ES2961306T3 - Método para obtener un valor de porcentaje de positividad para un biomarcador para células seleccionadas presentes en un campo de visión - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere, en parte, a métodos para derivar un valor de % de positividad de biomarcadores (PBP) para todas las células u opcionalmente, uno o más subconjuntos de las mismas, presentes en un campo de visión de una muestra de tejido de un paciente con cáncer. Los valores de PBP pueden ser indicativos de la respuesta de un paciente a la inmunoterapia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método para obtener un valor de porcentaje de positividad para un biomarcador para células seleccionadas presentes en un campo de visión
Campo de la invención
ANTECEDENTES
En la técnica se conocen varios métodos relacionados con los biomarcadores utilizados para el diagnóstico médico. Por ejemplo, el documento WO2015124777A1 divulga un método de análisis de imágenes médicas para identificar células tumorales positivas para biomarcadores en un portaobjetos. En el documento US7565247B1 se divulga un sistema óptico para determinar la distribución, el entorno o la actividad de moléculas indicadoras marcadas fluorescentemente en las células con el propósito de cribar un gran número de compuestos respecto a una actividad biológica específica. Sin embargo, siguen necesitándose nuevos métodos de diagnóstico mejorados para ser utilizados en el tratamiento del cáncer. La presente divulgación se refiere generalmente al campo del tratamiento del cáncer.
SUMARIO
En el presente documento se divulgan métodos para controlar el progreso de un paciente diagnosticado con cáncer y sometido a inmunoterapia, que comprenden:
i) utilizar al menos dos muestras que comprenden tejido tumoral tomadas de un paciente con cáncer en al menos dos momentos, uno antes y otro después del inicio de la inmunoterapia, obtener un valor de % de positividad para un biomarcador (PBP) para todas las células tumorales que expresen un biomarcador de interés para cada una de dichas al menos dos muestras para obtener al menos un primer valor para PBP y al menos un segundo valor para PBP;
(ii) registrar dicho al menos un primer valor para PBP y dicho al menos un segundo valor para PBP, siendo un cambio entre dicho al menos un primer valor para PBP y dicho al menos un segundo valor para PBP indicativo de una eficacia de dicha inmunoterapia.
El cambio puede ser una disminución entre dicho al menos un primer valor para PBP y dicho al menos un segundo valor para PBP, siendo la disminución indicativa de una eficacia positiva de dicha inmunoterapia. El cambio puede ser un aumento entre dicho al menos un primer valor para PBP y dicho al menos un segundo valor para PBP, siendo el aumento indicativo de una eficacia positiva de dicha inmunoterapia. Dicha inmunoterapia puede comprender terapia de puntos de control inmunitario.
En otro aspecto, en el presente documento se divulgan métodos para obtener un valor para el % de positividad para un biomarcador (PBP) para todas las células tumorales presentes en un campo de visión, que comprenden:
i) generar una imagen de las primeras señales de fluorescencia representativas de los núcleos de todas las células presentes en un campo de visión, y dilatar las primeras señales de fluorescencia hasta un diámetro que es el de una célula entera para construir una primera máscara de todas las células presentes en el campo de visión; ii) construir una segunda máscara de las segundas señales de fluorescencia representativas de todas las áreas presentes en el campo de visión, que expresan un biomarcador tumoral;
(iii) combinar dichas primera y segunda máscaras de manera que proporcione una tercera máscara que comprenda señales de fluorescencia representativas de todas las células tumorales en el campo de visión;
(iv) construir una cuarta máscara de las terceras señales de fluorescencia representativas de todas las áreas presentes en el campo de visión, que expresan un biomarcador de interés;
(v) combinar dichas tercera y cuarta máscaras de manera que proporcione una quinta máscara que comprenda señales de fluorescencia representativas de todas las células tumorales en el campo de visión, que también expresan el biomarcador de interés; y
(vi) obtener un valor de PBP para todas las células tumorales que expresan el biomarcador de interés dividiendo el área total de la quinta máscara por el área total de la tercera máscara.
El biomarcador de interés puede comprender un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en PD-L1, galectina 9 y MHC. El campo de visión puede comprender además células no tumorales. Las células no tumorales pueden comprender células inmunitarias y células estromales. El área total se puede medir en píxeles.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
LaFIG. 1muestra un ejemplo no limitante de una descripción general de anticuerpos y reactivos de detección utilizados en la preparación de muestras de tejido para la obtención de imágenes y el análisis.
LaFIG. 2amuestra un ejemplo no limitante de todos los núcleos detectados con DAPI dentro de una imagen.
LaFIG. 2bmuestra un ejemplo no limitante de una máscara binaria dilatada de todas las células dentro de la imagen de laFIG. 2a.
LaFIG. 3amuestra un ejemplo no limitante de una imagen de S100 detectada con tinte 488.
LaFIG. 3bmuestra un ejemplo no limitante de una máscara binaria de toda el área tumoral dentro de la imagen de laFIG. 3a.
LaFIG. 3cmuestra un ejemplo no limitante de una máscara de todas las células tumorales dentro de la imagen de laFIG. 3a.
LaFIG. 3dmuestra un ejemplo no limitante de una máscara de todas las células no tumorales dentro de la imagen de laFIG. 3a.
LaFIG. 4amuestra un ejemplo no limitante de una imagen de PD-L1 detectado con Cy® 5.
LaFIG. 4bmuestra un ejemplo no limitante de una máscara binaria de todas las células positivas para PD-L1 dentro de la imagen de laFIG. 4a.
LaFIG. 4cmuestra un ejemplo no limitante de una máscara de todas las células tumorales positivas para PD-L1 dentro de la imagen de laFIG. 4a.
LaFIG. 4dmuestra un ejemplo no limitante de una máscara de todas las células no tumorales positivas para PD-L1 dentro de la imagen de laFIG. 4a.
LaFIG. 5amuestra un ejemplo no limitante de una imagen de PD-1 detectado con Cy® 3.5.
LaFIG. 5bmuestra un ejemplo no limitante de una máscara binaria de todas las células no tumorales positivas para PD1 dentro de la imagen de laFIG. 5a.
LaFIG. 6amuestra un ejemplo no limitante de valores de % de positividad para un biomarcador (PBP) para todas las células que expresan PD-L1 en muestras de tejido de 21 pacientes con melanoma, ordenados por expresión creciente de PD-L1.
LaFIG. 6bmuestra un ejemplo no limitante de valores de PBP para todas las células no tumorales que expresan PD-1 en muestras de tejido de los mismos 21 pacientes con melanoma, ordenados por expresión creciente de PD-1.
LaFIG. 7muestra un ejemplo no limitante de una máscara de señales de fluorescencia correspondientes a células positivas para PD-L1 (rojo), células positivas para PD-1 (amarillo), todas las células tumorales (verde) y todas las células (azul) para un individuo con respuesta positiva a la inmunoterapia.
LaFIG. 8muestra un ejemplo no limitante de una máscara de señales de fluorescencia correspondientes a células positivas para PD-L1 (rojo), células positivas para PD-1 (amarillo), todas las células tumorales (verde) y todas las células (azul) para un individuo con respuesta negativa a la inmunoterapia.
LaFIG. 9muestra valores de % de positividad para un biomarcador (PBP) para PD-L1 y PD-1 de 38 pacientes con cáncer de pulmón no microcítico.
LaFIG. 10muestra una comparación del % de positividad para PD-L1 según lo determinado por un método de recuento de células automatizado frente a un método descrito en el presente documento.
LaFIG. 11es un diagrama de flujo de un proceso para obtener un valor de positividad para un biomarcador, de acuerdo con un ejemplo.
LaFIG. 12es un diagrama de flujo de un proceso para obtener un valor de positividad para un biomarcador, de acuerdo con un segundo ejemplo.
LaFIG. 13es un diagrama de bloques de un controlador configurado para obtener un valor de positividad para un biomarcador, de acuerdo con un ejemplo.
LaFIG. 14es un diagrama de flujo de los pasos de procesamiento de imágenes utilizados para obtener un valor de positividad para un biomarcador, de acuerdo con un ejemplo.
LaFIG. 15muestra otro ejemplo no limitante de una descripción general de anticuerpos y reactivos de detección utilizados en la preparación de muestras de tejido para la obtención de imágenes y el análisis.
LaFIG. 16amuestra un ejemplo no limitante de un ejemplo no limitante de todos los núcleos detectados con DAPI dentro de una imagen.
LaFIG. 16bmuestra un ejemplo no limitante de una máscara binaria dilatada de todas las células dentro de la imagen de laFIG. 16a.
LaFIG. 17amuestra un ejemplo no limitante de una imagen de PD-1 detectado con Cy® 5.
LaFIG. 17bmuestra un ejemplo no limitante de una máscara binaria de todas las células positivas para PD-1 dentro de la imagen de laFIG. 17a.
LaFIG. 18amuestra un ejemplo no limitante de una imagen de CD3 detectado con Cy® 3.
LaFIG. 18bmuestra un ejemplo no limitante de una máscara binaria de todas las células positivas para CD3 dentro de la imagen de laFIG. 18a.
LaFIG. 19muestra un ejemplo no limitante de una máscara binaria de todas las células doblemente positivas para PD-1 y CD3.
LaFIG. 20amuestra un ejemplo no limitante de la evaluación cuantitativa de linfocitos T CD3+ en muestras de tejido de pacientes con DLBCL (n = 43).
LaFIG. 20bmuestra un ejemplo no limitante de la evaluación cuantitativa de linfocitos T CD3+/ PD1+ en muestras de tejido de pacientes con DLBCL (n = 43).
LaFIG. 21amuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de CD25 en tejidos de NSCLC, gástricos y de melanoma.
LaFIG. 21bmuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de FoxP3 en tejidos de NSCLC, gástricos y de melanoma.
LaFIG. 22muestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de linfocitos T CD25+/FoxP3+ en tejidos de NSCLC, gástricos y de melanoma.
LaFIG. 23amuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de CD4 en tejidos de NSCLC, gástricos y de melanoma.
LaFIG. 23bmuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de CD8 en tejidos de NSCLC, gástricos y de melanoma.
LaFIG. 24amuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de fenotipo CD11b+/HLA-DR- en tejidos de melanoma metastásicos.
LaFIG. 24bmuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de fenotipo CD11b+/IDO-1+/HLA-DR- en tejidos de melanoma metastásicos.
LaFIG. 25amuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de fenotipo IDO-1+/HLA-DR+ en tejidos de melanoma metastásicos.
LaFIG. 25bmuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de fenotipo CD11b+/IDO-1+/HLA-DR+ en tejidos de melanoma metastásicos.
LaFIG. 26amuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de fenotipo CD11 b+/CD33+/ARG1 en tejidos de NSCLC.
LaFIG. 26bmuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de fenotipo CD11b+/HLA-DR+/IDO-1+ en tejidos de NSCLC.
LaFIG. 27muestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de fenotipo CD11b+/HLA-DR-/IDO-1+ en tejidos de NSCLC.
LaFIG. 28muestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de linfocitos T CD8+Ki67+ en tejidos de melanoma metastásicos.
