ES2963914T3

ES2963914T3 - Péptidos de WNT5A en la reducción de células madre cancerosas

Info

Publication number: ES2963914T3
Application number: ES18789182T
Authority: ES
Inventors: Anita Sjölander
Original assignee: Wntresearch AB
Current assignee: Wntresearch AB
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2024-04-03
Anticipated expiration: 2038-10-25
Also published as: CN111417403A; EP3700546B1; EP3700546C0; KR20200076713A; WO2019081657A1; SG11202003613YA; PL3700546T3; US20210008149A1; EP3700546A1; JP2023156343A; EP4154902A1; JP2021500415A; CN111417403B; CA3080256A1

Abstract

Un péptido derivado de la proteína WNT5A, siendo dicho péptido para uso en la prevención de la recurrencia o recaída de un cáncer en un paciente o para uso en la reducción o eliminación de células madre cancerosas en un paciente diagnosticado con un cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos de WNT5A en la reducción de células madre cancerosas

La presente invención se refiere a péptidos derivados de WNT5A para usar en la reducción o la eliminación de células madre cancerosas en un paciente con diagnóstico de cáncer.

Antecedentes

Un tumor primario rara vez es la causa de la muerte de los pacientes con cáncer. En la mayoría de los casos, la mortalidad es el resultado de la recaída del cáncer tras diferentes periodos de supervivencia sin recidiva después de la extirpación quirúrgica del tumor primario. El tratamiento actual de los pacientes con cáncer de mama, cáncer de colon o cáncer de próstata incluye cirugía, antineoplásicos, tratamiento endocrino y algunos tratamientos biológicos novedosos. Estas últimas modalidades de tratamiento se dirigen principalmente contra las células cancerosas proliferativas y, por tanto, contra el crecimiento del cáncer. Aunque estos tratamientos pueden tener un buen efecto sobre el propio tumor primario y sobre la mayoría de las células tumorales que quedan tras la cirugía, una gran proporción de los pacientes desarrollan posteriormente una enfermedad recidivante.

Una razón esencial de dicha recaída del cáncer es la existencia de un subconjunto de células tumorales con características 'similares a las de las células madre'. Estas células iniciadoras de tumores, que son distintas de las células madre no malignas, muestran índices proliferativos bajos, alta capacidad de autorrenovación, multi- o pluripotencialidad, capacidad de diferenciarse en células tumorales en proliferación activa, y se caracterizan además por su resistencia a la quimioterapia o a la radiación. Estas células similares a las células madre también se denominan células madre cancerosas (CMC). Se cree que la eliminación de las CMC podría erradicar posiblemente la enfermedad del cáncer y, por tanto, la recaída de esta enfermedad. Por lo tanto, un problema fundamental en la investigación del cáncer es la identificación y, en particular, el direccionamiento a las<c>M<c>responsables de la enfermedad recidivante. Un marcador tumoral es un biomarcador que se encuentra en la sangre, la orina o los tejidos corporales que puede estar elevado por la presencia de uno o más tipos de cáncer. Existen muchos marcadores tumorales diferentes, cada uno indicativo de un cáncer particular, y se utilizan para diagnosticar la presencia de cáncer y para especificar el tipo específico de cáncer. Por tanto, un nivel elevado de un marcador tumoral puede indicar un cáncer.

Se han realizado muchos intentos diferentes para superar el problema de la eliminación de las CMC, tales como el suministro de agentes terapéuticos, es decir, pequeñas moléculas, ARNip o anticuerpos que afectan a las vías de señalización embrionarias implicadas en la autorrenovación y la diferenciación en CMC. Hay, sin embargo, muchos inconvenientes con los intentos actuales de eliminar las CMC. En primer lugar, los marcadores difieren de un tipo de cáncer a otro y no existe un marcador universal que pueda utilizarse para todos los cánceres. En segundo lugar, pueden existir CMC biológicamente distintas dentro de ciertos tumores, como se sabe tanto en el caso de la leucemia mieloide aguda, como en algunos tumores sólidos. Finalmente, existe el riesgo de afectar a las células madre normales al dirigir los fármacos a las CMC, ya que las CMC tienen los mismos perfiles de expresión que los de las células madre normales. El documento WO 2016/092378 divulga una composición farmacéutica para tratar un tumor sólido, que comprende una población de células propagadoras de tumores (TPC,tumor-propagating cells)con características similares a las de las células madre en un sujeto, que comprende una cantidad terapéutica de un agente terapéutico y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el cáncer es un tumor de mama, en donde el agente terapéutico es un péptido derivado de Wnt5a tal como MDGCEL, y en donde el agente terapéutico puede combinarse con un antineoplásico.

En este contexto, es por tanto un objeto de la presente invención proporcionar un agente terapéutico no tóxico y seguro para prevenir o retrasar significativamente la recaída de la enfermedad cancerosa debido a la supervivencia de CMC.

