían el m ismo perfil de alcalo ides con alto contenido de tebaína y sustancia lm ente nada de oripavina o morfina.
�� Cuando las cápsulas estuvieron secas, las plantas se cosecharon a mano. Las cápsulas cosechadas se pesaron y luego se trillaron y tam izaron para separar las sem illas y la paja. Se tom aron subm uestras de la paja y se molieron hasta 2 mm.
La paja se extrajo m ediante el uso de una solución de extracción ácida (5 % EtOH, 0,17 % H3PO4), y se analizó mediante el uso de W aters Acqu ity ULPC® para el contenido de alcalo ides frente a soluciones de alcalo ides estándar en base al peso en seco. La pérdida por secado (LOD) de la paja se determ inó mediante el calentam iento de una muestra a 88 °C durante 9 m inutos mediante el uso de una balanza de infrarrojos (IR) (A&D Com pany Ltd Modelo AD4717, Japón).
Se usó para calcular la concentración de los a lcalo ides en la paja datos del área de pico de acuerdo con el siguiente cálculo:
C onten ido de alca lo ides (%) = 0,1 x SPLA x S TDC x (EV LO D% x SW1 x STDI
STD A 100 SPLI
SW x (100 - LOD%1
100
donde SPLA es el área bajo el pico de interés de la muestra
STDC es la concentración del a lcalo ide estándar en mg/ml
STDA es el área bajo el pico estándar
EV es el volum en de extractante en ml
LOD% es la pérdida por secado de la paja, que se expresa com o porcentaje
S W es el peso de la paja extraída en gramos.
STDI es el volum en de estándar inyectado en m icrolitros
SPLI es el volum en de muestra inyectada en m icrolitros
FN1-900-1 tenía un v igor notablem ente bajo en com paración con las otras líneas. El v igor de la FN1-1242-3 parecía normal. Las diferencias de v igor se hicieron evidentes mucho después del establecim iento, lo que indica que no se trataba de un efecto de la calidad de la semilla.
La Tabla 6 m uestra la pérdida por secado de la paja y el contenido medio de alcalo ides de las m uestras de paja duplicadas según lo determ inado por UPLC.
Los resultados m uestran que la paja de am apola en las dos líneas FN1-900-1 y FN1-1242-3 tiene un contenido muy alto de tebaína y muy bajo (0,01 % y 0,02 %, respectivam ente, en contenido de oripavina). No se detectaron otros alcalo ides (es decir, morfina, codeína, salutaridina, reticulina, laudanina, papaverina y noscapina) m ediante el uso del m étodo descrito.
C recim iento y evaluación de la generación M4
Mediante el uso de sem illas cosechadas de la generación M3, se cultivaron 2 grandes parcelas de cam po de FN1-1242-3 y una de FN1-900-1 m ediante el uso de equipos y m étodos com erciales. No se usaron aerosoles reguladores del crecim iento. La Tabla 7 resume los contenidos de alcalo ides alcanzados en estos cultivos. En el prim er sitio (E lphinstone, distrito de C ircular Head de Tasm ania), se cultivaron am bas selecciones, jun to con la línea progenitora normanda, W F03-0802. Las muestras recolectadas m anualm ente y tom adas de las parcelas se analizaron con más del 5,0 % de tebaína y 0,02 % de oripavina. Las m uestras cosechadas a m áquina se analizaron con 4,65 % de tebaína y 0,02 % de oripavina (líneas FN1 com binadas). La línea progenitora norm anda en el m ismo prado dio un resultado de 3,05 % de tebaína y 0,89 % de oripavina.
En R oebuck (distrito de M erseylea de Tasm ania), el cultivo FN1-1242-3 obtuvo un 4,36 % de tebaína y 0,02 % de oripavina, m ientras que la línea progenitora norm anda W F03-0802 obtuvo un prom edio de 2,08 % de tebaína y 0,75 % de oripavina. Estos datos m uestran que el rasgo de solo tebaína se heredó en la generación M4 y que perm ite a las plantas acum ular contenidos muy altos de tebaína.
El m étodo usado para el análisis de la paja es el siguiente. Las m uestras de diez gram os de paja molida se extrajeron con 100 ml de solución de extracción. La solución de extracción com prendía 30 % de etanol y 10 % de ácido acético glacial. Las m uestras se agitaron durante 25 m inutos y luego se filtraron a través de papel de filtro W hatm an núm. 6. Las soluciones se analizaron mediante el uso de un sistem a HPLC W aters A lliance equipado con una colum na Alltech Platinum C18, 7 m m x53 mm, con relleno de 3 micrones.