LaFIG. 29amuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de células CD163+ en tejidos de melanoma metastásicos.
LaFIG. 29bmuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de células CD68+ en tejidos de melanoma metastásicos.
LaFIG. 29cmuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de células CD163+CD68+ en tejidos de melanoma metastásicos.
LaFIG. 30amuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de linfocitos T positivos para LAG-3 en tejidos de DLBCL y NET.
LaFIG. 30bmuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de linfocitos T positivos para TIM-3 en tejidos de DLBCL y NET.
LaFIG. 31amuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de CTLA-4 en linfocitos T en tejidos de melanoma.
LaFIG. 31bmuestra un ejemplo no limitante de evaluación cuantitativa de CD80 en tejidos de melanoma.
LaFIG. 32muestra una clasificación representativa del tumor en función de su contexto inmunitario.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Tal como se utiliza en el presente documento, los expertos ordinarios en la técnica entenderán el término «aproximadamente» y este variará hasta cierto punto dependiendo del contexto en el que se utiliza. Si hay usos del término que no son claros para los expertos ordinarios en la técnica, dado el contexto en el que se utiliza, «aproximadamente» significará hasta más o menos un 10 % del término particular.
El uso de los términos «un» y «uno/a» y «el/la» y referentes similares en el contexto de la descripción de los elementos (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) debe interpretarse que abarca tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o lo contradiga claramente el contexto. La recitación de los rangos de valores en el presente documento tiene la finalidad meramente de servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado comprendido en el intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se recitara individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos o lenguaje a modo de ejemplo (p. ej., «tal/es como») proporcionados en el presente documento tiene por objeto meramente ilustrar mejor la divulgación y no supone ninguna limitación del alcance de las reivindicaciones a menos que se indique lo contrario. No debe considerarse que ningún lenguaje en la memoria descriptiva señale que cualquier elemento no reivindicado sea esencial.
El término “que trata” o “tratamiento” se refiere a la administración de una terapia en una cantidad, manera, o modo eficaz para mejorar una afección, síntoma o parámetro asociado con un trastorno o para prevenir la progresión de un trastorno, ya sea a un grado estadísticamente significativo o a un grado detectable para un experto en la técnica Una cantidad, manera o modo eficaz puede variar dependiendo del sujeto y se pueden adaptar al paciente.
Los tumores se pueden clasificar en función de su contexto inmunitario como “calientes” (inflamados) o “fríos” (no inflamados) (véase laFIG.32).Si bien cabe esperar que los pacientes que son portadores de tumores calientes respondan a ciertas inmunoterapias y posiblemente vivan más tiempo que los pacientes que son portadores de tumores fríos, antes no estaba claro para los expertos en la técnica qué biomarcadores se correlacionan con la respuesta y la supervivencia.
Para abordar este problema, algunos de los métodos descritos en el presente documento ayudan en la identificación de pacientes con cáncer que responden a una o más inmunoterapias mediante la expresión de biomarcadores de agotamiento inmunitario (p. ej., PD-1 y PD-L1) y pacientes con cáncer que no responden (p. ej., sin respuesta) mediante la presencia de tipos de células que se sabe que causan supresión inmunitaria (p. ej., CD11b, HLA-DR, IDO-1, ARG1) o células tumorales sumamente proliferativas sin expresión de MHC de clase I (p. ej., Ki67+, B2M-). Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender el uso de ensayos inmunohistoquímicos múltiples (p. ej., ensayos de FIHC múltiples) basados en características distintivas específicas de supresión o activación inmunitaria. En la siguiente tabla se muestran ejemplos no limitantes de ensayos de FIHC múltiples basados en características distintivas específicas de supresión o activación inmunitaria.
Las señales de fluorescencia pueden proceder de cuatro etiquetas de fluorescencia, cada una específica para un biomarcador diferente. Una primera etiqueta de fluorescencia puede estar asociada con el primer biomarcador de interés, una segunda etiqueta de fluorescencia está asociada con el segundo biomarcador de interés, una tercera etiqueta de fluorescencia está asociada con un tercer biomarcador de interés y una cuarta etiqueta de fluorescencia está asociada con un cuarto biomarcador de interés. El primer biomarcador de interés puede comprender un marcador tumoral y no tumoral. El segundo biomarcador de interés puede comprender un marcador no tumoral. El primer biomarcador de interés puede comprender un marcador tumoral y no tumoral, y el segundo biomarcador de interés puede comprender un marcador no tumoral. El tercer biomarcador de interés puede ser expresado por todas las células. El cuarto biomarcador de interés puede expresarse solo en las células tumorales. El tercer biomarcador de interés puede ser expresado por todas las células y el cuarto biomarcador de interés puede expresarse solo en las células tumorales. El cuarto biomarcador de interés puede ser el biomarcador del subconjunto. El tercer biomarcador de interés puede ser expresado por todas las células y el cuarto biomarcador de interés es el biomarcador del subconjunto. Una o más etiquetas de fluorescencia pueden comprender un fluoróforo conjugado con un anticuerpo que tiene una afinidad de unión por un biomarcador específico u otro anticuerpo. Una o más etiquetas de fluorescencia pueden ser fluoróforos con afinidad por un biomarcador específico.
Los ejemplos de fluoróforos incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, 6-FAM, rodamina, rojo Texas, rojo California, iFluor594, tetrametilrodamina, una carboxirodamina, carboxirodamina 6F, carboxirodol, carboxirodamine 110, azul Cascade, amarillo Cascade, cumarina, Cy2®, Cy3®, Cy3.5®, Cy5®, Cy5.5®, Cy7®, Cy-Cromo, DyLight® 350, DyLight® 405, DyLight® 488, DyLight® 549, DyLight® 594, DyLight® 633, DyLight® 649, DyLight® 680, DyLight® 750, DyLight® 800, ficoeritrina, PerCP (peridinina clorofila-a proteína), PerCP-Cy5.5, JOE (6-carboxy-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína), NED, ROX (5-(y -6-)-carboxy-X-rodamina), HEX, amarillo Lucifer, azul Marina, verde Oregon Green 488, verde Oregon Green 500, verde Oregon Green 514, Alexa Fluor® 350, Alex Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, ácido 7-amino-4-metilcumarin-3-acético, BODIPY® FL, BODIPY® FL-Br2, BODIPY® 530/550, BODIPY® 558/568, BODIPY® 630/650, BODIPY® 650/665, BODIPY® R6G, BODIPY® TMR, BODIPY® TR, OPAL™ 520, OPAL™ 540, OPAL™ 570, OPAL™ 620, OPAL™ 650, OPAL™ 690 y combinaciones de estos. El fluoróforo se puede seleccionar del grupo que consiste en DAPI, Cy® 2, Cy® 3, Cy® 3.5, Cy® 5, CY® 7, FITC, TRITC, un tinte 488, un tinte 555, un tinte de 594, rojo Texas, y cumarina. Los ejemplos de un tinte 488 incluyen, pero no se limitan a, Alexa Fluor® 488, OPAL™ 520, DyLight® 488, y CF™ 488A. Los ejemplos de un tinte 555 incluyen, pero no se limitan a, Alexa Fluor® 555. Los ejemplos de un tinte 594 incluyen, pero no se limitan a, Alexa Fluor® 594.
Tal como se utiliza en el presente documento, un «campo de visión» se refiere a una sección de una imagen digital de un portaobjetos completo de una muestra de tejido. La imagen de un portaobjetos completo puede tener 2-200 campos de visión predeterminados. La imagen de un portaobjetos completo puede tener 10-200 campos de visión predeterminados. La imagen de un portaobjetos completo puede tener 30-200 campos de visión predeterminados. La imagen de un portaobjetos completo puede tener 10-150 campos de visión predeterminados. La imagen de un portaobjetos completo puede tener 10-100 campos de visión predeterminados. La imagen de un portaobjetos completo puede tener 10-50 campos de visión predeterminados. La imagen de un portaobjetos completo puede tener 10-40 campos de visión predeterminados. La imagen de un portaobjetos completo puede tener 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100, incluidos los incrementos en estos, campos de visión predeterminados.
En los métodos divulgados en el presente documento, el paciente con cáncer es un mamífero. El mamífero puede ser humano. El mamífero puede no ser humano. El mamífero puede ser ratón, rata, cobaya, perro, gato, o caballo.
En los métodos divulgados en el presente documento, el tejido tumoral se toma de un paciente con cáncer. El tipo de cáncer incluye, pero no se limita a, los cánceres del: sistema circulatorio, por ejemplo, corazón (sarcoma [angiosarcoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma], mixoma, rabdomioma, fibroma, lipoma y teratoma), mediastino y pleura, y otros órganos intratorácicos, tumores vasculares y tejido vascular asociado al tumor; vías respiratorias, por ejemplo, cavidad nasal y oído medio, senos paranasales, laringe, tráquea, bronquios y pulmón, tales como cáncer de pulmón microcítico (SCLC, por sus siglas en inglés), cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC, por sus siglas en inglés), carcinoma broncógeno (células escamosas, células pequeñas indiferenciadas, células grandes indiferenciadas, adenocarcinoma), carcinoma alveolar (bronquiolar), adenoma bronquial, sarcoma, linfoma, hamartoma condromatoso, mesotelioma; sistema gastrointestinal, por ejemplo, esófago (carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, leiomiosarcoma, linfoma), estómago (carcinoma, linfoma, leiomiosarcoma), gástrico, páncreas (adenocarcinoma ductal, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, tumores carcinoides, vipoma), intestino delgado (adenocarcinoma, linfoma, tumores carcinoides, sarcoma de Karposi, leiomioma, hemangioma, lipoma, neurofibroma, fibroma), intestino grueso (adenocarcinoma, adenoma tubular, adenoma velloso, hamartoma, leiomioma); vías genitourinarias, por ejemplo, riñón (adenocarcinoma, tumor de Wilm [nefroblastoma], linfoma, leucemia), vejiga y/o uretra (carcinoma de células escamosas, carcinoma de células transicionales, adenocarcinoma), próstata (adenocarcinoma, sarcoma), testículos (seminoma, teratoma, carcinoma embrionario, teratocarcinoma, coriocarcinoma, sarcoma, carcinoma de células intersticiales, fibroma, fibroadenoma, tumores adenomatoides, lipoma); hígado, por ejemplo, hepatoma (carcinoma hepatocelular), colangiocarcinoma, hepatoblastoma, angiosarcoma, adenoma hepatocelular, hemangioma, tumores endocrinos pancreáticos (tales como feocromocitoma, insulinoma, tumor con péptido natriurético auricular intestinal, tumor de células de los islotes y glucagonoma); hueso, por ejemplo, sarcoma osteógeno (osteosarcoma), fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, linfoma maligno (sarcoma de células reticulares), mieloma múltiple, cordoma tumoral maligno de células gigantes, osteoronfroma (exostosis osteocartilaginosas), condroma benigno, condroblastoma, condromixofibroma, osteoma osteoide y tumores de células gigantes; sistema nervioso, por ejemplo, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, cáncer de cráneo (osteoma, hemangioma, granuloma, xantoma, osteítis deformante), meninges (meningioma, meningiosarcoma, gliomatosis), cáncer cerebral (astrocitoma, meduloblastoma, glioma, ependimoma, germinoma [pinealoma], glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, schwannoma, retinoblastoma, tumores congénitos), neurofibroma de la médula espinal, meningioma, glioma, sarcoma); sistema reproductivo, por ejemplo, ginecológico, de útero (carcinoma endometrial), cuello uterino (carcinoma cervicouterino, displasia cervicouterina pretumoral), ovarios (carcinoma de ovario [cistadenocarcinoma seroso, cistadenocarcinoma mucinoso, carcinoma no clasificado], tumores de células granulosas-tecas, tumores de células de Sertoli-Leydig, disgerminoma, teratoma maligno), vulva (carcinoma de células escamosas, carcinoma intraepitelial, adenocarcinoma, fibrosarcoma, melanoma), vagina (carcinoma de células claras, carcinoma de células escamosas, sarcoma botrioide (rabdomiosarcoma embrionario), trompas de falopio (carcinoma) y otros sitios asociados con órganos genitales femeninos; placenta, pene, próstata, testículos, y otros sitios asociados con los órganos genitales masculinos; sistema hemático, por ejemplo, sangre (leucemia mieloide [aguda y crónica], leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, enfermedades mieloproliferativas, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico), enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano [linfoma maligno]; cavidad oral, por ejemplo, labio, lengua, encía, suelo de la boca, paladar y otras partes de la boca, glándula parótida y otras partes de las glándulas salivales, amígdalas, orofaringe, nasofaringe, seno piriforme, hipofaringe, y otros sitios en el labio, cavidad oral y faringe; piel, por ejemplo, melanoma maligno, melanoma cutáneo, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Karposi, nevos displásicos lunares, lipoma, angioma, dermatofibroma y queloides; glándulas suprarrenales: neuroblastoma; y otros tejidos, incluidos los tejidos conectivo y blando, retroperitoneo y peritoneo, ojo, melanoma intraocular y anejos, mama, cabeza y/o cuello, región anal, tiroides, paratiroides, glándula suprarrenal y otras glándulas endocrinas y estructuras relacionadas, neoplasias malignas secundarias y no especificadas de los ganglios linfáticos, neoplasia maligna secundaria de los sistemas respiratorio y digestivo y neoplasia maligna secundaria de otros sitios, o una combinación de uno o más de estos.
