ES2961290T3 - Termociclador en tiempo real con unidad de excitación ajustable - Google Patents

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Abstract

La presente divulgación proporciona un termociclador en tiempo real, que comprende: un pozo para almacenar una muestra que comprende una diana y moléculas de fluorescencia, una unidad térmica para ajustar la temperatura de la muestra, una unidad de excitación para excitar las moléculas de fluorescencia de la muestra mediante radiación, una unidad de detección para detectar una señal de fluorescencia de la muestra, y un controlador para controlar la unidad de excitación para ajustar una intensidad de la excitación de la muestra basándose en información sobre el objetivo, de manera que la señal de fluorescencia esté en un rango de trabajo de la detección unidad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Termociclador en tiempo real con unidad de excitación ajustable
Campo técnico
La presente invención se refiere a un termociclador en tiempo real y a un método para ciclar térmicamente una muestra, en particular una muestra de ADN.
La presente invención se refiere, además, a un medio de almacenamiento legible por ordenador que almacena un código de programa informático, en el que el código de programa informático comprende instrucciones para llevar a cabo dicho método.
Antecedentes
La amplificación de ácidos nucleicos, en particular mediante la reacción en cadena de la polimerasa, ha revolucionado el análisis y/o la manipulación de los ácidos nucleicos procedentes de diferentes fuentes y para una diversidad de fines. Entre ellos se incluyen las aplicaciones médicas o clínicas de diagnóstico, las forenses, las de las industrias química o biotecnológica, y de ingeniería genética, entre otros.
Los dispositivos para la amplificación de los ácidos nucleicos son conocidos de la técnica y se denominan habitualmente "cicladores térmicos". Actualmente estos dispositivos con frecuencia son partes integradas en sistemas complejos, tales como los utilizados en dispositivos de secuenciación, en particular, en los sistemas de secuenciación denominados de próxima generación. La secuenciación de próxima generación permite que el usuario produzca un enorme número de secuencias de ácidos nucleicos que se analizan en serie o en paralelo, es decir, se determinan las secuencias de ácidos nucleicos, se cuantifican y, utilizando algoritmos adecuados, pueden ensamblarse fragmentos más cortos de secuencia de ácidos nucleicos, permitiendo obtener información sobre secuencias de ácidos nucleicos más largas, la presencia, tipo y cantidad de mutaciones, deleciones y/o inserciones en comparación con la información de secuencia en las bases de datos de ácidos nucleicos. Esta tecnología permite el análisis de enormes secuencias de ácidos nucleicos, incluso genomas enteros, en horas. Encuentra aplicación en el diagnóstico y cualquier otra tecnología o aplicación en base a la elucidación de las secuencias de ácidos nucleicos.
La mayoría de aplicaciones de amplificación de ácidos nucleicos están controladas, es decir, el procedimiento de la reacción de amplificación se monitoriza al igual que la determinación cualitativa y cuantitativa de la presencia o ausencia de determinadas secuencia de ácido nucleico diana de interés, p. ej., dianas diagnóstica o clínicamente relevantes, por ejemplo, las derivadas de agentes infecciosos o de oncogenes. Un medio utilizado frecuentemente de monitorización de la presencia o ausencia de ácidos nucleicos diana amplificados se basa en la utilización de reactivos marcados fluorescentemente que se incorporan en los ácidos nucleicos sintetizadosde novo.Las moléculas fluorescentes son sustancias que se unen a bloques constructivos de nucleótidos que se utilizan como sustratos durante la síntesis de secuencias de ácidos nucleicos o que se intercalan, p. ej., al generar secuencias de ácidos nucleicos de doble cadena. Con la estimulación electromagnética o de radiación apropiada a una determinada longitud de onda de excitación, se genera una señal fluorescente que puede medirse a la longitud de onda adecuada. Resulta posible utilizar diferentes tipos de moléculas que pueden estimularse y detectarse a diferentes longitudes de onda, tal como es conocido por el experto en la materia, y de esta manera pueden distinguirse entre sí las diferentes dianas. Con frecuencia, el nivel de la fluorescencia es directa o inversamente proporcional al tamaño de las moléculas diana amplificadas específicamente. La utilización simultánea de múltiples pigmentos en un pocillo permite la detección de varias secuencias diana en paralelo.
Los termocicladores en tiempo real se utilizan comúnmente, aunque sin limitación, para la reacción bioquímica de amplificación y detección de moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN). Son ejemplos de procedimientos de amplificación utilizados la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) o la amplificación mediante polimerasa y recombinasa (RPA). La amplificación del ADN resulta necesaria para incrementar la cantidad de una secuencia de ADN diana específica. El incremento de la secuencia de ADN diana resulta necesario para detectarlo y, en ocasiones, para cuantificarlo. La presencia de secuencias de ADN muestra la existencia de una diana, tal como un virus, bacteria u otro, en la muestra utilizada.
