ES2962707T3 - Nanodepósitos - Google Patents

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Cécile Oury
Christine Jerôme
Christophe Detrembleur
Patrizio Lancellotti
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Universite de Liege
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Abstract

Nanodepósitos y usos de los mismos, en particular el uso de nanodepósitos para recubrir una superficie de un dispositivo médico, biomaterial o bioprótesis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Nanodepósitos
La presente invención se refiere a nanodepósitos, métodos de fabricación de dichos nanodepósitos y sus usos, en particular al uso de nanodepósitos apropiados para revestir dispositivos médicos.
Los dispositivos médicos y los implantes de biomateriales se utilizan clínicamente en una diversidad de aplicaciones y su rendimiento resulta fundamental para la salud general y la calidad de vida del paciente.
La mayoría de los dispositivos médicos plantean problemas de biocompatibilidad. Es importante destacar que la implantación de materiales extraños en la vasculatura sanguínea activa el mecanismo de contacto de coagulación, lo que se puede traducir en complicaciones trombóticas. En particular, existe una necesidad médica de mejorar la biocompatibilidad y durabilidad de las válvulas cardíacas protésicas que se encuentran actualmente entre los dispositivos cardiovasculares más utilizados. Las válvulas cardíacas protésicas mecánicas tienen un riesgo sustancial de tromboembolia y obstrucción trombótica que a menudo requieren terapia anticoagulante crónica que a su vez se asocia con un mayor riesgo de complicaciones hemorrágicas. Por el contrario, a pesar de que las válvulas cardíacas bio-protésicas tienen un menor riesgo de tromboembolia sin anticoagulación, su durabilidad está limitada por el deterioro del tejido calcificado o no calcificado.
Los dispositivos médicos y los biomateriales también se pueden infectar y el tratamiento de dichas infecciones generalmente requiere la eliminación de todo el componente/sistema y la administración de antibióticos dirigidos a las bacterias causantes.
El documento US 2008/255677 divulga un implante médico que tiene un revestimiento polimérico aplicado mediante el método LbL en donde uno de los restos es PAH.
Como se ha destacado anteriormente, existe la necesidad de crear un producto antibacteriano, antibiopelícula, antitrombótico, antiinflamatorio y/o anticalcificación que se pueda anclar o unir a la superficie de un biomaterial o dispositivo médico.
Se han llevado a cabo intentos anteriores para modificar las superficies de biomateriales y dispositivos médicos con el fin de mejorar la biocompatibilidad de los dispositivos de contacto con la sangre. También se han adoptado estrategias de modificación de superficie para evitar la contaminación de biomateriales con bacterias, tales como revestir superficies de biomateriales y dispositivos médicos con plata que tiene propiedades antimicrobianas. No obstante, ninguna de estas modificaciones de superficie proporciona las propiedades combinadas de, por ejemplo, antibacteriana, antibiopelícula, antitrombótica y anticalcificación.
La divulgación se refiere a nanodepósitos, tales como nanogeles, que proporcionan un espacio de carga más grande que se puede usar para incorporar compuestos bioactivos. Dichos nanodepósitos se adhieren a la superficie de cualquier biomaterial o dispositivo médico, ya sea metálico o polimérico, o a una bioprótesis, y de ese modo reducen o evitan la infección y mejoran la biocompatibilidad y hemocompatibilidad de los materiales implantados de forma transitoria o permanente para contribuir a mantener su funcionalidad y aumentar su durabilidad.
Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis, en donde una superficie o parte de la misma está revestida con un nanodepósito unido a dicha superficie que comprende nanopartículas de nanogel, en donde el nanogel comprende un primer polímero de Fórmula 1:
Formula 1
reticulado a un segundo polímero que comprende una cadena principal hidrófila y uno o más restos reactivos, en donde el nanodepósito comprende además una o más moléculas bioactivas, moléculas terapéuticas o fármacos que se liberan desde dentro del nanodepósito.
El nanodepósito puede hacer referencia a una nanopartícula que comprende un nanogel, que está compuesto de un hidrogel con una red polimérica hidrófila reticulada. Los nanogeles suelen estar compuestos por polímeros sintéticos o biopolímeros que están reticulados de forma física o química. Los poros de los nanogeles pueden estar rellenos con moléculas pequeñas o macromoléculas y se pueden controlar sus propiedades, tales como hinchamiento, degradación y funcionalidad química.
La nanopartícula es cualquier partícula en donde la dimensión más larga sea menor que 1000 nm, por ejemplo, de aproximadamente 10 nm a 300 nm. Por ejemplo, el nanodepósito puede tener una dimensión más larga menor que aproximadamente 500 nm, menor que aproximadamente 300 nm, menor que aproximadamente 200 nm, menor que aproximadamente 150 nm, menor que aproximadamente 100 nm, menor que aproximadamente 50 nm, menor que aproximadamente 30 nm, menor que aproximadamente 10 nm o menor que aproximadamente 3 nm. El nanodepósito puede comprender nanopartículas que tienen un diámetro de aproximadamente 150 nm a aproximadamente 250 nm. El nanodepósito puede comprender nanopartículas que tienen un diámetro de aproximadamente 100 a aproximadamente 250 nm.
La reticulación entre el primer y segundo polímero puede implicar una reacción de amina-quinona. Preferentemente, la reticulación no utiliza polimerización por radicales.
El resto catecol puede tener la estructura:
también conocido como benceno 1,2 diol.
El conector puede ser un grupo de éster alquílico, una N-alquilamida, un alquilo o alcoxi.
La cadena principal del polímero o copolímero hidrófilo puede comprender uno o más de polialilamina, polivinilaminas, polivinilamidas, poli(alcohol vinílico), poli(meta)acrilatos, poli(met)acrilamida, poliuretano o PEG o un polielectrolito (catiónico, aniónico o zwitteriónico) o un biopolímero hidrófilo tal como un polisacárido tal como quitosano o hialuronano.
El primer polímero puede ser poliDOPA, por ejemplo poli(éster metílico de N-metacriloil 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina) también denominado P(mDOPA), como se ilustra a continuación:
Antes de uso, P(mDOPA) se puede oxidar para formar Pox(mDOPA), como se ilustra a continuación:
El primer polímero puede ser P(mDOPA), o poliDOPA, o sus copolímeros con monómeros hidrófilos (monómeros catiónicos, aniónicos, zwitteriónicos o monómeros hidrosolubles neutros). El primer polímero puede ser un copolímero de P(mDOPA).
En el segundo polímero, la cadena principal hidrófila puede comprender uno o más de una polialilamina, polivinilamina, polivinilamida, un poli(alcohol vinílico), poli(met)acrilato, una poli(met)acrilamida, un poliuretano, polietilenglicol (PEG), polielectrolito (catiónico, aniónico o zwitteriónico) con grupos reactivos tales como aminas primarias o secundarias o tiol; o un biopolímero hidrófilo tal como un polisacárido tal como quitosano o hialuronano.
El resto reactivo puede ser una amina primaria o secundaria o un tiol.
El segundo polímero puede ser un polímero natural o sintético con una función amina primaria, por ejemplo polivinilamina, quitosano o una proteína. El segundo polímero puede comprender una polialilamina, tal como poli(clorhidrato de alilamina), también conocido como PAH, como se ilustra a continuación:
El nanodepósito puede comprender nanopartículas formadas a partir de P(mDOPA) y PAH reticulados, que comprenden uno o ambos de los siguientes enlaces:
El nanodepósito se puede rellenar con uno o más agentes bioactivos tales como moléculas bioactivas, moléculas terapéuticas o fármacos que incluyen antibióticos, agentes antiformación de biopelículas, agentes antiplaquetas, anticoagulantes, agentes antitrombóticos y agentes anticalcificantes. Los agentes bioactivos pueden estar ubicados dentro de las nanopartículas en el nanodepósito y/o entre las nanopartículas del nanodepósito.
Los agentes bioactivos pueden incluir cualquier agente que se desee administrar a moléculas, células, tejidos u órganos para modular o modificar de otro modo la función molecular o celular, incluyendo efectos terapéuticos. Los agentes bioactivos incluyen, entre otros, compuestos farmacéuticamente activos o compuestos de diagnóstico. Los compuestos bioactivos incluyen, entre otros, nucleótidos (aptámeros, ARNi, oligonucleótidos antisentido), péptidos, oligopéptidos, proteínas, apoproteínas, glicoproteínas, antígenos y anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de los mismos, receptores y otras proteínas de membrana, oligopéptidos retroinversos, análogos de proteína en los que al menos un enlace no peptídico reemplaza a un enlace peptídico, enzimas, coenzimas, inhibidores enzimáticos, aminoácidos y sus derivados, hormonas, lípidos, fosfolípidos, liposomas, ricina o fragmentos de ricina; toxinas tales como aflatoxina, digoxina, xantotoxina, rubratoxina; analgésicos tales como aspirina, ibuprofeno y paracetamol; broncodilatadores tales como teofilina y albuterol; agentes de bloqueo beta tales como propranolol, metoprolol, atenolol, labetolol, timolol, penbutolol y pindolol; agentes antimicrobianos tales como los descritos anteriormente y ciprofloxacina, cinoxacina y norfloxacina; agentes antihipertensores tales como clonidina, metildopa, prazosina, verapamilo, nifedipina, aptoprilo y enalaprilo; agentes cardiovasculares que incluyen antiarrítmicos, glucósidos cardíacos, agentes antiangina y vasodilatadores; agentes del sistema nervioso central que incluyen estimulantes, sicotrópicos, antimaníacos y depresivos; agentes antivíricos; antihistamínicos tales como clorfenir mina y bromfeniramina; medicamentos contra el cáncer que incluyen agentes quimioterapéuticos, tales como clorambucilo, carboplatino, derivados de busulfano, doxorrubicina, etopósido, topotecano (TPT); tranquilizantes tales como diazepam, cordiazepóxido, oxazepam, alprazolam y triazolam, antidepresivos tales como fluoxetina, amitriptilina, nortriptilina e imipramina; antagonistas H-2 tales como nizatidina, cimetidina, famotidina y ranitidina; anticonvulsivos; agentes antináuseas; prostaglandinas; relajantes musculares; sustancias antiinflamatorias; estimulantes; descongestionantes; antieméticos; diuréticos; antiespasmódicos; antiasmáticos; agentes antiparkinson; expectorantes; supresores de tos; mucolíticos; vitaminas; y aditivos minerales y nutricionales. Otras moléculas incluyen nucleótidos; oligonucleótidos; polinucleótidos; y sus análogos y derivados reconocidos en la técnica y biológicamente funcionales, incluidos, por ejemplo, polinucleótidos metilados y análogos de nucleótidos que tienen enlaces fosforotioato; plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales y otros vectores de ácidos nucleico; polinucleótidos antisentido que incluyen aquellos sustancialmente complementarios a al menos un ácido nucleico endógeno o los que tienen secuencias con un sentido opuesto a al menos partes de genomas víricos o retrovíricos seleccionados; promotores; potenciadores; inhibidores; otros ligandos para regular la transcripción y traducción génicas.
El agente bioactivo puede ser un agente antiinfeccioso. Los agentes antiinfecciosos incluyen, entre otros, antibióticos, tales como amicacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, tobramicina, paromomicina, estreptomicina, espectinomicina, geldanamicina, herbimicina, rifaxi mina, loracarbef, ertapenem, dorpenem, imipenem/cilastatina, meropenem, cefadroxilo, cefazolina, cefalotina, cefalexina, cefaclor, cefamandol, cefoxitina, cefproxilo, cefuroxima, cefixima, cefdinir, cedfitoreno, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima, ceftriaxona, cefepima, ceftarolina fosamilo, ceftobiprol, teicoplanina, vancomicina, telavancina, daibavancina, oritavancina, clindamicina, lincomicina, daptomicina, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, roxitromicina, troleandomicina, telitromicina, espiramicina, aztreonam, furazolidona, nitrofurantoína, linezolid, amoxicilina, ampicilina, piperacilina, ticarcilina, bacitracina, colistina, polimixina B , ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, gemifloxacina, levoflaxicina, lomefloxacilina, moxifloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, mafenida, sulfacetamida, sulfadizina, sulfadizina de plata, sulfadimetoxina, sulfametizol, sulfametoxazol, sulfanilimida, sulfisoxazol, trimetoprim-sulfametoxazol, sulfonamidocrisoidina, demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina, clofazimina, dapsona, rifampicina, rifabutina, arspehnamina, cloranfenicol, fosfomicina, metronidazol, tiamfenicol, tigeciclina, tinidazol y trimetoprima.
Los agentes anti-formación de biopelículas incluyen, entre otros, péptidos naturales tales como catelicidina humana LL-37 o indolicidina de péptido bovino, o péptidos sintéticos tales como 1018, compuestos naturales con un resto de 2-aminoimidazol, inhibidores basados en 2-aminoimidazol, análogos de bencimidazoles, análogos de indoltriazoamida, inhibidores de biopelícula derivados de plantas tales como emodina, floretina, diterpeno casbano, resveratrol y sus oligómeros, derivados de azufre, análogos de furanona bromados, alcaloides de bromopirrol, esquilamicinas y estructuras D de (-)-ageloxima, cembranoides, análogos de N-acy1 homoserina lactona, carolactona, moléculas que interfieren con la formación de fibras similares a amiloide, ácidos grasos, donantes de óxido nítrico, líquidos iónicos tales como cloruro de 1 -alquil-3-metil imidazolio, bromuro de 1 -alquilquinolinio, todos estos agentes se pueden utilizar en combinación con antibióticos convencionales.
Los agentes antiplaquetas incluyen, entre otros, inhibidores irreversibles de ciclooxigenasa tales como aspirina y triflusal (Disgren), inhibidores del receptor de adenosina difosfato (ADP) tales como clopidogrel (Plavix), prasugrel (Effient), ticagrelor (Brilinta), ticlopidina (Ticlid), inhibidores de fosfodiesterasa tales como cilostazol (Pletal), antagonistas de receptor 1 activado por proteasa (PAR-1) tales como vorapaxar (Zontivity), inhibidores de glicoproteína IIB/IIIA (solo para uso intravenoso) tales como abciximab (ReoPro), eptifibatida (Integrilin), tirofiban (Aggrastat), inhibidores de recaptación de adenosina tales como dipiridamol (Persantine), inhibidores de tromboxano, inhibidores de tromboxano sintasa y antagonistas de receptor de tromboxano tales como terutroban, inhibidores de glicoproteína VI tales como Revacept, inhibidores de glicoproteína Ib e inhibidores de factor von Willebrand.
Los anticoagulantes incluyen, entre otros, acenocumarol, cumatetralilo, dicumarol, biscoumacetato de etilo, fenprocumón, varfarina, clorindiona, dipjenadiona, fenindiona, ticlomarol, bemiparina, certoparina, ardeparina, dalteparina, enoxaparina, nadroparina, parnaparina, reviparina, dabigatrán, apixabán, betrixabaan, darexabán, edoxabán, otamixabán, rivaroxabán, alteplasa, danaparoide, tinzaparina y fondaparinux.
Los agentes trombolíticos incluyen, entre otros, alteplasa, reteplasa, tenecteplasa, saruplasa, uroquinasa, anistreplasa, monteplasa, estreptoquinasa, ancrod, brinasa y fibrinolisina.