Los ejemplos de inmunoterapia incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales (p. ej., alemtuzumab o trastuzumab), anticuerpos monoclonales conjugados (p. ej., ibritumomab tiuxetán, brentuximab vendotina o adotrastuzumab emtansina), anticuerpos monoclonales biespecíficos (blinatumomab), inhibidores de puntos de control inmunitario (p. ej., ipilimumab, pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab o durvalumab), talidomida, lenalidomida, pomalidomida e imiquimod, y combinaciones de estos. La inmunoterapia puede comprender terapia de puntos de control inmunitario.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan métodos para obtener un valor para el % de positividad para un biomarcador (PBP) para todas las células tumorales presentes en un campo de visión, que comprenden:
i) generar una imagen de las primeras señales de fluorescencia representativas de los núcleos de todas las células presentes en un campo de visión, y dilatar las primeras señales de fluorescencia hasta un diámetro que es el de una célula entera para construir una primera máscara de todas las células presentes en el campo de visión; ii) construir una segunda máscara de las segundas señales de fluorescencia representativas de todas las áreas presentes en el campo de visión, que expresan un biomarcador tumoral;
(iii) combinar dichas primera y segunda máscaras de manera que proporcione una tercera máscara que comprenda señales de fluorescencia representativas de todas las células tumorales en el campo de visión;
(iv) construir una cuarta máscara de las terceras señales de fluorescencia representativas de todas las áreas presentes en el campo de visión, que expresan un biomarcador de interés;
(v) combinar dichas tercera y cuarta máscaras de manera que proporcione una quinta máscara que comprenda señales de fluorescencia representativas de todas las células tumorales en el campo de visión, que también expresan el biomarcador de interés; y
(vi) obtener un valor de PBP para todas las células tumorales que expresan el biomarcador de interés dividiendo el área total de la quinta máscara por el área total de la tercera máscara.
El área total se puede medir en píxeles. El área total de la quinta máscara y el área total de la tercera máscara se pueden medir cada una en píxeles. Un píxel puede tener 0,5 |jm de ancho. El biomarcador de interés puede comprender un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en PD-L1, galectina 9 y MHC. El biomarcador de interés puede comprender PD-L1. El biomarcador de interés puede comprender galectina 9. El biomarcador de interés puede comprender MHC. El campo de visión puede comprender además células no tumorales. Las células no tumorales pueden comprender células inmunitarias y células estromales.
En otro aspecto, en el presente documento se divulgan métodos para controlar el progreso de un paciente diagnosticado con cáncer y sometido a inmunoterapia, que comprenden:
i) utilizar al menos dos muestras que comprenden tejido tumoral tomadas de un paciente con cáncer en al menos dos momentos, uno antes y otro después del inicio de la inmunoterapia, obtener un valor de % de positividad para un biomarcador (PBP) para todas las células tumorales que expresen un biomarcador de interés para cada una de dichas al menos dos muestras para obtener al menos un primer valor para PBP y al menos un segundo valor para PBP;
(ii) registrar dicho al menos un primer valor para PBP y dicho al menos un segundo valor para PBP, siendo un cambio entre dicho al menos un primer valor para PBP y dicho al menos un segundo valor para PBP indicativo de una eficacia de dicha inmunoterapia.
El cambio puede ser una disminución entre dicho al menos un primer valor para PBP y dicho al menos un segundo valor para PBP, siendo la disminución indicativa de una eficacia positiva de dicha inmunoterapia. El cambio puede ser un aumento entre dicho al menos un primer valor para PBP y dicho al menos un segundo valor para PBP, siendo el aumento indicativo de una eficacia positiva de dicha inmunoterapia. El biomarcador de interés puede comprender un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en PD-L1, galectina 9 y MHC. El biomarcador de interés puede comprender PD-L1. El biomarcador de interés puede comprender galectina 9. El biomarcador de interés puede comprender MHC. La inmunoterapia puede comprender terapia de puntos de control inmunitario.
LaFIG. 11es un diagrama de flujo que representa los pasos de un método para obtener un valor de % de positividad para un biomarcador (PBP). En el paso 1101, se obtienen datos de imágenes y en el paso 1102, los datos de imágenes se separan de tal manera que los datos específicos de varios tipos de señales de fluorescencia se separan en diferentes canales. En el paso 1103, los datos de un primer canal se utilizan para generar una máscara de todas las células. En el paso 1104, los datos de un segundo canal se utilizan para generar una máscara del área en un campo de visión que expresa un biomarcador del subconjunto, por ejemplo, esta máscara del subconjunto puede ser una máscara de un área tumoral presente en un campo de visión. En el paso 1105, la máscara de todas las células y la máscara del subconjunto (p. ej., una máscara del área tumoral) se combinan para generar una máscara de todas las células del subconjunto.
Un subconjunto de células identificadas por un biomarcador del subconjunto y las células que no son de un subconjunto corresponden a las células tumorales y las células no tumorales, respectivamente o viceversa. Un subconjunto de células puede ser identificado por un biomarcador del subconjunto y las células que no son de un subconjunto corresponden a las células viables y las células no viables, respectivamente o viceversa. Un subconjunto de células puede ser identificado por un biomarcador del subconjunto es un subconjunto de células viables y las células que no son de un subconjunto consisten en las células viables no incluidas en el subconjunto de células viables. Un subconjunto de células puede ser identificado por un biomarcador del subconjunto y las células que no son de un subconjunto corresponden a los linfocitos T y las células que no son linfocitos T, respectivamente o viceversa. Un subconjunto de células puede ser identificado por un biomarcador del subconjunto y las células que no son de un subconjunto corresponden a las células mieloides y las células no mieloides, respectivamente o viceversa.
La combinación de la máscara de todas las células y la máscara del subconjunto puede identificar todas las células tumorales y/o todas las células no tumorales. El proceso se puede llevar a cabo solo en un tipo seleccionado de célula de interés, por ejemplo, solo células tumorales o solo células no tumorales. El proceso también puede dirigirse a un análisis de ambos. En el paso 1106, los datos de un tercer canal se utilizan para generar una máscara de todas las células que son positivas para un biomarcador (en función de las señales de fluorescencia que representan la presencia de una etiqueta fluorescente con una afinidad para unirse al biomarcador particular de interés). En los pasos 1107 y 1108, la máscara del biomarcador generada en el paso 1106 se combina con la máscara de células del subconjunto generada en el paso 1105. El paso 1107 combina la máscara del biomarcador con la máscara de células del subconjunto de una primera manera, para generar una máscara de todas las células del subconjunto que son positivas para el biomarcador. El paso 1108 combina la máscara del biomarcador con la máscara de células del subconjunto de una segunda manera, para generar una máscara de las células del subconjunto que no son positivas para el biomarcador. Uno o ambos pasos 1107 y 1108 se pueden realizar de acuerdo con el método de la divulgación. En el paso 1109/1110, se calcula una puntuación de PBP dividiendo el área de las células del subconjunto de interés (p. ej., las células del subconjunto que son positivas para el biomarcador identificado por la máscara en el paso 1107 o las células del subconjunto que no son positivas para el biomarcador identificado por la máscara en el paso 1108) por el área total de todas las células del subconjunto. Uno o ambos pasos 1109 y 1110 se pueden realizar de acuerdo con el método de la divulgación.
LaFIG. 12es un diagrama de flujo que representa los pasos de un método para obtener un valor de % de positividad para un biomarcador (PBP). En el paso 1201, se obtienen datos de imágenes y en el paso 1202, los datos de imágenes se separan de tal manera que los datos específicos de varios tipos de señales de fluorescencia se separan en diferentes canales. En el paso 1203, los datos de un primer canal se utilizan para generar una máscara de todas las células. En el paso 1204, los datos de un segundo canal se utilizan para generar una máscara de todas las células que son positivas para un biomarcador (en función de las señales de fluorescencia que representan la presencia de una etiqueta fluorescente con una afinidad para unirse al biomarcador particular de interés). En el paso 1205, se calcula una puntuación de PBP dividiendo el área de las células que son positivas para el biomarcador (que se identifica por la máscara creada en el paso 1204) por el área total de todas las células de interés (del paso 1203). El proceso de laFIG. 12puede llevarse a cabo por separado o simultáneamente con el método descrito en laFIG. 11.En otras palabras, se puede calcular una puntuación de PBP para todas las células, todas las células tumorales y todas las células no tumorales, o cualquier combinación de estas, combinando los métodos de lasFIGS. 11y12.