Un termociclador en tiempo real puede comprender una unidad térmica para ajustar la temperatura de la muestra y una unidad óptica para estimular y medir la muestra. En particular, la unidad óptica puede comprender una unidad de excitación para excitar la muestra mediante radiación y una unidad de detección para detectar la radiación, p. ej., luz, emitida por la muestra, p. ej., mediante fluorescencia.
Dependiendo del tipo y el volumen de la muestra, pueden emitirse cantidades completamente diferentes de radiación a partir de la muestra. Ello puede provocar que resulte difícil de medir con precisión la cantidad de radiación emitida.
Los documentos n.° WO2008/005321A2 y n.° WO2008/116186A1 dan a conocer sistemas de termociclado y métodos según la técnica anterior.
Resumen de la invención
El objetivo de la presente invención es proporcionar un termociclador en tiempo real y un método para ciclar térmicamente la muestra, en el que el termociclador en tiempo real y el método supera uno o más de los problemas anteriormente mencionados de la técnica anterior.
Con el fin de resolver dicho problema, realizaciones de la presente invención proporcionan un termociclador en tiempo real según la reivindicación 1, un método según la reivindicación 7 y un medio de almacenamiento legible por ordenador según la reivindicación 10.
Un primer aspecto de la invención proporciona un termociclador en tiempo real, que comprende:
- un pocillo para almacenar una muestra que comprende una diana y moléculas fluorescentes,
- una unidad térmica para ajustar la temperatura de la muestra,
- una unidad de excitación para excitar las moléculas fluorescentes de la muestra mediante radiación,
- una unidad de detección para detectar una señal fluorescente de la muestra,
- un controlador para controlar la unidad de excitación para ajustar la intensidad de la excitación de la muestra en base a la información sobre la diana.
El termociclador en tiempo real según el primer aspecto conlleva la ventaja de que la excitación de la muestra puede ajustarse en base a la información sobre la muestra, tal como la tipología de diana o el volumen de la muestra. Por ejemplo, en el caso de que haya un volumen mayor de muestra y se espere que la tipología de diana sea tal que genere una señal fluorescente fuerte, puede utilizarse una excitación más débil. De esta manera, puede evitarse que la señal medida en la muestra sea excesivamente fuerte. Preferentemente, el controlador controla la unidad de excitación para ajustar la intensidad de la excitación de la muestra en base a información sobre la diana de manera que la señal fluorescente quede en un intervalo o rango de trabajo de la unidad de detección.
La excitación de las moléculas fluorescentes de la muestra puede llevarse a cabo en cada ciclo que lleve a cabo el termociclador en tiempo real; correspondientemente, también la detección puede llevarse a cabo en cada ciclo. En algunas realizaciones, el intervalo de trabajo de la unidad de detección puede ser un intervalo de trabajo específico, p. ej., un intervalo de trabajo preferente o un intervalo de trabajo lineal de la unidad de detección. Por ejemplo, una unidad de detección puede presentar un intervalo de trabajo preferente, en el que se pueda detectar una intensidad de la señal de fluorescencia con una precisión particularmente elevada. El intervalo de trabajo preferente puede ser un intervalo de trabajo lineal y puede resultar deseable operar la unidad de detección en dicho intervalo de trabajo lineal.
El termociclador puede comprender una memoria que almacene información sobre el intervalo de trabajo de la unidad de detección.
Debido a que el termociclador en tiempo real ajusta la intensidad de la excitación, puede utilizar configuraciones de sensibilidad fija para el detector, es decir, no resulta necesario ajustar la sensibilidad. Sin embargo, también puede haber realizaciones en que se ajusten tanto la intensidad de la excitación como la sensibilidad del detector.
El termociclador en tiempo real puede utilizar una o más frecuencias de excitación y/o una o más frecuencias de detección.
En una primera implementación del termociclador en tiempo real según el primer aspecto, se configura el controlador para controlar la unidad de excitación para ajustar también una duración de la señal de excitación.
Por ejemplo, la duración de la señal de excitación puede cambiarse de 1 ms a 5 ms.
En una segunda implementación del termociclador en tiempo real según el primer aspecto como tal o según la primera implementación del primer aspecto, el controlador está configurado para ajustar la excitación en base a información sobre la tipología de la diana obtenida de una base de datos.