La fase móvil constaba de 8 ml de trietilam ina, 125 ml de acetonitrilo y 950 ml de agua MilliQ, ajustada a pH 4,1 con ácido fosfórico. El régimen de flu jo fue de 3 m l/m inuto y la colum na se m antuvo a 40 °C. Los alcalo ides se detectaron a 284 nm mediante el uso de un detector UV.
La pérdida por secado (LOD) de la paja se determ inó mediante el calentam iento de una m uestra a 88 °C durante 9 m inutos mediante el uso de una balanza de infrarrojos (IR) (A&D Com pany Ltd M odelo AD4717, Japón).
Las concentraciones de los a lcalo ides se determ inaron com parándolas con soluciones estándar y los resultados se calcularon en base al peso en seco. Los picos de tebaína y oripavina en estas m uestras representaron más del 98 %, y la m orfina y la codeína representaron m enos del 1 % del área del pico de alcaloides, lo que indica que sustancia lm ente no había m orfina ni codeína en estas muestras.
Tabla 7
Crecim iento y evaluación de la generación M5
Las sem illas de la generación M5 de FN1-1242-3 se sem braron en una prueba de cam po en Gawler, Tasm ania, el 29 de agosto de 2008, junto con sem illas de la línea progenitora W F03-0802. Am bas líneas se sem braron en tres réplicas bloqueadas en parcelas de 5 m de largo por 1,6 m de ancho. Se usaron prácticas com ercia les estándar para hacer crecer la prueba. No se usaron aerosoles reguladores del crecim iento. La prueba se cosechó el 19 de febrero de 2009 mediante recogida manual de todas las cápsulas en un radio de cuadrantes dentro de cada parcela de 2 m2. Las muestras fueron trilladas y la paja de am apola pesada. Después de m oler a <2 mm, la paja de am apola se extrajo y se analizó mediante el uso del m ismo m étodo usado para la generación M3 (descrito anteriorm ente). La Tabla 8 muestra el contenido medio de los a lcalo ides en la paja y los rendim ientos de alcalo ides por hectárea. En este ejemplo, el contenido de tebaína de la paja de FN1-1242-3 es el 96,3%del total, y el contenido de oripavina es el 1,47 % del total, donde el tota l es la sum a del contenido de morfina, codeína, tebaína y oripavina de la paja de amapola.
Tabla 8
Ejemplo 2
Extracción del látex
Reactivo
Tam pón de extracción del látex: Se disolvieron 23 g de dih idrogenofosfato de am onio en aproxim adam ente 750 ml de agua desionizada y se añadieron 200 ml de etanol y se com pletó hasta 1 litro con agua desionizada.
Método
M étodo isocrático:
Una placa de filtro Pall AcroPrep™ de 96 pocillos, GHP de 0,2 pm se colocó sobre una placa de recolección de 96 pocillos y 350 pl. Se etiquetaron tanto el filtro com o la placa de recolección y se pipetearon 280 pl de tam pón en cada pocillo de la placa de filtro mediante el uso de una multipipeta. M ediante el uso de unas pinzas, se tom ó de la planta a analizar una punta de la hoja de aproxim adam ente 5 mmx5 mm y se añadió al extractante. El látex se filtrará en la solución con el tiempo.
La muestra se dejó incubar a tem peratura am biente durante al m enos 30 minutos. La muestra se filtró mediante el uso de un colector de vacío (producto de Pall Corporation núm. 5017). La placa de recolección se cubrió con una lámina de sello adhesivo para PCR Abgene® (# de Cat: AB-0626) para evitar la evaporación. La placa de recolección se puede alm acenar en el refrigerador o en el conge lador hasta que se realice el análisis.
M étodo de análisis
Instrumento:
W aters Acqu ity UPLC®, con organizador de m uestras y sin tonizable Ultra Vio let
Detector (TUV)
Colum nas W aters, partículas híbridas de etilo (BEH) con puente, C18, 1,7 pm, 2 ,1 *50 mm
Detector TUV, longitud de onda 284 nm
Reactivos:
Fase móvil A - 9 % de metanol, 0,1 % de ácido fórm ico, ajustado con am oníaco a pH=9,6
Fase móvil B - 91 % de metanol, 0,1 % de ácido fórm ico, ajustado con am oníaco a pH=9,6
Lavado débil - 10 % metanol
Lavado - 100 % metanol
La opción "C argar adelante" del adm in istrador de m uestras se usó para ahorrar tiem po entre muestras. Con esta opción, cada muestra se aspiraba lista para la inyección m ientras se ejecutaba la anterior.