Los agentes anticalcificantes incluyen, entre otros, bifosfonatos, sales de aluminio, glutaraldehído, ácido amino oleico e inhibidores de metaloproteinasas.
El nanodepósito puede comprender nanopartículas de primer y segundo polímeros reticulados, y al menos una, preferentemente al menos dos, moléculas bioactivas, moléculas terapéuticas y/o fármacos. El nanodepósito puede comprender un agente antiplaquetas y/o un antibiótico. Las moléculas bioactivas, moléculas terapéuticas o fármacos se pueden encapsular en las nanopartículas y/o se pueden unir covalentemente a restos reactivos de nanopartículas.
El nanodepósito puede comprender un antibiótico y un agente antiplaquetas en una proporción de entre aproximadamente 1 parte de antibiótico y aproximadamente 5 partes de agente antiplaquetas, o entre aproximadamente 2 partes de antibiótico y aproximadamente 3 partes de agente antiplaquetas.
Se pueden injertar ligandos funcionalizados hidrófilos en las nanopartículas de nanogel reticuladas ensambladas. Los ligandos hidrófilos pueden comprender ligandos funcionalizados con extremos de tiol o vinilo. Los ligandos funcionalizados pueden comprender una o más moléculas de PEG (polietilenglicol) y/o uno o más ligandos de PEG funcionalizados con extremos vinílicos, tales como moléculas de PEG-acrilato. Cuando se usa PEG, PEG puede ser PEG 1,5 (Metoxi-PEG-(CH2)2-SH, PM 2.000), PEG2 (Metoxi-PEG-(CH2)2-SH, PM 2.000), PEG5 (Metoxi-PEG-( CH2)2-SH, PM 5.000) o PEG10 (Metoxi-PEG-(CH2)2-SH, PM 10.000). Cuando se utiliza PEG-acrilato (APEG), la molécula puede ser: APEG (acrilato de éter metílico de polietilenglicol, PM 480) o APEG1 (acrilato de éter metílico de polietilenglicol, PM 1.000). Los ligandos funcionalizados también pueden incluir polibetaínas. Como ligando funcionalizado se puede utilizar al menos PEG2, o un PEG con un peso molecular más elevado.
Preferentemente, los nanodepósitos que comprenden nanopartículas que llevan ligandos hidrófilos muestran propiedades antiadhesivas frente a plaquetas y bacterias en comparación con las nanopartículas de nanogel sin ligandos hidrófilos.
Preferentemente, los ligandos hidrófilos se añaden después de la formación de las nanopartículas de nanogel y se unen a la superficie de la nanopartícula.
El nanodepósito puede comprender nanopartículas que comprenden un primer polímero y un segundo polímero, en donde el primer polímero que lleva uno o más restos catecol está reticulado con el segundo polímero que comprende una cadena principal hidrófila con uno o más restos reactivos, y en donde las nanopartículas están decoradas superficialmente con ligandos hidrófilos.
El nanodepósito puede comprender dos o más capas de nanogel. Cada capa de nanogel puede comprender nanopartículas como se describe en la presente memoria. Cada capa puede ser igual o diferente. Por ejemplo, una capa puede comprender agentes bioactivos. Una capa puede comprender nanogeles rellenos con diferentes moléculas bioactivas. Alternativamente, las diferentes capas pueden comprender diferentes agentes bioactivos. El nanodepósito puede comprender 2, 3, 4, 5 o más capas de nanopartículas de nanogel. Mediante el uso de nanodepósitos de multicapa se pueden mejorar las propiedades antitrombóticas y/o antibiopelícula del nanodepósito. La presencia de múltiples capas de nanogel puede prolongar la liberación de agentes bioactivos desde el interior del nanodepósito.
El nanodepósito puede comprender al menos 5 capas de nanopartículas de nanogel, en donde las nanopartículas de al menos la capa más superior transportan ligandos funcionalizados. El nanodepósito puede comprender al menos 2, 3, 4, 5 o más capas, en donde al menos 1,2, 3, 4 o 5 capas contienen moléculas bioactivas, moléculas terapéuticas o fármacos, tales como un agente antibacteriano y/o antiplaquetas, y en donde la más superior transporta ligandos funcionalizados. El agente antibacteriano puede ser minociclina. El agente antiplaquetas puede ser ticagrelor. El ligando funcionalizado puede ser PEG2 o una molécula de PEG con un PM de aproximadamente 2000 o más.
Los nanodepósitos de la invención pueden tener propiedades antibacterianas y/o antitrombóticas/antiplaquetas conferidas por agentes bioactivos incorporados en el nanodepósito y/o como resultado de las composiciones químicas utilizadas para producir las nanopartículas.
Un implante de biomaterial puede ser cualquier material extraño implantable para uso clínico en mamíferos hospedadores tales como prótesis de articulaciones, marcapasos, desfibriladores automáticos implantables, catéteres que incluyen catéteres o materiales intravasculares o urinarios, endoprótesis vasculares que incluyen endoprótesis vasculares coronarias, válvulas cardíacas protésicas mecánicas y biológicas, lentes intraoculares, implantes dentales y similares. El implante de biomaterial puede ser una bioprótesis.
El dispositivo médico incluye, entre otros, cualquier dispositivo, herramienta, instrumento, implante o similar, relacionado con la medicina o la práctica de la medicina humana o veterinaria, o destinado a curar o tratar una enfermedad o afección. El dispositivo médico puede incluir todos los materiales naturales y sintéticos y materiales tanto fibrosos como no fibrosos. Por ejemplo, los materiales pueden estar compuestos de metal, plástico, papel, vidrio, cerámica, material textil, caucho, polímero, material de composite o cualquier otro material o combinación de materiales. Los dispositivos médicos a modo de ejemplo incluyen, entre otros, cualquier tipo de catéter; cánulas; agujas; endoprótesis vasculares de cualquier tamaño, forma o ubicación; bobinas de cualquier tamaño, forma o ubicación; lentes de contacto; DIUs; cámaras de bombas peristálticas; tubos endotraqueales; sondas de alimentación gastroentéricas; derivaciones arteriovenosas; condones; membranas oxigenadoras y renales; guantes; cables de marcapasos; gasas para heridas; pasadores, placas y tornillos metálicos; caderas artificiales metálicas; rodillas artificiales.
La bioprótesis incluye, entre otras, una prótesis hecha de material biológico. Los ejemplos incluyen válvulas cardíacas (por ejemplo, válvula cardíaca porcina descelularizada), pericardio (por ejemplo, pericardio bovino), injertos vasculares, prótesis de vejiga urinaria, prótesis de tendones, parches para hernias, mallas quirúrgicas y sustitutos cutáneos.
El nanodepósito se fija a la superficie de un dispositivo médico, implante de biomaterial o bioprótesis mediante diversas estrategias físicas o químicas, tales como electroinjerto (electroiniciación de la polimerización mediante polarización de la superficie metálica en presencia del monómero), irradiación superficial, ensamblaje capa a capa (LbL), revestimiento por rotación, deposición química de vapor (CVD), deposición láser, proteínas sanguíneas, revestimientos inspirados en mejillón y fenoles vegetales (Qiang Wei y Rainer Haag., 2005, Mater. Horizontal. 2015, 2: 567-577 Universal polymer coatings and their representative biomedical applications).
El nanodepósito se puede formar reticulando un primer polímero y un segundo polímero, en donde el primer polímero porta uno o más restos catecol; y el segundo polímero comprende una cadena principal hidrófila con uno o más restos reactivos. Los polímeros se pueden reticular en presencia de uno o más agentes bioactivos para producir nanopartículas que comprenden el primer y segundo polímeros con el agente bioactivo atrapado en su interior. Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere a un método de formación de un nanodepósito que comprende reticular un primer polímero que porta uno o más restos de catecol con un segundo polímero que comprende una cadena principal hidrófila con uno o más restos reactivos. El nanodepósito producido comprende preferentemente nanopartículas de polímeros reticulados.
El método para fabricar un nanodepósito puede comprender las etapas de:
i) obtención de P(mDOPA)
ii) oxidación de P(mDOPA) para formar una disolución acuosa de Pox(mDOPA):
iii) adición de una disolución de PAH a la disolución acuosa de Pox(mDOPA)
iv) reticulación de los compuestos de ii) y iii) para formar una disolución de nanogel de nanopartículas de fórmula:
Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere a un método de fabricación de un nanodepósito que comprende al menos dos moléculas bioactivas, moléculas terapéuticas o fármacos, comprendiendo el método las etapas de:
i) mezclar Pox (mDOPA) en una disolución acuosa con una molécula bioactiva, molécula terapéutica o fármaco: ii) añadir una disolución de PAH a la disolución acuosa resultante de Pox(mDOPA) obtenida en i) para formar una primera disolución de nanogel;
iii) repetir las etapas i) y ii) con una segunda molécula bioactiva, molécula terapéutica o fármaco para formar una segunda disolución de nanogel;
iv) mezclar la primera y segunda disoluciones de nanogel para obtener un nanodepósito con dos moléculas bioactivas, moléculas terapéuticas o fármacos.
El nanodepósito puede comprender una proporción de nanogeles rellenos con una primera molécula bioactiva, molécula terapéutica o fármaco con respecto a nanogeles rellenos con una segunda molécula bioactiva, molécula terapéutica o fármaco de entre aproximadamente 1 parte de la primera y aproximadamente 5 partes de la segunda molécula bioactiva, molécula terapéutica o fármaco; o aproximadamente 2 partes de la primera y aproximadamente 3 partes de la segunda molécula bioactiva, molécula terapéutica o fármaco.
La primera molécula bioactiva, molécula terapéutica o fármaco puede ser un antibiótico. La segunda molécula bioactiva, molécula terapéutica o fármaco puede ser un agente antiplaquetas.
Según otro aspecto de la invención, se proporciona un método de producción de un dispositivo médico, implante de biomaterial o bioprótesis con una superficie revestida que comprende revestir una superficie que comprende:
i) sumergir la superficie a revestir en una disolución de un primer polímero, en donde el primer polímero comprende un polímero de Fórmula I:
ii) oxidar el primer polímero;
iii) sumergir la superficie resultante en una segunda disolución polimérica, en donde el segundo polímero comprende una cadena principal hidrófila y uno o más restos reactivos;
iv) sumergir la superficie en una disolución que comprende nanopartículas de un nanogel, en donde el nanogel comprende un primer polímero de Fórmula I:
cadena principal (co)polimérica hidrófila
reticulado a un segundo polímero que comprende una cadena principal hidrófila y uno o más restos reactivos para producir un revestimiento sobre la superficie; y
v) opcionalmente sumergir la superficie revestida en una disolución de ligando funcionalizado hidrófilo.
El primer polímero puede ser P(mDOPA). La forma oxidada del primer polímero puede ser Pox(mDOPA). El segundo polímero puede ser PAH.
El nanodepósito de la etapa iv) puede comprender dos o más moléculas bioactivas, moléculas terapéuticas y/o fármacos. Las moléculas bioactivas pueden incluir un antibiótico y/o un agente antiplaquetas.
Se puede producir un dispositivo médico, implante de biomaterial o bioprótesis con una superficie revestida con un nanodepósito que comprende dos o más capas de nanopartículas repitiendo las etapas iii) y iv) del método descrito con anterioridad. Se puede producir un nanodepósito que comprende 2, 3, 4, 5 o más capas.
La bioprótesis puede ser una válvula cardíaca protésica.
El método de la invención se puede usar para revestir sólo una parte de la superficie de un dispositivo médico, implante de biomaterial o bioprótesis, o sustancialmente la totalidad o la superficie total de un dispositivo médico, implante de biomaterial o bioprótesis.
Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere a un dispositivo médico revestido, implante de biomaterial o bioprótesis según la invención o producido mediante el método de la invención para uso en la prevención o reducción de infecciones cuando el dispositivo médico, implante de biomaterial o bioprótesis se implanta en un sujeto.
Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere a un nanodepósito divulgado en la presente memoria para uso en la prevención o reducción de infecciones cuando el dispositivo médico, implante de biomaterial o bioprótesis se implanta en un sujeto. El sujeto puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano.
Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere a un método para revestir una superficie de un dispositivo médico, implante de biomaterial o bioprótesis con un nanodepósito, comprendiendo el método las etapas de
i) sumergir la superficie a revestir en una disolución de P(mDOPA);
ii) oxidar el P(mDOPA) para formar Pox(mDOPA);
iii) sumergir la superficie resultante en una disolución de PAH;
iv) sumergir la superficie en una disolución de un nanodepósito según la invención; y
v) opcionalmente sumergir la superficie revestida resultante en una disolución de ligando funcionalizado hidrófilo. Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere a un método para revestir una superficie de un dispositivo médico, implante de biomaterial o bioprótesis con un nanodepósito que comprende dos o más moléculas bioactivas, moléculas terapéuticas o fármacos diferentes, en donde el método comprende las etapas de i) sumergir la superficie en una disolución de p(mDOPA);
ii) oxidar p(mDOPA) para formar Pox(mDOPA);
iii) sumergir la superficie resultante en una disolución de PAH;
iv) sumergir la superficie en una disolución de nanodepósitos según la invención que contiene dos o más moléculas bioactivas, moléculas terapéuticas o fármacos;
v) repetir las etapas iii) y iv) al menos 3, 4 o 5 veces para construir un revestimiento de multicapa; y opcionalmente vi) sumergir la superficie revestida en una disolución de ligando funcionalizado hidrófilo
Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere a un implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis, tal como una válvula cardíaca protésica, revestida al menos en parte con un nanodepósito que comprende al menos 2, 3, 4, 5 , 6 o más capas según la invención. Al menos una de las capas del nanodepósito comprende preferentemente al menos 2 moléculas bioactivas, moléculas terapéuticas o fármacos. Preferentemente, la capa más externa del nanodepósito porta grupos funcionalizados según la invención.
Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere a un nanodepósito formado mediante reticulación de un primer polímero y un segundo polímero, portando el primer polímero uno o más restos catecol; y comprendiendo el segundo polímero una cadena principal hidrófila con uno o más restos reactivos; para uso como revestimiento sobre un implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis; opcionalmente en donde el nanodepósito contiene una o más moléculas bioactivas, moléculas terapéuticas o fármacos.
Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere a un nanodepósito que comprende un nanogel que comprende al menos polímeros de Fórmula I:
cadena principal (co)polimérica hidrófila
en donde la estructura principal del polímero hidrofílico comprende uno o más de polialilamina, polivinilaminas, polivinilamidas, poli(alcohol vinílico), poli(meta)acrilatos, poli(met)acrilamida, poliuretano o PEG o un polielectrolito (catiónico, aniónico o zwitteriónico) o un biopolímero hidrófilo tal como un polisacárido como quitosano o hialuronano. Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere a un nanodepósito que comprende un nanogel formado por polímeros de reticulación de Fórmula I:
cadena principal (co)polimérica hidrófila
en donde la estructura principal del polímero hidrófilo comprende uno o más de polialilamina, polivinilaminas, polivinilamidas, poli(alcohol vinílico), poli(meta)acrilatos, poli(met)acrilamida, poliuretano o PEG o un polielectrolito (catiónico, aniónico o zwitteriónico) o un biopolímero hidrófilo tal como un polisacárido como quitosano o hialuronano. Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere al uso de un nanodepósito divulgado en la presente memoria en una composición de revestimiento sobre un dispositivo médico, implante de biomaterial o bioprótesis. Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere al uso de un nanodepósito divulgado en la presente memoria como revestimiento en un dispositivo médico, implante de biomaterial o bioprótesis.
Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere al uso de un nanodepósito divulgado en la presente memoria como composición de revestimiento en un dispositivo médico, implante de biomaterial o bioprótesis.
Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere al uso de un nanodepósito en una composición de revestimiento en un dispositivo médico, implante de biomaterial o bioprótesis, en donde el nanodepósito comprende uno o más compuestos o fármacos bioactivos.
Un implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis, o parte de los mismos, se puede revestir con un nanodepósito sumergiendo el implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis en una disolución que comprende nanodepósitos divulgados en la presente memoria, o pulverizando el implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis con una disolución que comprende nanodepósitos divulgados en la presente memoria y a continuación secar el implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis revestida.
El nanodepósito se puede configurar para ser antiadhesivo tanto frente a plaquetas como frente a bacterias, y para almacenar y/o administrar moléculas terapéuticas y/o activas tales como moléculas activas biológicas y no biológicas (por ejemplo, fármacos, productos biológicos) con o sin revestimiento asociado que controla la velocidad de administración de la molécula terapéutica o activa al tejido circundante. La tasa de administración puede ser por un período de liberación de al menos 1 día, 2 días, 3 días, 7 días, mientras que la eficacia antiadhesiva se mantiene durante al menos un mes, al menos dos meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses o al menos 6 meses.
El nanodepósito puede contener un antibiótico y un agente antiplaquetas. El nanodepósito puede contener minociclina y ticagrelor. El nanodepósito puede contener un agente anti-formación de biopelículas y un anticoagulante. El nanodepósito puede contener un agente antiformación de biopelículas y un agente antiplaquetas.
Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere a un método para fabricar un nanodepósito que comprende las etapas de:
(i) mezclar en una disolución acuosa un polímero funcionalizado con quinona en presencia de una o más moléculas bioactivas o fármacos;
(ii) añadir una disolución polimérica a la disolución acuosa para formar una disolución de nanogel en donde el polímero está seleccionado entre uno o más de polialilamina, polivinilaminas, polivinilamidas, poli(alcohol vinílico), poli(meta)acrilatos, poli(met)acrilamida, poliuretano o PEG o un polielectrolito (catiónico, aniónico o zwitteriónico) o un biopolímero hidrófilo tal como un polisacárido tal como quitosano o hialuronano.
Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere a un método para fabricar un nanodepósito que comprende las etapas de:
(i) mezclar un polímero Pox (mDOPA) funcionalizado con quinona en una disolución acuosa con una o más moléculas bioactivas, moléculas terapéuticas o fármacos;
(ii) añadir una disolución de PAH a la disolución acuosa de Pox (mDOPA) para formar una disolución de nanogel.
Puede haber una etapa inicial de oxidación de p(mDOPA) para formar Pox (mDOPA).
Puede haber una etapa adicional de liofilizar la disolución de nanogel.
La disolución acuosa de Pox(mDOPA) y/o la disolución de PAH puede tener un pH de al menos 8, preferentemente al menos 10.
Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere a un método para elaborar un nanogel, que comprende las etapas de:
(i) disolver el primer polímero, por ejemplo metacrilamida, que contiene 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (P(mDOPA)) en agua destilada para producir P(mDOPA) oxidado,
(ii) añadir NaOH (0,1 M) a la disolución acuosa de P(mDOPA) oxidado a temperatura ambiente;
(ii) añadir una disolución de PAH a aproximadamente pH 10 a la disolución acuosa de P(mDOPA) oxidado con agitación vigorosa durante al menos 1 hora a temperatura ambiente.
Preferentemente en la etapa (ii), NaOH y P(mDOPA) oxidado se mezclan durante al menos 6 horas, preferentemente durante la noche. Preferentemente el pH de la solución es 10 o superior.
Una divulgación, que no forma parte de la invención, se refiere a un método para preparar un nanogel, que comprende las etapas de:
(i) disolver metacrilamida que porta 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (P(mDOPA)) en agua destilada en presencia de una molécula bioactiva o fármaco para producir P(mDOPA) oxidado durante 1 hora a 6 °C,
(ii) añadir NaOH (0,1 M) a la disolución acuosa de P(mDOPA) oxidado a temperatura ambiente durante la noche; (ii) añadir una disolución de PAH a pH 10 a la disolución acuosa de P(mDOPA) oxidado con agitación vigorosa durante la noche a 6 °C.
Se aprecia que las características opcionales aplicables a un aspecto o realización de la invención se pueden usar en cualquier combinación y en cualquier número. Además, también se pueden utilizar con cualesquiera de los otros aspectos o realizaciones de la invención en cualquier combinación y en cualquier número. Esto incluye las reivindicaciones dependientes de cualquier reivindicación que se utilicen como reivindicaciones dependientes para cualquier otra reivindicación de la presente solicitud.
La invención se describe con más detalle, únicamente mediante ejemplos no limitantes, con referencia a las siguientes figuras y ejemplos experimentales.
Figura 1 - muestra las estructuras químicas de (1) P(mDOPA), (2) Pox(mDOPA) (3) PAH
Figura 2 - muestra la estrategia para la formación de nanogeles de Pox(mDOPA)/PAH.
figura 3 - muestra el análisis TEM de un nanogel según la invención sin (a) y con liofilización (b).
Figura 4 - muestra el análisis DLS de la disolución de nanogel.
Figura 5 - muestra el análisis DLS de nanogel, nanogel(ABTs) y nanogel(ABTs-Tica).
Figura 6 - muestra la modificación de superficies de Ti con capas de polidopamina (PDOPA), PAH y nanogeles auto-reticulados mediante enlace de base de Schiff sobre sustratos de Ti revestidos con PDOPA.
Figura 7 - muestra una imagen de una superficie de Ti antes y después de la modificación de PDOPA.
Figura 8 - muestra observaciones de microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (SEM).
Figura 9 - muestra la acumulación de nanodepósitos analizados mediante microbalanza de cristal de cuarzo. Figura 10 - muestra la modificación de una superficie de Ti con nanogeles según la invención.
Figura 11 - muestra el análisis SEM de un nanogel según la invención depositado sobre una superficie de Ti siguiendo el 2° enfoque
Figura 12 - muestra imágenes de una válvula biológica antes y después de la modificación de PDOPA.
Figura 13- muestra imágenes SEM de la superficie de una válvula biológica antes (arriba a la izquierda) y después de la deposición de nanogel con (arriba a la derecha) o sin revestimiento de PDOPA (abajo a la izquierda) (aumento = 5000 X).
Figura 14 - muestra imágenes SEM de la superficie de una válvula biológica antes (arriba a la izquierda) y después de la deposición de nanogel con (arriba a la derecha) o sin revestimiento de PDOPA (abajo a la izquierda) (aumento = 30000 X).
Figura 15 - muestra ensayo de hemocompatibilidad dinámica utilizando un sistema Impact-R a una tasa de cizalladura constante de 1800 s-1 durante 2 min. Se muestra el efecto de la tensión de cizalladura sobre la adherencia de las plaquetas (gráfico de la izquierda) y la formación de agregados (gráfico de la derecha) en diferentes momentos con dos revestimientos poliméricos de PEG o APEG. En ambos gráficos se presentan los valores medianos de N = 4 donantes sanos. El análisis estadístico se realizó utilizando el software Graph Pad con ANOVA de dos factores agrupado y ensayo posterior de Bonferroni. Además, la adherencia de las plaquetas se correlacionó con los ángulos de contacto con agua de los revestimientos sobre soportes de vidrio: las superficies con menor ángulo de contacto (es decir, la superficie de PEG más hidrófila) proporcionaron una menor adherencia de plaquetas.
Figura 16 - muestra un ensayo dinámico Impact-R a una tasa de cizalladura constante de 1800 s-1 durante 2 minutos (A y B) o durante 4 min (C). A. Valores medianos de SC y AS determinados en 3 donantes sanos (duplicados por condición por donante). B. Imágenes representativas del ensayo que se muestra en A.
Figura 17 - muestra un ensayo dinámico Impact-R a una tasa de cizalladura constante de 1800 s-1 durante 4 min. El recuento de plaquetas se midió después de la exposición a tensión de cizalladura. El ensayo se llevó a cabo en un donante por cuadruplicado.
Figura 18 - muestra un ensayo estático que analiza las células sanguíneas adheridas a superficies modificadas con nanogel. La sangre se incubó en poliestireno de 24 pocillos no revestidos (NC) o revestidos con Nanogel (NG) o Nanogel Peg (NP) o Nanogel Antibiotics Peg (NAP). Las células que se adhirieron a la superficie se tiñeron con cristal violeta. Se procesaron imágenes de células fijadas sobre la superficie de poliestireno. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio óptico Olympus CKX41 (aumento de 20X). Número de celdas contadas en cada campo utilizando el software Fiji (complemento de análisis de partículas). Los números representan el promedio de 8 campos por condiciones.
Figura 19 - muestra plasma rico en plaquetas (PRP) a una concentración de 250.000 plaquetas/pl incubado en condiciones estáticas a 37 °C durante 1 min (A) o 45 min. (B) en pocillos revestidos de PS NC (poliestireno no revestido) o NAP (peg antibiótico de nanogel). Después de 3 lavados con NaCl al 0,9 %, las plaquetas se tiñeron con disolución de May-Grünwald y se observaron en un microscopio óptico Olympus CKX41 (10 aumentos).
Figura 20 - muestra la cuantificación de biopelículas de S.aureuscon violeta cristal. Las bacterias se cultivaron durante 24 horas sobre una superficie de poliestireno modificado por nanogeles rellenos o no con antibióticos según se indica.
Figura 21 - muestra el análisis SEM de la superficie de una válvula biológica después de una incubación de 24 horas con S.aureus.Se comparan las superficies no revestidas y modificadas con nanogel (aumento = 2000x).
Figura 22 - muestra bacterias deE. Faecaliscultivadas durante 24 horas sobre superficies de poliestireno modificado en condiciones estáticas o de agitación. También se muestra el recuento de UFC de bacterias planctónicas sembradas en placas de agar TSB.
Figura 23 - muestra los resultados de un estudio de la propiedad antitrombótica de los nanodepósitos en disolución mediante ensayos de agregación de plaquetas. (A) Se preincubó PRP durante 10 minutos con una disolución de nanodepósito que contenía concentraciones crecientes de ticagrelor o con ticagrelor libre, como se indica. La agregación de plaquetas se indujo añadiendo ADP 10 pM a 37 °C en condiciones de agitación (1200 rpm). Se muestran los porcentajes de agregación máxima registrados por medio de agregometría de transmisión de luz. Los datos representan medias ± DE (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001). (B) Máxima agregación de plaquetas obtenida en presencia de diferentes relaciones de nanogeles rellenos de ticagrelor y nanogeles rellenos de minociclina. NG: nanogel que porta PEG 1500; NGT: nanogel relleno con ticagrelor que porta PEG 1500; NGM: nanogel relleno con<minociclina que porta PEG 1500. Los datos representan medias ±>D<e>.
Figura 24 - ilustra los resultados de un estudio sobre el efecto del nanodepósito inmovilizado sobre la activación de la fase de contacto de la coagulación en plasma humano. Se incubó plasma convencional sobre las superficies de PS revestidas y no revestidas durante 10 minutos. Se comparan nanogeles mixtos rellenos con minociclina y ticagrelor en una relación 2/3 (NGT60:NGM40) con nanogeles rellenos con los dos fármacos (NGTM). Basal: plasma que no ha estado en contacto con las superficies de ensayo. NC: sin revestimiento. Los datos representan medias ± DE.
Figura 25 - ilustra los resultados de un estudio sobre el ensamblaje de nanogeles de multicapa en la formación de biopelícula de S.aureus.(A) Se dejó que las bacterias se adhirieran a la superficie de PS revestida y no revestida durante 24 h antes de la tinción con violeta cristal. Los datos representan medias ± DE. (B) Se dejó que las bacterias se adhirieran a la superficie de titanio revestida y no revestida durante 24 h antes de la tinción con violeta cristal. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. NC: sin revestimiento; NG: nanogel no relleno que porta PEG 1500; LBL-1,3,5: 1, 3 y 5 capas de una mezcla de nanogeles rellenos con minociclina y ticagrelor en relación 2/3.
Figura 26 - ilustra los resultados de un estudio de ensamblaje de nanogeles de multicapa sobre el efecto antiplaquetas de los nanodepósitos. NC: sin revestimiento; NG: nanogel no relleno que contiene PEG 1500; LBL-1,3,5: 1, 3 y 5 capas de una mezcla de nanogeles cargados con minociclina y ticagrelor en proporción 2/3. Los datos representan medias ± DE.
Figura 27 - muestra que la reticulación de los nanogeles de 5 capas con dopamina mantiene la eficacia antibiótica frente a la formación de biopelículas de S. aureus más allá de 48 h. (A) Las superficies se incubaron dos veces durante 24 h con medio fresco antes de añadir bacterias de S. aureus. La formación de biopelículas se cuantificó mediante tinción con violeta cristal después de 24 h. (B) Efecto anti-biopelícula del medio eli minado después de las segundas 24 h de contacto con las superficies de ensayo. NC: sin revestimiento; NG: nanogel de 5 capas con PEG 1500; NTMV: nanogel de 5 capas con PEG 1500, relleno con ticagrelor, minociclina y vancomicina; D-NTMV: nanogel de 5 capas reticulado con dopamina con PEG 1500, cargado con ticagrelor, minociclina y vancomicina. Los datos representan medias ± DE.
Figura 28 - muestra los resultados de análisisin vivode la eficacia anti-biopelícula de nanodepósitos inmovilizados sobre implantes de titanio. (A) Se implantaron discos de titanio preinfectados con S.aureuspor vía subcutánea en ratones (n = 3) y se dejaron durante 3 horas antes del análisis de bacterias vivas en los implantes mediante recuento de UFC. (B) Análisis de superficie de los implantes mediante SEM (2000 aumentos).
Figura 29 - muestra el espectro de RMN 1H de PEG1.5 con funcionalización terminal de tiol registrado en CDC13 con asignaciones de pico.
Figura 30 - muestra el (A) espectro 1H NMR de (2-(metacriloiloxi)etilfosforilcolina) polimerizada registrada en D20 con asignaciones de pico. (B) Cromatograma de exclusión por tamaño acuoso de cuatro pesos moleculares diferentes de estas polibetaínas.