Por ejemplo, la base de datos puede comprender una tabla que indique para cada tipología de diana, la intensidad de excitación que debe utilizarse con la muestra. En una realización preferente, la tabla indica por separado la duración y la intensidad de la señal de excitación que debe utilizarse con la muestra.
En una implementación adicional, el termociclador en tiempo real comprende, además, una interfaz gráfica de usuario para introducir información sobre la tipología de la diana en la base de datos. La información sobre la tipología de la diana puede ser, por ejemplo, el nombre del tipo. En otras realizaciones, el usuario puede introducir directamente las intensidades deseadas, p. ej., la intensidad y/o duración deseada, de la señal de excitación.
En una implementación adicional, la unidad de excitación comprende por lo menos dos emisores, en particular por lo menos dos diodos emisores de luz. Esto conlleva la ventaja de que el primero de los dos emisores puede estar diseñado para excitación de baja intensidad y el segundo de los dos emisores puede estar diseñado para la excitación de alta intensidad. De esta manera, p. ej., dependiendo del tipo de muestra, puede utilizarse un emisor diferente para la excitación de la muestra.
En una implementación adicional, el controlador está configurado para determinar un ajuste de la intensidad de la excitación de una muestra actual en base a una señal de fluorescencia detectada anteriormente de una muestra anterior de la misma tipología que la muestra actual. En algunos casos, el usuario podría conocer la tipología de la diana, pero no conocer todavía cuál es la intensidad de excitación preferente para ese tipología de diana. En particular, podría no conocerse la intensidad de la fluorescencia para dicho tipología de diana. De esta manera, el termociclador en tiempo real de dicha implementación puede almacenar la señal detectada para una muestra anterior de la misma tipología y ajustar correspondientemente la intensidad de excitación para una nueva diana de la misma tipología. Por ejemplo, si se hubiese determinado anteriormente que una primera diana de una determinada tipología de señal de excitación estándar rinde una señal de detección que es superior a la deseada, puede ajustarse la señal de excitación para que sea de una intensidad más baja para una nueva diana de la misma tipología. Dicha implementación conlleva la ventaja de que el termociclador en tiempo real puede aprender automáticamente las intensidades de excitación adecuadas.
En una implementación adicional, el termociclador en tiempo real comprende, además, una unidad de detección de tipología para detectar de la tipología de la diana en base a una medición del tipo de la muestra. Ello conlleva la ventaja de que el usuario no necesita introducir manualmente información sobre la tipología de la diana.
En una implementación adicional, la unidad de detección de tipología comprende un sensor óptico. De esta manera, el termociclador en tiempo real puede determinar, en base a la apariencia visual y/o una señal óptica adicional emitida por la muestra, cuál es la tipología de la diana. En otras realizaciones, pueden utilizarse otros sensores para determinar la tipología de la diana.
En una implementación adicional, la unidad de excitación y/o la unidad de detección están montadas en un brazo móvil que está configurado para mover la unidad de excitación y/o la unidad de detección entre una pluralidad de pocillos. Preferentemente, pueden utilizarse guías de onda lumínica para guiar la luz hacia y/o desde el pocillo.
Un segundo aspecto de la invención proporciona un método para ciclar térmicamente y detectar una primera muestra que comprende una primera diana y moléculas fluorescentes y una segunda muestra que comprende una segunda diana y moléculas fluorescentes, en el que el método comprende:
- ciclar térmicamente la primera muestra y excitar las moléculas fluorescentes de la primera muestra con radiación de una primera intensidad de excitación,
- ciclar térmicamente la segunda muestra y excitar las moléculas fluorescentes de la segunda muestra con radiación de una segunda intensidad de excitación,
en el que la segunda intensidad de excitación se selecciona de manera diferente de la primera intensidad de excitación en base a información sobre la primera diana y la segunda diana.
En particular, la segunda intensidad de excitación puede seleccionarse de manera que la señal fluorescente de la segunda muestra se encuentre comprendida dentro del intervalo de trabajo de la unidad de detección (100, 200). Por ejemplo, en base a la primera intensidad de excitación y la señal fluorescente resultante de la primera muestra, puede seleccionarse la segunda intensidad de excitación de manera que la señal fluorescente de la segunda muestra se encuentre comprendida dentro del intervalo de trabajo.
Por ejemplo, en el caso de que la información sobre la primera y segunda diana indique que la primera y segunda diana sean de la misma tipología, y en el caso de que la señal fluorescente de la primera muestra sea excesivamente elevada en el aspecto de que es superior al intervalo de trabajo de la unidad de detección, puede seleccionarse que la segunda intensidad de excitación sea más baja, de manera que la señal fluorescente de la segunda muestra se encuentre comprendida dentro del intervalo del detector. Preferentemente, en el caso de que la primera intensidad de excitación sea, p. ej., hasta 20 % superior al extremo superior del intervalo, puede seleccionarse la segunda intensidad de excitación para que sea por lo menos 20 % más baja que la primera intensidad de excitación.