Sumario

Un primer aspecto de la invención es un péptido derivado de la proteína WNT5A de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 para usar en la reducción o la eliminación de las células madre cancerosas en un paciente con diagnóstico de cáncer de colon, péptido que tiene una longitud de 20 aminoácidos o menos y comprende la secuencia de aminoácidos XDGXEL (SEQ ID NO: 2), o un derivado formilado de la misma, en donde X es cualquier aminoácido. En el contexto de la presente invención, recidiva o recaída tienen el mismo significado. Se cree que la eliminación de las CMC podría erradicar posiblemente la enfermedad del cáncer y, por tanto, la recaída de esta enfermedad, véase anteriormente, actualmente se cree que la enfermedad recidivante está causada por las CMC y, por tanto, se contempla que la reducción o la erradicación de las CMC retrasará o evitará la recidiva del cáncer.

En una realización adicional, la expresión de la proteína WNT5A en las células cancerosas del paciente es igual o inferior al 35 % de la expresión en las células no cancerosas circundantes. La expresión del nivel de WNT5 tanto en células cancerosas como no cancerosas se mide mediante inmunohistoquímica (IHC) utilizando anticuerpos primarios específicos dirigidos contra WNT5 combinados con un anticuerpo secundario para su detección y cuantificación.

Se ha correlacionado una baja expresión de WNT5A en los tumores de cáncer de mama, de colon y de próstata con un mayor número de recidivas de la enfermedad y un acortamiento en la supervivencia del paciente. Sin embargo, este efecto de la señalización de WNT5A no puede atribuirse a su efecto sobre la proliferación de las células cancerosas, que suelen estar ausentes o limitadas a los tumores con una señalización elevada de p-catenina (Dejmeket al.,The Expression and Signaling Activity of Wnt-5a/DDR1 and Syk Play Distinct but Decisive Roles in Breast Cancer Patient Survival. Clinical Cancer Research. 11: 520-528, 2005, Safholmet al.,El hexapéptido Foxy-5 derivado de Wnt-5a inhibe la metástasis del cáncer de mamain vivoal dirigirse a la motilidad celular. Clinical Cancer Research 14 (20): 6556-6563, 2008, Mehdawiet al.,Non-canonical WNT5A signaling up-regulates the expression of the tumour suppressor 15-PGDH and induces differentiation of colon cancer cells, Molecular Oncology 10: 1415-1429, 2016, Canesiet al.,El tratamiento con el péptido Foxy5, mimético de Wnt5a, reduce eficazmente la propagación metastásica de las células de cáncer de próstata con bajo nivel de Wnt5a en un modelo ortotópico de ratón. pLoS ONE doi.org/10.1371/journal.pone.084418, 2017)

La proteína WNT5A y un hexapéptido de WNT5A conocido denominado Foxy-5, ha demostrado en experimentosin vitroque disminuye la expresión de la enzima productora de PGE2, COX-2, y regula por incremento la enzima degradadora de PGE2 y lipoxina, 15-PGDH, en células de cáncer de colon (Mehdawiet al.,2016). En este estudio experimentalin vitro,los autores también demostraron que tanto el WNT5A recombinante como el péptido Foxy-5, inducían una reducción en la señalización de la p-catenina. Sorprendentemente, los inventores de la presente invención no han podido detectar ninguna reducción en el número de CMC durante dichas condicionesin vitro.

El experto sabe cómo diagnosticar un cáncer o un tumor, medir el crecimiento tumoral, diferenciar o distinguir el tejido tumoral del tejido normal y cómo medir la cantidad de WNT5A. El cáncer puede diagnosticarse mediante una TAC. Una baja expresión de la proteína WNT5A puede ser del 35 %, 30 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 2 % o 1 % de la expresión de WNT5A en las células circundantes no cancerosas, o ninguna expresión de WNT5A.

Dado que un medicamento debe ser producido a gran escala, la proteína WNT5A completa presenta varios inconvenientes como candidato a fármaco. Al ser una proteína de gran tamaño, la proteína WNT5A requiere una síntesis compleja y prolongada para producir únicamente la secuencia de aminoácidos primaria correcta y las modificaciones postraduccionales, y además la WNT5A tiene un dominio de unión al sulfato de heparano que puede limitar su distribución en el organismo. Por lo tanto, es preferible un péptido más pequeño que mimetice el efecto de WNT5A. Los péptidos de WNT5A que comprenden la secuencia de aminoácidos XDGXEL también comprenden efectos miméticos de WNT5A. Los péptidos de longitudes variables y que comprenden la secuencia XDGXEL (SEQ ID NO: 2) pueden producirse sintéticamente, por ejemplo, mediante síntesis peptídica en fase líquida o en fase sólida. El péptido de longitud variable tiene 20 aminoácidos o menos, y más preferentemente 10 aminoácidos o menos. Lo más preferentemente, el péptido es un hexapéptido que consiste en 6 aminoácidos. En una realización, la secuencia de aminoácidos es XDGXEL, en donde la X en posición 1 es M o norleucina, y la X en posición 4 es C o A. Ventajosamente, el péptido WNT5A de acuerdo con la invención es un péptido seleccionado del grupo que consiste en:

MDGCEL (SEQ. ID. NO. 3),

GMDGCEL (SEQ. ID. NO. 4),

EGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 5),

SEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 6),

TSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 7),

KTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 8),

NKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 9),

CNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 10),

LCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 11),

RLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 12),

GRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 13),

QGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 14),

TQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 15),

GTQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 16) y

LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 17),

o un derivado formilado de los mismos.