Figura 31 - muestra el ensayo de actividad LDH de adhesión de plaquetas sobre superficies de poliestireno. Se incubó PRP durante 45 minutos en las superficies revestidas y no revestidas indicadas. NC: sin revestimiento; NG: nanogel de 5 capas con PEG 1500; NTM: nanodepósitos que contienen minociclina y ticagrelor (nanogeles de 5 capas-PEG 1500 en una proporción de 2/3); NTM-APEG1: nanodepósitos que contienen minociclina y ticagrelor (nanogeles de 5 capas-acrilato de PEG 1000 en una proporción de 2/3); NTM-APEG2: nanodepósito que contiene minociclina y ticagrelor (nanogeles de 5 capas-acrilato de PEG 2000 en una proporción de 2/3). Los datos representan medias ± DE.
Figura 32 - muestra la formación de biopelícula de S.aureussobre implantes de titanio revestidos o no revestidos con nanogeles de 5 capas que portan diferentes ligandos con extremos funcionalizados con tiol o vinilo. Se dejó que las bacterias se adhirieran durante 3 horas antes del recuento de UFC. NC: sin revestimiento; NG-PB15: nanogeles de 5 capas con polibetaína de 15 kD como última capa; NG-P1.5, NG-P2: nanogeles de 5 capas con PEG de 1,5 kD o 2 kD como última capa. NG-APEG0.5: nanogeles de 5 capas-acrilato de PEG 500; NG-APEG1: nanogeles de 5 capas-acrilato de PEG 1000. Los datos representan medias ± DE.
Figura 33 - muestra la formación de biopelícula de S.aureusen superficies de PS revestidas o no revestidas con nanogeles de 5 capas que contienen PEG de diferentes pesos moleculares. Se dejó que las bacterias se adhirieran durante 24 h antes de la cuantificación de biopelícula mediante tinción con violeta cristal. Ctrl: sin revestimiento; NG: nanogel de 5 capas sin polímero injertado; NG-P1.5, NG-P2, NG-P5, NG-P10: nanogeles de 5 capas con PEG 1,5 kD, 2 kD, 5 kD, 10 kD como última capa. Los datos representan medias ± DE.
Figura 34 - ilustra los resultados de un estudio del efecto de PEG con extremo de tiol de diferente peso molecular sobre la adhesión de plaquetas bajo flujo usando Impact-R bajo flujo usando Impact-R. Se añadió sangre citrada a los pocillos de PS antes de aplicar 780 rpm durante 4 min. Se determinó la cobertura superficial (SC) y el tamaño de agregado (AS). NC: sin revestimiento; NG: nanogel de 5 capas sin polímero injertado; NG-P1.5, NG-P2, NG-P5, NG-P10: nanogeles de 5 capas con PEG 1,5 kD, 2 kD, 5 kD, 10 kD como última capa. Los datos representan medias ± DE.
Figura 35 - ilustra los resultados de un estudio sobre el efecto de nanogeles de 5 capas que portan tiol de PEG de diferentes pesos moleculares sobre la activación de la fase de contacto de coagulación. Se incubó plasma humano convencional durante 10 minutos a 37 °C antes del análisis del tiempo de coagulación en presencia del reactivo de tiempo de tromboplastina parcial no activada (NaPTT) de Nodia. Se utiliza caolín como control positivo. CTI: inhibidor de tripsina de maíz; NC: sin revestimiento; NG: nanogel de 5 capas sin polímero injertado; NG-P1.5, NG-P2, NG-P5, NG-P10: nanogeles de 5 capas con PEG 1,5 kD, 2 kD, 5 kD, 10 kD como última capa. Los datos representan medias ± DE.
Figura 36 - muestra la formación de biopelícula de S.aureusde Xen-29 en superficies de PS revestidas con nanogeles de 5 capas que contienen o no tiol de PEG o polibetaínas de diferente peso molecular. Se dejó que las bacterias se adhirieran durante 4 h antes de retirar el medio y cuantificar la emisión de fotones, que es directamente proporcional a la adhesión de las bacterias, ya sea inmediatamente (panel superior) o después de 2 h (panel inferior). NC: sin revestimiento; NG: nanogel de 5 capas sin polímero injertado; NG-PB7, NG-PB15, NG-PB44, NG-PB70: nanogeles de 5 capas con polibetaína de 7 kD, 15 kD, 44 kD, 70 kD como última capa; NG-P2: nanogeles de 5 capas con PEG 2 kD como última capa. Los datos representan medias ± DE.
Figura 37 - ilustra los resultados de un estudio del efecto de PEG con extremo de tiol y las polibetaínas sobre la adhesión de plaquetas bajo flujo utilizando Impact-R. Se añadió sangre citrada a los pocillos de PS antes de aplicar 780 rpm durante 4 min. Se determinaron la cobertura superficial (SC) y el tamaño de agregado (AS). NC: sin revestimiento; NG: nanogel de 5 capas sin polímero injertado; NG-PB7, NG-PB15, NG-PB44, NG-PB70: nanogeles de 5 capas con polibetaína de 7 kD, 15 kD, 44 kD, 70 kD como última capa; NG-P2: nanogeles de 5 capas con PEG 2 D como última capa. Los datos representan medias ± DE.
Figura 38 - muestra los resultados de un ensayo pNPP de adhesión de plaquetas sobre superficies de poliestireno. Se incubó PRP durante 45 minutos en las superficies revestidas y no revestidas indicadas. NC: sin revestimiento; NG-PB7, NG-PB15: nanogeles de 5 capas con polibetaína 7 o 15 kD como última capa; NG-P1.5, NG-P5: nanogeles de 5 capas con PEG de 1,5 kD o 5 kD como última capa. NG-APEG0.5: nanogeles de 5 capas-acrilato de PEG 500; NG-APEG1: nanogeles de 5 capas-acrilato de PEG 1000. Los datos representan medias ± DE.
Figura 39 - ilustra los resultados de un estudio sobre el efecto de nanogeles de 5 capas que contienen tiol de PEG o polibetaína de diferente peso molecular sobre la activación de la fase de contacto de coagulación. Se incubó plasma humano convencional durante 10 minutos a 37 °C antes del análisis del tiempo de coagulación en presencia del reactivo de tiempo de tromboplastina parcial no activada (NaPTT) de Nodia. Se utiliza caolín como control positivo. NC: sin revestimiento; NG: nanogel de 5 capas sin polímero injertado; NG-PB7, NG-PB15, NG-PB44: nanogeles de 5 capas con polibetaína de 7 kD, 15 kD, 44 kD como última capa; NG-P1.5, NG-P2, NG-P5: nanogeles de 5 capas con PEG 1,5 kD, 2 kD, 5 kD como última capa. Los datos representan medias ± DE.
Figura 40 - muestra la cuantificación de proteínas plasmáticas adheridas a superficies de poliestireno revestidas y no revestidas después de la incubación de plasma humano convencional durante 10 minutos a 37 °C. NC: sin revestimiento; NG: nanogel de 5 capas sin polímero injertado; NG-PB7, NG-PB15, NG-PB44: nanogeles de 5 capas con polibetaína de 7 kD, 15 kD, 44 kD como última capa; NG-P1.5, NG-P2, NG-P5: nanogeles de 5 capas con PEG 1,5 kD, 2 kD, 5 kD como última capa. Los datos representan medias ± DE.
La invención que ahora se describe de forma general se entenderá más fácilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen simplemente con el fin de ilustrar determinados aspectos y realizaciones de la presente invención, y no pretenden limitar la invención en modo alguno.
Materiales y métodos
Materiales
Reactivos
Los antibióticos ( minociclina, vancomicina) se adquirieron en Sigma, el fármaco antiplaquetas Ticagrelor se adquirió en Cayman Chemicals.
Tubos de extracción de sangre: Los tubos Vacutainer de citrato de sodio (3,2 % de citrato de sodio) eran de BD Biosciences.
Cepas bacterianas y medios de cultivo: S.epidermidis,la cepa RP62A (#35984) era de ATCC; S.aureus, E. faecalisse adquirieron en ATCC (25904 y 29212); las bacterias patógenas bioluminiscentes de S.aureus-xen29eran de Perkin Elmer (#119240). El caldo de soja tríptico (TSB) y el agar en polvo eran de Sigma-Aldrich.
Preparación de muestra
Esterilización de superficies antes de ensayoin vitro:todas las superficies revestidas o no revestidas se esterilizaron en etanol absoluto al 100 % durante 10 minutos, seguido de lavados de incubación de 2 a 5 minutos en agua destilada y un lavado en NaCl al 0,9 %.
Se extrajo sangre de donantes sanos (sin medicación y que no tomaron aspirina u otro fármaco anticoagulante en los últimos 20 días antes de la extracción) con una aguja de 18 g y se dejó fluir directamente en un tubo de polipropileno de 50 mL que contenía citrato de sodio al 3,2 % (1 volumen de citrato por cada 9 volúmenes de sangre) para el ensayo estático o utilizando una aguja de 21 g y tubos vacutainers de citrato para los ensayos dinámicos. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario de Lieja, Bélgica. Los donantes firmaron un consentimiento informado.
Las experimentaciones usando S.aureusse llevaron a cabo en una sala de nivel de bioseguridad 2 del GIGA-R.
Ensayo dinámico in vitro Impact-R
La sangre se dejó reposar en el tubo durante 45 minutos antes de cualquier procesado en el sistema Impact-R del dispositivo de cono y placa (Matis Medical). A continuación se mezcló la sangre a 10 rpm durante 1 min a temperatura ambiente antes de la aplicación de tensión de cizalladura. Para cada ensayo se depositaron cuidadosamente 130 pL de sangre en el pocillo. La tensión de cizalladura aplicada fue de 1800 s-1 durante 4 min (correspondiente a una velocidad de campana de 780 rpm): esta velocidad y el tiempo de incubación simula el flujo sanguíneo arterial laminar sobre una superficie de poliestireno y es útil para analizar la función de plaquetas bajo tensión de cizalladura.
Después de la aplicación de tensión de cizalladura durante 4 minutos, Cell Dyn recogió y analizó la sangre para determinar el recuento de plaquetas individuales, mientras que los pocillos de PS revestidos o no revestidos se lavaron suavemente con agua destilada 4 veces y se tiñeron con disolución de tinción de May-Grünwald durante 1 minuto a temperatura ambiente. Las plaquetas que se adhirieron a la superficie se visualizaron con un microscopio óptico y se cuantificaron utilizando el software Impact-R. Se obtuvieron dos parámetros a partir del análisis de (i) cobertura superficial (% de SC) y (ii) el tamaño agregado de las plaquetas (AS pm). Se repitió cada condición por duplicado para cada donante.
Ensayo estáticoin vitro
La adhesión de plaquetas a las superficies se analizó mediante uno de los siguientes ensayos fotométricos: ensayo LDH (ensayo de lactato deshidrogenasa) y ensayo de fosfato de p-nitrofenilo (pNPP). Los valores obtenidos de ambos ensayos son directamente proporcionales al número de plaquetas adheridas a la superficie. Se analiza indirectamente LDH liberada tras la lisis de plaquetas midiendo la conversión de NAD en NADH, detectada a 450 nm. El ensayo pNPP mide los niveles de fosfatasas alcalinas y ácidas liberadas tras la lisis de plaquetas. La hidrólisis de pNPP, un sustrato de estas fosfatasas, produce p-nitrofenol, que tiene una absorbancia máxima a 405 nm y es proporcional a la cantidad de plaquetas unidas a la superficie.
Se colocó plasma pobre en plaquetas (PPP) o plasma rico en plaquetas (PRP) sobre superficies revestidas de poliestireno durante 45 minutos a 37 °C. Las superficies se lavaron 3 veces con NaCl al 0,9 %. La lisis de plaquetas adheridas se logró añadiendo Triton al 1 % en PBS para el ensayo de LDH, o en Triton al 1 % en un tampón de citrato de sodio (citrato 0,05 M, pH 5,4) que contenía pNPP SmM para el ensayo de pNPP. Las lecturas de fondo de la incubación de PPP se restaron de las lecturas de PRP.
Ensayos de agregación plaquetaria
El plasma rico en plaquetas (PRP) se preparó mediante centrifugación de sangre humana anticoagulada con citrato a 100 xg durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los experimentos de agregación de plaquetas se llevaron a cabo en alícuotas de PRP con agitación (1200 rpm) a 37 °C utilizando agregometría con luz (agregómetro Chrono-Log Modelo 700, Kordia).
Interacción plasma-biomaterial: ensayo de coagulación y adhesión de proteínas plasmáticas
Los ensayos de coagulación se llevaron a cabo utilizando el analizador de hemostasis Stago STart.® 4 y reactivo de tiempo de tromboplastina parcial no activada (NaPTT) de Nodia. El reactivo NaPTT es un sustituto de plaquetas de fosfolípidos sintéticos destinado al estudio de activación de fase de contacto de coagulación. El analizador Stago es un sistema semiautomático integrado con un método electromecánico de detección de coágulos (sistema de detección basado en viscosidad). La formación de coágulos en plasma humano convencional citratado (Stago) se cataliza mediante la adición de iones Ca2+ y también por fosfolípidos. Se utilizó caolín como control positivo para la activación de la fase de contacto, mientras que se utilizó el inhibidor de tripsina de maíz (CTI), un inhibidor específico del factor XIIa, que es el factor que inicia la vía de activación de contacto, para determinar el tiempo de coagulación independientemente de este mecanismo. Se descongeló plasma humano convencional en un baño de agua a 37 °C y se añadió a pocillos de poliestireno (PS) revestidos y no revestidos durante 10 minutos a 37 °C sin agitación. A continuación se congeló rápidamente el plasma en un baño de hielo seco/acetona (-78 °C) y se almacenó a -80 °C hasta su análisis. El día del ensayo, el plasma se descongeló a 37 °C y se procesó inmediatamente en el aparato Stago STart.® 4. El reactivo de Nodia precalentado a 37 °C se añadió a 100 pl de plasma precalentado en una cubeta que contenía una perla metálica revestida antes de iniciar la coagulación mediante adición de una disolución de calcio precalentada (8,3 mM). El punto final de la coagulación se mide mediante el movimiento pendular de la perla alimentado por un campo electromagnético. Dicho movimiento, que está influenciado por la viscosidad del plasma, se detiene cuando la viscosidad llega al máximo, es decir, cuando se produce la coagulación de plasma.
La adherencia de las proteínas se midió utilizando el ensayo Pierce Micro BCA (ácido bicincónico), un método altamente sensible que detecta hasta 5 ng/mL de proteína. El ácido bicincónico se une a los iones Cu+ con una estequiometría 2:1 que proporciona elevada sensibilidad. El ensayo se basa en la conversión de iones Cu2+ en Cu+ por proteínas en el ambiente básico. Se añadieron 120 pl de plasma (plasma convencional Stago) precalentado a 37 °C en pocillos revestidos y no revestidos de una placa de poliestireno (PS) de 48 pocillos (pocillos de 11 mm de diámetro) y se incubaron durante 10 minutos a 37 °C. Después de 3 lavados con NaCl al 0,9 %, las proteínas adheridas se separaron añadiendo 250 pl de una disolución de SDS al 1 % en PBS durante 10 min a temperatura ambiente. La disolución de proteína sin diluir se usó en el ensayo Micro BCA.