En los métodos divulgados en el presente documento, la manipulación de las imágenes digitales puede llevarse a cabo mediante un sistema informático que comprende un controlador, tal como el controlador ilustrado en el diagrama de bloques de laFIG. 13,de acuerdo con un ejemplo. Se muestra que el controlador 200 incluye una interfaz de comunicaciones 202 y un circuito de procesamiento 204. La interfaz de comunicaciones 202 puede incluir interfaces cableadas o inalámbricas (p. ej., conectores, antenas, transmisores, receptores, transceptores, terminales de cable, etc.) para realizar comunicaciones de datos con varios sistemas, dispositivos o redes. Por ejemplo, la interfaz de comunicaciones 202 puede incluir una tarjeta Ethernet y un puerto para enviar y recibir datos a través de una red de comunicaciones basada en Ethernet y/o un transceptor WiFi para comunicarse a través de una red de comunicaciones inalámbricas. La interfaz de comunicaciones 202 se puede configurar para comunicarse a través de redes de área local o redes de área amplia (p. ej., Internet, una WAN de edificio, etc.) y puede utilizar diversos protocolos de comunicaciones (p. ej., BACnet, IP, LON, etc.).
La interfaz de comunicaciones 202 puede ser una interfaz de red configurada para facilitar las comunicaciones electrónicas de datos entre el controlador 200 y varios sistemas o dispositivos externos (p. ej., el dispositivo de obtención de imágenes 102). Por ejemplo, el controlador 200 puede recibir datos de imágenes para los campos de visión seleccionados del dispositivo de obtención de imágenes 102, para analizar los datos y calcular la puntuación de proximidad espacial (SPS, por sus siglas en inglés).
Todavía refiriéndose a laFIG. 13,se muestra que el circuito de procesamiento 204 incluye un procesador 206 y una memoria 208. El procesador 206 puede ser un procesador de propósitos generales o de propósitos específicos, un circuito integrado específico de la aplicación (ASIC, por sus siglas en inglés), una o más matrices de puertas programables en campo (FPGA, por sus siglas en inglés), un grupo de componentes de procesamiento u otros componentes de procesamiento adecuados. El procesador 506 se puede configurar para ejecutar un código informático o instrucciones almacenadas en la memoria 508 o recibidas de otros medios de lectura informática (p. ej., CDROM, almacenamiento en red, un servidor remoto, etc.).
La memoria 208 puede incluir uno o más dispositivos (p. ej., unidades de memoria, dispositivos de memoria, dispositivos de almacenamiento, etc.) para almacenar datos y/o un código informático para completar y/o facilitar los diversos procesos descritos en la presente divulgación. La memoria 208 puede incluir memoria de acceso aleatorio (RAM, por sus siglas en inglés), memoria de solo lectura (ROM, por sus siglas en inglés), almacenamiento en disco duro, almacenamiento temporal, memoria no volátil, memoria flash, memoria óptica o cualquier otra memoria adecuada para almacenar objetos de software y/o instrucciones del ordenador. La memoria 208 puede incluir componentes de la base de datos, componentes de código objeto, componentes descripto cualquier otro tipo de estructura de información para dar apoyo a las diversas actividades y estructuras de información descritas en la presente divulgación. La memoria 508 puede estar comunicablemente conectada al procesador 206 a través del circuito de procesamiento 204 y puede incluir código informático para ejecutar (p. ej., mediante el procesador 206) uno o más procesos descritos en el presente documento.
Todavía refiriéndose a laFIG. 13,se muestra que el controlador 200 recibe la entrada desde un dispositivo de obtención de imágenes 102. El dispositivo de obtención de imágenes adquiere todos los datos de imágenes y los registra, junto con todos los metadatos que los describen. El dispositivo de obtención de imágenes serializará a continuación los datos en un flujo que puede ser leído por el controlador 200. El flujo de datos puede acomodar cualquier tipo de flujo de datos binario, tal como el sistema de archivos, un RDBM o comunicaciones directas TCP/IP. Para el uso del flujo de datos, se muestra que el controlador 200 incluye un separador espectral(spectral unmixer)210. El separador espectral 210 puede recibir datos de imágenes de un dispositivo de obtención de imágenes 102 en el que realiza una separación espectral para separar una imagen que presenta varias longitudes de onda en canales individuales y discretos para cada banda de longitudes de onda. Por ejemplo, los datos de imágenes pueden «separarse» en canales separados para cada uno de los diversos fluoróforos utilizados para identificar células o proteínas de interés en la muestra de tejido. El fluoróforo, a modo de ejemplo solamente, puede ser uno o más del grupo que consiste en DAPI, Cy® 2, Cy® 3, Cy® 3.5, Cy® 5, FITC, TRITC, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 555, Alexa Fluor® 594 y rojo Texas. En un ejemplo, uno de los canales puede incluir datos de imágenes que están dentro de una banda predeterminada que rodea una longitud de onda de 461 nm (la longitud de onda de emisión máxima para DAPI), para identificar núcleos en la imagen. Otros canales pueden incluir datos de imágenes para diferentes longitudes de onda para identificar diferentes porciones de la muestra de tejido utilizando diferentes fluoróforos.
También se muestra que el controlador 200 incluye varios enmascaradores, como el enmascarador de células 212, el enmascarador de área del subconjunto 216 y el enmascarador de biomarcador 222. Estos, u otros enmascaradores que pueden incluirse en el controlador 200, se utilizan para recibir una señal separada del separador espectral 210 y crear una máscara para la célula o área de interés particular, dependiendo del fluoróforo utilizado para identificar ciertas características de interés en la muestra de tejido. Para crear una máscara, los enmascaradores (tales como el enmascarador de células 212, el enmascarador de área de subconjunto 216 y el enmascarador de biomarcador 222) reciben datos de imágenes relacionados con la intensidad de cada píxel en el campo de visión. La intensidad de píxeles es directamente proporcional a la cantidad de fluorescencia emitida por la muestra, que a su vez es directamente proporcional a la cantidad de biomarcador de proteínas en la muestra (cuando se utiliza un fluoróforo para identificar un biomarcador en particular). Se puede establecer un umbral absoluto en función de los valores que existen en los píxeles de la imagen. Todos los píxeles que sean mayores o iguales que el valor de umbral se cartografiarán como 1,0, o «activado», y todos los demás píxeles se cartografiarán como 0,0, o «desactivado». De esta manera, se crea una máscara binaria para identificar la porción de células o de tejido de interés en el campo de visión. Se puede crear una máscara utilizando un límite inferior en donde se aceptan todos los píxeles con una intensidad igual o superior a un límite inferior y se utilizan como valor de píxel para la máscara. Si la intensidad está por debajo del límite inferior, el valor de píxel se establece como 0,0 o «desactivado».
En el diagrama de flujo de ejemplo para enmascaramiento que se muestra en laFIG. 14,se muestra que los canales de tinte DAPI y 488 (u otro fluoróforo para identificar núcleos y áreas tumorales, respectivamente) utilizan el protocolo de límite inferior (pasos 1410, 1412, 1420, 1422), mientras que el canal Cy5 (u otro fluoróforo para identificar un biomarcador de interés) utiliza un protocolo de valor umbral (paso 1430), para proporcionar la salida de máscara. En asociación con el protocolo de límite inferior, también hay un paso de histograma para determinar el límite inferior. En particular,el umbral de histograma(paso 1412, 1422) produce un umbral de una imagen de entrada, pero utiliza una escala deslizante para determinar el punto en el que se produce el umbral. Las entradas son la imagen actual y unporcentaje de umbraldefinido por el usuario. Este último se utiliza para determinar en qué porcentaje de la intensidad total se debe establecer el nivel de umbral. En primer lugar, la intensidad de cada píxel se suma a una intensidad total. Elporcentaje de umbralse multiplica por esta intensidad total para obtener una suma de corte. Por último, todos los píxeles se agrupan por intensidad (en un histograma) y sus intensidades se suman de menor a mayor (intervalo por intervalo(bin by bin))hasta que se alcanza la suma de corte. La última intensidad de píxel más alta visitada en el proceso es el umbral de la imagen actual. Todos los píxeles con intensidades superiores a ese valor tienen sus intensidades establecidas en el máximo, mientras que todos los demás se establecen en el mínimo.
Los pasos identificados como los pasos 1414, 1416, 1424, 1426, 1428, 1432, 1434, 1436 en laFIG. 14representan los pasos intermedios que se producen en los enmascaradores iniciales, tales como el enmascarador de células 212 (pasos 1414, 1416), el enmascarador de área de subconjunto 216 (pasos 1424, 1426, 1428) y el enmascarador de biomarcador 222 (pasos 1432, 1434, 1436). Estos pasos se definen de la siguiente manera:
Dilataraumenta el área de las regiones más brillantes de una imagen. Se necesitan dos entradas paradilatar.La primera es la imagen actual implícita y la segunda es el número deiteracionespara dilatar. Se asume que solo se utilizan imágenes binarias para la primera entrada. El procedimiento funcionará en imágenes continuas, pero la salida no será unadilataciónválida. El proceso dedilatacióncomienza encontrando primero la intensidad máxima de píxeles en la imagen. Posteriormente, cada píxel de la imagen se examina una vez. Si el píxel bajo investigación tiene una intensidad igual a la intensidad máxima, ese píxel se dibujará en la imagen de salida como un círculo con un radio deiteracionesy centrado en el píxel original. Todos los píxeles de ese círculo tendrán una intensidad igual a la intensidad máxima. Todos los demás píxeles se copian en la imagen de salida sin modificaciones.
El procedimiento derellenado de huecosrellenará las regiones «vacías» de una imagen con píxeles a la intensidad máxima. Estas regiones vacías son aquellas que tienen una intensidad mínima y cuyo área de píxeles(tamaño)es la especificada por el usuario. La imagen actual yel tamañoson las dos entradas necesarias. Al igual quedilatar,este procedimiento solo debe aplicarse a imágenes binarias.
Erosionarprocesa las imágenes de la misma manera quedilatar.Todas las funciones son las mismas quedilatar,excepto que el primer paso determina la intensidad mínima de la imagen, solo los píxeles que coinciden con la intensidad más baja se alteran y los círculos utilizados para expandir los píxeles de intensidad mínima encontrados se llenan con el valor de intensidad más bajo. Al igual quedilatar,este procedimiento solo debe aplicarse a imágenes binarias.
Eliminar objetos.Se esperan dos entradas: la imagen actual yel tamaño del objeto. La eliminación de objetoses lo contrario al procedimiento derellenado de huecos.Cualquier región que contenga solo píxeles con una intensidad máxima que llene un área menor que eltamaño del objetode entrada se establecerá en la intensidad mínima y, por lo tanto, se “eliminará”. Este procedimiento sólo debe aplicarse a imágenes binarias; la aplicación a imágenes continuas puede producir resultados inesperados.
Las salidas en los pasos 1418, 1429 y 1438 son la máscara de células resultante, la máscara de subconjunto (o, en este ejemplo particular, la máscara de área tumoral) y la máscara de células biomarcadoras, respectivamente. LaFIG. 14describe además las combinaciones de estas máscaras resultantes para obtener la información de área relevante para la puntuación de PBP. Estas combinaciones se describen a continuación con referencia a los enmascaradores de combinación del controlador 200, representados en laFIG. 13.