En una realización preferida, el péptido WNT5A es MDGCEL (SEQ. ID. NO. 3). En una realización más preferida, la metionina de la posición 1 se derivatiza como una metionina formilada (N-formilmetionina). Este hexapéptido formilado se denomina Foxy-5. La modificación/derivatización (formilación) de un aminoácido mejora el efecto del péptido y lo hace más eficaz y resistente a la degradaciónin vivo.

En otra realización se contempla que el crecimiento o nicho de las CMC se vea favorecido por la p-catenina activa, el aumento de la expresión de la COX-2 y la reducción de la de la 15-PGDH. La señalización de la p-catenina activa, así como el aumento de la expresión de la COX-2 y la reducción de la de la 15-PGDH se miden más fácilmente mediante IHC utilizando anticuerpos primarios y específicos dirigidos contra la p-catenina activa, la COX-2 o la 15-PGDH combinados con un anticuerpo secundario complementario para su detección y cuantificación.

En realizaciones adicionales, las células cancerosas objetivo tienen unos niveles de señalización de p-catenina o una expresión de la COX-2 aumentados en más de un 35 %, 40 %, 50 %, 65 %, 70 %, 90 % o más del 100 % en comparación con el tejido circundante normal y/o una expresión de la 15-PGDH reducida en más del 35 %, 40 %, 50 %, 65 %, 70 %, 90%o hasta el 100%en comparación con el tejido circundante normal. Por tejido circundante normal debe entenderse el tejido inmediatamente circundante que consiste en células normales del mismo tipo que las células cancerosas.

En otra realización más, se contempla que el péptido de acuerdo con la invención se utilice en la reducción o la eliminación de las CMC en un paciente con diagnóstico de cáncer de colon, cuya prevención, reducción o eliminación comprende la siguiente etapa: inmediatamente después del diagnóstico del cáncer y/o durante la intervención quirúrgica y/o después de extirpar el tumor mediante cirugía, administrar una cantidad eficaz del péptido, opcionalmente, en donde dicha etapa se repite al menos 3 veces por semana durante 2 semanas o más. El periodo de tratamiento de las células madre cancerosas con dicho péptido puede ser durante 4, 6, 8, 12 semanas o hasta 1,2 o 3 meses o más. Dicho péptido también puede administrarse durante el periodo de tratamiento con el antineoplásico supresor tumoral, ya que el Foxy-5 no afecta al efecto citotóxico de la quimioterapia. Los antineoplásicos supresores tumorales suelen son generalmente muy tóxicos, y además de las células tumorales también destruyen las células sanas. Debido a la toxicidad del antineoplásico supresor tumoral, puede que no se administre durante el tiempo suficiente o en una dosis lo suficientemente alta como para destruir o eliminar todas las células cancerosas o las CMC, ya que el efecto adverso superaría cualquier efecto positivo.

La ventaja de administrar dicho péptido tras el tratamiento con un fármaco supresor tumoral es que el péptido no es tóxico para las células sanas, pero elimina o reduce el número de CMC que permanecen tras el tratamiento con la quimioterapia supresora tumoral, a la que las CMC son resistentes.

También se contempla que la administración de un antineoplásico supresor tumoral y del péptido de acuerdo con la invención pueda ser simultánea, o que el péptido se administre antes, durante y después de la extirpación quirúrgica del tumor primario hasta el inicio de la quimioterapia o tras la conclusión del tratamiento quimioterapéutico supresor tumoral.

Por tanto, dicho tratamiento combinatorio puede dar como resultado una mejora del tratamiento del cáncer sin aumentar los efectos secundarios.

La administración combinada puede ser beneficiosa para el cumplimiento terapéutico del paciente, ya que puede acortarse el periodo de tiempo en el que el tratamiento está en curso.

Si se administra secuencialmente, es decir, el péptido antes o después del antineoplásico supresor tumoral, puede ser más eficaz desde una perspectiva monetaria, ya que el péptido es costoso.

En una realización, la invención proporciona un péptido derivado de la proteína WNT5A de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, péptido que tiene una longitud de 20 aminoácidos o menos y comprende la secuencia de aminoácidos XDGXEL (SEQ ID NO: 2), o un derivado formilado de la misma, en donde X es cualquier aminoácido, para usar en la reducción o la eliminación de las CMC en un paciente con diagnóstico de cáncer de colon.

En realizaciones adicionales, la invención proporciona los siguientes objetos numerados:

1. Un péptido derivado de la proteína WNT5A de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 para usar en la reducción o la eliminación de las células madre cancerosas en un paciente con diagnóstico de cáncer de colon, péptido que tiene una longitud de 20 aminoácidos o menos y comprende la secuencia de aminoácidos XDGXEL (SEQ ID NO: 2), o un derivado formilado de la misma, en donde X es cualquier aminoácido.

2. Un agonista peptídico derivado de la proteína WNT5A de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 para usar en la reducción o la eliminación de las células madre cancerosas en un paciente con diagnóstico de cáncer de colon, péptido agonista que tiene una longitud de 20 aminoácidos o menos y comprende la secuencia de aminoácidos XDGXEL (SEQ ID NO: 2), o un derivado formilado de la misma, en donde X es cualquier aminoácido.