Análisis de adhesión bacteriana y formación de biopelículas
Se cultivó una colonia de S.epidermidiso S.aureusoE. faecalisO/N a 37 °C en medio TSB bajo agitación (220rpm), al día siguiente se llevó a cabo una dilución 1:100 en medio TSB fresco y la suspensión se cultivó durante 4 horas hasta alcanzar la fase logarítmica (OD595=0,5). A continuación, las bacterias se diluyeron 1/20 en NaCl estéril al 0,9 % para tener alrededor de 200.000 ufc/pl y se incubaron 500 pl en condiciones estáticas o dinámicas durante 24 horas a 37 °C en placas de 24 pocillos de poliestireno revestidas o no revestidas. Las suspensiones de bacterias se analizaron mediante placas de agar y recuento de UFC (unidades de formación de colonias), mientras que las biopelículas se analizaron mediante tinción con violeta cristal. La superficie se lavó primero 3 veces con NaCl al 0,85 % para eli minar las bacterias planctónicas y a continuación se tiñó con cristal violeta al 1 % durante 40 minutos. Después de 3 lavados con agua, el colorante de violeta cristal retenido en las bacterias se liberó usando ácido acético al 10 % durante 10 minutos. Las intensidades se midieron a 595 nm en una placa de 96 pocillos utilizando un lector de placas espectrofotómetro. Las condiciones estaban por duplicado y las lecturas por triplicado. También se evaluó la cinética de adhesión de bacterias y formación de biopelícula en superficies mediante el uso de bacterias S.aureuscon el sistema IVIS Lu mina (Perkin Elmer). Se dejó que las bacterias se adhirieran durante 3 horas antes de lavar los pocillos y posteriormente se registraron las señales de luminiscencia, directamente proporcionales a la densidad de las bacterias, durante tiempos crecientes. Se tomaron imágenes de las biopelículas utilizando el sistema de cámara IVIS. Se cuantificó la emisión total de fotones de los pocillos seleccionados utilizando el paquete de software LivingImage.
Modelo de ratón de infección asociada a biomateriales: implantación subcutánea de un dispositivo de titanio preinfectado y formación de biopelículasin vivo
Se cultivóStaphylococcus aureusdurante 2 h a 37 ° C en medio TSB para alcanzar la fase logarítmica. Las bacterias se diluyeron 1:10000 en TSB suplementado con NaCl al 2 % glucosa al 1 % y se colocó una alícuota de 800 gl (correspondiente a 20000 UFC/disco) sobre discos de titanio de 0,2 cm de diámetro (Biotronik). Se dejó que las bacterias se adhirieran a todos los discos durante 3 h a 37 °C en condiciones estáticas. Se eli minó la suspensión de bacterias y la superficie se lavó suavemente 3 veces en PBS. Para determinar la cantidad de bacterias que se adhirieron a los discos de titanio, la mitad de los discos se sometieron a tratamiento de ultrasonidos durante 5 minutos en un dispositivo de ultrasonidos de baño de agua Fisher. Las bacterias desprendidas se sembraron en una placa de agar TSB para determinar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por disco antes de la implantación. La otra mitad de los discos se implantó en ratones BALB/cJRj macho de 8 semanas de edad (Janvier Laboratories) de la siguiente manera. Dos horas antes de la anestesia, se inyectó a los ratones por vía subcutánea 0,05 mg/kg de analgésico de buprenorfina (Temgesic). Quince minutos antes de la implantación, los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de cetamina (125 mg/kg)/xilazina (12,5 mg/kg). Los ratones se afeitaron en la parte ventral inferior debajo de la caja torácica y el área se esterilizó con betadina seguido de una disolución de etanol al 70 %. Con un bisturí esterilizado se realizó una incisión en la piel y se insertaron discos infectados o no infectados con S.aureusentre la piel y los músculos. Después de 4 h de incubación, los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical y los dispositivos se analizaron para determinar UFC/disco (mediante tratamiento con ultrasonidos, como se ha descrito con anterioridad). El protocolo fue aprobado por el comité de ética de la Universidad ULiege (# 16-1774). Se tomaron imágenes SEM de discos de titanio explantados con el microscopio Quanta (4000 aumentos). Los discos de titanio se lavaron suavemente y se fijaron en glutaraldehído 2,5 en tampón Sorensen durante 1 hora a 4 °C, seguido de 3 lavados en tampón Sorensen y fijación en OsO4 al 2 % durante 1 hora a 4 °C. Los discos se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol, se secaron bajo atmósfera de CO2 (secado en punto crítico) para mantener las estructuras biológicas y a continuación metalizarlas.
Resultados y discusión
Ejemplos
Ejemplo 1. Preparación de nanogel reticulado y relleno con moléculas bioactivas.
Se diseñó específicamente un homopolímero de metacrilamida que contenía 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (P (mDOPA), 1, Figura 1) para preparar nanogeles e inmovilizar (bio)moléculas activas mediante atrapamiento físico o conjugación covalente. Los nanogeles reactivos reticulados se pueden depositar directamente sobre una superficie previamente revestidas con una capa de polidopamina bioinspirada. Esta estrategia tiene varias ventajas con respecto a los métodos existentes: i) no se utiliza un agente de reticulación externo, ii) las reacciones de acoplamiento son rápidas a temperatura ambiente en agua, iii) no se forman ni liberan productos secundarios indeseados fuera de la película, y iv) las biomoléculas activas se pueden injertar covalentemente en la superficie.
Se utilizó un proceso de reticulación rápido y basado en agua para explotar las propiedades redox de las moléculas de DOPA con el fin de proporcionar una función reactiva disponible para la formación de nanogeles y para su funcionalización.
Se prepararon disoluciones estables de nanogeles en agua controlando adecuadamente tanto el estado redox del polímero P (mDOPA) como el pH de las disoluciones de PAH. Las condiciones de preparación son cruciales para el éxito de la formación del nanogel. Primero, se oxida P (mDOPA) en medio acuoso en condiciones básicas durante 12 horas para formar Pox (mDOPA) hidrosoluble. Los restos DOPA oxidados de Pox(mDOPA) son necesarios para la interacción covalente de PAH a través de la reacción de amina/quinona y/o la formación de bases de Schiff a temperatura ambiente y, en consecuencia, para la preparación de nanogel reticulado estable (Figura 2).
La formación de nanogeles Pox(mDOPA)/PAH se llevó a cabo primero mediante la adición lenta de una disolución de PAH a una disolución acuosa de Pox(mDOPA) a temperatura ambiente. Se controlaron las relaciones de peso y los modos de adición de los dos socios para formar dispersiones estables de nanogeles (Pox(mDOPA)/PAH). Para ello, la lenta adición de PAH a una disolución acuosa de Pox (mDOPA) tuvo como resultado la formación espontánea de una disolución estable y transparente de color marrón claro de nanogeles reticulados a temperatura ambiente. La presencia de nanogeles se confirmó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) realizada después de la liofilización que mostró nanogeles con un diámetro que oscilaba entre 100 y 200 nm (Figura 3b). Es importante tener en cuenta que la disolución de nanogeles se tuvo que liofilizar en la rejilla TEM antes del análisis. Si la disolución simplemente se dejaba caer sobre la rejilla y se secaba lentamente a temperatura ambiente en condiciones atmosféricas, los nanogeles experimentaban agregación intensa (Figura 3a).
El análisis por dispersión dinámica de luz (DLS) sin filtración mostró una aglomeración de nanogeles con un diámetro hidrodinámico promedio igual a 130 nm con una polidispersidad bastante alta (PDI = 0,2) (Figura 4). Las disoluciones de nanogel fueron estables durante al menos un mes cuando se almacenaron a temperatura ambiente y a un pH de alrededor de 10 sin agitación. La disolución permaneció transparente sin precipitación y la distribución de diámetro hidrodinámico obtenida por DLS permaneció casi sin cambios después de un mes de almacenamiento.
Se exploró más a fondo la capacidad de los nanogeles para el relleno y administración de múltiples fármacos. Se incorporaron diferentes agentes bioactivos mediante la combinación de conjugación covalente, interacciones electrostáticas e hidrófobas, así como la formación de enlaces de hidrógeno. La conjugación covalente se llevó a cabo aprovechando la reactividad de los grupos quinona de Pox (mDOPA) hacia la función de amina. Para ello, para la conjugación se utilizó vancomicina (V), un antibiótico de glucopeptídico que contiene amina primaria en su secuencia, y para la incorporación se empleó atrapamiento físico de minociclina (M), un antibiótico de tipo tetraciclina, y ticagrelor (T), un agente antiplaquetas con propiedades antitrombóticas.
Luego se prepararon Pox(mDOPA)-VMT/PAH) de manera similar mediante adición de una disolución de PAH a una disolución acuosa de Pox(mDOPA) rellena con VMT, lo que dio como resultado la apariencia de una suspensión de color amarillo-marrón. La medición de DLS sin filtración evidenció la presencia de nanogeles con un diámetro hidrodinámico promedio de 200 nm ligeramente superior al anterior debido probablemente a la presencia de (bio)moléculas VMT (Figura 5).
Todas las etapas sintéticas se llevan a cabo en condiciones suaves y en medios acuosos, lo que hace que las vías de síntesis de los componentes básicos sean relevantes para el desarrollo de un proceso seguro para el medio ambiente.
Oxidación de P (mDOPA) en medio básico: La oxidación se llevó a cabo según un estudio previo (Faure y col., Biofouling 2012: 28(7):719-28). Se disolvieron P(mDOPA) (20 mg) en agua destilada (20 mL) y se añadió lentamente una disolución de NaOH (0,1 M) para elevar el pH por encima de 10. Esta etapa de oxidación duró al menos una noche al aire.
La preparación de nanogeles reticulados de Pox (mDOPA)/PAH fue la siguiente:
Preparación de nanogel: Se disolvió P(mDOPA) (2,5 mg) en agua destilada (5 mL) y se añadió lentamente NaOH (0,1 M) para elevar el pH por encima de 10 y favorecer la oxidación de los grupos catecol de P(mDOPA). Después de una noche a temperatura ambiente, se añadió lentamente una disolución acuosa de PAH (0,5 mL; 0,5 g/L) a pH 10 a la disolución de Pox (mDOPA) con agitación intensa. La disolución se hizo reaccionar durante una hora a temperatura ambiente con agitación intensa. Los nanogeles con diámetro que oscilaba entre 150 nm y 250 nm se observaron mediante DLS.
Preparación de antibióticos en nanogel (ABT): El procedimiento es idéntico al descrito anteriormente, excepto que Pox (mDOPA) se disolvió en presencia de ABTs ( minociclina y vancomicina) para aumentar la interacción entre las cadenas poliméricas y los fármacos. Después de 1 hora a 6 °C, se añadió lentamente una disolución acuosa de PAH (0,5 mL; 0,5 g/L) a pH 10 a la disolución de Pox (mDOPA) con agitación intensa. La disolución se hizo reaccionar durante una noche a 6 °C con agitación intensa antes de la deposición del nanogel. La concentración final de los ABT en la disolución de nanogeles fue de 0,5 mg/mL.
Preparación de Nanogel Ticagrelor (T): El procedimiento es idéntico al descrito anteriormente excepto que se disolvió Pox(mDOPA) en presencia de 1 mL de disolución de ticagrelor (1 mg/mL en DMSO) para aumentar la interacción entre las cadenas poliméricas y los fármacos. Después de 1 hora a 6 °C, se añadió lentamente una disolución acuosa de PAH (0,5 mL; 0,5 g/L) a pH 10 a la disolución de Pox(mDOPA)/T con agitación intensa. La disolución se hizo reaccionar durante una noche a 6 °C con agitación intensa antes de la deposición del nanogel.
Ejemplo 2. Inmovilización de nanogel sobre sustrato de titanio mediante revestimiento de polidopamina
Una primera estrategia consistió en una primera inmersión del sustrato en una disolución tampón Tris de DOPA para anclar fuertemente la primera capa a la superficie mediante interacciones DOPA/metal (Figura 6). A continuación, las siguientes capas se construyeron mediante inmersión sucesiva de la superficie en una disolución acuosa de un polímero que contenía aminas primarias, polialilamina (PAH), y a continuación en una disolución de un nanogel basada en P(mDOPA). Se usaron poli(metacrilamida) que portaba restos de DOPA oxidados en cada unidad monomérica (Figura 1, fórmula (2)). Se utilizaron (Pox(mDOPA)) en combinación con PAH para preparar disoluciones estables de nanogeles en agua a temperatura ambiente que se podían depositar fácilmente en la superficie de titanio (Ti).
Revestimiento de polidopamina
Se ha utilizado polidopamina (PDOPA) para modificar superficies bioinertes porque se puede adherir a diversas superficies de materiales. Las moléculas de dopamina tienen un motivo 3,4-dihidroxi-1 -fenilalanina-lisina, que se puede polimerizar para formar capas de PDOPA sobre superficies de materiales en condiciones suaves. La incorporación de PDOPA como películas de imprimación proporciona una ruta alternativa para funcionalizar esos biomateriales con superficies no incrustantes y puede mejorar aún más sus propiedades biológicas, químicas y terapéuticas deseables para aplicaciones biomédicas.
Se disolvió dopamina (2 mg/mL) en Tris-HCl 10 mM (pH 8,5) y los sustratos se sumergieron en la disolución. La oxidación inducida por pH cambia el color de la disolución a marrón oscuro, lo que tiene como resultado la deposición espontánea de una fina película polimérica adherente (Figura 7). Para evitar la deposición de micropartículas, se puede utilizar una concentración de dopamina más baja, 0,125 mg/mL, y/o fue necesaria una orientación vertical de la muestra. Las superficies revestidas se enjuagaron con agua ultrapura y se secaron con gas N2 antes del almacenamiento o se trataron como se describe a continuación para la formación de capa relativa.
Monocapa de PAH autoensamblada asistida por polidopamina
Después de la modificación de la superficie de titanio usando PDOPA como primera capa, tiene lugar el injerto covalente de PAH mediante una reacción de amina/quinona y/o la formación de una base de Schiff a temperatura ambiente y, por consiguiente, para la reticulación entre capas (Esquema 1). Es importante destacar que la siguiente disolución de PAH se depositó a un pH mayor que 10 para obtener el polímero en estado desprotonado. De este modo fue posible la reacción entre aminas primarias y los grupos quinona de Pox (mDOPA). En medios ácidos, los grupos amina estaban protonados y no reaccionaban con Pox (mDOPA), de modo que no se puede producir reticulación ni crecimiento de la película. Para la formación de la capa relativa de PAH, se disolvió 1 mg/mL de disolución de PAH en agua ultrapura que se equilibró a un pH mayor que 10 mediante adición de una disolución de NaOH 0,1 M. A continuación se sumergieron los sustratos revestidos con polidopamina en la disolución. Después de 4 horas o más (normalmente reacción durante la noche durante 18 horas), los sustratos se enjuagaron con agua ultrapura.
Los ángulos de contacto se midieron sobre una superficie de titanio seca después de dejar caer 10 pl de agua ultrapura. Los ángulos de contacto estático en las superficies de titanio puro y de titanio revestidas con polidopamina fueron 85°±2° y 47±6°, respectivamente, lo que demuestra la modificación de la superficie.