Se muestra que el controlador 200 incluye enmascaradores de combinación, tales como el enmascarador de células de subconjunto 218, el enmascarador de células que no son de un subconjunto 220 y el enmascarador de combinación 230. Las células del subconjunto identificadas por el enmascarador 218 y las células que no son de un subconjunto identificadas por el enmascarador 220 pueden ser células tumorales y células no tumorales, respectivamente. El enmascarador de células de subconjunto realiza una operaciónAnd,como se muestra en el paso 1452 de laFIG. 14,para combinar la salida del enmascarador de células 212 (representativo de todas las células de la imagen) con la salida del enmascarador de área de subconjunto 216. En consecuencia, el enmascarador de células de subconjunto genera una máscara de todas las células de subconjunto de la imagen. Esta misma combinación, utilizando una operaciónSalidarealizada por el enmascarador de células que no son de un subconjunto 220 como se muestra en el paso 1454 en laFIG. 14,genera una máscara de todas las celdas que no son de un subconjunto en la imagen de muestra.
El enmascarador de combinación 230 está configurado para combinar dos máscaras de entrada. Como se muestra en laFIG. 14,el enmascarador de combinación 230 combina la máscara de biomarcador con una de entre la máscara de células de subconjunto (del enmascarador de células de subconjunto 218) o una máscara de células que no son de un subconjunto (del enmascarador de células que no son de un subconjunto 220), o ambas máscara de biomarcador máscara de subconjunto y máscara de biomarcador máscara que no es de un subconjunto. Las líneas de puntos representan que una o ambas máscaras de células pueden combinarse con la máscara de biomarcador en el enmascarador de combinación 230. El resultado del enmascarador de combinación 230 es una máscara representativa de todas las células de subconjunto que son positivas para el biomarcador y/o todas las células que no son de un subconjunto que son positivas para el biomarcador. El enmascarador de combinación 230 puede combinar las máscaras de una manera alternativa, de modo que el resultado del enmascarador de combinación 230 sea una máscara representativa de las células de subconjunto que no son positivas para el biomarcador (biomarcador negativo). Si las células de interés no están relacionadas específicamente con el subconjunto, por ejemplo, tumor o no tumor, sino más bien, todas las células, entonces la máscara positiva para el biomarcador no se combina con ninguna máscara adicional y pasa a través del enmascarador de combinación 230 sin modificación.
Para calcular el % de puntuación de positividad para un biomarcador (PBP), el área de la máscara positiva para el biomarcador o la máscara negativa para el biomarcador (en cuyo caso la puntuación representa la negatividad para el biomarcador) de las células de subconjunto seleccionadas (p. ej., todas, tumorales o no tumorales) se determina en píxeles en el evaluador de área 232. El área total de todas las células seleccionadas (positivas y negativas para el biomarcador), se determina en píxeles en el evaluador de área 232. Las líneas de puntos que terminan en el evaluador de área 232 indican que las entradas de área total pueden ser una o más de la máscara de todas las células, la máscara de células de subconjunto y la máscara de células que no son de un subconjunto, que se calcularán por separado. Se determina un porcentaje de la puntuación de positividad para un biomarcador en la calculadora de positividad 236. La puntuación de BPB se puede calcular dividiendo el área de la máscara positiva para el biomarcador celular seleccionado del evaluador de área 232 por el área de todas la máscaras de células seleccionadas del evaluador de área 232 y multiplicando 100. La ecuación ejecutada por la calculadora de interacción 236 es:
AP BPB =- /x lO O
a a
en donde A<p>es un área positiva para el biomarcador para el tipo seleccionado de células de subconjunto (p. ej., todas, tumorales o no tumorales) y A<a>es el área total de todas las células del tipo celular seleccionado (todas, tumorales, no tumorales). Del mismo modo, A<n>podría reemplazar A<p>en la ecuación anterior, en donde A<n>es un área negativa para el biomarcador para el tipo celular seleccionado (p. ej., todas, tumorales o no tumorales), para determinar una puntuación representativa del porcentaje de negatividad para el biomarcador para el tipo de célula de subconjunto.
El procedimiento And se modela basándose en una operación AND binaria, pero difiere en formas significativas. And acepta la imagen actual y un resultado seleccionado por el usuario. La salida es una imagen creada realizando una multiplicación de las intensidades normalizadas de píxeles coincidentes de las dos imágenes de entrada. En algunos casos, los datos de intensidad de la imagen ya están normalizados. Por lo tanto, el procedimiento And es simplemente una multiplicación por píxeles de las dos imágenes. Las dos entradas necesarias paraSalidason la imagen actual y un resultado seleccionado por el usuario.Salidaelimina la segunda imagen de la primera de acuerdo con la fórmula A * (1 -B/B<máx>) donde A es la imagen actual, B la imagen seleccionada por el usuario que se va a eliminar y B<máx>es la intensidad máxima de B. Tenga en cuenta que la división de B por B<máx>normaliza B.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Preparación de muestras, obtención de imágenes y análisis de imágenes para muestras de tejido de melanoma de pacientes humanos
Preparación de las muestras.Se desparafinaron muestras de tejido fijadas en formol e incrustadas en parafina (FFPE, por sus siglas en inglés). A continuación, los portaobjetos se rehidrataron a través de una serie de lavados de xileno a alcohol antes de incubarlos en agua destilada. A continuación, se realizó la recuperación del antígeno inducida por calor usando condiciones de presión y temperatura elevadas, se dejó enfriar y se transfirió a solución salina tamponada con Tris. A continuación, se realizó una tinción donde se llevaron a cabo los siguientes pasos. En primer lugar, se bloqueó la peroxidasa endógena, seguido de la incubación con una solución bloqueante de proteínas para reducir la tinción inespecífica de anticuerpos. A continuación, los portaobjetos se tiñeron con un anticuerpo primario anti-PD1 de ratón. Después, los portaobjetos se lavaron antes de la incubación con un anticuerpo secundario anti-ratón HRP. Los portaobjetos se lavaron y después se detectó la tinción de PD-1 utilizando TSA+ Cy® 3.5 (Perkin Elmer). Cualquier HRP residual se desactivó a continuación con dos lavados de benzhidrazida fresca 100 mM con peróxido de hidrógeno 50 mM. Los portaobjetos se lavaron de nuevo antes de teñirlos con un anticuerpo primario anti-PD-L1 de conejo. Los portaobjetos se lavaron y después se incubaron con un cóctel de anticuerpo secundario anti-conejo HRP más anti-S100 de ratón marcado directamente con tinte 488 y 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Los portaobjetos se lavaron y después se detectó la tinción de PD-L1 utilizando TSA-Cy® 5 (Perkin Elmer). Los portaobjetos se lavaron por última vez antes de cubrirlos con medios de montaje y se dejaron secar durante una noche a temperatura ambiente. En laFIG. 1se muestra una descripción esquemática de los anticuerpos y los reactivos de detección.
Obtención de imágenes y análisis de las muestras.A continuación, se adquirieron imágenes de fluorescencia usando el sistema de análisis de portaobjetos inteligente Vectra 2 usando el software Vectra versión 2.0.8 (Perkin Elmer). En primer lugar, se obtuvieron imágenes monocromáticas del portaobjetos con un aumento de 4x utilizando DAPI. Se utilizó un algoritmo automatizado (desarrollado con inForm) para identificar las áreas del portaobjetos que contenían tejido.
Se obtuvieron imágenes de las áreas del portaobjetos en las que se identificó que contenían tejido con un aumento de 4x para los canales asociados con DAPI (azul), FITC (verde) y Cy® 5 (rojo) para crear imágenes RGB. Estas imágenes con un aumento de 4x se procesaron usando un algoritmo de enriquecimiento automático (desarrollado con inForm) en el selector de campo de visión 104 para identificar y clasificar posibles campos de visión con un aumento de 20x de acuerdo con la expresión de Cy® 5 más alta.
Se obtuvieron imágenes de los 40 campos de visión superiores con un aumento de 20x en las longitudes de onda de DAPI, FITC, rojo Texas y Cy® 5. Se revisó la aceptabilidad de las imágenes sin procesar, y las imágenes que estaban desenfocadas, carecían de células tumorales, presentaban mucha necrosis o contenían niveles elevados de señal de fluorescencia no asociada con la localización esperada del anticuerpo (es decir, tinción de fondo) se rechazaron antes del análisis. Las imágenes aceptadas se procesaron utilizando AQUAduct (Perkin Elmer), en donde cada fluoróforo se separó espectralmente mediante un separador espectral 210 en canales individuales y se guardó como un archivo separado.
Los archivos procesados se analizaron más a fondo utilizando AQUAnalysis™ o mediante un proceso completamente automatizado utilizando AQUAserve™. Los detalles fueron los siguientes.
Cada imagen de DAPI fue procesada por el enmascarador de células 212 para identificar todos los núcleos celulares dentro de esa imagen (FIG. 2a) y después se dilató en 3 píxeles para representar el tamaño aproximado de una célula completa. Esta máscara resultante representaba todas las células dentro de esa imagen (FIG. 2b).
S100 (marcador de células tumorales para melanoma) detectado con el tinte 488 (FIG. 3a) fue procesado por el enmascarador tumoral 216 para crear una máscara binaria de toda el área tumoral dentro de esa imagen (FIG. 3b). La superposición entre esta máscara y la máscara de todas las células creó una nueva máscara para las células tumorales (FIG. 3c).
De manera similar, la ausencia del marcador de células tumorales en combinación con la máscara de todos los núcleos creó una nueva máscara para todas las células no tumorales (FIG. 3d),realizada por el enmascarador de células no tumorales 220.
Cada imagen de Cy® 5 (FIG. 4a)fue procesada por un enmascarador de biomarcadores 222 para crear una máscara binaria de todas las células que son positivas para PD-L1 (FIG.4b).La superposición entre la máscara de todas las células tumorales y la máscara de todas las células positivas para PD-L1, utilizando el enmascarador de combinación 230, creó una nueva máscara de todas las células tumorales positivas para PD-L1 (FIG. 4c).De manera similar, la superposición entre la máscara de todas las células no tumorales y la máscara de todas las células positivas para PD-L1, utilizando el enmascarador de combinación 230, creó una nueva máscara de todas las células no tumorales positivas para PD-L1 (FIG.
4d).
Cada imagen de Cy® 3.5 (FIG. 5a) se superpuso con la máscara de todas las células no tumorales para crear una máscara binaria de todas las células que son positivas para PD-1 (FIG. 5b).
El % de positividad para un biomarcador (PBP) para todas las células tumorales que expresaban PD-L1 se obtuvo, usando una calculadora de positividad 236, dividiendo el área total, medida en píxeles y determinada por el evaluador de área 232, de la máscara de todas las células tumorales positivas para PD-L1 (FIG. 4c) por el área total, medida en píxeles y determinada por el evaluador de área 232, de la máscara de todas las células tumorales (FIG. 3c).Los valores representativos de PBP para todas las células que expresan PD-L1 se muestran en laFIG. 6a(datos ordenados según la expresión creciente).
El PBP para todas las células no tumorales que expresaban PD-1 se obtuvo dividiendo el área total, medida en píxeles, de la máscara de todas las células no tumorales positivas para PD-1 (FIG. 5b)por el área total, medida en píxeles, de la máscara de todas las células no tumorales(FIG. 3d).Los valores representativos de PBP para todas las células no tumorales que expresan PD-1 se muestran en laFIG. 6b(datos ordenados según la expresión creciente).