3. El péptido para usar de acuerdo con uno cualquiera de los objetos 1 o en donde la expresión de WNT5A en las células cancerosas sea igual o inferior al 35 % de la expresión en las células no cancerosas circundantes.

4. El péptido para usar de acuerdo con uno cualquiera de los objetos 1 a 3 en donde X en la posición 1 es M o norleucina, y X en la posición 4 es C o A.

5. El péptido para usar de acuerdo con uno cualquiera de los objetos 1 a en donde dicho péptido se selecciona del grupo que consiste en:

MDGCEL (SEQ. ID. NO. 3),

GMDGCEL (SEQ. ID. NO. 4),

EGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 5),

SEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 6),

TSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 7),

KTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 8),

NKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 9),

CNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 10),

LCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 11),

RLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 12),

GRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 13),

QGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 14),

TQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 15),

GTQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 16) y

LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 17),

o un derivado formilado de los mismos.

6. El péptido para usar de acuerdo con uno cualquiera de los objetos 1 a en donde dicho péptido es MDGCEL (SEQ.ID.NO.3), o un derivado formilado del mismo.

9. El péptido para usar de acuerdo con uno cualquiera de los objetos 1 a 8, en donde las células cancerosas presentan una p-catenina elevada.

10. El péptido para usar de acuerdo con uno cualquiera de los objetos 1 a 9 en donde la señalización de p-catenina está elevada en un 35 % o más de la señalización de p-catenina en las células circundantes no cancerosas.

11. El péptido para usar de acuerdo con uno cualquiera de los objetos anteriores combinado con al menos un antineoplásico supresor tumoral, en donde la prevención, la reducción o la eliminación comprende las siguientes etapas: a) administrar una cantidad eficaz de un antineoplásico supresor tumoral; b) antes, simultáneamente y/o posteriormente tras el tratamiento con dicho al menos un antineoplásico supresor tumoral, administrar una cantidad eficaz del péptido, opcionalmente, en donde el etapa b) se repite al menos 3 veces por semana durante 2 semanas o más.

12. El péptido para usar de acuerdo con el objeto 11 en donde dicho fármaco supresor tumoral es una combinación de 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorina y oxaliplatino (FOLFOX), antraciclina tal como epirubicina o doxorubicina, o taxano tal como docetaxel o paclitaxel.

13. El péptido para usar de acuerdo con el objeto 11 en donde dicho fármaco supresor tumoral es una combinación de 5-FU, leucovorina y oxaliplatino (FOLFOX)

14. El péptido para usar de acuerdo con el objeto 11 en donde dicho tratamiento farmacológico supresor tumoral es una combinación de antraciclinas tales como epirubicina o doxorubicina, o taxanos tales como docetaxel o paclitaxel

Breve descripción de las figuras

Las figuras que se describen a continuación sirven de apoyo a la descripción detallada. La invención se describirá ahora con referencia a las figuras, en las que:

La Figura 1 es una visión general esquemática de los experimentos con animales descritos en los ejemplos 1 a 3. La Figura 2 muestra el efectoin vivodel tratamiento con Foxy-5 sobre la expresión de la proteína a Ld H en tejido del cáncer de colon, visualizado mediante inmunohistoquímica (IHC). Se presentan fotos representativas de animales tratados con solución salina y con Foxy-5. De cada uno de esos portaobjetos, se colocaron 4 recuadros sobre el tejido teñido, y para cada una de ellos se puntuó la tinción de ALDH como un porcentaje de las células teñidas multiplicado por la intensidad de la tinción. Se utilizó la siguiente puntuación para el porcentaje de células teñidas; 0 para las células teñidas positivas <5 %, 1 para las células positivas 5-25 %, 2 para las células positivas 26-50 %, 3 para las células positivas 51 75 %, 4 para las células positivas >75 %. Para las intensidades de tinción, las zonas teñidas se puntuaron como; 1 para tinción débil, 2 para tinción intermedia y 3 para tinción fuerte. Para cada casilla se obtuvo una puntuación final multiplicando la puntuación del porcentaje de células teñidas positivamente por la puntuación de la intensidad de la tinción. Finalmente, se obtuvo un valor medio de los 4 recuadros para cada tumor. A continuación, se utilizó el mismo protocolo de puntuación para todos los análisis de IHC presentados en el presente estudio.

La Figura 3 muestra el efectoin vivodel tratamiento con Foxy-5 sobre la expresión de la proteína Dck1 (denominada también DCAMKL1) en tejido de cáncer de colon visualizada mediante IHC. Se presentan fotos representativas de animales tratados con solución salina y con Foxy-5. De cada uno de dichos portaobjetos se colocaron 4 recuadros sobre el tejido teñido, y para cada uno de ellos se puntuó la tinción de Dck1 (DCAMKL1) como un porcentaje de las células teñidas multiplicado por la intensidad de la tinción, como se describe detalladamente para la Figura 2.

La Figura 4 muestra el efectoin vivodel tratamiento con Foxy-5 sobre la expresión del ARNm de ALDH y Dck1 (DCAMKL1) en tejido xenográfico de cáncer de colon en comparación con la de los tumores de ratones de control tratados con vehículo. La Figura 5 muestra el efectoin vivodel tratamiento con Foxy-5 sobre la expresión de las proteínas Cox-2 y 15-PGDH en tejido de cáncer de colon visualizado mediante IHC. Las tinciones de IHC se puntuaron exactamente como se describe en detalle para la tinción de IHC en la Figura 1.