Ensamblaje de nanogel
El injerto covalente de nanogeles se llevó a cabo mediante la misma reacción y/o formación de bases de Schiff entre las aminas primarias de la monocapa de PAH y los grupos quinona de Pox (mDOPA) en el nanogel. A continuación, se incubó la superficie revestida por una capa de PDOPA y una capa de PAH con las disoluciones acuosas de los nanogeles Pox(mDOPA)/PAH siguiendo el protocolo que se describe a continuación. Los ángulos de contacto se midieron sobre una superficie de titanio modificada con PAH y nanogel. El ángulo de contacto del PAH fue de aproximadamente 65°; su amplitud fue mayor que la medida en una superficie revestida con polidopamina, probablemente debido a la presencia de un grupo amina no polar. Después de la deposición de nanogel que presenta los mismos grupos catecol que la polidopamina, el ángulo de contacto disminuyó a aproximadamente 42°.
Monocapa de injerto de PEG
El poli(etilenglicol) (PEG) es uno de los polímeros sintéticos más utilizados para conferir resistencia proteica a una superficie. En la bibliografía se pueden encontrar diversas estrategias para modificar sustratos con ese tipo de polímeros, tales como electroinjerto, monocapas autoensambladas (SAM) y adsorción de copolímeros, por citar solo algunas. El injerto de PEG se llevó a cabo aprovechando la reactividad de los grupos quinona de Pox (mDOPA) frente a tioles. Para ello, se consideró PEG con función terminal de tiol (PEG-SH) para la conjugación. Esta estrategia basada en tiol permite injertos específicos en condiciones suaves y sin restricción de pH, en contraste con la estrategia basada en amino que requiere pH > 10. Para injertos de PEG, se disolvieron 5 mg/mL de metoxi-poli(etilenglicol)-tiol (mPEG-SH, 1,5 kDa) en Tris 10 mM, pH 8,0. El tampón utilizado para mPEG-SH se desgasificó a vacío durante aproximadamente 1 hora para evitar la oxidación (-S-S-) entre grupos tiol. Se hizo reaccionar PEG en la capa de PDOPA (capa de nanogel) mediante adición de tipo Michael y reacciones de base de Schiff para inhibir las interacciones no específicas y aumentar la naturaleza hidrófila en condiciones fisiológicas. Los ángulos de contacto con agua verificaron el anclaje de cadenas de PEO a superficies de Ti modificadas. Sorprendentemente, se encontró una capa de PEO que presentaba un ángulo de contacto de 43°±1.
Brevemente, la deposición de nanogel utilizando PDOPA como primera capa se llevó a cabo a temperatura ambiente en cinco etapas:
Etapa 1: Se sometieron a tratamiento de ultrasonidos discos de Ti (1 cm de diámetro) en tetrahidrofurano (THF), acetona, etanol y agua, 10 minutos en cada etapa.
Etapa 2: El Ti se sumergió inmediatamente en la disolución tampón DOPA Tris (0,125 g l-1) durante 18h.
Etapa 3: Después de enjuagar dos veces con un poco de agua, los sustratos modificados se sumergieron en una disolución de PAH (pH>10) durante 18 h y se enjuagaron dos veces con un poco de agua.
Etapa 4: Después de enjuagar dos veces con 5 mL de agua, los sustratos modificados se sumergieron en una disolución de nanogeles (rellenos con ABT y T) durante 18 h y se enjuagaron dos veces con 5 mL de agua.
Etapa 5: Después de enjuagar dos veces con 5 mL de agua, los sustratos modificados se sumergieron en una disolución de PEG-SH durante 1 hora y se enjuagaron dos veces con 5 mL de agua.
La morfología de la superficie es un parámetro importante para los dispositivos biomédicos que puede afectar la energía de la interfaz y también la interacción entre los biocomponentes y las superficies del material. Para obtener más información y comprender las microestructuras de las superficies de Ti revestidas con nanogel, se llevaron a cabo observaciones de microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (SEM) (Figura 8). La superficie de Ti con pristina exhibió una morfología relativamente suave (paneles de la izquierda). Por el contrario, después de la deposición de nanogeles, se observaron numerosos nanogeles bien distribuidos, con tamaños que oscilaban entre 80 nm y 120 nm (paneles de la derecha). Los resultados indicaron que el tamaño de los nanogeles depositados corrobora los tamaños de los nanogeles medidos por TEM en disolución (Figura 2b).
Ensamblaje capa a capa (LbL)
La deposición de LbL se llevó a cabo en las mismas condiciones, utilizando un procedimiento similar al descrito anteriormente excepto que las etapas 2 a 4 se repitieron cinco veces para obtener cinco capas.
Microbalanza de cristal de cuarzo
Como primera evidencia de la acumulación de la película de multicapa, se utilizó una microbalanza de cristal de cuarzo acoplada con disipación (QCM-D) para seguir el crecimiento de película en tiempo real en sensores de oro midiendo la variación de la frecuencia resonante (Af) frente a tiempo. Una disminución en Af indica deposición de polímero. La Figura 9 muestra que todos los componentes se depositaron exitosamente según el protocolo de deposición seleccionado y las condiciones redox/pH y permanecen en el sustrato incluso después de enjuagar con agua.
En primer lugar, se hizo fluir una disolución tampón tris de DOPA (0,125 g/L) a través de la celda a temperatura ambiente, lo que condujo a la primera capa de anclaje. El cambio f continuó disminuyendo, hasta que se enjuagó DOPA de la cámara de muestra. En segundo lugar, se inyectó una disolución de PAH (pH>10), lo que provocó un cambio negativo inmediato que indica un aumento de masa en la interfaz, a medida que el polímero se adsorbe en la superficie de oro. Después de eli minar el exceso de polímero no unido mediante enjuague con agua, se alcanzó una línea base estable durante la etapa de enjuague, lo que demuestra que la capa relativa polimérica se adhirió fuertemente a la superficie. Una vez que se eli minó el polímero adsorbido de forma reversible en la etapa de enjuague, se introdujo una disolución de nanogel en agua mili-Q (pH ~10) en la cámara del sensor, al mismo caudal y temperatura. La deposición de la disolución de nanogel se observó por la importante disminución de la frecuencia de vibración. Es importante destacar que esta capa de nanogeles fue estable, ya que no se puede eli minar después de enjuagar con agua. En la última etapa, se puede apreciar el polímero unido de manera irreversible a partir de Af bruto después de la inyección de la disolución de PEG-SH, debido a la reacción de la función tiol con los grupos de quinona residuales presentes en los nanogeles (Figura 9).
Ejemplo 3. Inmovilización directa de nanogel sobre sustrato de titanio
En un segundo enfoque, se sumergió directamente la superficie de titanio en la disolución de nanogel para obtener una superficie modificada con nanogel sin necesidad de un revestimiento de imprimación. En este caso, el mecanismo de ensamblaje se basa en la propiedad adhesiva de catecol y el grupo quinona presentes en la superficie del nanogel (Figura 10).
Mediante análisis SEM, se observó la formación de una monocapa de nanogeles Pox(mDOPA)/PAH sobre Ti (Figura 11). Se encontró que los diámetros estimados de los nanogeles variaban entre 80 nm y 120 nm.
Ejemplo 4: Inmovilización de nanogeles sobre bioprótesis de válvula
Se utilizó el mismo enfoque descrito anteriormente para modificar una válvula biológica. Respetando las mismas etapas, las válvulas biológicas se sumergieron primero en una disolución tampón Tris de DOPA (Tris-HCl 10 mM (pH 8,5)) para anclar fuertemente la primera capa de polidopamina. El implante adquirió un color marrón oscuro como resultado del depósito de una fina película adherente de PDOPA (Figura 12).
A continuación, se construyeron las siguientes capas mediante inmersión sucesiva de la válvula en una disolución acuosa de polialilamina (PAH) y posteriormente en una disolución de nanogel basado en P(mDOPA).
Se llevaron a cabo las siguientes etapas a temperatura ambiente:
Etapa 1: Se sumergieron discos biológicos (1 cm de diámetro) tres veces en 10 mL de agua, durante 10 min.
Etapa 2: Los discos biológicos se sumergieron inmediatamente en la disolución tampón DOPA Tris (0,125 g l-1) durante 18 h.
Etapa 3: Después de enjuagar dos veces con 5 mL de agua, el tejido modificado se sumergió en una disolución de PAH (pH>10) durante 18 h y se enjuagó dos veces con 5 mL de agua.
Etapa 4: Después de enjuagar dos veces con 5 mL de agua, el tejido modificado se sumergió en una disolución de nanogel durante 18 h y se enjuagó dos veces con 5 mL de agua.
Etapa 5: Después de enjuagar dos veces con 5 mL de agua, el tejido modificado se sumergió en una disolución de PEG-SH durante 1 h y se enjuagó dos veces con 5mL de agua.
Se utilizó microscopía electrónica de barrido SEM para analizar la morfología de superficie del tejido biológico modificado. Se observó que la superficie del tejido biológico antes de la modificación exhibía nanofibras de colágeno relativamente lisas y ordenadas. Después de la deposición de nanogel, las fibras de colágeno aparecieron más compactas (Figura 13) y se observaron nanogeles bien distribuidos en la superficie de las fibras de colágeno (Figura 14). El revestimiento de imprimación PDOPA aumentó la deposición de nanogel.
Se hizo un seguimiento en tiempo real de los crecimientos de película (PDOPA y nanogeles) utilizando una microbalanza de cristal de cuarzo junto con una técnica de disipación (QCM-D). En este estudio se utilizó un Q-Sense E4. El resonador AT-cut revestido de acero inoxidable (frecuencia fundamental: 5 MHz) se utilizó tal como se recibió. En primer lugar, se introdujo agua destilada en la celda y se mantuvo el flujo hasta obtener una línea base estable. Luego se inició la deposición de LbL modificando el líquido expuesto al cristal de agua destilada a la disolución de DOPA 0,125 g l-1 con NaCl 0,15 M a un caudal de 200 pl min -1, temperatura de 25 °C. Después de 10 minutos, el sustrato se enjuagó con agua destilada para eli minar el exceso de DOPA libre. A continuación, se llevó a cabo la deposición alternativa de HAP (1 g l -1) y disoluciones de nanogeles (aproximadamente 10 min para cada etapa) con etapas de enjuague con agua destilada entre cada capa. Finalmente se introdujo la disolución de PEG-SH en el sistema como última capa y se enjuagó aún más cuando se obtuvo una señal estable.
Se utilizó un analizador de partículas Delsa Nano-C (Beckman Coulter) equipado con una fuente de diodo láser (longitud de onda 658 nm; potencia 30 mW) para medir el diámetro hidrodinámico de las disoluciones acuosas de nanogeles. Se recogieron datos de dispersión para al menos 50 mediciones individuales con un ángulo de dispersión constante y se promediaron para cada muestra. Los datos de dispersión obtenidos se ajustaron mediante un análisis acumulado ponderado por volumen para estimar el coeficiente de difusión de los nanogeles en disolución. El diámetro hidrodinámico de las muestras (DH) se obtuvo mediante la relación de Stokes-Einstein.
Las muestras para microscopía electrónica de barrido (SEM) se analizaron mediante un microscopio electrónico de barrido con pistola de emisión de campo (FEG-SEM). Se utilizó MEB ULTRA55 que funcionaba a 3 kV para la observación de muestras después de una capa delgada (10 nm) de Au-Pd para aumentar el contraste.
Síntesis de éster metílico de N-metacriloil 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina
Se añadió clorhidrato de éster metílico de DOPA (9 g, 0,0363 mol) en CH2Cl2 seco (350 mL) a un matraz de fondo redondo de dos bocas equipado con embudo de adición y agitador magnético, y se colocó bajo nitrógeno. Luego se añadió Et3N recién destilado (17,7 mL, 0,127 mol) y el matraz se enfrió a 0 °C. Se añadió gota a gota una disolución de cloruro de metacriloilo (3,51 mL, 0,0363 mol) en CH2Cl2 (70 mL) a través de un embudo de adición con agitación intensa en atmósfera de nitrógeno. La mezcla final se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 48 h. Después de la reacción, se retiró el cloruro de trietilamonio, formado como subproducto, mediante filtración y el exceso de reactivos se retiró a presión reducida. El producto se recuperó en forma de un sólido pegajoso con un rendimiento de 90 %.
Síntesis de P(mDOPA)
Antes de la polimerización, se debe proteger el grupo catecol de mDOPA para evitar reacciones secundarias durante la polimerización por radicales de sus grupos -OH. Se colocaron 2 g de mDOPA con grupos catecol protegidos (véase más abajo la etapa de protección) (2,6 mmol) bajo nitrógeno en un matraz de fondo redondo de una boca equipado con agitador magnético. Al mismo tiempo, se disolvieron 19 mg (0,067 mmol) de iniciador V501 en 7 mL de agua destilada. La disolución de pH se ajustó por encima de 9 con Na2CO3 hasta la completa disolución del polvo blanco. A continuación se desgasificó la disolución burbujeando nitrógeno a través de ella durante 15 minutos. Posteriormente, se transfirieron las disoluciones acuosas de iniciador V501 con un capilar bajo nitrógeno en el matraz de vidrio que contenía mDOPA protegida. El reactor se calentó en un baño de aceite termostatizado a 70 °C durante 24 horas. A continuación, los grupos catecol se desprotegieron ajustando el pH alrededor de 2 con HCl concentrado. La mezcla resultante se sometió a diálisis (porosidad de membrana 1000 Da) frente a agua durante 48 horas, seguido de liofilización. El copolímero se recuperó en forma de un polvo blanco con un rendimiento de 88 %.
Síntesis de a-metoxi-(w-mercapto-poli(óxido de etileno) (MPEG-SH)
Se sintetizó a-metoxi-x-mercapto-poli(óxido de etileno) (MPEG-SH) mediante esterificación del grupo terminal hidroxilo de monometoxi poli(óxido de etileno) (MPEG-OH) (Mn = 1500 g/mol) con ácido mercaptoacético. Se llevó a cabo una reacción típica como se muestra a continuación. Se añadió MPEG-OH (10 g; 5 mmol) a un matraz de dos bocas de 100 mL equipado con agitador y dispositivo Dean-Stark. El MPEG-OH se secó mediante tres destilaciones azeotrópicas con tolueno y finalmente se disolvió en 50 mL de tolueno. A continuación se añadieron ácido mercaptoacético (3,5 mL, 50 mmol) y ácido sulfúrico concentrado (dos gotas). El matraz se calentó en un baño de aceite a 110 °C durante la noche. MPEG-SH se recogió mediante precipitación en éter a 0 °C y a continuación se secó a 40 °C a vacío durante 24 h.
Ejemplo 5: Propiedades antitrombóticas de nanogeles bioactivos
Ensayo dinámico de Impact-R
Para estudiar la interacción sangre-material en condiciones dinámicas, se utilizó el aparato Impact-R. Esta es un sistemain vitrocasi fisiológico que imita el flujo laminar de la sangre en circulación y se utiliza para estudiar la función de las plaquetas y la formación de trombos bajo flujo. El flujo laminar creado por la rotación a velocidad constante de un pistón (la campana y el cono) sobre una fina capa de sangre depositada en un pocilio, activa las plaquetas por esfuerzo de cizalladura, las plaquetas se adhieren a la superficie de poliestireno del pocillo y a continuación se tiñen con Tinción de May-Grünwald. El sistema permite variar la velocidad: cuanto mayor es la velocidad, lo que corresponde a una mayor frecuencia cardíaca, más trombos se forman en la superficie.