LasFIG. 7y8muestran ejemplos representativos de máscaras superpuestas que indican células positivas para PD-L1 (rojo), células positivas para PD-L (amarillo), células tumorales (S100, verde) y todas las células (DAPI, azul). Para una respuesta positiva a la inmunoterapia, la máscara en laFIG. 7indica fácilmente la presencia de células positivas para PD-L1 (rojo), células positivas para PD-1 (amarillo) y todas las células tumorales (verde). Por el contrario, para una respuesta negativa a la inmunoterapia, la máscara en laFIG. 8indica la presencia de células tumorales (S100, verde) y todas las células (DAPI, azul), pero muestra pocas o ningunas células positivas para PD-L1 (rojo) o células positivas para PD-1 (amarillo).
Ejemplo 2 Preparación de muestras, obtención de imágenes y análisis de imágenes para muestras de tejido de carcinoma pulmonar no microcítico (NSCLC) de pacientes humanos.
Se realizaron procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo el anti-S100 de ratón marcado directamente con tinte 488 por un anti-pan citoqueratina de ratón marcado directamente con tinte 488 para muestras de tumores epiteliales. Los valores de PBP para PD-1 y PD-L1 se muestran en laFIG. 9.Un subconjunto de estos pacientes exhibió niveles elevados de interacción receptor-ligando que recordaban la supresión inmunitaria.
Ejemplo 3. Comparación de técnicas de análisis
Para generar especímenes de control, se cultivaron líneas celulares de linfoma con expresión establecida previamente de PD-L1 (Karpas 299) o falta de expresión (Ramos RA 1) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, las células se contaron y las dos líneas celulares fueron mezcladas en porcentajes variables para generar una serie de bloques de pelets de líneas celulares FFPE con una variación en la expresión de PD-L1 de un 0 a un 100 %. Se utilizaron a continuación núcleos (600 |jm) de estas mezclas de líneas celulares, así como de resecciones normales de tejido de las amígdalas, para crear una micromatriz tisular (TMA, por sus siglas en inglés). A continuación, una sección de esta TMA se tiñó, se obtuvieron imágenes y a continuación se calificó cada núcleo para el % de positividad para PD-L1 usando AQUAnalysis™ (todos los pasos como se describe en el Ejemplo 1) y los resultados se muestran en el eje Y de laFIG. 10,donde cada punto representa un núcleo único (campo de visión único).
Como alternativa, las mismas imágenes se cuantificaron para el % de expresión de PD-L1 utilizando un software basado en el recuento celular para la comparación de la siguiente manera. Se utilizó DAPI para identificar primero cada núcleo celular y después se creó un citoplasma morfológico alrededor de los núcleos celulares identificados. Se estableció un umbral de intensidad para identificar células con expresión de PD-L1 en el citoplasma de las células. El número total de células identificadas por encima de este umbral se dividió entonces por el número total de células en la imagen para determinar el % de células positivas para PD-L1 en cada núcleo y los resultados se muestran en el eje X de laFIG. 10.
En general, hubo un nivel elevado de concordancia entre los dos métodos de recuento celular (R2 = 0,86, pendiente 1,1); sin embargo, hubo tres valores atípicos perceptibles etiquetados como A, B, C en laFIG. 10donde el%de positividad para PD-L1 determinado por la puntuación AQUA® fue significativamente mayor que el del método de recuento celular. Los puntos A y B fueron núcleos de líneas celulares donde un 100 % de las células eran Karpas299 y por lo tanto los valores determinados por la puntuación AQUA® estaban mucho más cerca de lo esperado y el método de recuento celular no pudo identificar el citoplasma de las células como positivo para PD-L1. Del mismo modo, en el punto C, la mezcla celular incluyó un 40 % teórico de células Karpas299 donde el valor determinado por la puntuación AQUA® estuvo de nuevo mucho más cerca de lo esperado respecto al método de recuento celular. Estos resultados demostraron la superioridad de los métodos divulgados en el presente documento respecto al software basado en el recuento celular.
Ejemplo 4. Preparación de muestras, obtención de imágenes y análisis de imágenes para muestras de tejido con células que expresan PD-L1 y células que expresan CD80.
Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-1 por la tinción y el análisis de CD80.
Ejemplo 5. Preparación de muestras, obtención de imágenes y análisis de imágenes para muestras de tejido con células que expresan CTLA-4 y células que expresan CD80.
Preparación de la muestraLas muestras de tejido incluídas en parafina y fijadas en formol (FFPE) se desparafinaron, se rehidrataron y se realizó la recuperación del antígeno en condiciones de temperatura elevada. A continuación, se realizó una tinción donde se llevaron a cabo los siguientes pasos. En primer lugar, los tejidos fueron sometidos a detección de la expresión de CTLA-4 usando 20 pares de sondas de hibridación que abarcan aproximadamente 1 kb del ARNm de CTLA-4 usando RNAScope® (Advanced Cell Diagnostics). La hibridaciónin situse visualizó con TSA-Cy®3. Los portaobjetos se lavaron y cualquier HRP residual se desactivó a continuación con dos lavados de benzhidrazida fresca 100 mM con peróxido de hidrógeno 50 mM. Los portaobjetos se lavaron de nuevo antes de teñirlos con un anticuerpo primario anti-CD80 de ratón. Los portaobjetos se lavaron y después se incubaron con un anticuerpo secundario anti-ratón HRP. Los portaobjetos se lavaron y después se detectó la tinción de CD80 utilizando TSA-Cy® 5 (Perkin Elmer). Cualquier HRP residual se desactivó a continuación con dos lavados de benzhidrazida fresca 100 mM con peróxido de hidrógeno 50 mM. Los portaobjetos se lavaron de nuevo antes de teñirlos con un anticuerpo primario anti-CD3 de conejo. Los portaobjetos se lavaron y después se incubaron con un cóctel de anticuerpo secundario anti-conejo HRP más 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Los portaobjetos se lavaron y después se detectó la tinción de CD3 utilizando TSA-AlexaFluor488® (Life Technologies). Los portaobjetos se lavaron por última vez antes de cubrirlos con medios de montaje y se dejaron secar durante una noche a temperatura ambiente.
Se realizaron procedimientos de obtención de imágenes y análisis análogos a los del Ejemplo 1, obteniendo las imágenes en las longitudes de onda de DAPI, FITC, Cy® 3 y Cy® 5. Se utilizó la expresión de CT<l>A-4 y CD80 para desarrollar un algoritmo de enriquecimiento para la adquisición de imágenes 20x. Se realizó un análisis para estudiar la prevalencia de CTLA-4 en linfocitos T positivos para CD3 y expresión de CD80 en muestras tumorales tomadas de pacientes con melanoma metastásico. Los resultados se muestran en lasFIGS. 31ay31b
Ejemplo 6. Preparación de muestras, obtención de imágenes y análisis de imágenes para muestras de tejido con células que expresan PD-L2 y células que expresan PD-1.
Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 por la tinción y el análisis de PD-L2.
Ejemplo 7. Preparación de muestras, obtención de imágenes y análisis de imágenes para muestras de tejido con células que expresan CTLA-4 y células que expresan CD86.
Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de CTLA-4 y CD86.
Ejemplo 8. Preparación de muestras, obtención de imágenes y análisis de imágenes para muestras de tejido con células que expresan LAG-3 y células que expresan HLA-DR.
Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de LAG-3 y HLA-DR.
Ejemplo 9. Preparación de muestras, obtención de imágenes y análisis de imágenes para muestras de tejido con células que expresan TIM-3 y células que expresan galectina 9.
Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de TIM-3 y galectina 9.
Ejemplo 10. Preparación de muestras, obtención de imágenes y análisis de imágenes para muestras de tejido con células que expresan 41BB y células que expresan 4.1BBL.
Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de 41BB y 4.1 BBL.
Ejemplo 11. Preparación de muestras, obtención de imágenes y análisis de imágenes para muestras de tejido con células que expresan OX40 y células que expresan OX40L.
Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de OX40 y OX40L.
Ejemplo 12. Preparación de muestras, obtención de imágenes y análisis de imágenes para muestras de tejido con células que expresan CD40 y células que expresan CD40L.
Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de CD40 y CD40L.
Ejemplo 13. Preparación de muestras, obtención de imágenes y análisis de imágenes para muestras de tejido con células que expresan ICOS y células que expresan ICOSL.
Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de ICOS e ICOSL.
Ejemplo 14. Preparación de muestras, obtención de imágenes y análisis de imágenes para muestras de tejido con células que expresan GITR y células que expresan GITRL.
Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de GITR y GITRL.
Ejemplo 15. Preparación de muestras, obtención de imágenes y análisis de imágenes para muestras de tejido con células que expresan HLA-DR y células que expresan TCR.
Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de HLA-DR y TCR.
Ejemplo 16. Preparación de muestras, obtención de imágenes y análisis de CD3 y PD-1 en muestras de tejido de pacientes con linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL, por sus siglas en inglés)
Preparación de las muestras.Se desparafinaron muestras de tejido incluidas en parafina fijadas en formol (FFPE) de pacientes con DLBCL (n = 43). A continuación, los portaobjetos se rehidrataron a través de una serie de lavados de xileno a alcohol antes de incubarlos en agua destilada. A continuación, se realizó la recuperación del antígeno inducida por calor usando condiciones de presión y temperatura elevadas, se dejó enfriar y se transfirió a solución salina tamponada con Tris. A continuación, se realizó una tinción donde se llevaron a cabo los siguientes pasos. En primer lugar, se bloqueó la peroxidasa endógena, seguido de la incubación con una solución bloqueante de proteínas para reducir la tinción inespecífica de anticuerpos. A continuación, los portaobjetos se tiñeron con un anticuerpo primario anti-PD1 de ratón. Después, los portaobjetos se lavaron antes de la incubación con un anticuerpo secundario anti-ratón HRP. Los portaobjetos se lavaron y después se detectó la tinción de PD-1 utilizando TSA+ Cy® 3 (Perkin Elmer). A continuación, los reactivos de anticuerpos primarios y secundarios se eliminaron mediante microondas. Los portaobjetos se lavaron de nuevo antes de teñirlos con un anticuerpo primario anti-CD3 de conejo. Los portaobjetos se lavaron y después se incubaron con un cóctel de anticuerpo secundario anti-conejo HRP más 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Los portaobjetos se lavaron y después se detectó la tinción de CD3 utilizando TSA-Cy® 5 (Perkin Elmer). Los portaobjetos se lavaron por última vez antes de cubrirlos con medios de montaje y se dejaron secar durante una noche a temperatura ambiente. En laFIG. 15se muestra una descripción esquemática de los anticuerpos y los reactivos de detección.
Obtención de imágenes y análisis de las muestras.A continuación, se adquirieron imágenes de fluorescencia usando el sistema de análisis de portaobjetos inteligente Vectra 2 usando el software Vectra versión 2.0.8 (Perkin Elmer). En primer lugar, se obtuvieron imágenes monocromáticas del portaobjetos con un aumento de 4x utilizando DAPI. Se utilizó un algoritmo automatizado (desarrollado con inForm) para identificar las áreas del portaobjetos que contenían tejido.