La Figura 6 muestra el efectoin vivodel tratamiento con Foxy-5 sobre la expresión de la p-catenina nuclear activa en tejido de cáncer de colon HT-29 visualizado mediante IHC. Las tinciones de IHC se puntuaron exactamente como se describe en detalle para la tinción de IHC en la Figura 1. En el panel inferior derecho, se presenta el tamaño de los tumores de los animales tratados con solución salina y con Foxy-5.

La Figura 7 muestra el efectoin vivodel tratamiento con Foxy-5 sobre la expresión de la p-catenina nuclear activa en tejido de cáncer de colon Caco-2 visualizado mediante IHC. La tinción de IHC se puntuó exactamente como se describe en detalle para la tinción de IHC en la Figura 2. En el panel inferior derecho, se presenta el tamaño de los tumores de los animales tratados con solución salina y con Foxy-5.

Las Figuras 6 y 7 muestran además el efectoin vivodel tratamiento con Foxy-5 sobre el volumen tumoral en tejido xenográfico de cáncer de colon HT-29 y Caco-2, respectivamente. El conocimiento de que los cánceres de colon presentan una señalización elevada de p-catenina hace posible validar los efectos resumidos en las Figuras 6 y 7, respectivamente, determinando su relación con los cambios en el volumen tumoral. Las Figuras resumen los efectos del tratamiento con Foxy-5 sobre el volumen tumoral de los tumores derivados de HT29 y Caco-2 en comparación con el de los ratones de control (tratados con vehículo).

La Figura 2B se basa en un análisis repetido y ampliado como en la figura 2, y muestra el efectoin vivodel tratamiento con Foxy-5 sobre la expresión de la proteína ALDH en tejido xenográfico de cáncer de colon visualizado mediante inmunohistoquímica (IHC). Se presentan imágenes representativas de animales tratados con vehículo (solución salina) y con Foxy-5. De cada uno de esos portaobjetos, se colocaron aleatoriamente 6 recuadros sobre el tejido teñido, y para cada uno de ellos se puntuó la tinción de ALDH como un porcentaje de las células teñidas multiplicado por la intensidad de la tinción. Se utilizó la siguiente puntuación para el porcentaje de células teñidas; 0 para las células teñidas positivas <5 %, 1 para las células positivas 5-25 %, 2 para las células positivas 26-50 %, 3 para las células positivas 51-75 %, 4 para las células positivas >75 %.

Para las intensidades de tinción, las zonas teñidas se puntuaron como; 1 para tinción débil, 2 para tinción intermedia y 3 para tinción fuerte. Para cada casilla se obtuvo una puntuación final multiplicando la puntuación del porcentaje de células teñidas positivamente por la puntuación de la intensidad de la tinción. Finalmente, se obtuvo un valor medio de los 6 recuadros para cada muestra tumoral. A continuación, se utilizó el mismo protocolo de puntuación para todos los análisis de IHC presentados en el presente estudio.

La Figura 3B se basa en un análisis repetido y ampliado como en la figura 3, y muestra el efectoin vivodel tratamiento con Foxy-5 sobre la expresión de la proteína Dck1 (denominada también DCAMKL1) en tejido xenográfico de cáncer de colon visualizado mediante IHC. Se presentan imágenes representativas de animales tratados con vehículo y con Foxy-5. De cada uno de dichos portaobjetos se colocaron 6 recuadros sobre el tejido teñido, y para cada uno de ellos se puntuó la tinción de Dck1 según la intensidad de la tinción, como se describe detalladamente para la Figura 2.

La Figura 5B se basa en un análisis repetido y ampliado como en la figura 5, y muestra el efectoin vivodel tratamiento con Foxy-5 sobre la expresión de la proteína Cox-2 en tejido xenográfico de cáncer de colon visualizado mediante IHC. Se presentan imágenes representativas de animales tratados con vehículo y con Foxy-5. De cada uno de dichos portaobjetos se colocaron 6 recuadros sobre el tejido teñido, y para cada uno de ellos se puntuó la tinción de Cox-2 como un porcentaje de las células teñidas multiplicado por la intensidad de la tinción, como se describe detalladamente para la Figura 2.

La Figura 5C se basa en un análisis repetido y ampliado como en la figura 5, y muestra el efectoin vivodel tratamiento con Foxy-5 sobre la expresión de la proteína 15-PGDH en tejido xenográfico de cáncer de colon visualizado mediante IHC. Se presentan imágenes representativas de animales tratados con vehículo y con Foxy-5. De cada uno de dichos portaobjetos se colocaron 6 recuadros sobre el tejido teñido, y para cada uno de ellos se puntuó la tinción de 15-PGDH como un porcentaje de las células teñidas multiplicado por la intensidad de la tinción, como se describe detalladamente para la Figura 2.