Tabla 9
Las muestras se inyectaron autom áticam ente (volum en de inyección 2,0 o 3,5 j L) y se les realizó una crom atografía m ediante Acquity UPLC® junto con los a lcalo ides estándar de referencia. Después de que se analizó el conjunto de muestras con Acqu ity UPLc ®, los picos se identificaron en com paración con los estándares que se ejecutaron en el conjunto de muestras. Los tiem pos de retención típ icos fueron los siguientes:
Las separaciones obtenidas mediante el uso de este m étodo se m uestran en la Figura 1. Aunque las form as y separaciones de los picos no son perfectas, son bastante adecuadas para un m étodo de detección m uy rápido. Se usó el software Em power (W aters Corporation, Milford, M assachusetts) para identificar picos y calcular sus áreas. Luego, los datos se exportaron a una hoja de cálculo de Excel donde se usó los datos del área de pico para determ inar cuáles am apolas tenían perfiles de alcalo ides inusuales.
M étodo del gradiente:
Para un análisis repetido más preciso de las muestras, se usó un m étodo de UPLC con gradiente de 2,5 m inutos. Es lo mismo, com o se describ ió anteriorm ente, excepto que se usaron las siguientes condiciones de gradiente. La Figura 2 proporciona un crom atogram a de la paja de am apola de la generación M3 de FN1-1242-3. El volum en de inyección de la muestra en la F igura 2 fue de 2,0 j l . A TA indica tebaína, ori indica pico de oripavina, A M A representa m orfina y A C A representa codeína.
Tabla 10
Ejemplo 3
Determ inación de la genética del rasgo de solo tebaína.
Se realizaron cruces entre líneas FN1 con bajo contenido de oripavina (<2 % de com binación de morfina, codeína, oripavina y tebaína) y líneas norm ales de am apola que contienen morfina. Todas las plantas de la primera generación F1 contenían morfina, lo que indica que los genes responsables de la característica de solo tebaína son recesivos. Las plantas F1 se autopolin izaron. Las sem illas se recolectaron de las plantas F1 y se sem braron en bandejas. Cuando las plantas estaban en la etapa de 6 hojas, se realizaron pruebas de látex para determ inar los quim iotipos de las plantas F2 individuales.
La prueba de látex se realizó de acuerdo con el m étodo del E jem plo 4 al retirar la punta de la hoja com pletam ente expandida más joven y colocarla en tam pón extractante ácido en una placa de filtro Pall. Después de de jar pasar un tiem po para que el látex destilara de la hoja al tam pón, el extractante se filtró al vacío en una placa de 96 pocillos y se selló. Las muestras se analizaron mediante UPLC mediante el uso del m étodo m ostrado en el Ejemplo 4.
Las concentraciones de alcalo ide se calcularon a partir de las áreas de los picos con referencia a soluciones de alcalo ides estándar, y cada alcalo ide se convirtió en un porcentaje del alcalo ide m orfinano tota l (morfina, codeína, tebaína y oripavina) para determ inar el qu im iotipo de la planta. Un conjunto de reglas incorporadas en declaraciones anidadas "IF" se establecieron para determ inar el quim iotipo. Las reglas, aplicadas secuencialm ente, fueron las siguientes:
Si la concentración total de morfina, codeína, tebaína y oripavina es in ferior a 5 jg /m l en la solución inyectada, no hay resultados.
Si el porcentaje de noscapina es >15, quim iotipo = noscapina.
Si el porcentaje de tebaína es >98, quim iotipo = solo tebaína.
Si porcentaje de tebaína oripavina >95, quim iotipo = normanda.
Si porcentaje de tebaína codeína >96, quim iotipo = codeína.
Si el porcentaje de m orfina es >2, quim iotipo = morfina.
De cua lquier otra manera, el quim iotipo se clasificó com o OCT, lo que indica que la planta contenía oripavina, codeína y tebaína.
Cuatro quim iotipos se identificaron en las poblaciones:
Morfina: m orfina presente típ icam ente con tebaína y codeína
Normanda: tebaína y oripavina presentes, sustancia lm ente sin m orfina
Solo tebaína: tebaína presente, sustancia lm ente sin oripavina ni morfina
Codeína: tebaína y codeína presentes, sustancia lm ente sin m orfina
La planta ocasional fue identificada com o OCT. Estas generalm ente, se trataban de plantas muy pequeñas que encajaban en una de las cuatro categorías a m edida que se desarrollaban. En general, el 0,18 % de las plantas se clasificaron com o OCT y el 0,03 % como noscapina y se ignoraron en el cálculo de las relaciones para este análisis. Se realizaron pruebas de Chi cuadrado para determ inar si los patrones de segregación observados diferían significativam ente de una segregación de quim iotipos 9:3:3:1 (m orfina:codeína:norm anda:so lo tebaína, respectivam ente).