Mediante la inspección de la superficie de poliestireno al microscopio óptico y mediante análisis de imágenes, es posible obtener dos parámetros: el porcentaje de superficie cubierta por agregados de plaquetas (SC, %), y el tamaño promedio de los agregados (trombos) (AS, pm2).
El ensayo se llevó a cabo con sangre citratada de donantes sanos. La SC y AS obtenidas fueron proporcionales a la velocidad de rotación del cono en un radio de pocillo específico (la velocidad aumenta con el radio).
Se sometió a ensayo el efecto de diferentes revestimientos poliméricos en diferentes momentos (Figura 15). Los polímeros (PEG y PEG reticulado, APEG) se unieron covalentemente a una fina capa de polidopamina, DOPA, que también se sometió a ensayo sola y que tuvo un ligero, pero no significativo, efecto sobre la reducción de la activación y adherencia de plaquetas. Al aumentar el tiempo de tensión de cizalladura aplicada a la sangre, los dos parámetros SC y AS aumentaron de forma significativa. Se encontró una diferencia significativa en todos los momentos entre la superficie no revestida (NC) y revestida con PEG para los parámetros SC y AS.
A continuación se sometieron a ensayo los siguientes revestimientos, polidopamina (DOPA), DOPA-PEG (PEG), DOPA-Nanogel (NGEL) y DOPA-Nanogel-PEG (NGEL-PEG) en 3 donantes sanosin vitroen el Impact-R usando una tensión de cizalladura de 1800 s-1 durante 2 minutos (Figura 16A, B). Se observaron diferencias significativas en los valores de SC para todos los revestimientos en comparación con NC, excepto para DOPA. Los pocillos de PS revestidos PEG proporcionaron los valores más bajos de SC y AS. Las plaquetas no pudieron formar agregados en la superficie revestida con PEG. Es importante destacar que la deposición de nanogel no mostró propiedades adhesivas de plaquetas.
Se llevó a cabo el ensayo de la Figura 17 para estudiar el efecto de ticagrelor solo (NG-T-PEG) o en combinación con los dos antibióticos (NG-TA-PEG) sobre el consumo de plaquetas inducido por flujo. En el siglo XIX se realizó un ensayo con una muestra de sangre de un donante a un valor de 1800 s-1 durante 4 min. No se observó unión de plaquetas en ninguna condición excepto en los pocillos no revestidos (NC). Los valores indicados en la Figura 17 representan el recuento de plaquetas individuales en sangre después del ensayo y, de este modo, representan la formación de agregados de plaquetas en la superficie y/o sangre. Se observó un aumento significativo en el recuento de plaquetas para ambos nanogeles, lo que indica que las plaquetas permanecieron en suspensión como plaquetas individuales (es decir, no activadas) y no se adhirió a la superficie.
Ensayo estático
Se estudió la hemocompatibilidad del revestimiento en condiciones estáticas (sin aplicación de tensión cortante). El ensayo estático se llevó a cabo incubando 500 pl de sangre fresca con agitación suave (60 rpm) durante 2 h a 37 °C y 5 % de CO2 en una placa de 24 pocillos no tratada y observando la adherencia celular en el microscopio óptico en presencia o ausencia de revestimiento. Las células se tiñeron con colorante de Violeta Cristal. En la Figura 18, las imágenes de microscopio óptico de células teñidas con cristal violeta resaltaron la inhibición de la adhesión de las células sanguíneas después de la modificación de la superficie del PS. Las condiciones fueron: Sin revestimiento (NC), Nanogel (NG), Nanogel Peg (NP) y Nanogel antibióticos Peg (NAP) unidos a una capa de polidopamina.
También se incubó una suspensión de plaquetas (PRP: plasma rico en plaquetas) con pocillos de PS revestidos con NAP durante 1 min (Figura 19A) o durante 45 min (Figura 19B). Se apreció una clara diferencia en la cobertura de la superficie en comparación con el pocillo NC-PS. NC-1 min: 90 % de cobertura de superficie (SC); NAP-1 min: 5 % de SC; NC-45 min: 99,5 % de SC; NAP-45 min: 40 % de SC.
De este modo, todos estos datos indican que la modificación de la superficie con la preparación de nanogel de la presente invención no activa las plaquetas en condiciones estáticas y dinámicas.
Ejemplo 6: Propiedades antibiopelículas de los nanogeles bioactivos:Estafilococo (S) aureus
Se analizaron biopelículas de S.aureuscultivados durante 24 h en una placa de 24 pocillos en condiciones estáticas mediante tinción con violeta cristal (Figura 20). Se observó una reducción de la biopelícula cuando se rellenaron nanogeles con minociclina. Por el contrario, la vancomicina unida covalentemente no reduce la formación de biopelículas. Por consiguiente, la condición Ng-Mino-Peg condujo a una reducción de un 95 % en las bacterias planctónicas en comparación con todas las demás condiciones.
En el caso de discos de válvulas biológicas incubados en condiciones estáticas conS.aureusdurante 24 h en una placa de 24 pocillos, las bacterias planctónicas murieron por completo cuando se incubaron con un disco modificado con Ng-ABsPeg, mientras que las bacterias viables estaban presentes en la condición de disco sin revestimiento.
Curiosamente, el análisis SEM de la superficie de la válvula biológica modificada con vancomicina, minociclina y nanogeles rellenos de ticagrelor no detectó ninguna bacteria, mientras que la superficie no modificada reveló biopelículas grandes (Figura 21). De este modo, el nanogel bioactivo de la presente invención confiere potentes propiedades anti-biopelícula a las válvulas biológicas.
Ejemplo 8: Propiedades antibiopelícula de los nanogeles bioactivos:Enterococcus (E) faecalis
La Figura 22 muestra el efecto de la modificación de la superficie del PS en la formación de biopelículas deE. faecalis.La actividad antibacteriana se observó evaluando la viabilidad de las bacterias en suspensión. Los nanogeles rellenos de vancomicina presentaron actividad antibacteriana en condiciones estáticas, lo que demuestra que la unión covalente del antibiótico en los nanogeles preserva su actividad. Lminociclina fue eficaz tanto en condiciones estáticas como agitadas.
Ejemplo 9: Definición de la proporción óptima de minociclina y ticagrelor para crear un nanodepósito con propiedades antitrombóticas
Para producir un nanodepósito con actividad antibacteriana y antiplaquetas que exhibiera propiedades antitrombóticas óptimas, primero se determinó la concentración óptima del fármaco antiplaquetas ticagrelor. Para ello, se centrifugó 1 mL de suspensiones de nanogel relleno con concentraciones crecientes de ticagrelor a 12000 g durante 15 minutos, se lavó 2 veces en PBS y se resuspendió en 300 gl de PBS. Se incubaron 260 gl de plasma rico en plaquetas (PRP) con 10 gl de suspensiones de nanogel purificadas durante 10 minutos. A continuación se indujo la agregación de plaquetas añadiendo ADP 10 gM a 37 °C en condiciones de agitación. Se comparó la eficacia de las suspensiones de nanogel para inhibir la agregación de plaquetas inducida por ADP con la de la concentración IC50 de ticagrelor libre. Se observó que los nanogeles rellenos con 112 gg/mL de ticagrelor eran tan potentes como ticagrelor de 1,8 gg/mL para inhibir la agregación de plaquetas (Figura 23A). Esta concentración de carga se utilizó para estudios posteriores.
Se identificó que los nanogeles antiplaquetas (rellenos con 112 gg/mL de ticagrelor) se formaban más fácilmente en ausencia de minociclina. Por tanto, se adoptó una estrategia en la que las dos disoluciones de nanogel se mezclaron en una proporción x/y para obtener un nanodepósito que contenía minociclina y ticagrelor. Una proporción de x ( minociclina)/y (ticagrelor) entre 1/5 y 2/3 proporcionó una inhibición óptima de la agregación de plaquetas inducida por ADP (Figura 23B). Además, la inmovilización de la mezcla de nanogel preparada en una proporción de 2/3 sobre una superficie de poliestireno no activó la coagulación del plasma humano en comparación con la superficie no revestida (Figura 24).
Ejemplo 10: El ensamblaje de multicapa de nanogeles mejora la eficacia antibiopelícula y antitrombótica del nanodepósito
A continuación se evaluó si el ensamblaje de multicapa podía mejorar la eficacia antibacteriana y antiplaquetas del nanodepósito. Se inmovilizaron uno, tres o cinco nanogeles capa por capa sobre superficies de poliestireno o titanio. Posteriormente se incubaron las superficies con S.aureus,y se cuantificó la formación de biopelículas como se describe en Métodos. Se encontró que el aumento del número de capas de nanogel aumentaba la acción anti biopelícula del nanodepósito (Figura 25).
Para estudiar el efecto antiplaquetas de los nanodepósitos de multicapa inmovilizados, se llevó a cabo un ensayo utilizando el aparato Impact R (véase Métodos). La sangre se preactivó o no con ADP 2,8 gM durante 1 min a temperatura ambiente con agitación suave antes de aplicar una rotación de 720 rpm durante 4 min. Se determinó la cobertura de superficie y el tamaño de los agregados sobre cada superficie analizada y se analizó la disminución del recuento de plaquetas en el sobrenadante. Se anticipó que ticagrelor liberado del nanodepósito puede revertir el efecto del ADP ya que tiene una mayor afinidad por el receptor plaquetario P2Y12.
Se comparó el efecto de una capa de nanogel relleno con ticagrelor/ minociclina con el de nanogeles rellenos de cinco capas (Figura 26). También se incluyeron superficies no revestidas y superficies revestidas con nanogeles no cargados. La preactivación con ADP indujo la formación de microagregados en disolución, lo que resultó en una menor cobertura de superficie (Figura 26A), un tamaño de agregado ligeramente mayor (Figura 26B) y pérdida de plaquetas individuales (Figura 26C), en comparación con la sangre no activada tras la incubación en una superficie no revestida (NC) o en una superficie revestida con nanogel no relleno (NG). La incubación de sangre en una superficie revestida con nanogeles rellenos inhibió el efecto de ADP, como resultado de la liberación de ticagrelor del nanodepósito. La eficacia del nanodepósito de 5 capas fue superior a la del de 1 capa en términos de cobertura de superficie y tamaño de agregado. Ambos nanodepósitos recuperaron la pérdida de plaquetas individuales en disolución inducida por ADP.
Ejemplo 11: La reticulación del ensamblaje de nanogel de multicapa retarda la liberación de moléculas bioactivas y prolonga la eficacia
Se observó que la liberación de moléculas bioactivas se ralentizaba al reticular el ensamblaje de nanogel de cinco capas con dopamina en la último etapa de la formación del nanodepósito. Al ajustar la densidad de reticulación del revestimiento de nanogel, se puede ajustar la tasa de difusión de las moléculas rellanas. Dopamina actúa como agente de reticulación para ralentizar la difusión de moléculas bioactivas de los nanodepósitos. Este tratamiento con dopamina puede afectar a la difusión de moléculas de dos maneras diferentes. En primer lugar, dopamina puede penetrar dentro de las diferentes capas del ensamblaje de nanogeles LBL, reaccionar con los nanogeles y, de este modo, aumentar su densidad de reticulación. En segundo lugar, dopamina se puede polimerizar en la disolución y se puede depositar por precipitación en forma de una capa delgada sobre la superficie del LBL y actuar como barrera adicional a la difusión de las moléculas bioactivas.
Después de las etapas de deposición de las diferentes capas, el ensamblaje de LBL resultante se sumergió en una disolución de dopamina de 0,125 mg/mL durante una hora. La superficie se lavó antes de injertar PEG 1500 sobre la superficie. Las superficies revestidas y no revestidas se incubaron solo con medio durante 48 h. El medio se modificó dos veces antes de permitir que las bacterias se adhirieran como se ha descrito con anterioridad. La Figura 27A muestra que el nanodepósito no reticulado relleno con minociclina y vancomicina (NTMV) no pudo inhibir la formación de biopelículas de S.aureus,mientras que el nanodepósito reticulado (D-NTMV) todavía estaba activo después de 48 h. La Figura 27B representa el efecto antibacteriano del medio eli minado después de las segundas 24 h de contacto con los dos nanodepósitos, lo que demuestra la liberación de una mayor concentración de antibióticos del nanodepósito reticulado durante este período de contacto.
Ejemplo 12: Demostración in vivo de la eficacia antibacteriana del nanodepósito inmovilizado sobre implantes de Ti
Para demostrar la eficacia anti-biopelícula del nanodepósito in vivo, se utilizó un modelo de ratón de infección deS.aureusde implante de titanio. Los dispositivos de titanio preinfectados se implantaron por vía subcutánea y se evaluó la formación de biopelículain vivodespués de 4 h. La Figura 28A muestra el número de UFC por disco de titanio explantado después de corregir las UFC iniciales por disco en el momento de la implantación. El nanodepósito evitó por completo la formación de biopelículas en los implantes de titanio, en comparación con los nanogeles sin relleno. Este resultado se confirmó aún más mediante microscopía electrónica de barrido de implantes de titanio (Figura 28B). Las bacterias fueron visibles únicamente en nanogeles de titanio revestido no rellenos. Se observaron células inmunes en implantes revestidos con nanodepósitos.
Ejemplo 13: Preparación de nanogeles reticulados ensamblados con LBL cubiertos por diferentes ligandos funcionalizados con extremos tiol o vinilo
Para identificar una formulación de nanogel que ejerciera propiedades antiadhesivas intrínsecas frente a plaquetas y bacterias, se añadieron diferentes ligandos funcionalizados con extremos de tiol o vinilo como última capa de nanogeles ensamblados con LBL.
Se sintetizó a-metoxi-w-mercapto-poli(óxido de etileno) (MPEG-SH), deno minado PEG1.5, mediante esterificación del grupo terminal hidroxilo del monometoxi poli(óxido de etileno) (MPEG-OH) (Mn = 1500 g/mol) con ácido mercaptoacético de la siguiente manera:
Se añadió MPEG-OH (10 g; 5 mmol) a un matraz de dos bocas de 100 mL equipado con agitador y dispositivo Dean-Stark. MPEG-OH se secó mediante tres destilaciones azeotrópicas con tolueno y finalmente se disolvió en 50 mL de tolueno. Después se añadieron ácido mercaptoacético (3,5 mL, 50 mmol) y ácido sulfúrico concentrado (dos gotas). El matraz se calentó en un baño de aceite a 110 °C durante la noche. MPEG-SH se recogió mediante precipitación en éter a 0 °C y posteriormente se secó a 40 °C a vacío durante 24 h. PEG-SH se caracterizó por 1H NMR (Figura 29).
Se obtuvieron PEG2 (Metoxi-PEG-(CH2)2-SH, PM 2.000, Nombre químico: a-Mercaptoetil-w-metoxi, polioxietileno, ref. SUNBRIGHT® ME-020SH), PEG5 (Metoxi-PEG-(CH2)2-SH, PM 5.000, Nombre químico: a-Mercaptoetil-w-metoxi, polioxietileno, ref. SUNBRIGHT® ME-050SH) y PEG10 (Metoxi-PEG-(CH2)2-SH, Mn 10.000, Nombre químico: a-Mercaptoetil-w-metoxi, polioxietileno, ref. SUNBRIGHT® ME-100SH) a partir de la corporación NOF.