La Figura 8 se basa en un análisis repetido y ampliado como la figura 6 y 7, respectivamente, y muestra el efectoin vivodel tratamiento con Foxy-5 sobre la expresión de la p-catenina nuclear activa en tejido xenográfico de cáncer de colon HT-29 y Caco-2 visualizado mediante IHC. Se presentan imágenes representativas de animales tratados con vehículo y con Foxy-5. De cada uno de dichos portaobjetos se colocaron 6 recuadros sobre el tejido teñido, y para cada uno de ellos se puntuó la tinción de la p-catenina nuclear activa como un porcentaje de las células teñidas multiplicado por la intensidad de la tinción, como se describe detalladamente para la Figura 2.

La Figura 9 muestra el efectoin vivodel tratamiento con Foxy-5 sobre la expresión de la proteína Ascl2 en tejido xenográfico de cáncer de colon HT-29 y Caco-2 visualizado mediante IHC. La proteína Ascl2 es un factor de transcripción activado por la señalización de la p-catenina que se ha demostrado que promueve el nicho de las CMC. Se presentan imágenes representativas de animales tratados con vehículo y con Foxy-5. De cada uno de dichos portaobjetos se colocaron 6 recuadros sobre el tejido teñido, y para cada uno de ellos se puntuó la tinción de Ascl2 como un porcentaje de las células teñidas multiplicado por la intensidad de la tinción, como se describe detalladamente para la Figura 2. La Figura 10 muestra la ausencia de efecto de Foxy-5 sobre la citotoxicidad inducida por FOLFOX. Las células HT29 de cáncer de colon se trataron con FOLFOX solo (triángulos verdes), 5-FU solo (triángulos naranjas), oxaliplatino solo (cuadrados negros), Foxy-5 solo (cuadrados rojos) o FOLFOX Foxy-5 (círculos azules). Los efectos citotóxicos de estos diferentes tratamientos se evaluaron mediante el ensayo de viabilidad celular por fluorescencia CellTiter-Blue™. Las curvas de respuesta a la dosis de todos estos tratamientos diferentes en HT29 se resumen en la figura. Los datos están normalizados y se muestran como la media ± EEM.

Descripción detallada

La familia de proteínas Wnt (sitio de integración relacionado con Wingless) contiene proteínas muy conservadas que desempeñan un papel en el desarrollo embrionario, tales como la polarización del eje corporal, la proliferación y la migración celulares. Las vías de señalización de las Wnt son canónicas o no canónicas, y desencadenan principalmente la regulación de la transcripción génica y el aumento de la proliferación a través de la señalización canónica o la regulación de varias funciones no proliferativas a través de la activación de diferentes vías de señalización no canónicas en las células. Las proteínas Wnt intervienen además en la regeneración tisular en la médula ósea, la piel y el intestino de los adultos. Una mutación genética en la vía de señalización de las Wnt puede causar cáncer de mama, cáncer de próstata, glioblastoma, diabetes de tipo II y otras enfermedades.

La vía canónica de las Wnt activa la p-catenina y es integral en la regulación de la autorrenovación de las células madre normales, y la subversión de la señalización canónica de las Wnt se ha implicado en la carcinogénesis. Por el contrario, la señalización no canónica de las Wnt se caracteriza por la ausencia de un aumento de la señalización de la p-catenina, y se ha estudiado por su papel en la polarización, la gastrulación y la organogénesis embrionarias. Además, se propone que la Wnt no canónica antagoniza la señalización canónica. La WNT5A es un ejemplo de ligando de Wnt no canónico. La WNT5A es supresora tumoral en la leucemia mielógena aguda (LMA), el cáncer de colon, el cáncer de mama y de próstata, y el carcinoma ovárico. En un estudio de Borcherdinget al. sedemostró que la sobreexpresión de WNT5A en un modelo de ratón homocigótico paraWNT5Ase correlaciona con un número reducido de CMC mamarias, Paracrine WNT5A signalling inhibits expansion of tumour-initiating cells, Cancer Research 75: 1972-1982, 2015, lo que sugiere que la pérdida heterocigótica de WNT5A se correlaciona con una menor supervivencia de los pacientes con cáncer de mama. De manera interesante, la WNT5A tiene el efecto contrario en el melanoma maligno, el cáncer gástrico, así como algunos otros tipos de cáncer, como ejemplifica el hecho de que una expresión elevada de WNT5A en el melanoma maligno primario se correlaciona con un menor tiempo de supervivencia.

La WNT5A es una proteína expresada por muchas células normales del organismo. La WNT5A es secretada por las células y ejerce su acción en las mismas células o en las vecinas uniéndose a un complejo receptor en el que participa principalmente un receptor Frizzled y activándolo. Se sabe que la proteína WNT5A activa un receptor denominado Frizzled 5. Tras la activación del receptor Frizzled 5 se activan una serie de acontecimientos de señalización en el interior de las células, donde uno de los primeros acontecimientos, es la generación de un aumento efímero del calcio en el interior de la célula, una denominada señal de calcio. A su vez, la señal de calcio desencadena una serie de acontecimientos de señalización venideros que dan lugar a un cambio en las funciones de las células, tales como la adhesión y la migración. Por tanto, la activación de dicho receptor Frizzled da lugar a acontecimientos de señalización en el interior de la célula, lo que provoca un aumento en la adherencia de la célula a sus células vecinas y de su adhesión al tejido conjuntivo circundante, lo que da como resultado una disminución de la capacidad de la célula tumoral para migrar a las estructuras próximas, tales como los ganglios linfáticos y los vasos sanguíneos. En las células epiteliales mamarias sanas, por ejemplo, la WNT5A está muy expresada y asegura una firme adherencia entre las células y a la membrana basal circundante, restringiendo así la migración de las células.