En el ejemplo anterior, el ciclado térmico y la detección de la señal fluorescente se llevan a cabo en diferentes tiempos para la primera y segunda muestra.
En otro ejemplo, la primera y la segunda diana no son de la misma tipología. La primera muestra con la primera diana presenta un nivel elevado de la intensidad de fluorescencia debido a la especial mezcla de reacción. La segunda muestra con la segunda diana presenta un nivel bajo de intensidad de fluorescencia. En el caso de que la primera y segunda diana se encuentren ambas en el intervalo de trabajo del detector y presenten una altura de fluorescencia comparable, la intensidad de excitación de la primera diana debe reducirse y la de la segunda diana debe incrementarse.
En realizaciones adicionales, la información sobre la primera y segunda diana puede estar previamente almacenada en una base de datos y el ciclado térmico, la excitación de las moléculas fluorescentes y la detección de la primera y segunda muestra pueden llevarse a cabo simultáneamente o en periodos de tiempo que se solapen.
El intervalo de trabajo de la unidad de detección puede ser un intervalo de trabajo preferente del intervalo de detección, p. ej., un intervalo de trabajo lineal.
Los métodos según el segundo aspecto de la invención pueden llevarse a cabo en el termociclador en tiempo real según el primer aspecto de la invención. Algunas características o implementaciones adicionales del método según el segundo aspecto de la invención pueden llevar a cabo la funcionalidad del termociclador en tiempo real según el primer aspecto de la invención y sus diferentes formas de implementación.
La primera y segunda muestra pueden ciclarse térmicamente de manera simultánea, aunque en diferentes pocillos o el ciclado térmico de la primera y segunda muestra puede llevarse a cabo en diferentes tiempos.
En una primera implementación del método del segundo aspecto, el método comprende, además:
- obtener información sobre la primera diana y la segunda diana,
- almacenar la información obtenida sobre la primera diana y la segunda diana en una base de datos, y
- ajustar la intensidad de excitación en base a la información de la base de datos.
En una segunda implementación del método del segundo aspecto, la obtención de la información sobre la primera y segunda muestra se lleva a cabo realizando una medición de las dianas de la primera y segunda muestra, en donde, en particular, la realización de la medición incluye la medición de la señal fluorescente de la primera y/o segunda muestra.
En una segunda implementación del método del segundo aspecto, el método comprende, además, mover la unidad de excitación y/o la unidad de detección entre un primer pocillo de la primera muestra y un segundo pocillo de la segunda muestra.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por ordenador que almacena código de programa informático, en el que el código de programa informático comprende instrucciones que, al ser ejecutadas por un procesador, llevan a cabo el método del segundo aspecto o una de las implementaciones del segundo aspecto.
Breve descripción de los dibujos
Con el fin de ilustrar las características técnicas de realizaciones de la presente invención más claramente, los dibujos adjuntos proporcionados para describir las realizaciones se presentan brevemente a continuación. Los dibujos adjuntos en la descripción siguiente son meramente algunas realizaciones de la presente invención; son posibles modificaciones de estas realizaciones sin apartarse del alcance de la presente invención según se define en las reivindicaciones.
FIG. 1 es un diagrama de bloques que ilustra un termociclador en tiempo real de acuerdo con una realización de la presente invención.
FIG. 2 es un diagrama de bloques que ilustra un termociclador en tiempo real adicional de acuerdo con una realización adicional de la presente invención, y
FIGs. 3a y 3b son diagramas de resultados experimentales obtenidos con termocicladores en tiempo real de acuerdo con la presente invención.
Descripción detallada de realizaciones
Las descripciones anteriormente proporcionadas son solo modos de implementación de la presente invención; el alcance de la presente invención no se encuentra limitado a las mismas. El experto en la materia podrá realizar cualesquiera variaciones o sustituciones. Por lo tanto, el alcance de protección de la presente invención está sujeto al alcance de protección según las reivindicaciones adjuntas.
Para los termocicladores en tiempo real, la información relevante y el resultado habitualmente no están contenidos en una medición. Se realizan varias mediciones periódicas, normalmente entre 30 y 50, para realizar un seguimiento del cambio de señal durante la amplificación. El cambio de la señal durante el tiempo muestra el resultado requerido. Habitualmente se representan en un gráfico las mediciones individuales, que muestran la señal a lo largo del ciclo o del tiempo. Los puntos de medición individuales se unen y, en ocasiones, se ajustan para formar una curva.