Se obtuvieron imágenes de las áreas del portaobjetos en las que se identificó que contenían tejido con un aumento de 4x para los canales asociados con DAPI (azul), Cy®3 (verde) y Cy® 5 (rojo) para crear imágenes RGB. Estas imágenes con un aumento de 4x se procesaron usando un algoritmo de enriquecimiento automático (desarrollado con inForm) en el selector de campo de visión 104 para identificar y clasificar posibles campos de visión con un aumento de 20x de acuerdo con la expresión de Cy® 3 más alta.
Se obtuvieron imágenes de los 40 campos de visión superiores con un aumento de 20x en las longitudes de onda de DAPI, Cy®3 y Cy® 5. Se revisó la aceptabilidad de las imágenes sin procesar, y las imágenes que estaban desenfocadas, carecían de células tumorales, presentaban mucha necrosis o contenían niveles elevados de señal de fluorescencia no asociada con la localización esperada del anticuerpo (es decir, tinción de fondo) se rechazaron antes del análisis. Las imágenes aceptadas se procesaron utilizando AQUAduct (Perkin Elmer), en donde cada fluoróforo se separó espectralmente mediante un separador espectral 210 en canales individuales y se guardó como un archivo separado.
Los archivos procesados se analizaron más a fondo utilizando AQUAnalysis™ o mediante un proceso completamente automatizado utilizando AQUAserve™. Los detalles fueron los siguientes.
Cada imagen de DAPI fue procesada por el enmascarador de células 212 para identificar todos los núcleos celulares dentro de esa imagen (FIG. 16a) y después se dilató en 2 píxeles para representar el tamaño aproximado de una célula completa. Esta máscara resultante representaba todas las células dentro de esa imagen (FIG. 16b).
Cada imagen de Cy® 5 (FIG. 17a)fue procesada por un enmascarador de biomarcadores 222 para crear una máscara binaria de todas las células que son positivas para PD-1 (FIG. 17b).
Cada imagen de Cy® 3 (FIG. 18a)fue procesada por un enmascarador de biomarcadores 222 para crear una máscara binaria de todas las células que son positivas para CD3 (FIG. 18b).
Las máscaras binarias para todas las células positivas para PD-1 y positivas para CD3 se combinaron para crear una máscara binaria de todas las células que son doblemente positivas para PD-1 y CD3 (FIG. 19).
El % de positividad para un biomarcador (PBP) para todas las células CD3 que expresaban PD-1 se obtuvo, usando una calculadora de positividad 236, dividiendo el área total, medida en píxeles y determinada por el evaluador de área 232, de la máscara de todas las células positivas para PD-1 (FIG. 17b) por el área total, medida en píxeles y determinada por el evaluador de área 232, de la máscara de todas las células positivas para CD3 (FIG. 18b).Se observó una distribución diferencial de los linfocitos T agotados (CD3+/PD1+) en sitios primarios (niveles bajos) frente a secundarios (niveles elevados). Los resultados se muestran en lasFIGS. 20ay20b
Ejemplo 17. Comparación de plataformas
La precisión de los procedimientos análogos a los Ejemplos 1 y 16 se confirmó mediante la comparación con la citometría de flujo. Las frecuencias de los linfocitos T reguladores (basadas en la expresión de FoxP3 y CD25) se determinaron en sangre com l im l n IL-2 T F D2 r n í n n l r i r n D .
Ejemplo 18. Evaluación de los linfocitos T CD25/FoxP3 en múltiples indicaciones tumorales
Se realizaron procedimientos análogos a los del Ejemplo 16 con la identificación adicional de células tumorales con anticuerpos anti-S100 o anti-citoqueratina detectados con un anticuerpo secundario AlexaFluor488 y se obtuvieron imágenes en las longitudes de onda de DAPI, FITC, Cy® 3 y Cy® 5 para la evaluación cuantitativa de CD25 y FoxP3 en tejidos de NSCLC, gástrico y de melanoma. Los tejidos se tiñeron con anticuerpos que reconocían CD25 y FoxP3 y su expresión en áreas no tumorales se calculó como % de expresión. La prevalencia de los linfocitos T CD25/FoxP3+ varió entre un 1 % y un 10 % en especímenes de archivo de tejido pulmonar, gástrico y de melanoma. Los resultados se muestran en lasFIG. 21y22.
Ejemplo 19. Evaluación de los linfocitos T CD4/CD8 en múltiples indicaciones tumorales
Se realizaron procedimientos análogos a los del Ejemplo 16 con la identificación adicional de células tumorales con anticuerpos anti-S100 o anti-citoqueratina detectados con un anticuerpo secundario AlexaFluor488 y se obtuvieron imágenes en las longitudes de onda de DAPI, FITC, Cy® 3 y Cy® 5 para la evaluación cuantitativa de CD4 y CD8 en tejidos de NSCLC, gástrico y de melanoma. Los tejidos se tiñeron con anticuerpos que reconocían CD4 y CD8 y su expresión en áreas no tumorales se calculó como % de expresión. Se observó un amplio intervalo de expresión (10 %-50 %) para los linfocitos T CD4+ y CD8+ en secciones secuenciales de los especímenes tumorales. Los resultados se muestran en lasFIGS. 23ay23b
Ejemplo 20. Evaluación de células similares a las células supresoras derivadas de origen mieloide (MDSC, por sus siglas en inglés) en muestras tumorales de pacientes diagnosticados con melanoma metastásico o cáncer de pulmón no microcítico.
Para identificar células similares a MDSC que expresan marcadores fenotípicos característicos de las células mieloides (p. ej., CD11b, CD33 y HLA-DR) y marcadores bioquímicos (p. ej., ARG1 e IDO-1) que desempeñan la función supresora sobre estas células, las muestras se tiñeron con CD11b, HlA-d R, e IDO, o CD11 b, CD33, y A r G1.
Se utilizó la expresión diferencial de CD11b, HLA-DR e IDO-1 para estudiar la presencia de un subconjunto de células mieloides supresoras conocidas como TAM (siglas en inglés de macrófagos asociados a tumores) en biopsias tumorales de pacientes con melanoma metastásico. Los subfenotipos representativos que pueden ser relevantes para predecir la respuesta a las inmunoterapias contra el cáncer se muestran en lasFIG. 24a, 24b,25ay25b.
Se utilizaron expresiones diferenciales de CD11 b, CD33 y ARG-1 o CD11 b, HLA-DR e IDO-1 para estudiar la presencia de células similares a MDSC y TAM en especímenes tumorales de pacientes con cáncer de pulmón avanzado (NSCLC). Los subfenotipos representativos que pueden ser relevantes para predecir la respuesta a las inmunoterapias contra el cáncer se muestran en lasFIG. 26a, 26by27.
Preparación de las muestras.Se desparafinaron muestras de tejido fijadas en formol e incrustadas en parafina (FFPE). A continuación, los portaobjetos se rehidrataron a través de una serie de lavados de xileno a alcohol antes de incubarlos en agua destilada. A continuación, se realizó la recuperación del antígeno inducida por calor usando condiciones de presión y temperatura elevadas, se dejó enfriar y se transfirió a solución salina tamponada con Tris. A continuación, se realizó una tinción donde se llevaron a cabo los siguientes pasos. En primer lugar, se bloqueó la peroxidasa endógena, seguido de la incubación con una solución bloqueante de proteínas para reducir la tinción inespecífica de anticuerpos. A continuación, los portaobjetos se tiñeron con un anticuerpo primario anti-IDO-1 de conejo o anti-CD33 de ratón. Después, los portaobjetos se lavaron antes de la incubación con un anticuerpo secundario anti-conejo o anti-ratón HRP. Los portaobjetos se lavaron y después se detectó la tinción de anti-IDO-1 o anti-CD33 utilizando<t>S<a>+ Cy® 5 (Perkin Elmer). Cualquier HRP residual se desactivó a continuación con dos lavados de benzhidrazida fresca 100 mM con peróxido de hidrógeno 50 mM. Los portaobjetos se lavaron de nuevo antes de teñirlos con un anticuerpo primario anti-HLA-DR de ratón o anti-ARG1 de conejo. Los portaobjetos se lavaron y después se incubaron con un anticuerpo secundario anti-ratón o anti-conejo HRP. Los portaobjetos se lavaron y después se detectó la tinción con anti-HLA-DR o anti-ARG1 utilizando TSA-Cy® 3 (Perkin Elmer). A continuación, los reactivos de anticuerpos primarios y secundarios se eliminaron mediante microondas. Los portaobjetos se lavaron de nuevo antes de teñirlos con un anticuerpo anti-CD11b de conejo. Los portaobjetos se lavaron y después se incubaron con un cóctel de anticuerpo secundario anti-conejo HRP más 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Los portaobjetos se lavaron y después se detectó la tinción con anti-CD11b utilizando TSA-AlexaFluor488 (Life Technologies). Los portaobjetos se lavaron por última vez antes de cubrirlos con medios de montaje y se dejaron secar durante una noche a temperatura ambiente.
Se utilizaron procedimientos análogos a los del Ejemplo 16 para la obtención de imágenes y el análisis de las muestras en longitudes de onda de DAPI, FITC, Cy®3 y Cy®5. Las imágenes con un aumento de 4x se procesaron usando un algoritmo de enriquecimiento automático (desarrollado con inForm) en el selector de campo de visión 104 para identificar y clasificar posibles campos de visión con un aumento de 20x de acuerdo con la expresión de Cy® 3 y Cy® 5 más alta.
Cada imagen de DAPI fue procesada por el enmascarador de células 221 para identificar todos los núcleos celulares dentro de esa imagen y después se dilató para representar el tamaño aproximado de una célula completa. Esta máscara resultante representaba todas las células dentro de esas imágenes.
Cada imagen de AlexaFluor488® fue procesada por el enmascarador de biomarcador 222 para crear una máscara binaria de todas las células que son positivas para CD11b.
Cada imagen de Cy® 3 fue procesada por un enmascarador de biomarcadores 222 para crear una máscara binaria de todas las células que son positivas para HLA-DR o CD33.
Cada imagen de Cy® 5 fue procesada por un enmascarador de biomarcadores 222 para crear una máscara binaria de todas las células que son positivas para IDO-1 o ARG1.
Las máscaras binarias para todas las células positivas para CD11b y positivas para HLA-DR se combinaron para crear una máscara binaria de todas las células que son doblemente positivas para CD11b y HLA-DR o son positivas para CD11b y negativas para HLA-DR.
Se obtuvo el % de positividad para un biomarcador (PBP) para todas las células CD11b que carecían de expresión de HLA-DR, usando la calculadora de positividad 236, dividiendo el área total, medida en píxeles y determinada por el evaluador de área 232, de la máscara de todas las células positivas para CD11 b, negativas para HLA-DR por el área total, medida en píxeles y determinada por el evaluador de área 232, de la máscara de todas las células positivas para CD11 b. Los resultados se muestran en laFlG. 24apara muestras tumorales obtenidas de pacientes diagnosticados con melanoma metastásico.