La Tabla 11 muestra los resultados de las 9 poblaciones derivadas de progenitores FN1 que tienen un quim iotipo de solo tebaína. Cinco de ellos se ajustan a una relación de 9:3:3:1 (P<0,05). De las que no cum plían con la relación esperada, FN1-1242 es notable porque tenía más plantas con el qu im iotipo de codeína de lo esperado, m ientras que todas las demás líneas que no cum plían con la relación tenían m enos plantas de codeína de lo esperado. Se realizaron trabajos adicionales con la progenie de FN 1-1242 en la que las plantas se cultivaron hasta la etapa de gancho y se recolectó el látex de las hojas y se clasificó en quim iotipos. La distribución fue 96:41:42:11, lo que da una prueba de Chi cuadrado de 3,1 que indica que no hay una diferencia significativa con respecto a la relación esperada.
La segregación en 4 quim iotipos indica que dos genes separados están involucrados en el quim iotipo de solo tebaína. Uno de ellos es el gen asociado con la m utación de la am apola norm anda (descrita en la patente de Estados Unidos núm. 6,067,749). El segundo gen es responsable del nuevo rasgo bajo en oripavina o de solo tebaína, el cual es responsable de bloquear la ruta entre la tebaína y la oripavina. Estos dos cam bios genéticos trabajan jun tos en las líneas descritas en la presente descripción para proporcionar a las plantas de am apola un alto contenido de tebaína y un bajo contenido de oripavina.
Tabla 11
Ejemplo 4
Análisis del látex de las hojas
Reactivo
Extractante ácido: Una probeta m edidora de 1 L se llenó con agua desionizada hasta la mitad. 1 ml de concentración. Se añadieron 50 ml de ácido fosfórico y etanol y el volum en se com pletó hasta 1 litro con agua desionizada.
Método
Una placa de filtro Pall AcroPrep™ de 96 pocillos, GHP de 0,2 pm se colocó sobre una placa de recolección de 96 pocillos y 350 pl. Se etiquetaron tanto el filtro com o la placa de recolección y se pipetearon 280 pl de extractante ácido en cada pocillo de la placa de filtro mediante el uso de una multipipeta. Una punta de la hoja más joven se arrancó com pletam ente expandida de cada planta para ser analizada y se añadió al extractante. El látex se destiló a la solución con el tiempo.
Las m uestras se dejaron incubar a tem peratura am biente durante al menos 30 m inutos. Las muestras se filtraron mediante el uso de un colector de vacío (producto de Pall Corporation núm. 5017). La placa de recolección se cubrió con una lámina de sello adhesivo para PCR ABgene® (# de Cat: AB-0626) para evita r la evaporación. La placa de recolección se puede alm acenar en el refrigerador o en el conge lador hasta que se realice el análisis.
M étodo de análisis
Las m uestras se analizaron mediante el uso de el m ismo instrumento, reactivos y detalles del m étodo del instrum ento (ver Tabla 10) com o se describe para el m étodo de gradiente en el E jem plo 2.
Las muestras se inyectaron y crom atografiaron autom áticam ente por Acqu ity UPLC® jun to con los alcaloides estándar de referencia. Después de que se analizó el conjunto de m uestras con Acqu ity UPLC®, los picos se identificaron en com paración con los estándares que se ejecutaron en el conjunto de muestras. Se usó el software Em power (W aters Corporation, Milford, M assachusetts) para identificar picos y calcular sus áreas. Luego, los datos se exportaron a una hoja de cálculo de Excel donde se usaron datos del área de pico para determ inar los perfiles de alcaloides.