En general, un resultado positivo de una PCR muestra una forma más o menos sigmoidal. Existe una fluorescencia basal al inicio, un incremento de la señal y una fluorescencia final. La señal se eleva tan pronto como el número de ADN amplificados sea suficientemente alto para que pueda detectarse una señal. Ello es importante para el análisis de los datos. Un incremento muestra la presencia de un ADN diana y, además, desde el momento del incremento, pueden extraerse conclusiones sobre la cantidad de la muestra. En el caso de que el incremento sea temprano, habrá una cantidad elevada de ADN diana al inicio. Un incremento tardío de la señal muestra que la cantidad inicial es pequeña. Se requiere más tiempo para amplificar suficiente ADN diana. Después del punto de incremento, continúa la amplificación del ADN y la señal se incrementa adicionalmente. El incremento se convierte en una señal estable, una vez la amplificación prácticamente ha finalizado y se ha agotado la reacción química. En el caso de que no haya ADN diana en la muestra, no se producirá ninguna incremento de la señal y, por lo tanto, se observará una línea horizontal estable como resultado.
Para el análisis, puede restarse la desviación (línea de base) de la curva resultante y pueden llevarse a cabo cálculos adicionales para suavizar las curvas. La resta de la desviación puede realizarse para facilitar la comparación de las curvas. En el caso de que todas se inicien en cero, pueden analizarse, p. ej., mediante la fijación de un umbral.
La combinación de una unidad óptica con una unidad térmica resulta en un ciclador en tiempo real para la amplificación y detección de las moléculas de ADN. La amplificación del ácido nucleico específico se lleva a cabo en recipientes de reacción pequeños llamados pocillos. Normalmente se disponen ocho por doce pocillos en un patrón, formando un adaptador de placa de microtitulación de 96 pocillos. Existen instrumentos con otros números o configuraciones de pocillos y existen instrumentos que utilizan tubos individuales. Dos unidades importantes de un termociclador en tiempo real son la unidad óptica y la unidad térmica. Evidentemente, un termociclador en tiempo real puede comprender otros componentes, tales como piezas mecánicas, elementos electrónicos, firmware y software.
La amplificación del ADN puede llevarse a cabo mediante reactivos bioquímicos, que requieren temperaturas específicas. Con respecto a los requisitos térmicos, algunos procedimientos requieren el ciclado de diferentes etapas de temperaturas; otros procedimientos son isotérmicos. Normalmente, las temperaturas requeridas están comprendidas entre 35 °C y 95 °C, dependiendo de la aplicación. En general, el calentamiento y el enfriamiento son necesarios. Pueden utilizarse elementos Peltier o aire para templar los reactivos. Existen otros métodos, tales como el calentamiento mediante inducción magnética. Resulta necesario un control muy preciso de la temperatura debido a que el proceso bioquímico es muy sensible a la temperatura.
Una manera de detectar el resultado de la amplificación es mediante la detección de la fluorescencia. La fluorescencia generalmente se estimula mediante radiación electromagnética. La radiación resulta absorbida por la molécula fluorescente. Las moléculas fluorescentes también se denominan pigmentos fluorescentes. Tras la absorción, la molécula emite radiación que puede ser una señal fluorescente que puede ser detectada por un detector. La señal emitida preferentemente se encuentra en un intervalo de longitudes de onda diferente que la radiación de excitación. Por lo tanto, pueden distinguirse las radiaciones de excitación y emisión. La exposición de una muestra a radiación de excitación y la detección de la radiación emitida es parte del campo de la fluorimetría, que es conocida de la técnica.
La unidad óptica para la medición de las señales utiliza una fuente lumínica para la excitación y un detector para la detección de las señales fluorescentes. Pueden utilizarse componentes ópticos especiales, tales como un filtro óptico, para proporcionar luz de la longitud de onda apropiada para la excitación y detección, y para distinguir entre luz de excitación y señal. Cada pigmento fluorescente presenta un espectro específico. En un pocillo podría haber varios pigmentos fluorescentes diferentes para diferentes dianas. Por ello, deben excitarse y detectarse separadamente diferentes pigmentos. Normalmente, hay uno a cuatro pigmentos fluorescentes diferentes en cada pocillo, aunque puede haber más. Puede haber una o varias fuentes de excitación y uno o varios detectores. Las fuentes lumínicas adecuadas pueden ser, por ejemplo, LED, láser, lámparas halógenas o similares. Son ejemplos de detectores, los fotodiodos, los fotomultiplicadores, los dispositivos acoplados con carga (CCD, por sus siglas en inglés) y otros. Se requieren componentes mecánicos y ópticos para llevar la luz de excitación a los reactivos y la señal al detector.