Las máscaras binarias para todas las células positivas para CD11b, positivas para IDO y positivas para HLA-DR se combinaron para crear una máscara binaria de todas las células positivas para CD11b, negativas para<h>LA-DR y positivas para IDO-1.
La PBP para todas las células CD11b que expresaban IDO-1, pero que carecían de expresión de HLA-DR se obtuvo dividiendo el área total, medida en píxeles, de la máscara de todas las células positivas para CD11 b, negativas para HLA-DR, positivas para IDO-1 por el área total, medida en píxeles, de la máscara de todas las células positivas para CD11b. Los resultados se muestran en laFIG.24bpara muestras tumorales obtenidas de pacientes diagnosticados con melanoma metastásico y laFIG. 27para pacientes diagnosticados con cáncer de pulmón no microcítico.
Las máscaras binarias para todas las células positivas para HLA-DR y positivas para IDO-1 positivas se combinaron para crear una máscara binaria de todas las células que son doblemente positivas para HLA-DR e IDO-1.
Se obtuvo el % de positividad para un biomarcador (PBP) para todas las células HLA-DR que expresaban IDO-1, usando la calculadora de positividad 236, dividiendo el área total, medida en píxeles y determinada por el evaluador de área 232, de la máscara de todas las células positivas para IDO-1, positivas para HLA-DR por el área total, medida en píxeles y determinada por el evaluador de área 232, de la máscara de todas las células positivas para HLA-DR. Los resultados se muestran en laFIG. 25apara muestras tumorales obtenidas de pacientes diagnosticados con melanoma metastásico.
Las máscaras binarias para todas las células positivas para CD11b, positivas para IDO y positivas para HLA-DR se combinaron para crear una máscara binaria de todas las células positivas para CD11 b, positivas para h LA-DR y positivas para IDO-1.
La PBP para todas las células CD11b que expresaban IDO-1 y HLA-DR se obtuvo dividiendo el área total, medida en píxeles, de la máscara de todas las células positivas para CD11b, positivas para HLA-DR, positivas para IDO-1 por el área total, medida en píxeles, de la máscara de todas las células positivas para CD11 b. Los resultados se muestran en laFIG. 25bpara muestras tumorales obtenidas de pacientes diagnosticados con melanoma metastásico y laFIG. 26bpara muestras tumorales obtenidas de pacientes diagnosticados con cáncer de pulmón no microcítico.
Las máscaras binarias para todas las células positivas para CD11b, positivas para CD33 y positivas para ARG1 se combinaron para crear una máscara binaria de todas las células positivas para CD11b, positivas para c D33 y positivas para ARG1.
La PBP para todas las células CD11b que expresaban CD33 y ARG1 se obtuvo dividiendo el área total, medida en píxeles, de la máscara de todas las células positivas para CD11b, positivas para CD33, positivas para ARG1 por el área total, medida en píxeles, de la máscara de todas las células positivas para CD11b. Los resultados se muestran en laFIG. 26apara muestras tumorales obtenidas de pacientes diagnosticados con cáncer de pulmón no microcítico.
Ejemplo 21. Evaluación de los linfocitos T activados en muestras tumorales de pacientes diagnosticados con melanoma metastásico.
Se realizaron procedimientos análogos a los del Ejemplo 20 para teñir cada muestra con una combinación de DAPI, CD3, CD8 y Ki67 para identificar subpoblaciones de linfocitos T activados. Se estudió la prevalencia de CD8+Ki67+ en biopsias tumorales obtenidas de pacientes diagnosticados con melanoma metastásico(FIG. 28).
Ejemplo 22. Evaluación de la prevalencia de macrófagos en muestras tumorales de pacientes diagnosticados con melanoma metastásico.
Se realizaron procedimientos análogos a los del Ejemplo 16 con la identificación adicional de células tumorales con anticuerpo anti-S100 detectado con un anticuerpo secundario AlexaFluor488 y se obtuvieron imágenes en las longitudes de onda de DAPI, FITC, Cy® 3 y Cy® 5 para la evaluación cuantitativa de CD163 y CD68 en tejidos de melanoma. Los tejidos se tiñeron con anticuerpos que reconocían CD163 y CD68 y su expresión en áreas no tumorales se calculó como expresión de PBP única o expresión de PBP doble. Los resultados se muestran en lasFIG. 29a, 29by29c
Ejemplo 23. Evaluación de la prevalencia de la supresión de linfocitos T en muestras tumorales de pacientes diagnosticados con linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL) y tumores neuroendocrinos (NET).
Se realizaron procedimientos análogos a los del Ejemplo 1 para teñir los especímenes tumorales de DLBCL y NET con un anticuerpo primario anti-LAG-3 de ratón, secundario anti-ratón HRP, detectado con TSA+Cy®3.5, donde el HRP restante se desactivó con benzhidrazida 100 mM y peróxido de hidrógeno 50 mM. Después de esto, los portaobjetos se tiñeron con un anticuerpo primario anti-TIM-3 de conejo, secundario anti-conejo HRP, detectado con TSA-Cy®5. A continuación, los anticuerpos primarios y secundarios se eliminaron mediante microondas. A continuación, los tejidos se tiñeron con un anticuerpo primario anti-CD3 de conejo, secundario anti-conejo HRP más 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), detectado con Opal™520. La obtención de imágenes se realizó de forma análoga al Ejemplo 1 en las longitudes de onda de DAPI, FITC, rojo Texas y Cy® 5. El análisis se realizó de forma análoga al Ejemplo 1 para determinar la prevalencia de PBP de los linfocitos T que fueron positivos para LAG-3 y TIM-3 respectivamente. Los resultados se muestran en lasFIGS.
30ay30b
Debe entenderse que se pueden realizar cambios y modificaciones en esto de acuerdo con la el conocimiento ordinario en la técnica sin alejarse de la tecnología en sus aspectos más amplios como se define en las siguientes reivindicaciones.
La divulgación, descrita ilustrativamente en el presente documento, puede ponerse en práctica adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no divulgados específicamente en el presente documento. Por lo tanto, por ejemplo, los términos «que comprende», «que incluye», «que contiene», etc., se leerán de manera expansiva y sin limitaciones. Adicionalmente, se entenderá que la frase «que consiste esencialmente en» incluye aquellos elementos recitados específicamente y aquellos elementos adicionales que no afecten materialmente las características básicas y novedosas de la tecnología reivindicada. La frase «que consiste en» excluye cualquier elemento no especificado.
Se pueden realizar muchas modificaciones y variaciones sin alejarse del alcance de la invención definida por las reivindicaciones, como será evidente para los expertos en la técnica. La presente invención debe estar limitada solo por los términos de las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que esta divulgación no se limita a métodos, reactivos, composiciones de compuestos o sistemas biológicos particulares, que por supuesto pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir la divulgación, y no pretende ser limitante.
Además, cuando las características o aspectos de la divulgación se describan en términos de grupos de Markush, los expertos en la técnica reconocerán que la divulgación también se describe de ese modo en términos de cualquier miembro o subgrupo de miembros individual del grupo de Markush.
Como entenderá un experto en la técnica, para todos y cada uno de los propósitos, particularmente en términos de proporcionar una descripción escrita, todos los intervalos divulgados en el presente documento también abarcan todos y cada uno de los posibles subintervalos y combinaciones de subintervalos de estos. Cualquier intervalo enumerado puede reconocerse fácilmente como lo suficientemente descriptivo y que permite que el mismo intervalo se descomponga en al menos mitades, tercios, cuartos, quintos, décimos,etc.iguales. Como ejemplo no limitante, cada intervalo analizado en el presente documento puede desglosarse fácilmente en un tercio inferior, tercio medio y tercio superior,etc.Como también entenderá un experto en la técnica, todo el vocabulario tal como «hasta», «al menos», «mayor que», «menor que», y similares, incluyen el número recitado y se refieren a intervalos que pueden desglosarse posteriormente en subintervalos como se ha analizado anteriormente. Finalmente, como entenderá un experto en la técnica, un intervalo incluye a cada miembro individual.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un método para obtener un valor para el%de positividad para un biomarcador (PBP) para todas las células tumorales presentes en un campo de visión, que comprende:
i) generar una imagen de las primeras señales de fluorescencia representativas de los núcleos de todas las células presentes en un campo de visión, y dilatar las primeras señales de fluorescencia hasta un diámetro que es el de una célula entera para construir una primera máscara de todas las células presentes en el campo de visión;
ii) construir una segunda máscara de las segundas señales de fluorescencia representativas de todas las áreas presentes en el campo de visión, que expresan un biomarcador tumoral;
(iii) combinar dichas primera y segunda máscaras de manera que proporcione una tercera máscara que comprenda señales de fluorescencia representativas de todas las células tumorales en el campo de visión;
(iv) construir una cuarta máscara de las terceras señales de fluorescencia representativas de todas las áreas presentes en el campo de visión, que expresan un biomarcador de interés;
(v) combinar dichas tercera y cuarta máscaras de manera que proporcione una quinta máscara que comprenda señales de fluorescencia representativas de todas las células tumorales en el campo de visión, que también expresan el biomarcador de interés; y
(vi) obtener un valor de PBP para todas las células tumorales que expresan el biomarcador de interés dividiendo el área total de la quinta máscara por el área total de la tercera máscara.
2. El método de la reivindicación 1 en el que el biomarcador de interés comprende un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en PD-L1, galectina 9 y MHC.
3. El método de la reivindicación 2 en el que el biomarcador de interés comprende PD-L1.
4. El método de la reivindicación 2 en el que el biomarcador de
interés comprende galectina 9.
5. El método de la reivindicación 2 en el que el biomarcador de interés comprende MHC.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5 en el que el campo de visión comprende además células no tumorales.
7. El método de la reivindicación 6 en el que las células no tumorales comprenden células inmunitarias y células estromales.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en el que el área total se mide en píxeles.
9. El método de la reivindicación 8, en el que un píxel tiene 0,5 |jm de ancho.
10. Un método para controlar el progreso de un paciente diagnosticado con cáncer y sometido a inmunoterapia, que comprende:
i) utilizar al menos dos muestras que comprenden tejido tumoral tomadas de un paciente con cáncer en al menos dos momentos, uno antes y otro después del inicio de la inmunoterapia, obtener un valor de % de positividad para un biomarcador (PBP) para todas las células tumorales que expresen un biomarcador de interés para cada una de dichas al menos dos muestras para obtener al menos un primer valor para PBP y al menos un segundo valor para PBP;
(ii) registrar dicho al menos un primer valor para PBP y dicho al menos un segundo valor para PBP, siendo un cambio entre dicho al menos un primer valor para PBP y dicho al menos un segundo valor para PBP indicativo de una eficacia de dicha inmunoterapia;
en donde dicho al menos un primer valor para PBP y dicho al menos un segundo valor para PBP se obtienen de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
11. El método de la reivindicación de 10, en donde el cambio es una disminución entre dicho al menos un primer valor para PBP y dicho al menos un segundo valor para PBP.
12. El método de la reivindicación de 10, en donde el cambio es un aumento entre dicho al menos un primer valor para PBP y dicho al menos un segundo valor para PBP.
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