Con el fin de reconstituir la señalización de WNT5A en tejido canceroso que carecen de una expresión endógena de WNT5A, se ha desarrollado un péptido pequeño, es decir, igual o inferior a 20 aminoácidos, derivado de la secuencia de aminoácidos de la molécula<w>N<t>5<a>, y a continuación se ha modificado adicionalmente. Un ejemplo de dicho péptido es Foxy-5, que es un agonista verdadero de WNT5A en el sentido de que desencadena los mismos acontecimientos de señalización y respuestas funcionales que WNT5A y, en comparación con WNT5A, es una molécula mucho más simple y puede administrarse sistémicamente y aún así, llegar al tejido tumoral. Por tanto, la expresión propiedades de señalización, como se utiliza en el presente documento, significa la unión de la WNT5A o del péptido Foxy-5 principalmente a una proteína receptora Frizzled (Fz), seguida de una cascada de señalización intracelular en la célula que da lugar finalmente a la reducción o eliminación de las CMC.

La expresión que rodea a las células no cancerosas, como se utiliza en el presente documento, significa células morfológicamente normales, del mismo tipo a partir del cual se ha originado el tumor, encerrando o rodeando el tejido tumoral.

Ejemplos

Ejemplo 1

Se analizaron los tumores de dos tipos diferentes de células de cáncer de colon humano HT29 y Caco-2 mediante inmunohistoquímica (IHC) y ARNm (véase la figura 1).

El día 0: se realizaron inyecciones subcutáneas de células de cáncer de colon HT29 o Caco-2 en ratones atímicos.

El día 7 después del establecimiento de los tumores en los ratones, se realizaron inyecciones intraperitoneales (IP) de vehículo solo (solución salina) (gr 1) o de Foxy-5 (2 |jg/g; gr 2).

Durante los días 9-23 se controló el crecimiento tumoral y el peso de los animales; a continuación, 8 inyecciones IP cada 2 días de vehículo solo (gr 1) o de Foxy-5 (2 jg/g; gr 2).

El día 24, los dos tipos de tumores (derivados de Caco-2 y de HT29) (divididos en dos partes de las cuales una se fijó y la otra se congeló a -80 °C) se analizaron mediante IHC para determinar su expresión proteica de COX-2, 15PGDH, pcatenina, Ascl2, ALDH y Dckl1 y por su contenido en ARNm de ALDH y de Dckl1 (ALDH es un marcador general de células madre y Dck1 es un marcador específico de las CMC de colon).

Se demostró que Foxy-5 reducía significativamente la expresión de los dos biomarcadores de células madre en los cánceres de colon derivados tanto de Caco-2 como de HT29 (véanse las figuras 2 a 4).

Ejemplo 2

Para validar adicionalmente los hallazgos resumidos en las figuras 2-4, analizamos los posibles mecanismos responsables de la disminución del número de CMC en los presentes experimentos. La enzima ciclooxigenasa-2 (COX-2) suele estar regulada por incremento en el cáncer de colon. La actividad de la COX-2 da lugar a la generación y liberación de la prostaglandina E2 (PGE2). La PGE2 promueve la progresión del cáncer y se ha demostrado que favorece la expansión de las CMC de colon. (Wanget al.,Prostaglandin E2 promotes colorectal cancer stem cell expansion and metastasis in mice. Gastroenterology 149: 1884-1895, 2015). Aunque se cree que la perturbación de la vía de señalización canónica de las WNT explica el inicio de los tumores colorrectales, se cree que el aumento de la expresión de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) que se produce en la mayoría de los tumores colorrectales desempeña un papel crucial durante el desarrollo del cáncer colorrectal. El aumento de la expresión de la COX-2 da lugar a una mayor abundancia de su principal producto metabólico, la prostaglandina E2 (PGE2). El tratamiento de los animales del presente estudio con Foxy-5 dio como resultado una disminución no sólo de la expresión de la enzima generadora de PGE2, la COX-2, (véase la figura 5 y 5B sino también un aumento de la enzima degradadora de PGE2, la 15-PGDH, (véase la figura 5 y 5C). Estos datos demuestran que el tratamiento con el péptido Foxy-5 puede, mediante una acción doble única, provocar una reducción en el nivel intratumoral de PGE2 y explicar por tanto la reducción observada de las CMC (figuras 2-4 y 2B-3B).