Existen varias posibilidades respecto a los principios de excitación y detección, tales como la iluminación y detección de la placa completa, escanear los pocillos, una fuente y un detector para cada pocillo, o llevar los tubos al sistema óptico, entre otros.
La intensidad de fluorescencia medida puede variar significativamente entre diferentes mezclas de reactivos biológicos y entre diferentes dispositivos técnicos. Dicha variación puede comportar que la unidad de detección proporcione resultados de mala calidad o resultados que resulten difíciles de analizar. Para una detección óptima, la señal detectada debería encontrarse comprendida dentro del intervalo de trabajo de la unidad de detección. La mayoría de detectores no son lineales, sino que presentan un intervalo de trabajo específico o preferente. En el caso de que la señal que debe detectarse sea excesivamente elevada, puede saturarse el detector. Una señal excesivamente débil puede presentar mucho ruido. Las unidades ópticas, instaladas en los cicladores en tiempo real actuales, son muy diversas, tal como se ha indicado anteriormente. Cada unidad óptica presenta un intervalo de trabajo único, algunas de ellas son muy sensibles, mientras que otras pueden detectar incluso señales fluorescentes elevadas. Esta diversidad presenta una enorme influencia sobre las muestras detectadas. Existen algunos ejemplos que se detectan claramente en un sistema pero que detectan como muy débiles y ruidosos en otro sistema. A la inversa, las señales de fluorescencia elevadas pueden saturar un sistema y detectarse correctamente en otro sistema.
Con respecto a las mezclas de reacción para las reacciones bioquímicas, son muy diversos en composición y en la concentración de sus ingredientes. Por lo tanto, la intensidad de la señal fluorescente misma puede variar considerablemente. La intensidad de la fluorescencia basal y de la fluorescencia final en cada pocillo individual para cada pigmento individual puede ser diferente dependiendo de las propiedades de la mezcla de reactivos en el pocilio. La adaptación de la mezcla de reactivos para obtener señales fluorescentes más altas o más bajas es muy complejo o, en ocasiones, no resulta posible.
En la mayoría de cicladores en tiempo real se utiliza una configuración fija para la intensidad de la fuente de excitación y para la sensibilidad del detector. Para detectar todas las señales con claridad, un detector debe presentar un intervalo de detección muy amplio. No obstante, los análisis podrían resultar difíciles debido a que las intensidades de los resultados varían mucho.
Para compensar para las diferentes alturas de las intensidades de señal fluorescente, el termociclador en tiempo real puede presentar la posibilidad de modificar la configuración de la fuente de excitación o del detector. El detector puede adaptarse, por ejemplo, mediante modificación de la ganancia del fotomultiplicador o el tiempo de integración de una cámara, para llevar la señal fluorescente hasta el interior del intervalo correcto del detector. En este caso, la señal fluorescente se modifica después de su generación. Ello ayuda a evitar las señales saturadas o a incrementar la intensidad de señales muy débiles y ruidosas, aunque estos cambios afectan a todas las muestras en una misma tanda de manera equivalente. Sin embargo, se mantendrán las diferentes potencialmente enormes de intensidad de la señal fluorescente entre muestras individuales. Por lo tanto, la configuración aplicada es un compromiso para generar un ajuste óptimo en términos de intensidad de fluorescencia en todas las muestras, en lugar de mejorar cada señal individualmente.
Los termocicladores en tiempo real de la técnica anterior se enfrentan al reto de intensidades de fluorescencia variables entre diferentes dianas. Ello puede resolverse mediante la adaptación de la intensidad de excitación de cada pocillo y de cada pigmento fluorescente de manera individual, permitiendo de esta manera una mejora óptima de la señal para las señales débiles y fuertes. De esta manera, pueden ajustarse todas las señales para que se encuentren comprendidas dentro de un intervalo preferente, p. ej., un intervalo lineal, del detector y reducirse las diferencias de intensidad de señal. Ello simplifica el análisis de las curvas de amplificación resultantes.
Preferentemente, se utiliza una fuente de excitación que es capaz de ajustar su intensidad de excitación en el rango de milisegundos. Para el detector no resulta necesario ningún cambio de sensibilidad o de otras configuraciones, debido a que las intensidades de señal se ajustan según la excitación. Para controlar las configuraciones, controlar la fuente de excitación y el detector y para gestionar los datos de la unidad óptica, pueden utilizarse elementos electrónicos adecuados.