Claims (14)
1. Una planta de am apolaPapaver somniferumque tiene un qu im iotipo establem ente hereditario de solo tebaína, cuya planta al cosechar sus cápsulas de am apola producirá una paja de am apola que tiene tebaína que constituye el 95 % en peso o más que una com binación de alcaloides, y que tiene oripavina que constituye el 5 % en peso o m enos que una com binación de alcaloides, en donde la com binación de alcalo ides com prende morfina, codeína, tebaína y oripavina;
y en donde la tebaína constituye el 3,0 % o más de la paja de am apola en base al peso en seco, en donde el quim iotipo de solo tebaína se proporciona por dos genes independientes, el primero evita que la tebaína se convierta en neopinona y evita que la oripavina se convierta en morfinona,
y el segundo bloquea la ruta entre la tebaína y la oripavina,
en donde dicha planta se puede obtener m ediante
i) polin ización cruzada de una prim era planta deP. somniferumprogenitora con una segunda planta deP. somniferumprogenitora dicha prim era planta deP. somniferumprogenitora es una planta cultivada a partir de la sem illa ATCC PTA-9109, y dicha segunda planta deP. somniferumprogenitora no tiene el quim iotipo de solo tebaína,
ii) reco lectar la sem illa F1 del cruce de la etapa (i),
iii) cultivar una planta F1 y perm itir que dichas plantas F1 se autopolinicen,
iv) reco lectar la sem illa f 2 y cultivar una población de plantas F2 a partir de dicha semilla,
v) seleccionar entre la población F2, las plantas que tras la cosecha de sus cápsulas de am apola producirán una paja de am apola que tiene tebaína que constituye el 95 % en peso o más que una com binación de alcaloides, y que tiene oripavina que constituye el 5 % en peso o m enos que la com binación de alcaloides, en donde la com binación de alcalo ides com prende morfina, codeína, tebaína y oripavina; y en donde la tebaína constituye el 3,0 % o más de la paja de am apola en base al peso en seco.
2. La planta de acuerdo con la reivindicación 1 que, cuando se cruza con una planta de am apola de P.somniferumque contiene morfina, da una generación F1 en la que todas las plantas contienen m orfina y que, después de la autofecundación de la dicha generación F1, da una población F2 que estadísticam ente se ajusta a un patrón de segregación de quim iotipo A: B: C: D de 9:3:3:1 en donde los quim iotipos se definen sobre la base de reglas aplicadas secuencialm ente de m anera que:
D representa las plantas que tienen tebaína >98 %
C representa las plantas que tienen tebaína oripavina >95%
B representa las plantas que tienen tebaína codeína >96 %, y
A representa las plantas que tienen >2 % de morfina,
m edido com o porcentaje del contenido total de los alcalo ides m orfinanos en el látex de la planta.
3. La planta de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la tebaína constituye el 3,5 % o más de la paja de am apola en base al peso en seco.
4. La planta de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la tebaína constituye el 4,0 % o más de la paja de am apola en base al peso en seco.
5. La planta de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la tebaína constituye el 97 % en peso o más que la com binación de alcalo ides y la oripavina constituye el 0,7 % en peso o menos de la com binación de alcaloides.
6. La planta de acuerdo con la reivindicación 1, en donde sustancia lm ente no hay m orfina o codeína en la com binación de alcaloides, o en donde sustancia lm ente no hay oripavina en la com binación de alcaloides.
7. La planta, de cualquiera de las re ivindicaciones 1 a 6, en donde la oripavina constituye el 0,4 % o m enos que la paja de am apola en base al peso en seco.
8. La planta, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la oripavina constituye entre el 0,01 y 1,0 % en peso de la com binación de alcaloides.
9. Progenie dePapaver somniferum,sem illa de dichaPapaver somniferumque se ha depositado en la Colección Am ericana de Cultivos Tipo bajo la designación ATCC PTA-9109,
dicha progenie tiene un quim iotipo de solo tebaína, de m anera que la paja de am apola de dicha progenie tiene tebaína que constituye el 95 % en peso o más que una com binación de alcaloides,
y tiene oripavina que constituye el 5 % en peso o menos que la com binación de alcaloides,
y en donde la tebaína constituye el 3,0 % o más del contenido de alcalo ides de la paja de am apola en base al peso en seco,
en donde el quim iotipo de solo tebaína se proporciona por dos genes independientes, el prim ero evita que la tebaína se convierta en neopinona y evita que la oripavina se convierta en morfinona,
y el segundo bloquea la ruta entre la tebaína y la oripavina.
10. Una paja de am apola de una planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Una sem illa de la planta de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
12. Un concentrado de paja de am apola para la extracción de tebaína que es un concentrado de paja de am apola de la planta de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
13. Un m étodo para la producción de tebaína que com prende las etapas de: a) cosechar cápsulas de am apola de la planta de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para producir una paja de am apola o reco lectar y secar el látex de las cápsulas de am apola inm aduras de la planta para producir opio; y b) extraer quím icam ente la tebaína de la paja de am apola o del opio.
14. Una población vegetal de plantas dePapaver somniferumde reproducción estable de cualquiera de las re ivindicaciones 1 a 9.
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