Ejemplo 3

El efectoin vivodel tratamiento con Foxy-5 sobre la señalización de la p-catenina en tejido de cáncer de colon HT-29 o Caco-2 podría ser otra posible explicación del número reducido de CMC observado. Se observó una disminución de la cantidad de expresión de la p-catenina nuclear activa en los tumores de cáncer de colon derivados tanto de Caco-2 como de HT29 (véase la figura 7 y 8) como resultado del tratamiento con Foxy-5. Las observaciones de la reducción de la señalización de p-catenina por parte de Foxy-5 fueron validadas por las reducciones de los volúmenes tumorales (figura 6 y 7). Esencial para el presente estudio es el hecho de que también se observó que las reducciones inducidas por Foxy-5 del objetivo anterógrado de la p-catenina, Ascl2, un factor de transcripción que promueve el nicho de las células madre cancerosas, indica que la capacidad del tratamiento con Foxy-5 para reducir el número de CMC depende también de la reducción de la señalización de p-catenina/Ascl2 (véase la figura 6-9). Por consiguiente, el péptido Foxy-5 presenta una propiedad única para reducir el número de CMC por su capacidad para dirigirse a tres elementos diferentes (COX-2, 15-PGDH y p-catenina) que da lugar a la reducción en dos vías de señalización independientes que promueven las CMC.

Ejemplo 4

El objetivo de este estudio era ensayar la posibilidad de un tratamiento simultáneo de Foxy-5 y FOLFOX, evaluando el efectoin vitrodel péptido Foxy-5 sobre el efecto citotóxico del FOLFOX. FOLFOX está formado por una combinación de los dos antineoplásicos 5-FU y oxaliplatino, y ácido folínico, este último, denominado también leucovorina, no es un antineoplásico pero se utiliza para potenciar el efecto del 5-FU en las células humanas de cáncer de colon HT29. FOLFOX es la quimioterapia utilizada más habitualmente en el tratamiento de pacientes con cáncer de colon.

El experimento inicial consistió en evaluar el efecto citotóxico del péptido Foxy-5, oxaliplatino y 5-FU como monoterapia (Figura 10). Los resultados confirmaron que, al igual que el ácido folínico, el péptido Foxy-5 no tenía ningún efecto citotóxico sobre la viabilidad celular y, en consecuencia, no se pudo determinar un valor de la CI50. Mientras que a partir de las curvas de respuesta a la dosis, se calculó que los valores de la CI50 del oxaliplatino y del 5-FU eran de 3.4 y 6.8 |<j>M, respectivamente.

Los resultados de la combinación indican que el péptido Foxy-5 no potencia ni reduce el efecto inhibidor del FOLFOX sobre la viabilidad celular. El valor de la CI50 del tratamiento con FOLFOX solo fue de 1.5 j M, y un tratamiento combinado con el péptido Foxy-5 y FOLFOX mostró el mismo valor de la CI50, como también queda claro en sus curvas de respuesta a la dosis superpuestas de la Figura 10.

En conclusión, la adición de Foxy-5 no alteró el efecto del tratamiento con FOLFOX sobre la viabilidad de las células humanas de cáncer de colon HT29, por tanto, no puede preverse ninguna interacción. Por lo tanto, no hay indicios de que Foxy-5 disminuya el efecto citostático del tratamiento con FOLFOX.

Claims

REIVINDICACIONES

3. El péptido para usar de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde la expresión de WNT5A en las células cancerosas es igual o inferior al 35 % de la expresión en las células no cancerosas circundantes.

4. El péptido para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde X en la posición 1 es M o norleucina, y X en la posición 4 es C o A.

5. El péptido para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho péptido se selecciona del grupo que consiste en:

MDGCEL (SEQ. ID. NO. 3),

GMDGCEL (SEQ. ID. NO. 4),

EGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 5),

SEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 6),

TSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 7),

KTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 8),

NKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 9),

CNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 10),

LCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 11),

RLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 12),

GRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 13),

QGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 14),

TQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 15),

GTQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 16) y

LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL (SEQ. ID. NO. 17),

o un derivado formilado de los mismos.

6. El péptido para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho péptido es MDGCEL (Se Q ID No : 3) o un derivado formilado del mismo.

7. El péptido para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la reducción o la eliminación comprende la siguiente etapa:

a) inmediatamente después del diagnóstico del cáncer y/o durante la intervención quirúrgica y/o después de extirpar el tumor mediante cirugía, administrar una cantidad eficaz del péptido, opcionalmente, en donde el etapa a) se repite al menos 3 veces por semana durante 2 semanas o más.

8. El péptido para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 combinado con al menos un antineoplásico supresor tumoral, en donde la prevención, la reducción o la eliminación comprende las siguientes etapas: a) administrar una cantidad eficaz de un antineoplásico supresor tumoral;

b) antes, simultáneamente y/o posteriormente tras el tratamiento con dicho al menos un antineoplásico supresor tumoral, administrar una cantidad eficaz del péptido, opcionalmente, en donde el etapa b) se repite al menos 3 veces por semana durante 2 semanas o más.

9. El péptido para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 combinado con al menos un antineoplásico supresor tumoral, en donde dicho péptido y dicho antineoplásico supresor tumoral están combinados o separados y/o se administran simultánea o secuencialmente.

10. La combinación para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en donde dicho al menos un antineoplásico supresor tumoral es una combinación de 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorina y oxaliplatino (FOLFOX) o antraciclina o taxano.

11. La combinación para usar de acuerdo con la reivindicación 9 y 10, en donde la antraciclina es epirubicina o doxorubicina, o el taxano es docetaxel o paclitaxel.

12. La combinación para usar de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho antineoplásico supresor tumoral es una combinación de 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorina y oxaliplatino (FOLFOX) para usar en el tratamiento de un paciente con diagnóstico de cáncer de colon.