Para evitar que el usuario debe introducir un valor de la intensidad de excitación para cada pigmento en cada pocillo, puede seleccionarse automáticamente la intensidad de la excitación según la diana utilizada. El usuario introduce la diana para el pocillo y se selecciona automáticamente el parámetro para la óptica a partir de una base de datos.
De esta manera, antes de que pueda medirse automáticamente una nueva mezcla de reactivos, se proporcionan las configuraciones correctas al sistema. La intensidad de excitación correcta para una mezcla de reacciones puede determinarse una vez por medición y después almacenarse en la base de datos para el uso en el futuro.
La FIG. 1 es una ilustración esquemática de un termociclador en tiempo real 100. El termociclador en tiempo real 100 comprende una unidad óptica 100, un pocillo 120, una unidad térmica 130 y un controlador 140. La unidad óptica 110 comprende una unidad de excitación 112 y una unidad de detección 114. La unidad de excitación 112 está configurada para excitar las moléculas fluorescentes de una muestra en el pocillo 120 mediante radiación 122. La unidad de detección 114 está configurada para detectar una señal fluorescente 124 de la muestra en el pocillo 120.
La unidad térmica 130 se dispone en posición contigua al pocillo 120 y está configurada para ajustar la temperatura de la muestra en el pocillo 120. La unidad óptica 110 está conectada a un controlador 140. El controlador 140 está configurado para controlar la unidad de excitación 112 a fin de ajustar la intensidad de la excitación de las moléculas fluorescentes de la muestra en base a la información sobre la diana.
El termociclador en tiempo real 100 comprende opcionalmente (tal como se indica mediante líneas discontinuas en la FIG. 1) una base de datos 150 y/o una interfaz gráfica de usuario 160. La base de datos 150 puede comprender información sobre la muestra. La interfaz gráfica de usuario 160 puede configurarse para permitir que el usuario introduzca la información sobre la muestra.
La FIG. 2 es una ilustración esquemática de un termociclador en tiempo real adicional 200. El termociclador en tiempo real 200 puede ser el termociclador en tiempo real 100 mostrado en la FIG. 1, aunque solo se muestran algunos componentes en la figura 2. El termociclador en tiempo real 200 comprende una primera unidad óptica 210a que está configurada para enviar una señal de excitación 222a fuerte a una muestra en el pocillo 230a. La unidad óptica 210a mide una señal fluorescente fuerte 224a procedente de la muestra. El termociclador en tiempo real 200 comprende, además, una segunda unidad óptica 210b que está configurada para enviar una señal de excitación 222a más débil a una segunda muestra en el segundo pocillo 230b. Debido a que la segunda muestra presenta propiedades fluorescentes más fuertes, una segunda señal fluorescente 224b, que es de intensidad similar a la primera señal fluorescente 224a, es emitida por la muestra y medida en la unidad óptica 210b.
Las FIGs. 3a y 3b ilustran resultados experimentales obtenidos con un termociclador en tiempo real de acuerdo con la presente invención.
Se llevó a cabo una tanda de PCR de 45 ciclos. Se utilizaron tres dianas diferentes para el experimento. Las dianas se encontraban en pocillos separados, aunque todas utilizaban el mismo pigmento fluorescente. Se utilizaron varias réplicas que eran muy similares. En aras de la claridad, se muestra solo una curva por diana en los gráficos de la FIG.
3a y de la FIG. 3b. Se midieron todas las dianas con la misma potencia de la fuente de excitación. Además, se midieron réplicas de la diana tres con una potencia de excitación cuatro veces más alta.
En los gráficos, se muestran las señales fluorescentes a lo largo de los ciclos de amplificación. Los puntos de medición individuales se unen formando una curva. Las curvas de la diana 1 se etiquetan con un "1" en el gráfico. Las dianas 2 y 3 se etiquetaron de manera igual, aunque las curvas con una potencia de excitación más alta se etiquetan con "3a".
Las FIGs. 3a y 3b muestran las señales fluorescentes en bruto. La variabilidad de las diferentes curvas es explícita: la curva 1 presenta una elevada fluorescencia basal y una fluorescencia final elevada. La curva 2 muestra una fluorescencia basal baja pero una fluorescencia final elevada, mientras que para la curva número 3, las fluorescencias basal y final son bajas. La curva 3a presenta una elevadas fluorescencia basal y final.