La fórmula química de MPEG-SH de la corporación NOF es:
Se utilizaron los siguientes ligandos de PEG funcionalizados con terminación vinílica (PEG-acrilato): acrilato de éter metílico de polietilenglicol, Mn 480, Sigma-Aldrich, ref. 454990 (APEG0.5), acrilato de éter metílico de polietilenglicol, Mn 1.000, Alfa Aezar. ref. 46537 (APEG1). Su fórmula química es:
El método de síntesis de polibetaínas se ilustra a continuación. La polimerización de 2-(metacriloiloxi)etilfosforilcolina (MPC) se logró añadiendo MPC (0,5 g, 1,7 mmol), ditiobenzoato de ácido 4-cianopentanoico (CTP; 10 mg, 0,05 mmol), AIBN (1,2 mg, 7,3 x 10-3 mmol) y H2O:MeOH desionizada 3:1 (5,0 mL) en un matraz Schlenk equipado con barra agitadora magnética. A continuación, la mezcla se agitó en un baño de hielo para garantizar la disolución completa de CTP y AIBN. Posteriormente, la disolución se purgó con nitrógeno antes de sumergirla en un baño de aceite precalentado a 70 °C. Después de 12 h, la polimerización se detuvo mediante enfriamiento rápido y exposición al aire. A continuación se sometió a diálisis la disolución de polimerización frente a agua desionizada durante 12 h con 3 cambios de agua desionizada. Luego se recuperó el homopolímero mediante liofilización. Las polibetaínas se caracterizaron por 1H NMR (Figura 30).
Se prepararon disoluciones estables de nanogeles en agua controlando de manera apropiada tanto el estado redox del polímero P (mDOPA) como el pH de las disoluciones de PAH. En primer lugar, se oxida P (mDOPA) en medio acuoso en condiciones básicas durante 12 h para formar Pox(mDOPA) hidrosoluble. Los restos DOPA oxidados de Pox(mDOPA) son necesarios para la interacción covalente de PAH a través de la reacción de amina/quinona y/o la formación de bases de Schiff a temperatura ambiente y, por consiguiente, para la preparación de nanogeles reticulados estables.
La inmovilización de nanogeles reticulados sobre una superficie de un sustrato se logró mediante una primera inmersión del sustrato en una disolución tampón T ris de DOPA para anclar fuertemente la primera capa a la superficie. Posteriormente, las siguientes capas se construyen mediante inmersión sucesiva de la superficie en una disolución acuosa de un polímero que contiene aminas primarias, polialilamina (PAH), y luego en una disolución de nanogel seguido de dos lavados con agua desionizada. El ensamblaje capa a capa (LBL) se obtuvo repitiendo las etapas anteriores de deposición y lavado. A continuación, se añadieron disoluciones de ligandos funcionalizados con extremos de tiol y vinilo (5 mg/mL en Tris 10 mM, pH 8,0) como última capa explotando la reactividad de los grupos quinona de Pox(mDOPA) frente a tioles, y mediante adición tipo Michael y reacciones de base de Schiff con el grupo amino de PAH, respectivamente.
La siguiente tabla muestra los ángulos de contacto medidos en una superficie revestida con nanogeles que portan diferentes ligandos con extremos funcionalizados con tiol o vinilo, en comparación con polidopamina.
En los siguientes ejemplos, se sometieron a ensayo las propiedades antiadhesivas (proteínas plasmáticas, plaquetas y bacterias) de nanogeles de 5 capas inmovilizados en superficie injertados con los diferentes ligandos a modo de última capa. También se estudió el efecto sobre la activación de la fase de contacto de la coagulación.
Ejemplo 14: Los ligandos con extremos funcionalizados con tiol son superiores a aquellos con extremos funcionalizados con vinilo para evitar la adhesión de plaquetas en nanodepósitos inmovilizados.
Se llevaron a cabo ensayos de actividad de LDH para comparar la adhesión de plaquetas sobre una superficie de poliestireno revestida o no con nanogeles de 5 capas o nanodepósitos que portan una capa superior de PEG con extremos funcionalizados con tiol o vinilo (Figura 31). Después de 45 minutos de incubación de PRP en las superficies, se observó que los nanodepósitos formados por nanogeles de PEG-SH rellenos con minociclina y ticagrelor (en una proporción de 2/3, ver arriba) inhibían eficientemente la adhesión de plaquetas, en comparación con los nanogeles no rellenos, mientras que los mismos nanodepósitos formados por nanogeles que contienen acrilato de PEG fueron menos eficientes.
Ejemplo 15: Superioridad del ligando PEG2000 con extremos funcionalizados con tiol para evitar la formación de biopelículas de S.aureusen implantes de titanio revestidos con nanogel
Para determinar si el injerto de ligando en nanogeles podía conferir por sí solo propiedades antiadhesivas a las superficies, se comparó la formación de biopelícula de S.aureusen implantes de titanio de calidad médica revestidos o no con nanogeles de 5 capas que portaban diferentes ligandos con extremos funcionalizados con tiol o vinilo. Se evaluó la formación de biopelículas separando y colocando en placas las bacterias que se adhirieron después de 3 h a los implantes. A continuación se determinaron los recuentos de UFC. Parecía que el ligando PEG2000 con terminación de tiol podía conferir la propiedad antibiopelícula más eficaz al titanio en comparación con la polibetaína 15000 y el PEG-acrilato 500 y 1000 (Figura 32).
Ejemplo 16: Ligandos de PEG con funcionalidad terminal de tiol: efecto de peso molecular sobre la adhesión de bacterias
Se prepararon más comparaciones de eficacia anti-biopelícula de S.aureusde nanogeles que portaban PEG tiol de peso molecular mayor que 2000. La Figura 33 indica que el efecto anti-biopelícula de los nanogeles de tiol de PEG aumenta con el peso molecular de PEG.
Ejemplo 17: Ligandos de PEG con funcionalidad terminal de tiol: efecto de peso molecular sobre la adhesión de plaquetas bajo flujo
Con el objetivo de crear una superficie con propiedades antibiopelícula y antiplaquetas, se llevaron a cabo experimentos de adhesión de plaquetas bajo flujo utilizando el sistema Impact-R, se compararon los mismos ligandos de PEG tiol que en el ejemplo 16 (Figura 34). A diferencia de la formación de biopelículas, los resultados indican que los nanogeles sin polímeros injertados ya conferían un efecto antiplaquetas a las superficies, como lo demuestran los porcentajes reducidos de cobertura de superficie por plaquetas y el tamaño reducido de los agregados, en comparación con las superficies no revestidas. También se observaron diferencias entre los efectos antibiopelícula y antiplaquetas en términos de pesos moleculares de PEG tiol. De hecho, el revestimiento antiplaquetas óptimo se logró utilizando PEG 1500 o PEG 2000, mientras que el aumento de peso molecular no mejoró el efecto.
Ejemplo 18: Ligandos de PEG con funcionalidad terminal de tiol: efecto de peso molecular sobre la coagulación
Se comparó el tiempo de coagulación de plasma que había estado en contacto con superficies revestidas y no revestidas. La referencia fue el plasma en estado basal, es decir, plasma que no había estado en contacto con la superficie (excepto la superficie del tubo y las puntas) (Figura 35). La Figura 35 muestra un acortamiento del tiempo de coagulación obtenido cuando se inmoviliza caolín con carga negativa sobre la superficie, y el efecto opuesto del inhibidor de FXIIa CTI. Se observó que las superficies revestidas con nanogeles de 5 capas que portaban ligandos de PEG prolongaron ligeramente los tiempos de coagulación, en comparación con las superficies no revestidas. Al comparar PEG de diferentes pesos moleculares, se apreció que los tiempos de coagulación más largos fueron producidos por nanogeles que portaban PEG 2000 y 5000. De este modo, aunque no alcanzaron la inhibición total de la fase de contacto de coagulación, estos nanogeles pudieron mejorar el efecto de las superficies no revestidas.
Ejemplo 19: Los ligandos de PEG tiol son superiores a las polibetaínas para evitar la formación de biopelículas
Los datos presentados aquí indican que el injerto de PEG 2000 en un ensamblaje de nanogel podía conferir propiedades antiadhesivas a las superficies frente a plaquetas y bacterias. Se llevó a cabo una comparación adicional tomando PEG 2000 como referencia, con polibetaínas de diferente tamaño de cadena y peso molecular. La formación de biopelículas se evaluó por primera vez utilizando el sistema IVIS Lu mina y bacterias bioluminiscentes de S.aureus(Figura 36). Esta técnica nos permitió seguir la cinética de adhesión de bacterias en una superficie de ensayo. Como se muestra en la Figura 36, PEG 2000 siguió siendo el mejor ligando antibiopelícula entre todas las polibetaínas analizadas.
Ejemplo 20: Los ligandos de PEG tiol son superiores a las polibetaínas para evitar la adhesión de plaquetas en condiciones de flujo
De manera similar a lo anterior, se evaluó la eficacia de ligandos de polibetaína de diferente tamaño de cadena y peso molecular para evitar la adhesión de plaquetas en condiciones de flujo (Figura 37). Se observó que PEG 2000 era superior a cualquiera de las polibetaínas en términos de cobertura de superficie y tamaño de los agregados de plaquetas formados en la superficie. Por el contrario, no se apreciaron diferencias entre PEG con terminación de tiol y las polibetaínas al evaluar la adhesión de plaquetas en condiciones estáticas (Figura 38).
Ejemplo 21: Los ligandos de PEG con funcionalidad terminal de tiol son superiores a las polibetaínas en términos de coagulación
Se demostró que entre los ligandos de PEG con terminación de tiol, PEG 2000 produjo la activación de coagulación más baja (Figura 35). También se compararon PEG 2000 con polibetaínas con terminación de tiol de tamaño de cadena y peso molecular crecientes. La Figura 39 no muestra ningún efecto del tamaño de cadena con el polímero de polibetaína, mientras que se confirmó que PEG 2000 no produjo más activación de la fase de contacto que el plasma basal que no había estado en contacto con la superficie de los pocillos de PS.
Ejemplo 22: Los ligandos de PEG con funcionalidad terminal de tiol son superiores a las polibetaínas para evitar la adhesión de proteínas plasmáticas
Cuando el plasma o la sangre entran en contacto con una superficie extraña, el primer episodio es la adsorción de proteínas, que favorece la adhesión de plaquetas y conduce a la activación de la cascada intrínseca de coagulación. Por tanto, someter a ensayo la adherencia de proteínas plasmáticas es una etapa importante en el desarrollo de dispositivos hemocompatibles.
La superficie de los pocillos de poliestireno se revistió o no con nanogeles de 5 capas que portaban o no PEG o polibetaína de diferentes pesos moleculares a modo de última capa superior. Este ensayo está en línea con la idea general de que la longitud de un polímero injertado podía evitar la adsorción inespecífica de proteínas. Nuestros resultados indican que PEG 2000 (NG-P2) y 5000 (NG-P5) mejoran la propiedad antiincrustante de la superficie, en comparación con los nanogeles sin polímero injertado (NG), mientras que las polibetaínas (NG-PB7, 15, 44) no pueden (Figura 40).
Se apreciará que la referencia en los ejemplos a nanogeles también se puede sustituir por referencia a nanodepósitos. El lector apreciará que el término nanogeles se puede usar para hacer referencia a un nanodepósito que comprende nanopartículas formadas por nanogel.

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis, en donde una superficie o parte de la misma está revestida con un nanodepósito unido a dicha superficie que comprende nanopartículas de un nanogel, en donde el nanogel comprende un primer polímero de Fórmula I: cadena principal (co)polimérica hidrófila
    reticulado a un segundo polímero que comprende una cadena principal hidrófila y uno o más restos reactivos, en donde el nanodepósito comprende además una o más moléculas bioactivas, moléculas terapéuticas o fármacos que se liberan desde dentro del nanodepósito.
  2. 2. El implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis según la reivindicación 1, en donde el nanodepósito contiene un antibiótico y/o un agente antiplaquetas.
  3. 3. El implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis de cualquier reivindicación anterior, en donde la cadena principal polimérica o copolimérica hidrófila puede comprender uno o más de polialilamina, polivinilaminas, polivinilamidas, poli(alcohol vinílico), poli(meta)acrilatos, poli(met)acrilamida, poliuretano o PEG o un polielectrolito (catiónico, aniónico o zwitteriónico) o un biopolímero hidrófilo tal como un polisacárido tal como quitosano o hialuronano.
  4. 4. El implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis de cualquier reivindicación anterior, en donde el primer polímero es P(mDOPA).
  5. 5. El implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el segundo polímero es poli(clorhidrato de alilamina).
  6. 6. El implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las nanopartículas tienen un diámetro de 100 nm a 250 nm.
  7. 7. El implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde al menos algunas de las nanopartículas están decoradas con un ligando funcionalizado hidrófilo.
  8. 8. El implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis según la reivindicación 7, en donde los ligandos funcionalizados hidrófilos son un ligando con funcionalidad terminal de tiol o vinilo.
  9. 9. El implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis según la reivindicación 8, en donde el ligando funcionalizado hidrófilo es PEG2 o un PEG con un peso molecular mayor que 2000.
  10. 10. El implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el nanodepósito comprende más de una capa de nanopartículas.
  11. 11. El implante de biomaterial, dispositivo médico o bioprótesis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la bioprótesis es una válvula cardíaca o un catéter.
  12. 12. Un método para producir un dispositivo médico, un implante de biomaterial o una bioprótesis con una superficie revestida que comprende i) sumergir la superficie a revestir en una disolución de un primer polímero, en donde el primer polímero comprende un polímero de Fórmula I: cadena principal (co)polimerica hidrofila
    ii) oxidar el primer polímero; iii) sumergir la superficie resultante en una segunda disolución polimérica, en donde el segundo polímero comprende una cadena principal hidrófila y uno o más restos reactivos; iv) sumergir la superficie en una disolución de nanodepósito que comprende nanopartículas de un nanogel, en donde el nanogel comprende un primer polímero de Fórmula I: cadena principal (co)polimérica hidrófila
    reticulado a un segundo polímero que comprende una cadena principal hidrófila y uno o más restos reactivos para producir un revestimiento sobre la superficie; y v) opcionalmente sumergir la superficie revestida en una disolución de ligando funcionalizado hidrófilo.
  13. 13. El método de la reivindicación 12, en donde el nanodepósito de la etapa iv) es como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 a 9.
  14. 14. El método de la reivindicación 12, en donde en la etapa i) el primer polímero es P(mDOPA); y/o en la etapa ii) el polímero oxidado es Pox(mDOPA); y/o en la etapa iii) el segundo polímero es PAH; en la etapa iv) el nanodepósito comprende nanopartículas de Pox (mDOPA) y PAH reticulados, y opcionalmente tiene la fórmula de uno o ambos de:
    y/o en donde en la etapa v) el ligando funcionalizado hidrófilo es PEG2 o un PEG con un PM superior a 2000.
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