En comparación con la curva 3, la curva 3a presenta una intensidad de fluorescencia mucho más alta, que resulta de la potencia de excitación más alta. Con respecto al detector, la curva 3a se encuentra en el intervalo medio, mientras que la curva 3 se encuentra en un intervalo muy bajo. El intervalo completo del detector es de entre 0 y 4000. Las señales de la diana 2 van desde una intensidad de fluorescencia baja a una intensidad de fluorescencia alta. También pueden optimizarse con respecto al intervalo del detector.
Para el análisis, habitualmente se resta la línea base a fin de normalizar las curvas. Ello permite comparar las diferentes curvas con respecto al punto de incremento de la señal. En la FIG. 3b se muestran los datos de la FIG. 3a con la línea base normalizada. Las intensidades de fluorescencia finales de las curvas 1, 2 y 3a se encuentran en un intervalo similar, mientras que la fluorescencia final de la curva 3 es mucho más baja. Con respecto al presente ejemplo, es claramente visible que resulta más fácil analizar las curvas si presentan una altura comparable, especialmente en el caso de que se utilice un umbral.

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Termociclador en tiempo real (100, 200), que comprende:
    - un pocillo (120, 230a-b) para almacenar una muestra que comprende una diana y moléculas fluorescentes,
    - una unidad térmica (130) para ajustar una temperatura de la muestra,
    - una unidad de excitación (112) para excitar las moléculas fluorescentes de la muestra mediante radiación,
    - una unidad de detección (114) para detectar una señal fluorescente (124, 224a-b) de la muestra, y - un controlador (140) para controlar la unidad de excitación (112),
    caracterizado por que el controlador está configurado para ajustar la intensidad de la excitación de la muestra en base a información sobre la diana de manera que la señal fluorescente quede en un intervalo de trabajo de la unidad de detección.
  2. 2. Termociclador en tiempo real (100, 200) según alguna de las reivindicaciones anteriores, en el que el controlador (140) está configurado para ajustar la excitación en base a la información sobre una tipología de la diana obtenida de una base de datos (150).
  3. 3. Termociclador en tiempo real (100, 200) según la reivindicación 2, que comprende, además, una interfaz gráfica de usuario (160) para introducir en la base de datos (150) información sobre la tipología de la diana en el pocillo (120, 230a-b).
  4. 4. Termociclador en tiempo real (100, 200) según alguna de las reivindicaciones anteriores, en el que la unidad de excitación (112) comprende por lo menos dos emisores, en particular por lo menos dos diodos emisores de luz.
  5. 5. Termociclador en tiempo real (100, 200) según alguna de las reivindicaciones anteriores, en el que el controlador (140) está configurado para determinar un ajuste de la intensidad de la excitación de una muestra actual en base a una señal fluorescente detectada anteriormente (124, 224a-b) de una muestra anterior que comprende el mismo tipología de diana que la muestra actual.
  6. 6. Termociclador en tiempo real (100, 200) según alguna de las reivindicaciones anteriores, en el que la unidad de excitación (112) y/o la unidad de detección (114) están montadas en un brazo móvil que está configurado para mover la unidad de excitación y/o la unidad de detección entre una pluralidad de pocillos (120, 230a-b).
  7. 7. Método para ciclar térmicamente y detectar una primera muestra que comprende una primera diana y moléculas fluorescentes y una segunda muestra que comprende una segunda diana y moléculas fluorescentes, en el que el método comprende:
    - ciclar térmicamente la primera muestra y excitar las moléculas fluorescentes de la primera muestra con radiación de una primera intensidad de excitación, y
    - ciclar térmicamente la segunda muestra y excitar las moléculas fluorescentes de la segunda muestra con radiación de una segunda intensidad de excitación,
    caracterizado por que una segunda intensidad de excitación que es diferente de la primera intensidad de excitación se selecciona en base a la información sobre la primera y segunda dianas de manera que la señal fluorescente de la segunda muestra quede comprendida dentro del intervalo de trabajo de la unidad de detección (100, 200).
  8. 8. Método según la reivindicación 7, que comprende, además:
    - obtener información sobre la primera y segunda diana,
    - almacenar la información obtenida sobre la primera y segunda diana en una base de datos (150), y - ajustar la intensidad de excitación en base a la información de la base de datos (150).
  9. 9. Método según la reivindicación 8, en el que la obtención de la información sobre la primera y segunda muestra se lleva a cabo mediante la realización de una medición de la primera y segunda diana, en el que, en particular, la realización de la medición incluye la medición de la señal fluorescente de la primera y/o segunda muestra.
  10. 10. Medio de almacenamiento legible por ordenador que almacena código de programa informático, en el que el código de programa informático comprende instrucciones que al ser ejecutadas por un procesador llevan a cabo el método según alguna de las reivindicaciones 7 a 9.
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